标题： Post-injury hydraulic fracturing drives fissure formation in the zebrafish basal epidermal cell layer

期刊：Current Biology 

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cub.2023.05.021

摘要

皮肤上皮是生物体内部与外部环境之间的屏障。在斑马鱼和其他淡水生物中，这一屏障功能需要耐受表皮两侧巨大的渗透梯度。伤口会破坏这一上皮结构，由于等渗组织液与外部低渗淡水混合，导致组织微环境发生剧烈紊乱。本研究发现，斑马鱼幼体在急性损伤后，表皮会发生一种类似水力压裂的剧烈裂隙形成过程，该过程由外部液体的流入驱动。伤口闭合后可阻止外部液体继续流入，裂隙首先在基底表皮层中距伤口最近的位置开始形成，随后以恒定速率在组织中延伸，跨度超过100微米。在此过程中，最外层的表皮表层保持完整。若在等渗外部环境中对幼体进行伤口处理，裂隙形成会被完全抑制，这表明渗透梯度是裂隙形成的必要条件。此外，裂隙形成在一定程度上依赖于肌球蛋白II的活性，抑制肌球蛋白II会降低裂隙从伤口向外延伸的距离。在裂隙形成过程中及之后，基底层会形成巨大的巨胞饮体（横截面积范围为1至4074ec0-9d30-4cbf-bd56-b2f40840a4bd）。我们认为，过量外部液体通过伤口进入体内，随后表皮表层细胞通过肌动球蛋白 purse-string 收缩闭合伤口，导致斑马鱼表皮细胞外间隙的液体压力升高。这种过高的液体压力会引发组织裂隙形成，最终液体通过巨胞饮作用被清除。

图形摘要

引言

许多动物上皮组织的一项关键功能是建立并维持其顶端面与基底面之间环境成分的极端差异。例如，哺乳动物胃上皮在胃腔（pH值3）与机体其他部位（pH值7.4）之间形成pH梯度¹，青蛙表皮则产生电荷失衡，形成跨上皮电位数十毫伏， 以及淡水斑马鱼的幼体在其体内渗透压存在超过20倍差异的情况下表皮。 上皮细胞的损伤会破坏此类梯度，且伤口愈合对于上皮细胞通过重新闭合受损组织并防止不受调控的跨上皮通量来重建这些梯度至关重要。

伤口愈合是一个复杂的过程，根据动物种类和伤口性质的不同，包含不同阶段。伤口愈合的一个常见且关键的阶段是上皮再生，这是一种集体行为，上皮细胞会感知到附近的损伤并以协调的方式向伤口处迁移，封闭受损区域。上皮再生是由基于肌动球蛋白的过程驱动，包括形成超细胞肌动蛋白 purse-string 索（该索收缩以收紧伤口边缘）以及上皮细胞基于肌动蛋白定向向损伤部位迁移。通过细胞-细胞连接实现的组织连接的物理协调对于上皮再形成也至关重要，细胞间的黏附水平受到严格调控，以在维持组织结构的同时促进细胞移动。例如，在小鼠皮肤伤口愈合过程中，细胞下调紧密连接和基于 E-钙粘蛋白的黏着连接，同时保留桥粒连接，这一过程被认为可使组织松弛并促进细胞向伤口迁移。

关于上皮损伤后跨上皮梯度的紊乱如何影响上皮再形成和伤口愈合，仍有诸多问题尚未解决。这些机制在表皮中可能尤为重要，因为表皮在组织液与外界之间会形成离子电势和液体成分的极端梯度¹⁴。在某些情况下，梯度紊乱引发的环境变化已被证实具有信号传导功能，可作为组织损伤的信号¹⁵。例如，跨上皮的短路现象电势可在表皮内产生电场，引导细胞迁移和组织再生电位可在表皮内产生电场，引导细胞迁移和组织再生，而渗透压冲击驱动的核肿胀则能 激活信号转导级联反应激活信号转导级联反应，促进受损组织的再上皮化和免疫细胞浸润。除了激活信号转导程序外，梯度破坏似乎也有可能为流体流动等物理过程提供强大驱动力，而流体流动可能会影响伤口愈合过程中上皮组织的结构或排列方式。

我们特别感兴趣的是跨上皮梯度破坏会如何影响愈合上皮组织的结构。斑马鱼作为模式生物具有显著优势，且其生活在淡水水环境中，是研究梯度破坏与伤口愈合关系的理想体系。斑马鱼幼鱼表皮具有优异的光学特性，同时可借助遗传工具实现活体荧光成像，这使得斑马鱼幼鱼成为探究伤口早期快速修复机制的重要模型系统。损伤后数分钟斑马鱼幼虫的表皮由两层细胞组成：一层是通过紧密连接维持屏障功能的表层细胞，另一层是具有增殖能力的基底细胞，这类细胞可在基底膜/细胞外基质（ECM）上迁移，还能执行包括吞噬凋亡细胞在内的其他组织维持功能26-28（图1A和图1B）。以往研究表明，这两层细胞对损伤的反应采用不同的伤口闭合机制：表层细胞会在伤口边缘组装肌动蛋白-肌球蛋白收缩环，而基底细胞则主动向伤口方向迁移关键的是，斑马鱼是淡水生物，能够承受组织液与周围环境之间超过20倍的渗透梯度。有多种环境信号有助于斑马鱼检测伤口，包括上述的渗透压诱导的细胞肿胀以及电信号的建立指向伤口的电场。尽管这些效应目前已在伤口愈合的最早阶段发现了细胞环境中这些由损伤引发的快速变化，但尚不清楚这些显著的环境破坏会如何影响伤口愈合的后续阶段，甚至也不清楚伤口愈合前的间质环境是如何恢复的。

本研究以斑马鱼幼鱼表皮的上皮化修复过程为研究对象，结果表明，除了参与伤口感知外，外部介质在伤口处的涌入会通过受伤后基底表皮细胞之间形成的裂隙深入渗透至表皮深层。这些裂隙以恒定速度从伤口处向外延伸超过100微米——约为10个细胞直径，而液体涌入产生的静水压力以及基于肌球蛋白II的组织收缩力均会促进裂隙的形成。裂隙形成后，细胞仍会通过包含黏着连接和桥粒的连接束保持连接，并通过增加巨胞饮作用摄取过量的外源性液体。研究数据显示，表皮破损必然伴随的过量细胞外液体快速涌入会引发一系列此前未被发现的事件，即上皮组织先形成裂隙，随后触发巨胞饮作用。这些研究结果凸显了液体流动等大规模物理过程在斑马鱼幼鱼伤口反应调控中的关键作用。

结果

基底表皮细胞停止向伤口迁移后，细胞之间会出现裂隙

使用先前开发的裂伤伤口技术，我们旨在确定上皮再形成末期发生的事件序列，此时细胞速度放缓并重新形成稳定的上皮。在这种伤口处理方法中，使用玻璃针刺穿并撕裂尾鳍的后端，在脊索正后方产生两个全层切口。我们发现这种伤口处理方法能引发强烈的迁移性伤口反应，该反应几乎在受伤后立即开始，并持续约15分钟。在此期间，基底细胞形成富含肌动蛋白的片状伪足突起，并向受伤区域迁移⁴。令人惊讶的是，我们发现随着基底表皮细胞速度放缓，它们开始相互分离，导致细胞之间出现数微米宽的间隙，我们将其称为“裂隙”（图1C和图1D；视频S1）。在基底表皮细胞表达细胞质荧光蛋白（mCherry）作为体积标记的幼虫中，裂隙最容易被观察到。在不同的伤口处理方式下均能观察到裂隙，包括激光诱导烧伤伤口、尾鳍截断和戳伤伤口（图S1），本研究中我们重点采用裂伤方法。裂隙的形成呈现出显著的规律性，并似乎以波状形式在组织中传播，从伤口部位开始向前延伸（图1D）。尽管裂隙通常在中线处开始形成，但其向前传播的速度在背腹轴上的不同位置并无显著差异。裂隙的宽度往往随着与伤口距离的增加而减小，且尽管裂隙会随时间变窄（视频S1），但它们在受伤后至少会持续3小时（图S1A）。

经进一步观察发现，三细胞连接处出现的微小缝隙先于相邻细胞间裂隙的形成（图1D，蓝色箭头）。裂隙形成后，细胞内部开始积累大量深色点状结构，这表现为细胞质荧光蛋白信号的局部荧光强度降低，与充满液体的内体或巨胞饮体的特征相符（图1D，黄色箭头）。这些深色点状结构大小不一，部分直径可达数微米。随着点状结构的积累，每个细胞边缘的裂隙从宽度一致、平滑均匀的缝隙转变为不均匀的“串珠状”形态，细胞间连接处的缝隙宽度也随之发生变化（图1D，品红色箭头）。

为了定量比较许多幼虫和不同条件下裂隙的动态变化，我们开发了一套计算流程，用于在延时电影的每一帧中识别分离的细胞边界（详见STAR方法学）。为了突出裂隙，该流程使用了边缘检测滤波器，该滤波器会生成一幅图像，其中每个像素的强度值与该像素邻域与原始图像中深色线性结构的相似程度相关；我们将这一测量指标称为“裂隙指数”（图1E和图S2A）。为了揭示裂隙在组织中扩散的范围和速度，我们根据距伤口的距离和伤口后的时间，对裂隙指数的平均值进行分箱处理，得到了裂隙测时图可显示随时间推移出现明显脊线检测的区域（图1F）。对多条幼虫的裂隙测时图取平均值后，我们的观察得到了验证：裂隙首先以恒定速度在组织中传播，随后进入传播速度减慢的阶段（图1F）。

图1. 伤口愈合过程中裂隙在表皮细胞间扩散。(A) (Ai) 受精后3天（dpf）斑马鱼幼虫的示意图，标注了本文全程使用的xy（矢状）和xz（冠状）平面。(Aii) 幼虫表皮的xz切片显示其双层结构，由表层和基底层（由DNp63启动子标记）构成，基底层附着于细胞外基质（ECM）之上。(B) 未受伤的3 dpf表皮的电子显微照片，根据(Aii)进行伪彩色处理。粉色和橙色阴影分别标记表层和基底层；同一色调的不同深浅突出各层内的相邻细胞。(C) 受伤后不同时间点，基底层细胞表达细胞质mCherry的3 dpf幼虫的最大强度投影（TgBAC(DNp63:Gal4); Tg(UAS:mCherry)）。顶部展示了撕裂操作的示意图。mpw：受伤后分钟数。(D) 来自(C)的局部放大图，展示受伤后基底层细胞间裂隙随时间的扩展过程。蓝色箭头头指示在完全裂隙形成前，三细胞连接处出现的深色点状结构；黄色箭头头指示裂隙形成后细胞内出现的大型深色点状结构；品红色箭头头突出裂隙随时间形成的不规则串珠状形态。局部放大图(Di)–(Diii)追踪特定细胞随时间向伤口的迁移过程。局部放大图(Diii)中追踪的细胞迁移距离最远，这与其最靠近伤口的位置一致。(E) 由基底层细胞mCherry信号计算得出的裂隙指数图像示例。(F) 平均裂隙指数的时间-空间图谱（Kymograph），显示裂隙最初沿远离伤口的方向线性扩展，约12分钟后扩展速度变慢。裂隙指数为15条幼虫的平均值。(G) 裂隙动力学的定量分析，包括裂隙形成的起始时间、初始线性扩展阶段的扩展速度以及线性扩展的空间范围。每个点代表一条单独的幼虫（((n ≥29))），粗线和细线分别表示平均值±1个标准差。另见图S1、图S2及视频S1。

为提取裂隙传播的起始时间、速度和距离，我们对线扫描图像的线性传播部分进行了直线拟合（图S2B）。该分析显示，裂隙在伤口形成后6±2分钟（标准偏差[SD]，(n=29 larvae))）开始出现，并以21±10皮米/分钟的速度在组织中传播，最终传播至130±36毫米的距离（图1G）。此前我们已证实，在斑马鱼基底表皮伤口反应的迁移阶段，细胞迁移以前向传播的波状形式启动，这与裂隙形成的过程类似⁴。有趣的是，这种细胞运动波的空间范围和传播速度（200毫米和40毫米/分钟）与裂隙传播的范围和速度（130毫米和21毫米/分钟）相当，而细胞运动波的启动几乎在伤口形成后立即开始，早于裂隙的传播。总体而言，我们对裂隙动力学的定量分析表明，基底细胞裂隙在衰减前，会以恒定速率从伤口处向外传播多个细胞直径的距离。

分离的基底细胞仍通过细索状连接体相连，而表层则保持完整

考虑到细胞间黏附对多种集体行为的重要性组织行为，包括上皮单层细胞的迁移基底细胞间裂隙的出现出乎意料。为了更详细地探究裂隙的结构，我们对未受伤的幼虫以及在受精后2、7和20周固定的幼虫进行了超薄切片透射电子显微镜观察。如先前研究所示28,31,32，未受伤幼虫的基底细胞和表层细胞以相互嵌合的方式紧密贴合：每个细胞的横截面在细胞核上方的中部最高，并向边缘的细胞-细胞连接处逐渐变窄（图1B和图2A）。这种特征性的、相互嵌合的三维（3D）表皮结构与此前为青蛙幼虫表皮确立的几何结构一致33。与连接紧密的未受伤表皮不同，受精后2周的表皮横截面中，基底细胞之间以及基底-表层界面处出现了许多微小的空隙（图2B）。对细胞及其间隙的人工分割结果显示，受精后2周时，间隙占表皮总横截面积的12%，较未受伤组织的2%有所增加。尽管远离伤口处的表层细胞横截面仍保持未受伤时的形态（图2B，白色箭头头），但靠近伤口处的表层细胞不再与基底细胞相互嵌合（图2B，黑色箭头头）；相反，表层细胞在顶侧隆起，在基底侧则更为扁平。

在每毫米伤口7个细胞（7 mpw）的时间点，裂隙通常刚出现（通过活体共聚焦显微镜成像判断），基底细胞沿伤口方向高度伸长，这与此时通常发生的细胞迁移情况一致⁴²¹。在这个时间点，基底细胞之间的间隙远大于每毫米伤口2个细胞（2 mpw）时的间隙，尤其是在基底细胞与基底膜之间（图2C）。在每毫米伤口20个细胞（20 mpw）时，迁移已停止，且裂隙在光学显微镜下仍清晰可见，基底细胞呈扁平卵圆形，出现了较大的圆形间隙在相邻基底细胞的连接处观察到（图2D）。这些结构在形态上与2毫周时观察到的微小间隙明显不同。尽管存在这些较大的间隙，基底细胞仍频繁与相邻细胞保持侧向接触。在所有时间点，表层细胞均保持紧密的侧向接触，表明该层未出现裂隙。此外，无论是在基底细胞的侧向界面，还是在基底细胞与表层细胞的界面，都能清晰看到间隙，这说明裂隙会在所有基底细胞表面形成，不过在共聚焦图像的最大强度投影中，仅能在侧向表面检测到。为排除固定伪影的影响，我们观察了在基底细胞中表达LifeAct的幼虫的伤口闭合过程，并探究了使用电镜固定液固定时对裂隙及整体组织结构的影响。我们发现，光学显微镜下可观察到的裂隙形态和排列并未因固定而改变（图S3）。总体而言，我们的电镜观察表明，基底细胞间的间隙在伤口后迅速形成——甚至早于光学显微镜可检测到的时间——且随着时间推移会逐渐融合，而表层层在整个伤口愈合过程中始终保持完整。

电子显微镜观察显示，我们在光学显微镜下看到的裂隙并未完全消除细胞间的接触（图2）。为了检测这些持续接触处是否存在E-钙粘蛋白，我们对幼虫进行了伤口处理：这些幼虫的基底层表达mCherry，而表层和基底层均表达融合了超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）的斑马鱼E-钙粘蛋白（Cdh1）。 利用基层特异性的mCherry，我们通过计算区分了基层和表层产生的E-钙粘蛋白信号，并将各层中E-钙粘蛋白的动态变化与裂隙的动态变化进行对比——裂隙在mCherry通道中表现为暗区。我们观察到，在整个伤口愈合过程中，E-钙粘蛋白始终维持在基层和表层的细胞连接处（图3A；视频S2）。尽管细胞质中的E-钙粘蛋白信号有所减弱，但其仍保留在细胞连接处，这与电子显微镜下观察到的大量膜连接结构相符（图2）。这类膜连接结构具有较高的表面积与体积比，因此相比细胞质标志物，更易富集E-钙粘蛋白这类膜结合标志物。虽然E-钙粘蛋白在整个伤口愈合过程中始终定位于细胞连接处，但需注意的是，实验过程中基层和表层的E-钙粘蛋白信号强度均显著下降；由于基于细菌人工染色体（BAC）的天然cdh1启动子表达水平较低，且sfGFP的光漂白速率相对较高，因此无法区分sfGFP的光漂白现象与E-钙粘蛋白的潜在降解。我们还在电子显微镜样本中高倍镜下观察了细胞间连接，发现连接细胞的结构常终止于电子致密斑块（图3B，蓝色箭头），该结构与桥粒斑块相似，且有许多中间丝从斑块中延伸出来（图3B，黄色箭头）。综上，我们对细胞间连接的共聚焦显微镜和电子显微镜观察结果表明，裂隙形成过程中，黏着带和桥粒可能仍保持部分完整性。

图2。损伤后不久，基底细胞之间的间隙就会出现。（A-D）伤前（A）或伤后不同时间（B-D）的3-dpf表皮的xz平面电子显微照片。每张显微照片都附有相机lucida绘图，以引导眼睛。相机lucida绘图的着色与图1Aii中的着色相匹配；绿色（D）所示的细胞具有与免疫细胞一致的细胞核形态。细胞之间的间隙早在2 mpw时就出现，在7 mpw时合并，在20 mpw时出现在浅表细胞和基底细胞界面的细胞-细胞连接处。（B）中的白色箭头：离伤口更远的浅表细胞保留了未受伤细胞中看到的平坦的顶面和弯曲的基底表面。（B）中的黑色箭头：靠近伤口的浅表细胞具有倒置的形状，顶面弯曲，基底表面平坦。另见图S3。

图3. 出现裂隙的细胞仍通过细胞间连接保持连接

为了调和共聚焦显微镜下细胞间出现裂隙与细胞间束缚和黏附持续存在这一矛盾现象，我们着手确定通过成像比电子显微镜实际更大体积的组织来形成裂缝。通过从20 mpw幼虫的树脂包埋样品中切割半薄的0.5 mm切片，我们获得了20 mm的连续横截面，用于组织学成像和3D组织重建（视频S3）。这足以观察多个细胞周围裂缝的排列。一致的通过我们的电子显微镜观察，这种组织学成像强调裂缝出现在基底细胞的侧向和顶端表面（图3C；分别为黑色和白色箭头），而在共聚焦显微镜中只有侧向裂缝容易检测到。我们还在组织学成像中观察到许多系绳，通常在基底膜附近或位于表层细胞与基底细胞之间（图3C，黄色箭头）。重要的是，连续切片组织学的3D重建显示，裂隙在侧面和顶端表面之间是连续的（图3D）。这促使我们使用瞬时结构照明显微镜（iSIM）研究膜索及其结构。通过对同时表达基底细胞特异性Lifeact-GFP以及两层中均标记tdTomato的Cdh1的受伤斑马鱼进行成像，我们观察到大量膜索实例，这些膜索在裂隙状基底细胞之间显示出F-肌动蛋白和Cdh1的定位（图3E）。因此，裂隙在基底细胞层与表层细胞层的界面处形成了一个相互连接的网络，而两层细胞之间的连接则通过膜索得以维持，这些膜索在裂隙形成过程中通过与肌动蛋白细胞骨架结合的黏着连接保持连接状态。

裂隙中充满外部来源的液体，并在屏障功能恢复后形成

表皮裂隙相互连接的管道状结构让人联想到水力压裂（或称“压裂”），这种结构此前已在上皮单层细胞中以及早期胚胎发育期间被观察到。因此，我们推测裂隙可能是由组织损伤时外部液体渗入表皮引起的。为了测试裂隙是否含有外部液体，我们将10kDa荧光标记的葡聚糖脉冲进入受伤幼虫周围的外部培养基7分钟，并在从培养基中洗出多余的葡聚糖后对表皮进行成像（大约需要3分钟，见STAR方法）。我们观察到荧光葡聚糖很容易进入受伤的组织，荧光信号的前部传播与裂隙形成完全一致（图4A；视频S4）。有趣的是，除了在侧向细胞-细胞连接处与裂隙发生荧光葡聚糖共定位外，在最大强度投影中，在穿过细胞中间的通道中也观察到葡聚糖（图4A；白色箭头，见插图），与电镜和组织学观察到的浅层-基底层边界处的裂隙一致（图3）。本实验证明表皮裂隙含有外部液体。

组织的水力破裂是由间质液静水压的大幅增加驱动的，这只有在间质液被限制从幼虫流出回到外部介质时才会发生。组织屏障功能负责这种流体流动的限制，在淡水鱼未受伤的表皮中，这种屏障功能非常紧密。在受伤的表皮中，屏障功能在伤口部位明显受损，但原则上可能在组织的其他地方受损。鉴于远离伤口的浅层紧密连接（图2A）和伤口部位发出的裂缝中葡聚糖的排他性流入（图4A），我们推测屏障功能在远离受伤部位的斑马鱼表皮中得到维持。这意味着液体只能直接在伤口部位流入或流出表皮。此外，我们预测一旦伤口部位的屏障功能恢复，间质液就会受到加压，导致裂缝形成。

为了确定受伤后表皮屏障功能何时恢复，我们在受伤后的不同时间将3分钟的可固定荧光葡聚糖脉冲应用于受伤的幼虫，在脉冲后立即固定幼虫，然后对它们进行成像以寻找组织内葡聚糖的存在（图4B和4C）。在对照条件下，在所有在荧光葡聚糖存在下受伤的幼虫中观察到葡聚糖，然后固定在3 mpw。然而，只有17%的幼虫在组织内显示出显着的荧光信号，这些幼虫以7 mpw开始，然后固定在10 mpw。最后，没有暴露于从17 mpw开始并固定在20 mpw的荧光葡聚糖脉冲的幼虫表现出内部荧光（每个时间点(n>11)幼虫）（图4D）。这表明大多数伤口在7 mpw或之前基本上是封闭的，与光显微镜容易观察到裂缝形成和扩展的典型时间相吻合（图1G）。

渗透梯度和肌球蛋白II收缩性促进裂缝的形成和扩展

驱动组织破裂的静水压可能来自渗透梯度从低渗外部介质驱动到组织中的多余液体。这种多余的液体在伤口密封后会变得加压，从而防止多余的液体离开组织。伤口边缘的收缩力可能会迫使液体进一步进入组织。为了测试组织收缩力对外部液体浸润的贡献，我们用肌球蛋白II抑制剂气泡抑制剂抑制组织收缩力。为了测试渗透梯度的贡献，我们用山梨醇调整外部渗透压以匹配内部液体的渗透压，而不会破坏渗透压依赖离子或电伤口线索。我们首先确定这些扰动对表皮损伤后重建屏障功能能力的影响。用等渗山梨醇处理幼虫在任何时间点都不影响右旋糖酐浸润幼虫的比例（10 mpw为17%，20 mpw为0%），这表明渗透梯度的扰动并没有破坏屏障功能重建的时间（图4D）。然而，在在7至10毫渗透摩尔浓度之间加入右旋糖酐脉冲至60%（图4，经费希尔精确检验，p=0.026），这与此前关于肌球蛋白收缩力有助于伤口闭合与密封的研究结果一致。7 这些右旋糖酐渗透实验表明，组织收缩力可促进表皮屏障功能的重建，而渗透梯度则无此作用。

图4. 外源右旋糖酐通过活体和固定化幼虫的开放性伤口进入体内。(A)（左）实验流程示意图。简要来说，将幼虫置于TMR葡聚糖存在的环境中进行伤口处理，孵育7分钟。随后用E3培养基洗涤幼虫3分钟，并以1分钟为间隔进行活体成像。伤后22分钟处的白色箭头示例展示了葡聚糖并非沿细胞边界流动，而是穿过细胞中部的情况，这可能是由于葡聚糖流经细胞顶端表面所致。（右）3天龄幼虫伤口处理后的延时成像最大强度投影图，该幼虫的基底细胞表达mCherry，在添加了2毫克/毫升10千道尔顿TMR葡聚糖的E3培养基中进行伤口处理。品系为(TgBAC(DNp63:Gal4); Tg(UAS:mCherry))。(B) 固定葡聚糖检测实验的流程示意图。(1) 将幼虫置于E3培养基（低渗）、270毫摩尔山梨醇（等渗培养基）或添加了50毫摩尔对硝基布雷克司他丁的E3培养基中进行伤口处理。(2) 分别等待0、7和17分钟后，用2毫克/毫升TMR葡聚糖（低渗和等渗组）或AF680-葡聚糖（布雷克司他丁组）对幼虫处理3分钟。(3) 对幼虫进行洗涤、固定并成像。

尽管渗透梯度和组织收缩性并非外部液体进入的严格必要条件，但我们推测它们可能会影响进入的液体量，进而影响其静水压，而静水压可能会影响裂隙的形成。为了验证渗透梯度和收缩性在裂隙形成中的作用，我们在等渗山梨醇溶液或布雷克司他中对基底层表达 mCherry 的幼虫进行了伤口处理。如前所述，在低渗条件下，裂隙出现并从伤口处向外扩散（图1F和图5A）。相比之下，在等渗山梨醇中受伤的幼虫在整个伤口愈合过程中保持了完整的基底层细胞层（图5B；视频S5）。用布雷克司他处理的幼虫在伤口附近形成了裂隙，但这些裂隙未能进一步扩散到组织中（图5C；视频S6）。

为比较不同条件下的裂隙传播情况，我们回到了用于将脊状结构的局部丰度量化为裂隙指数的分析流程。对幼虫数据取平均后，裂隙时程图证实，低渗介质中观察到的缝隙传播在等渗山梨醇环境中并未出现（图5D，上行）。当对裂隙时程图进行裂隙形成评分时（采用STAR方法中所述的盲法评分），所有经低渗处理的幼虫((n=30))在受伤后均显示裂隙形成阳性评分，而经等渗处理的幼虫((n=11))（n=11）均为阴性评分。因此，基底细胞之间形成大规模裂隙需要内部与外部液体之间存在渗透梯度。

对经 blebbistatin 处理的斑马鱼幼虫的裂隙运动轨迹图取平均后显示，裂隙出现爆发性形成但几乎不发生延伸；而作为溶剂对照的 DMSO 处理组幼虫，裂隙延伸过程正常（图5D，最后一行）。对这些运动轨迹图进行评分后发现，100%的对照组幼虫（((n=9))）以及77%的经 blebbistatin 处理的幼虫（((n=13))）均形成了裂隙，并被纳入后续分析。由对实验条件不知情的评分者手动测量运动轨迹图中线性延伸的范围，结果显示经 blebbistatin 处理的幼虫裂隙平均延伸80毫米，显著低于 DMSO 处理对照组幼虫平均143毫米的延伸长度（图5 (p=0.0010)，经 Tukey 检验）。这些数据表明，组织收缩力既促进裂隙延伸，也促进伤口闭合。尽管渗透梯度不影响伤口闭合，但它们在裂隙形成中具有独特作用，可能是通过控制外部液体的进入量来实现的。

图5 渗透梯度与组织收缩力促进裂隙形成。(A)（上图）3天受精后幼虫在E3溶液（低渗培养基）中被切割后尾鳍随时间的变化情况：该幼虫在基底细胞中表达mCherry，基因型为(TgBAC(DNp63:Gal4); Tg(UAS:mCherry))。伤口形成时间比标注时间早1-2分钟。（下图）时程序列下方为放大的局部细节图。(B) 幼虫在添加270 mM山梨醇的E3溶液（等渗培养基）中，按(A)中的方式进行伤口处理。(C) 幼虫在添加50 mM对硝基布雷施蓝素的E3溶液中，按(A)中的方式进行伤口处理。(A)-(C)均为转盘共聚焦显微镜拍摄的图像经最大强度Z轴投影处理后的结果。(D) 裂隙指数随时间变化的线扫图，数据取自距离伤口特定距离处的区域，对低渗E3溶液中受伤的幼虫（编号((n=30))）、添加270 mM山梨醇的E3溶液中受伤的幼虫（编号((n=11))）、添加50 mM对硝基布雷施蓝素的幼虫（编号((n=13))）以及以0.1%二甲基亚砜作为布雷施蓝素溶剂对照的幼虫（编号((n=9))）的结果取平均值。裂隙指数为按照STAR方法和图1中的描述进行分析。图1F中使用的幼虫数据已整合到此处显示的平均低渗裂隙线扫描图（左上）中。（E）裂隙形成呈阳性的幼虫的量化裂隙动力学。每个点代表一只幼虫（((n≥9))）。粗线和细线分别代表该条件下的平均值±1个标准差。根据单因素方差分析（ANOVA）结合图基（Tukey）检验，赋形剂对照组与低渗组无显著差异（无显著性差异，(p 0.05)），而 blebbistatin 组与赋形剂对照组存在显著差异（((p=0.0010))）。此处同时绘制了图1G中的低渗数据以作对比。另参见视频S5和S6。

裂隙中的液体通过基底层的巨胞饮作用被清除

到目前为止，我们已经描述了基底表皮层内因外部液体进入而形成的裂隙的发生情况受伤的幼虫。除裂隙外，我们还通过三种成像方式——光学显微镜（图1D，黄色箭头）、组织学（视频S3）和电子显微镜（图6C）——均观察到伤口附近的基底细胞中存在大型细胞内囊泡。这促使我们使用早期内体报告基因——带有GFP标签的Fab1、YOTB、Vac1和EEA1结构域的串联重复序列（2xFYVE）——来研究伤口愈合过程中内体的动态变化。2xFYVE结构域以高亲和力特异性结合早期内体膜上的磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）。在缺乏富含PI3P的内体膜时，该探针会保留在胞质中³⁸。因此，我们在基底层表达EGFP-2x-FYVE²⁷，以观察伤口愈合过程中早期内体的行为。我们注意到，从伤后10分钟（mpw）开始，整个基底层中直径大于5微米的2xFYVE标记囊泡的形成显著增加，其大小多样性相较于伤前和伤后即刻阶段明显提升（图6A和图S4A；视频S7）。根据直径大于16242e6-3487-43b2-a7bf-a9750523ebfa微米的特征，这些内体很可能来源于巨胞饮作用——这是一种高度多样的内吞途径，其特征是内吞囊泡直径大于0.5微米（横截面积大于(~ 0.2 mu m^{2})）。巨胞饮作用中形成的大型囊泡可促进细胞表面积的改变。因此，为观察伤口愈合过程中巨胞饮体的动态变化，我们对FYVE标记的内体进行分割，并根据面积将其伪色标记为三类：小体积（((<1 mu m^{2})面积，橙色）、中等体积（(1-5 mu m^{2})面积，蓝色）和大体积（((>5 mu m^{2})面积，黑色）。分割过程中，我们剔除了距离过近无法单独识别或FYVE信号不均匀的内体结构（图S4B）。值得注意的是，由于部分结构未被识别或误识别，分割仅能对内体的数量和大小进行粗略估算（图S4B）。

我们计算了5分钟窗口内的内体平均数量，以评估伤口处理后群体水平随时间的变化（图6B）。在伤后5分钟内，我们观察到小内体和中内体的数量均下降（图6B），这与FYVE信号部分重新分布至细胞质基质相符（图6A，伤后10分钟）。然而，由于撕裂过程中组织的损失，内体数量的这种下降可能被高估了。因此，我们重点比较了伤口处理后内体数量的变化趋势。伤口处理后，与伤后最初5分钟相比，小内体和中内体的数量随时间逐渐减少（图6B左图和中图）。相比之下，大内体的数量从伤后10分钟开始增加（图6A红色箭头处及图6B右图）。通过电子显微镜，我们证实了基底细胞内存在大囊泡（图6C）。有趣的是，我们还观察到一个基底细胞顶面向裂隙伸出两个突起的例子（图6C左图），这与巨胞饮杯的横截面形态相似。40 正在形成的巨胞饮杯会募集一圈突起结构F-肌动蛋白。我们通过免疫结构照明显微镜（iSIM）在基底细胞中共表达F-肌动蛋白报告基因Lifeact-绿色荧光蛋白（Lifeact-GFP）与胞质mCherry，对裂隙诱导的巨胞饮过程形成过程中的F-肌动蛋白进行了可视化观察（图6D，红色箭头；视频S8）。我们观察到胞质mCherry信号中出现“空洞”的同时，F-肌动蛋白环发生聚集，这与既往发表研究中关于巨胞饮体形成过程中肌动蛋白聚集的描述相似⁴⁰。总体而言，我们对裂隙形成后大型内体的观察结果表明，在渗透压梯度作用下被驱入组织的多余液体，会在肌球蛋白II收缩力产生的静水压作用下被迫穿过表皮裂隙，随后基底层会通过巨胞饮作用清除这些外部多余液体。

图6.外部液体通过巨噬细胞作用清除。（A）在E3培养基存在下受伤的基底细胞中表达mCherry和GFP-2xFYVE的3-dpf幼虫受伤后的时间推移的最大强度投影：（TgBAC（DNp63：Gal4）；Tg（UAS：mCherry）；Tg（UAS：2xFYVE-GFP））。第一列和第二列分别显示mCherry和GFPFYVE通道。第三列显示合并。第四列显示GFP-FYVE的分割。分割的结构分为三类和伪彩色((orange: <1 mu m^{2})；蓝色：(1-5 mu m^{2})；和黑色：(>5 mu m^{2})）。红色箭头显示大的内吞结构。全尺寸图像如图S4所示。

讨论

综合来看，我们的活体成像、电子显微镜和组织学研究结果表明，斑马鱼幼鱼伤口愈合过程中的液体流入会在基底表皮层的细胞之间形成裂隙（图7）。低渗外部介质与等渗组织液之间的渗透梯度会增强液体的流入。随着伤口愈合的推进，伤口边缘的组织收缩（可能由表层细胞层中的肌动蛋白球蛋白 purse string 介导）促进伤口闭合，这会限制流入的液体回流到环境中，而持续的组织收缩随后会使组织液产生压力。伤口闭合后静水压的这种升高，会通过水力压裂（即压裂作用）形成裂隙。裂隙形成于基底细胞的侧向连接处，以及基底细胞与表层细胞的界面处，并从伤口边缘向前延伸超过100微米。最终，过量的外部来源液体会被内吞到基底细胞内的大型巨胞饮囊泡中，这可能是表皮清除液体的方式之一。我们发现裂隙会在组织内持续存在超过3小时（图S1）。我们推测，在如此长的时间尺度下，伤口反应过程中引入的任何过量液体都可通过肾脏经血液清除，大约在受精后2天（dpf）开始发挥功能。裂隙形成需要渗透梯度，因为当外部介质与内部介质等渗时，裂隙不会形成（图5）。我们认为这是由于液体流入伤口的量减少，而非伤口反应本身存在差异。尽管等渗溶液会在一定程度上抑制伤口反应，21但本研究中使用的等渗山梨醇溶液仍能支持部分伤口反应，包括基底细胞向伤口的定向迁移以及伤口处依赖肌球蛋白-II的 purse-string 收缩。

裂隙形成需要渗透梯度，因为当外部介质与内部介质等渗时，裂隙不会形成（图5）。我们认为这是由于液体流入伤口的量减少，而非伤口反应本身存在差异。尽管等渗溶液会在一定程度上抑制伤口反应，21但本研究中使用的等渗山梨醇溶液仍能支持部分伤口反应，包括基底细胞向伤口的定向迁移以及伤口处依赖肌球蛋白-II的 purse-string 收缩。margin.4,42 因此，我们得出结论，裂隙不存在我们在等渗培养基中观察到的现象并非源于伤口反应的完全缺失，而是仅仅因为缺乏陡峭的渗透梯度。与渗透梯度不同，肌球蛋白II的收缩性并非裂隙形成的严格必要条件，因为经布雷布他汀处理的斑马鱼幼虫仍会形成裂隙。然而，裂隙要向前方长距离扩散至表皮，肌球蛋白的收缩性是必不可少的。我们推测这一现象源于伤口边缘的肌动-蛋白环收缩束，该结构不仅促进伤口闭合（图4D），还能在屏障功能恢复后，通过伤口边缘的持续收缩提高内吞液体的静水压，从而使裂隙的形成距离远大于肌球蛋白II收缩性缺失的情况。与该模型相符的是，裂隙首次出现在表皮的典型时间与伤口对葡聚糖不再具有通透性的时间一致，均在受精后约7天（图1G和图4D）。除环缩模型外，基底细胞内细胞自主的肌球蛋白II收缩性也可能促进组织深层的裂隙形成，其机制可能是将液体从细胞中挤出——类似于挤压湿海绵。我们更倾向于环缩模型，因为该模型能自然解释裂隙为何从伤口处向前方扩散；而基底细胞收缩性模型则需假设基底细胞收缩性存在时空梯度，才能解释这一扩散现象。要直接区分这两种模型，需开发组织特异性的肌球蛋白收缩性干扰技术，以实现单独消融环缩结构的收缩性，而非消融基底细胞的收缩性。

钙在细胞内对于协调伤口愈合过程中的组织动态变化至关重要，同时在细胞外也能促进细胞间黏附。我们认为细胞内钙信号传导在裂隙形成中不发挥直接作用。我们及其他研究团队此前已检测到细胞内钙波在斑马鱼尾鳍伤口的研究中，研究人员发现钙波在1至3百万像素宽度内完成在组织中的传播，远早于我们在此报告的任何裂隙形成活动。我们无法排除伤口形成过程中细胞外钙发生潜在变化的可能性，这种变化可能会干扰细胞间连接，从而促进裂隙形成。然而，我们认为这种可能性不大：所有成像条件下的外部钙浓度均相同，但等渗处理组未观察到任何裂隙，这表明细胞外钙浓度的任何可能变化都不足以引发裂隙形成。

细胞外基质因肿胀或流动导致的液体积聚是诱导形态发生组织形态形成的一种新机制发育过程中的变化。染色方法我们电子显微镜分析中使用的方法无法对细胞外基质（ECM）做出诊断，因此我们无法排除裂隙中存在细胞外基质的可能性，而水凝胶的溶胀效应可能会导致裂隙形成。

水力压裂对细胞间紧密接触的破坏，最早是在生长于拉伸水凝胶上的哺乳动物上皮细胞（马-达比犬肾细胞）培养单层中被发现的；当拉伸力解除时，水凝胶中积聚的多余水分会被强制穿过细胞单分子层，导致连接快速破坏。 在该实验条件下，未观察到水力产生的裂缝发生空间扩展，这可能是由于微图案上生长的单分子层尺寸较小，或是实验设计使得水在水凝胶的所有点均匀释放，流体流动无横向梯度。在小鼠胚胎囊胚腔的形成过程中也观察到了水力压裂现象，其中主动离子转运会产生渗透梯度，将液体吸入胚胎内，进而在压力作用下形成管腔，这些管腔逐渐融合成囊胚腔。36 斑马鱼肠道中单个连续管腔的形成可能也基于类似的过程。我们还观察到裂缝形成过程中组织间隙出现明显的融合现象（图2），但这种融合是通过电子显微镜而非光学显微镜观察到的，因此其空间尺度比以往的这些观察结果更小。需要采用更高分辨率的活细胞成像技术，才能对比伤口诱导裂缝的融合动态与体内其他水力压裂过程中的融合动态。值得注意的是，肌球蛋白II的收缩性在上皮单分子层和小鼠胚胎中均能促进裂缝闭合，而我们的研究发现，在伤口愈合的背景下，肌球蛋白II的收缩性反而会促进裂缝的形成与扩展。这种差异可能是由于肌球蛋白II的收缩性在伤口环境中为裂缝形成提供了允许性压力，发挥了独特作用。

我们在此描述的由水力压裂驱动的组织裂隙现象，与组织断裂有着显著区别——组织断裂时上皮层发生撕裂，导致原本相邻的细胞完全分离。这类断裂已通过将上皮片拉至超过临界应变的实验得到研究，且在简单多细胞生物黏体虫（*Trichoplax adhaerens*）的正常运动过程中，断裂也会常规发生。与组织断裂不同，我们所报道的与伤口相关的水力裂隙现象，至少保留了一部分细胞-细胞连接，这一点在超微结构水平（图3B）和超分辨率水平（图3E）上均有体现。裂隙形成过程中连接基底细胞的连接结构，让人联想到细胞用于维持接触的连接结构在部分回缩后与基底保持接触

我们通过光学显微镜和电子显微镜观察发现，伤口愈合后基底细胞中出现了体积显著增大的囊泡，这表明积聚的外部液体是通过巨胞饮作用被清除的。巨胞饮作用是一种不依赖网格蛋白的过程，会形成大型多形性囊泡，使细胞能够快速响应环境变化，进而改变其表面积和净体积。巨胞饮作用在哺乳动物组织培养细胞中响应生长因子的研究最为广泛多种因素，但也存在若干案例显示其似乎发挥机械作用。例如，有研究报道普通水螅的外表皮存在组成型巨胞饮作用，且该过程会因组织拉伸而被下调。在单细胞水平上，未成熟树突状细胞会生成巨胞饮体，这使其对流体阻力不敏感，从而助力其在组织内探索空间。

组织间隙液的调控性积聚在发育场景中促成了多种形态发生事件：除了囊胚腔的形成外，在斑马鱼外包过程中，组织间隙液的重新分布促进了脊索前板细胞的迁移，而作为细胞密度拥挤转变的一部分，组织间隙液的积聚还调节着斑马鱼体轴伸长的程度。此外，由细胞外基质成分积聚介导的渗透性肿胀推动了斑马鱼内耳半规管的形成。在所有这些发育过程中，液流是通过细胞形状或细胞黏附的改变，或是通过渗透压物质的主动运输与极性合成产生渗透梯度，在内部受到调控的。与之相反，伤口后促使裂隙形成的液体来源于外部，而裂隙形成则是对快速且剧烈的环境变化的一种响应。面对如此剧烈的变化，裂隙从伤口边缘向前稳定且强劲地线性延伸，这一现象就更显非凡了。

目前尚不清楚裂伤是否在促进伤口愈合的其他方面发挥某种作用，而非仅仅是动物对伤口及其随后接触大量稀释外部液体所产生的一种不可避免的急性反应。不过，人们很容易做出一种推测性类比，将其与人类皮肤伤口伴随的肿胀联系起来人。 具体而言，“凹陷性水肿”被定义为一种凹陷按压后会留下凹陷，与健康组织形成对比，这表明其机械柔韧性。凹陷性水肿是炎症反应的一部分，在此过程中血管通透性增加，将液体释放到周围组织中，并促进免疫细胞进入。尽管炎症中额外液体的来源是内部的，而非驱动鱼类伤口相关裂隙形成的外部液体，但我们推测，鱼类在受伤过程中所采用的机制可能在哺乳动物体内被改造，以在炎症和损伤的刺激下产生水肿。这些裂隙的另一个有趣作用可能是，通过在皮肤细胞之间开辟通道，促进免疫细胞浸润到伤口部位，从而发挥抗感染和伤口修复的功能。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。