题目：Single-cell analysis of shared signatures and transcriptional diversity during zebrafish development

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37995681/

期刊：Developmental Cell

亮点

l Daniocell：野生型斑马鱼发育的0.5 M-cell，62阶段scRNA-seq图谱

l 与大脑后静脉相关的epas1a+血管周围细胞亚型

l 转录不同的肠平滑肌群

l Best 4+肠细胞与人类的相似性、解剖学和发育轨迹

摘要

在发育过程中，动物会形成具有特定身份、功能和形态的不同细胞群。我们对野生型斑马鱼胚胎发生和早期幼体发育（受精后3至120小时）62个阶段的489,686个细胞进行了转录差异群体图谱绘制。利用这些数据，我们鉴定出了在多种组织及其细胞类型特异性适应中重复使用的有限基因表达程序目录。我们还确定了每个转录状态在发育过程中的持续时间，并发现了意料之外的长期循环细胞群。通过对非骨骼肌和内胚层进行聚焦聚类和转录轨迹分析，我们揭示了研究不足的细胞类型和亚群的转录谱及候选转录调控因子，包括气导管、单个肠道平滑肌层、空间特异性的周细胞亚群，以及新近发现的best4+细胞。为助力更多研究发现，我们通过网站Daniocell公开了这份斑马鱼早期发育的全面转录图谱。

图形摘要

引言

发育生物学的一个核心研究课题是探究不同细胞类型中观察到的形态和功能多样性与转录组多样性之间的关联——即存在哪些转录差异，以及这些差异如何赋予细胞独特的形态和功能？在朝着解答这一问题迈出关键一步的过程中，单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术为绘制转录组不同细胞群的图谱提供了契机以无偏倚的方式绘制发育过程中转录特性不同的细胞群。1-13scRNA-seq 衍生的不同来源的分子细胞类型目录动物研究已发现了此前未被识别的细胞类型或状态2,并实现了跨物种细胞类型转录相似性的详细比较。此外，利用拟时间轨迹及相关方法分析的高分辨率单细胞RNA测序时间序列方法2,推导了基因表达级联反应结合细胞的特化与分化过程，以识别候选的调控因子或功能基因用于下游验证。总体而言，单细胞转录组学方法通过揭示未预期的复杂性、以全转录组水平而非仅通过选定的标记基因对细胞进行表征，以及助力生成和优化假说，对发育生物学中经典的遗传学和胚胎学研究形成了补充。

斑马鱼是研究脊椎动物胚胎发生的强大模型，因为它们的遗传可追溯性、光学透明度、外部受精、高繁殖力和脊椎动物之间的高度保护极大地促进了发育筛选，严格的谱系追踪，详细机械学研究和人类疾病建模。我们展示了斑马鱼发育过程中细胞类型异质性和转录进展的全球观点，包括合子基因组激活到自由游泳、进食的动物后的第一次转录事件。我们从62个紧密间隔的发育阶段生成了489,686个单细胞转录组图谱。我们搜索了在多个组织中重复使用的基因表达程序（GEPs），并确定了在早期发育过程中持续时间最长的转录状态。由于对此类复杂数据的全球分析很少暴露其完整的细胞多样性，我们还在内胚层和非骨骼肌中进行了重点分析。这确定了未表征的细胞亚型，解决了一些神秘细胞类型的表达谱，并使我们能够提出推定的祖细胞、候选调节基因和其中的细胞类型特异性基因表达级联。为了让斑马鱼社区和其他研究人员能够访问这些数据，我们开发了门户网站Daniocell。 

结果

利用单细胞RNA测序对斑马鱼发育进行高时间密度采样

发育过程具有极强的动态性，要理解这些过程，就需要明确基因在细胞类型内部及细胞类型之间表达的时间、顺序和调控机制。为了分析斑马鱼发育过程中野生型分子细胞状态，我们从 TL/AB 斑马鱼胚胎和幼体的 50 个发育阶段（覆盖受精后 14 至 120 小时）构建了单细胞转录组。为了捕捉低丰度细胞群并实现稳定的细胞簇鉴定，我们每 12 小时进行一次高密度采样；为了为研究基因表达动态提供高时间连续性，我们每 2 小时采集少量细胞（图 1A；表 S1）。为了降低成本，我们采用了 MULTI-seq 细胞标记技术35，该技术可在样本收集前为细胞标记条形码，从而允许更高的输入细胞浓度，随后通过计算方法识别并去除由此产生的增多的细胞双胞体。我们将测序读段比对到 GRCz11 基因组上基因组通过劳森实验室斑马鱼转录组注释（v4.3.2）完成注释，该注释整合了Ensembl和Refseq注释信息，包含优化的3'非翻译区（3' UTR）模型，并提出了额外的基因模型。36 我们将这些注释与已发表的3.3–12小时受精后（hpf）野生型斑马鱼单细胞数据2相结合，构建了涵盖62个发育阶段、489,686个细胞的连续单细胞时间序列，时间跨度为3.3–120 hpf（图1A、图1B及图S1A–S1C）。在这些转录组中，我们平均检测到每个细胞8,621个转录本和1,745个基因（图S1D–S1G；表S1）。我们的数据集补充了近期的野生型斑马鱼单细胞图谱，这些图谱采用了不同技术（细胞核vs.完整细胞）、分析的发育时长更短或采样时间点频率更低。2,9,37–40

我们接下来确定了发育过程中的转录细胞类型和细胞状态。我们以半监督的方式迭代聚类单细胞转录组，首先将细胞分配到19种广泛的组织类型，然后通过在每种组织内进行聚类将其分到独立的簇中（图S1H）。这些簇代表转录特征相似的细胞群——其中转录差异可（1）不同的细胞类型，（2）同一细胞类型在不同时间点（由于基因表达在细胞类型内常随发育过程发生变化）或不同解剖位置的状态，或（3）同一细胞类型处于不同细胞状态时（例如细胞对DNA损伤产生转录应答时）。根据细胞高表达和差异表达的基因（详见STAR方法），结合既往研究发表的基因表达模式、ZFIN基因表达数据库⁴¹以及Thisse原位杂交数据集⁴²,⁴³对细胞簇进行注释。综上，共鉴定出521个细胞簇，代表200至300种终末细胞类型、中间细胞类型或细胞状态（表S2）。为实现可视化，将细胞投影至均匀流形逼近与投影（UMAP）空间，并按发育阶段或起源组织进行着色（图1B、图1C、图S1A及图S1H）。该数据集涵盖了构成大多数主要器官的细胞的特化与分化过程，但少数组织的解离效果较差，因此占比不足（心脏、软骨细胞及鱼鳔）。

为了向公众开放这些数据，我们创建了Daniocell网站（https://daniocell.nichd.nih.gov/），该网站包含斑马鱼发育过程中基因表达的预计算信息。每个基因都有专属页面，展示（1）其在各组织和细胞类型中的表达模式（以UMAP和点图形式呈现），并按时间维度解析；（2）在所有细胞及各组织中，与该基因表达模式最相似和最相异的基因。每个细胞群也有专属页面，展示（1）该细胞群中细胞的发育阶段；（2）这些细胞是否处于细胞周期中；（3）每个细胞群内最具特异性且表达量最高的基因。Daniocell旨在助力斑马鱼研究领域的快速研究，同时也可作为本论文的配套参考工具。

图1. 涵盖胚胎发生和早期幼虫发育的高时间分辨率单细胞RNA测序时间进程。(A)收集单细胞转录组的发育阶段（彩色点）。(B 和 C) 单细胞转录组的 UMAP 降维投影，(B) 按发育阶段着色（同 A），(C) 按筛选的主要组织着色。(D) 每个基因的表达模式特异性。根据基因的簇平均表达（对数转换后）的变异系数（CV）和表达各基因的细胞类型数量，通过阈值划分（虚线）对基因进行分类。(E) 不同表达特异性类别的示例基因表达模式。(F) 每个基因的时间维度（x 轴）和细胞类型维度（y 轴）表达变异的比较。另见图 S1 及表 S1–S3。

发育过程中基因表达的时空变化

为探究这些数据的质量并了解发育过程中的全局基因表达模式，我们确定了是否能检测到每个基因的表达，以及其表达模式在发育过程中是恒定的还是变化的。我们在参考转录组中检测到了67%的基因的表达，表达的判定标准为：在(≥22 cells)的22个细胞（我们最小的细胞簇规模）中检测到(≥1)个转录本，且在至少一个细胞簇中每个细胞的平均表达量为(≥0.1)个计数。为检测发育过程中的基因表达变异，我们将细胞簇平均表达量的变异系数（CV）以及表达某一基因的细胞类型或组织数量作为粗略指标。为这些连续指标设定分类阈值具有一定的主观性，但有助于描述整体趋势。16.7%的基因呈泛在表达，其中3.6%的基因在不同细胞簇间的波动极低，这类基因通常被称为“持家基因”，数量相较于成年器官中的研究鉴定结果44,45（图1D；表S3）。21.5%的基因表达模式极为局限，其中11.2%的基因仅在(≤3)细胞类型中表达，其余则仅在4种组织中表达（图1D和1E；表S3）。大多数基因（62%）既不具有特异性也不具有普遍性，在多种细胞类型和组织中呈现多样化表达。极少基因仅在时间维度上存在表达差异而在细胞类型间无差异（图1F），且所有这类基因似乎都是由母体提供且降解速度缓慢的转录本。最后，约一半已注释的转录本缺乏正式的基因名称——包括未命名的cDNA克隆（si:ch211-、si:dkey-、zgc:等）、计算机预测基因（LOC-、CABZ-、BX-、AL-等），以及通过Lawson实验室从头转录组组装鉴定的推定基因（XLOC-）。尽管这类基因的实验支持度较低，未命名的cDNA克隆的检测频率与“已命名”基因相近，且表现出略高的时空变异性（图S1I–S1K）。计算机预测基因和“XLOC-”基因的检测频率则低得多，但一旦被检测到，其时空限制性更强（图S1E–S1K）。综上，尽管单细胞RNA测序（scRNA-seq）无法捕获每个细胞内的全部mRNA，这些数据仍描绘出斑马鱼发育前5天中约三分之二基因组的定量、时间分辨且细胞类型特异性的基因表达模式。此外，该研究强调大多数基因的表达在不同细胞类型中存在差异，凸显了尚待解析的发育基因调控的广度。最后，研究表明许多研究不足的和“未命名”的基因在发育过程中以受限的表达模式表达，值得进一步探究。

利用全基因组方法绘制转录状态的持续时间

发育中的细胞所表达的基因（即其转录状态）在细胞特化和分化过程中会发生显著变化。我们的数据集为利用细胞的完整转录组来确定每种转录状态的持续时间（即具有特定基因表达谱的细胞在发育过程中可存在多久）提供了可能。在本分析中，我们旨在（1）确定发育过程中各转录状态的持续时间，（2）评估每种转录状态下的细胞是否仍在持续分裂，以及（3）结合这些分析来识别在发育过程中持续存在较长时间的细胞增殖群体。

为确定发育状态的持续时间，我们采用了ε近邻方法：我们（1）在缩放后的基因表达空间中定义一个距离来表示转录相似的细胞（ε），（2）找到每个细胞在该ε邻域内的相邻细胞，（3）计算每个细胞与其相邻细胞之间的发育阶段差异（图2A）。更长的“平均阶段“差异”表示一个细胞在发育过程中因持续时间较长而具有转录相似的对应细胞。在该指标中，平均阶段差异为36小时的细胞，其转录相似细胞的平均年龄在36小时更年轻到36小时更年长之间。

在发育过程中，大多数转录状态的持续时间较短，这与发育的动态特性一致（图S2A和S2B）。在前5天内，85%的细胞处于持续时间为(≤24 ~h)的转录状态，96.8%的细胞处于持续时间为(≤48 ~h)的转录状态（图S2C）。为了进行下游分析，我们将细胞分为“短期”和“长期”状态，其中15%的转录状态(present ≥24)被归为长期状态。该阈值的设定兼顾了对异常长时程状态的聚焦，同时覆盖了多个关键阶段，以确保分析结果的可靠性。此外，根据细胞在不同细胞周期阶段相关转录本的表达情况，我们将每个细胞进一步划分为“增殖”或“非增殖”状态（图2B和图S2A-S2D）。

首先，我们通过本分析的视角，研究了从早期祖细胞发育至终末分化过程已有充分文献记载的细胞类型（例如快肌细胞）（图2C）。早期体节成肌细胞（tbx6+）为短期增殖状态；在24小时胚胎期，大多数细胞退出细胞周期，但由于开始成肌细胞融合（mymk+），仍被归为短期细胞；最终，从60小时胚胎期开始，细胞被检测为长期细胞，处于非增殖状态，并终末分化为快肌纤维（myhz1.1+/tnni2b.2+）（图2C）。这一模式在多种细胞类型中均被观察到，包括慢肌细胞（图S2E）、晶状体纤维细胞（图S2F）、血细胞、后表皮细胞以及部分表皮外层细胞。这表明（正如人们所预期的）许多细胞会先退出细胞周期，随后在分化过程中形成稳定的转录组，进而成为长期细胞。

然而，许多其他细胞类型在发育后期退出细胞周期，但仍主要被归为短期转录状态（图2D和图S2G）。例如，肠道细胞（cdx1b+）从受精后约60-72小时开始退出细胞周期，在此过程中它们下调内胚层祖细胞基因（如foxa3），并上调肠上皮细胞（apoa4a和abca1b）以及分泌细胞（scg3、fev）的分化标志物，但几乎没有细胞被归为长期转录状态（图2D）。这与以往的观察结果一致，即斑马鱼的消化器官虽早在受精后76小时就具备生理功能，但在受精后96小时才发育成熟⁴⁶⁻⁴⁸。轴中胚层衍生物（图S2G）、原肾、色素细胞、肝脏和脉管系统中也观察到了类似模式。因此，许多细胞类型在受精后4天（dpf）——本分析的结束节点——停止分裂，但转录组仍在持续变化；尽管此时幼虫通常已需要这些细胞发挥功能，且这些细胞大概率已完成分化。

处于长期转录状态的细胞中有27%仍在进行细胞分裂。其中一些代表了命运指定的转运扩增群体，由于发育不同步，这些群体在较长一段时间内持续增殖（例如成红细胞和表皮细胞）。该类别还包括已知的干细胞群体，如肌肉卫星细胞（图2E）、放射状胶质细胞（图S2H）、米勒胶质细胞（图S2I）、造血干细胞、间充质祖细胞以及部分神经祖细胞（如her4.1+阳性细胞）（图2F）。例如，体节肌源性卫星细胞（pax7a+、meox1+）在两种情况下均被观察到在11至120小时受精后（hpf）期间，细胞处于增殖与非增殖状态；这些细胞最初为短期存在，到48小时受精后（hpf）则转变为长期存在，同时多数细胞仍处于增殖状态。这一转变的特征是meox1基因表达下调，同时pitx3等转录因子（TFs）以及col18a1b等细胞外基质（ECM）基因表达上调（图2E）。该分析表明，这些长期祖细胞群（卫星细胞、放射状胶质细胞、米勒胶质细胞及其他细胞群）在发育过程中保持转录组的一致性（图2F；表S4）。近期斑马鱼神经元发育研究同样发现，15天受精后（dpf）的视网膜祖细胞在转录组上与24小时受精后（hpf）之前的胚胎祖细胞几乎一致⁵¹。本研究发现，多个通常通过单个标记基因进行研究的眼祖细胞群⁵²⁻⁵⁶，即便从全转录组层面分析，也属于长期存在的细胞群，包括：（1）vsx2+/vsx1/notch3+视神经祖细胞，（2）光感受器祖细胞（otx5+/crx+），以及（3）视网膜神经节细胞、视锥双极细胞和少突胶质细胞的祖细胞（hes2.1+/atoh7+/vsx1+/olig2+）（图2F）。研究还进一步识别出特征尚未被充分阐明的长期增殖细胞群，例如(gfra 3^{+} / ret^{+} / msc^{+})标记的头面部肌肉细胞（图2G）、(pou2f3+/sox8b+)标记的味觉上皮细胞（图2H），以及(sp8a+/b+)标记的嗅觉上皮细胞等（图2F；表S4）。这些细胞群可能代表了尚未被发现的干细胞状态或瞬时扩增状态，值得进一步深入研究。

重要的是，一些经典的干细胞群无法被长期识别，因为它们在发育过程中会发生转录组成熟——例如，pax3+ 脊髓前体细胞存在于受精后14至58小时，但被归为短期细胞，因为它们的转录组在这段时间内发生显著变化。insm1a+/her4.1+ 下丘脑前体细胞也表现出类似特征⁵¹。此外，受精后96小时及之后出现的长期转录状态被归为短期状态，因为我们在受精后120小时后缺乏相关测量数据。此外，只要细胞持续处于某一状态，即便单个细胞仅短暂处于该状态，该状态也会被识别为长期状态——例如，细胞快速通过某一状态但持续启动该状态（如体节发生过程）。最后，本分析的具体结果取决于定义转录相似性（ε）和“长期”的参数选择，但整体趋势对参数选择具有稳健性（本文识别的长期状态是发育过程中最持久的状态之一）。

图2.发育过程中转录状态的持续时间。（A）通过ε（ε）邻域识别转录相似细胞的方法示意图，确定与转录相似细胞的发育阶段的相似性，并分为短期或长期状态。 

共享发育基因表达程序的鉴定与组织特异性适应

不同的细胞类型通常拥有共同的细胞状态、特征或特化结构，例如纤毛，它由嗅觉感觉神经元、肾小管细胞等多种细胞产生。而纤毛发生源于一套共同的遗传程序的启动在多种细胞类型中均观察到这一规律，57、58 二者存在诸多共同特征，目前尚不清楚基础的遗传程序是否也具有共通性。全动物时间序列单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据有助于解答这一问题，因为它能支持对所有细胞类型和多个发育阶段的基因表达相关性分析。本研究对斑马鱼发育过程中两个或多个组织共有的基因表达程序（GEPs）进行了分类（图3A）。为找到这些基因表达程序，我们（1）利用5近邻网络对数据进行平滑处理以降低技术噪声⁵⁹，（2）采用模糊C均值（FCM）聚类算法对基因进行分组随着时间推移和不同组织中表达模式相似，60-63 (3) 过滤掉了低质量的基因表达程序（GEPs）以及仅在单一组织中表达的基因表达程序。该方法鉴定出87个共享的基因表达程序，包含8至735个成员基因（平均95个）。我们可以根据单个成员基因明确注释其中79个共享的基因表达程序（图3A；表S5）；目前尚不清楚剩余的8个是技术伪影还是文献中未记载的发育相关基因表达程序。

13个基因表达程序（GEPs）在大多数组织中共享，代表了代谢、细胞周期或细胞骨架组织等基本细胞功能（图3A；表S5）。其余74个经过注释的基因表达程序（GEPs）局限于2种及以上组织中的特定细胞类型，且通常代表与赋予特定细胞特征相关的功能相关基因。例如，为验证我们的方法，我们鉴定出4个与研究最深入的反复出现的细胞特征之一——运动纤毛相关的基因表达程序（GEPs）64,65（图S3A）。

一个反复出现的主题是，许多被定义为模块的过程都有一个核心共享程序，随后会在不同的细胞类型中对其进行修改；我们在专门负责蛋白质吸收的细胞、产生黏液的细胞、上皮细胞中都观察到了这一趋势细胞等。例如，GEP-193 在特化用于蛋白质吸收的细胞（原肾近端小管和肠道溶酶体丰富肠细胞 [LREs]）中表达，并包含与巨蛋白相关的受体介导内吞机制基因（lrp2a/b、cubn、amn 和 dab2），已知这些基因在这些细胞类型中是共有的66,67（图3B）。该模块还鉴定出多个额外的共有的跨膜转运蛋白，表明与巨蛋白相关的内吞作用伴随着更广泛的营养吸收程序（图3B）。GEP-193 还包含几种原肾特异性转运蛋白，表明共有的吸收程序在各个组织中得到了进一步特化（图3B）。LREs 和近端小管还表达 GEP-121，这是溶酶体相关分解酶的模块（图S3B），这表明与巨蛋白相关的内吞作用伴随着肠道以外组织中溶酶体降解能力的相应增强，而此前已在肠道中证实了这一点68。GEP-121 还与其他溶酶体丰富的细胞类型共有，包括黑素细胞、巨噬细胞、小胶质细胞和淋巴内皮细胞，这表明溶酶体降解能力和蛋白质吸收活性是分别调控的，且重复使用的 GEPs 有时会组合以完成更广泛的任务（图S3B）。

同样地，肠道、食管和皮肤内的黏液分泌细胞均表达GEP-94——这是一套黏蛋白合成相关的共同程序，其中包含催化黏蛋白特定位点翻译后修饰的酶，具体包括催化O-糖基化的酶（如修饰黏蛋白主链的GALNTs，以及延长糖链的B3GNTs和B4GNTs）。然而，肠道杯状细胞表现出了细胞类型特异性的适应性变化——其表达的唾液酸转移酶（ST3Gal）数量多于食管或皮肤的黏液分泌细胞（图3C）。这表明斑马鱼杯状细胞的黏蛋白可能拥有更长的唾液酸链，这与大鼠的情况相似；在大鼠中，较长的唾液酸链被认为能够保护肠道黏蛋白免受细菌（原文此处未完整结束）细菌蛋白水解酶。

在上皮细胞类型中，我们观察到五种基因表达程序（GEPs，图3D），其中四种是已知的，包括两种组织特异性上皮基因表达程序（GEP-91和GEP-16）以及两种包含传统上皮标记基因的基因表达程序（GEP-100和GEP-37，如epcam、膜联蛋白、闭合蛋白、紧密连接蛋白和角蛋白）。值得注意的是，部分上皮细胞类型（包括晶状体、肝脏和视网膜色素上皮细胞）中并未包含“传统”上皮标记基因。然而，我们意外地发现了一种在所有上皮细胞类型中均存在的基因表达程序GEP-106（包括表达传统标记基因和不表达传统标记基因的上皮细胞）。该程序包含脂联素受体2（adipor2）、酸性磷酸化糖蛋白簇蛋白（tuft1a）、主要组织相容性复合体I类抗原（mhc1zba）、β2-微球蛋白（b2ml）、烯醇化酶超家族成员1（enosf1）以及碱性亮氨酸拉链结构域转录因子（nfe2l2a）（图3D）。这确定了一组在所有上皮细胞中均表达的基因，但其功能目前尚不明确，值得未来进一步研究。

总体而言，这些研究结果表明，尽管在发育过程中多种组织会通过重复使用基因表达程序来形成部分细胞特征，但这类共享的基因表达程序种类实际上相对有限。在大多数情况下，这些共享的程序会伴随细胞类型特异性的细化调整，从而为每种不同的细胞类型赋予专属特性。

图3. 重复利用的基因表达程序的鉴定。（A）二元热图展示了多种组织中细胞类型共有的基因表达程序（“GEPs”，x轴标注了部分注释信息）的表达结构域。表S5包含完整的GEP注释信息。（B）肠道富含溶酶体的肠细胞（LREs）与原肾近曲小管（PCT）和近端直小管（PST）共有的巨蛋白相关基因及溶质载体（SLC）转运蛋白基因的基因表达点图。SLC转运蛋白基因根据其所属的家族/类别进行着色。（C）五种上皮GEPs的高载量基因点图：一种为所有上皮细胞共有，两种包含经典上皮基因，另外两种为组织特异性基因。x轴：具有上皮特征的细胞类型，以及作为非上皮对照的肌肉细胞。（D）与黏蛋白O-糖基化相关的模块GEP-94的共有成员和组织特异性成员点图。RPE：视网膜色素上皮；EVL：被覆层。另见图S3和表S5。 

对斑马鱼非骨骼肌的聚焦分析鉴定出独特的周细胞亚群

斑马鱼发育过程中存在极其丰富的细胞类型解剖多样性，在这一全动物数据集内进行的迭代聚类分析也揭示了相似的转录组多样性。然而，分子分类与解剖分类之间并非完全对应。因此，我们对非骨骼肌细胞和内胚层衍生物开展了针对性分析，以进一步探究其转录组多样性，并更好地将其与功能及解剖分类相匹配。

非骨骼肌包括平滑肌细胞和周细胞等多种细胞类型。这些细胞为腔道器官提供结构和功能支持，包括消化系统（内脏平滑肌）、大血管（血管平滑肌）和毛细血管（周细胞）。70-73 然而，平滑肌细胞和周细胞的转录异质性、空间分布以及发育调控因子仍是研究领域是多种生物中积极研究的课题。为了进一步为了探究斑马鱼中这些神秘的组织，我们对3866个非骨骼肌细胞进行了迭代重聚类（图4A和图S4A）。我们的细胞群包含2个心肌细胞群（C14和C17）、肝星状细胞（C18），以及(2 pdgfra)这一我们无法注释的细胞群（表达lyve1a或cxcl11，对应C5和C19）。我们依据传统平滑肌标志物acta2和tagln的表达情况鉴定出了平滑肌细胞，其中包含5个血管平滑肌细胞群（C2、C11、C12、C15和C21）。此外，基于传统内脏平滑肌标志物结蛋白-b（desmb）以及平滑肌蛋白-a和-b（smtna和smtnb）的表达⁷⁶,⁷⁷，我们鉴定出3个内脏平滑肌细胞群（C8、C10和C13）（图4B），还发现了3个仅表达1-2种传统内脏平滑肌标志物的潜在内脏平滑肌细胞群（C16、C22和C23）（图4A和图S4B）。最后，我们鉴定出3个周细胞群（C4、C9和C20）（图4A、图4C和图S4C）以及1个推定的肌成纤维细胞群（C3）（图S4D-图S4G）。血管平滑肌细胞的特征已相对明确；在本节中，我们将重点分析不同的周细胞群，并在下一节中回到内脏平滑肌细胞的讨论。

研究人员根据此前已报道的小鼠和斑马鱼周细胞标记基因——abcc9、pdgfrb，以及新发现的斑马鱼血管周围细胞中周细胞特异性标记基因ndufa4l2，对周细胞簇进行了鉴定（图4C、图4D及图S4。已有研究在小鼠中证实存在转录特征不同的周细胞亚群，但斑马鱼中尚未发现此类现象。本研究在斑马鱼周细胞中观察到3种不同的转录状态或亚群：周细胞-0无任何特异性标记，另外2种亚群各拥有超过10个特异性标记（图S4C）。例如，周细胞-1表达肾上腺髓质素（adma），周细胞-2则表达促血管生成因子epas1[80]以及esama等白细胞外渗相关基因（图4C至图4。不同周细胞亚群的传统周细胞和平滑肌细胞基因表达模式存在差异：周细胞-1表达pdgfra（该基因有时被视为成纤维细胞标记），而传统平滑肌细胞标记基因tagln仅在周细胞-0中表达，周细胞-1和周细胞-2均不表达该基因（图4C）。有少量细胞同时表达周细胞-1和周细胞-2的标记基因，这表明这两种亚群关系密切，或代表非排他性的转录状态。为排除这些亚群是细胞解离不彻底导致的人为假象的可能性，研究人员对周细胞0细胞与其他细胞进行计算模拟得到的双细胞组合，从未重现出周细胞1或周细胞2的表达谱（图S5A–S5C）。周细胞可能起源于源自神经嵴和中胚层来源82,83；1型周细胞且-2个簇包含表达foxc1a/b和foxf2b的细胞，这些基因通常被视为源自颅神经嵴的血管周细胞标志物84–89（图S5D）。

为进一步表征周细胞2群体，我们对epas1a（周细胞2特异性标志物）以及ndufa4l2a和abcc9（通用周细胞标志物）进行了原位杂交实验。我们在后脑的脑后静脉周围观察到了epas1a+/ndufa4l2a+和epas1a+/abcc9+阳性细胞（图4F-4H及S5E-S5G，箭头），但后脑其他血管周围的ndufa4l2a+阳性细胞并不表达epas1a（图4H，箭头头）。值得注意的是，ndufa4l2a+/epas1a+阳性细胞通常并非沿血管分布，但在许多斑马鱼的相同位置均能观察到这类细胞（图4G、4H、S5E及S5F，箭头）。当观察到多个空间邻近的ndufa4l2a+/epas1a+阳性细胞时，通常至少有一个细胞与血管分离（图4G、4I、S5E及S5F）。斑马鱼头部的其他区域，包括前脑、眼睛和咽弓，虽含有大量ndufa4l2a+阳性细胞，但几乎不存在epas1a+阳性细胞，这表明周细胞2群体在空间上仅限于后脑区域（图4J-4M及S5H-S5J）。这与包括哺乳动物在内的其他生物的研究结果一致，即转录组学特征不同的周细胞亚群与特定组织相关联⁷⁹。综上，这些研究结果表明斑马鱼存在多个具有周细胞转录特征的不同亚群，且这些亚群呈现出空间分布上的分离状态。

图4.非骨骼肌亚聚类识别不同的周细胞亚型。（A）3,866个非骨骼肌细胞的UMAP投影，按簇编号和颜色编码。进一步分析的人群用虚线圆圈（周细胞，图4）和框（平滑肌，图5）突出显示。（B）与血管（vaSMCs）和内脏SMCs（viSMCs）相比，选择差异表达的周细胞特异性标记（x轴）。（C）与血管SMCs（x轴，P0-P2）和肌成纤维细胞（x轴，vaSMCs）相比，三个周细胞簇（x轴，P0-P2）和肌成纤维细胞之间选择差异表达的基因（y轴）。表达是自然对数转化的。其他标记见图S4C。（D）周细胞标记基因的表达（自然对数）。（E和E）adma*（E）和epas 1a*（E）cels在三个周细胞簇（C9、C20和C4）上的比例分别((n = 172)、79和27个细胞）。

斑马鱼肠道平滑肌细胞类型的分子特征

肠道被平滑肌环绕，平滑肌调控着肠道的形态发生90、干细胞维持91、肠神经系统模式形成以及胃肠动力。肠道平滑肌（内脏平滑肌细胞的一部分）呈双层排列，一层为纵行排列，另一层为环行排列77。在人类、小鼠和斑马鱼中，已有可标记这两层平滑肌细胞的肠道平滑肌细胞标志物的相关报道；然而，据我们所知，能够区分环行和纵行平滑肌细胞的标志物至今尚未被发现。我们在斑马鱼中发现了两个具有不同标志物的desmb+/smtnb+肠道平滑肌细胞群。C8群表达kcnk18、fsta、foxf2a、gucy1a1、npnt，C10群表达il13ra2、tesca、rgs2、fhl3b（图4A、图5A和图5B）。对C8/C10标志物il13ra2和fsta/kcnk18进行原位杂交实验发现，这些标志物与标记平滑肌的acta2表达重叠，但彼此之间无重叠，这证实了这些细胞群是不同的群体（图5C和图S6A–S6E）。il13ra2+细胞似乎沿着肠道的长度方向排列同时，fsta+/kcnk18+细胞呈现垂直于肠道的取向（图5C和图S6A-S6E）。在横截面观察时，acta2:mCherry信号在肠道周围形成环状；fsta+细胞核沿环分布，既存在于环内，也与环的内表面接触（图5D，箭头），而il13ra2+细胞核则主要与环的外表面接触（图5D，箭头头），这表明这些细胞核属于不同的细胞层。此外，F0嵌合体Tg(kcnk18 1.8kb:sfGFP)胚胎中的GFP阳性细胞证实，C8细胞（fsta+/kcnk18+）垂直于肠道排列，在横截面观察时呈环形包裹肠道（图5E、图5F、图S6F和图S6G）。基于这些结果，我们提出C8（fsta+/kcnk18+）构成肠道平滑肌内层环行肌细胞，而C10（il13ra2+）推测代表外层纵行肌细胞（图5G），其转录差异目前尚不完全明确。

为了确定伴随这两种平滑肌细胞（SMC）命运获得过程的转录事件，我们使用 URD 重建了发育轨迹²。我们重点关注推测为非神经嵴来源的平滑肌（acta2+）群体（foxc1a/b– 和 prrx1a/b–），其中包括三个内脏平滑肌细胞群体、两个血管平滑肌细胞群体以及推测的成肌纤维细胞。这些轨迹覆盖了从受精后3天（3 dpf）的祖细胞到受精后5天（5 dpf）的不同细胞簇，并预测了两种肠道平滑肌细胞之间存在密切关联（图5H）。我们检测了沿这两条肠道平滑肌细胞轨迹分支的基因表达动态，鉴定出可能对这两种细胞群体的特化至关重要的早期转录因子（图5I、图S6I–S6K、图S7；表S6）。两种肠道平滑肌细胞群体共享多个转录因子，包括foxf1、foxp4、meis2a和pbx3b（图S6I），尽管这些因子在动物体内均有广泛表达。然而，我们发现foxq1a、foxq1b、foxf2a和tcf21这些转录因子的表达仅限于呈环形的fsta/kcnk18a+平滑肌细胞轨迹，而il13ra2+平滑肌细胞（推测为纵向上的）则表达cremb、itpr1a和tead3a（图5I、图S6J、图S6K）。值得注意的是，尽管这些转录因子表达广泛，以往在小鼠⁹⁷和非洲爪蟾⁹⁸中的研究已证实foxf1和foxf2是肠道平滑肌细胞整体分化所必需的。综上，这些结果揭示了这两层肠道平滑肌之间的转录差异，这些差异可能是其已被报道的形态学特征的基础，或是对这些形态学特征的响应。生物物理差异。

图5.肠平滑肌细胞（SMC）亚型中不同的基因表达。（A）肠SMC簇之间的顶部差异表达基因（y轴）（x轴）。表达是自然对数转化的。（B-D）常见（acta2和cald1b）和差异表达（il13ra2、tesca、fsta和kcnk18）肠SMC标志物的表达（自然对数）。

气动导管及best4+细胞的分子特征与候选调控因子

与非骨骼肌类似，我们对内胚层衍生物的细胞异质性进行了表征，并推断了内胚层细胞特化背后的转录事件斑马鱼发育过程中的细胞类型。我们对12592个内胚层细胞进行了迭代亚聚类和注释（图6A和图S8A），并鉴定了每个聚类表达的转录因子（图S8B）。异质性的主要来源在不同的内胚层组织中存在差异：主要是胰腺内不同的细胞类型、肝脏的代谢特化（例如，胆固醇生物合成特化的msmo1+肝细胞37，以及肠道的前后位置和不同细胞类型）。

在内胚层衍生物中，转录特征研究最少的是那些让鱼类调节浮力的结构：鱼鳔以及连接鱼鳔与食管的气导管。我们鉴定出一个跨越2–5天胚胎期（dpf）的细胞簇（C32），该簇表达了此前有研究报道在气导管和鱼鳔中均存在的基因（anxa5b、hb9/mnx1、ihha、shha和sox2）（图6B和6C），但不表达此前仅报道在鱼鳔中存在的基因（acta2、elovl1a、fgf10、has2、hprt1l、ptch1、ptch2和slc16a3b）⁴²,⁹⁹,¹⁰⁰，这表明该细胞簇代表气导管。差异基因表达分析显示，与其他内胚层衍生物相比，表面活性物质相关蛋白ba（sftpba）和转录因子（TF）sim1b在C32细胞簇中呈特异性表达（图6B和6C，黄色箭头）。尽管特异性稍弱，但气导管细胞还表达了另外几种转录因子（arnt2、sim2和sim2.1），这些转录因子可能对气导管的细胞命运特化至关重要（图6C）。RNA原位杂交实验证实，sftpba和sim1b仅在气导管和未膨胀的前鱼鳔芽中表达（图6D）。使用鱼鳔特异性标志物slc16a3b进行共染色实验证实，在5天和7天胚胎期，sftpba的表达仅局限于气导管（图6E和图S8C）。综上，我们鉴定出了气导管的特异性分子标志物，尽管其转录组特征至今仍未被阐明，但气导管在形态上至少一个世纪以来的认知。

在肠道内，除了三种常规的肠上皮细胞群外，我们还检测到了两种表达肠上皮细胞标志物的非经典细胞群（图6A），其中包括专门负责蛋白质吸收的LREs。另一群细胞（C16）与人类best4+细胞相似（图6F、图6G00），这是一种近期被发现的细胞类型，在发炎的肠道中其数量可能会减少。另有两个研究团队近期也在斑马鱼6天龄（dpf）幼鱼和成体肠道中鉴定出了这类细8 而我们发现该细胞最早出现在斑马鱼3天龄幼鱼的肠道中（图S8A），此时正处于其初步分化阶段。RNA原位杂交技术证实，best4+细胞广泛分布于斑马鱼肠道各处（图6H），与通用肠道标志物cdx1b的表达区域重叠也证明了这一点（图S8D–S8D00）。前部的best4+细胞共表达otop2（图6G、图6H，黄色箭头），而otop2在斑马鱼肠道后部的一个区域也有表达，该区域大概率是LREs（图6G0、图6H，白色箭头）。这一发现与近期针对人类的单细胞研究结果一致，这些研究指出otop2在best4+细胞中也有表达。仅存在于肠道的特定区域，不过该区域在人类中位于后方（结肠），而在斑马鱼中位于前方。

随后我们更广泛地分析了斑马鱼best4+细胞的基因表达情况。这类细胞既表达吸收细胞特征基因（318个），也表达分泌细胞特征基因（288个），但在早期发育阶段，分泌相关基因的表达水平更高（图S9A–S9D）。总体而言，best4+细胞在转录层面具有显著独特性——在肠道细胞中，它们仅表达36个仅存在于该细胞类型的基因。在所有标记任意肠道群体或类别（分泌/吸收）的基因中，与人类结肠中的所有其他细胞类型相比，斑马鱼best4+细胞与人类best4+细胞的相似性最高（图7A）。这种相似性程度与其他斑马鱼-人类同源细胞类型相当，包括杯状细胞、肠内分泌细胞（EECs）、簇样细胞、成熟肠上皮细胞以及吸收性祖细胞（图7A）。斑马鱼与人类best4+细胞共有的特异性标志物包括best4、otop2、cftr、碳酸酐酶（ca2和ca4b，而非ca4/7）、notch2、her9和gucy2c（图6F、7B、7C、S9E和S9F）。103,108 此外，我们发现斑马鱼best4+细胞也像人类best4+细胞一样，高表达激素及激素受体，不过其信号分子组成有所不同；斑马鱼best4+细胞表达胆囊收缩素激素（cckb）以及促泌素受体（sctr）、前列腺素E受体4（ptger4c）、肾上腺素能受体（adra2a）和速激肽受体2（tacr2）等激素受体（图6F、7B、S9E和S9F）。

图6. 内胚层衍生物的亚聚类实现了气导管和Best4+细胞的分子特征分析。(A)12592个内胚层细胞的UMAP投影，按聚类进行颜色编码和编号。(B) 特定肺导管标志物（sftpba和sim1b）和高表达肺导管标志物（mnx1和ihha）的表达量（自然对数）。(C) 与其他内胚层衍生物（横轴）相比，排名前列的差异表达肺导管标志物（纵轴）。表达量经自然对数转换。

尽管目前已在多种生物中发现best4+细胞和LREs，但调控其特化的转录事件仍未知。为确定候选调控因子，我们利用URD重建了肠道细胞的发育轨迹，并鉴定出在朝向这两种细胞群的轨迹上表达呈动态变化的转录因子（图7D）²。我们观察到细胞分裂为两个祖细胞群（36–60小时胚胎期），一个与吸收性肠上皮细胞（EC-1、EC-2、EC-3）相关，另一个与best4+细胞及分泌细胞（肠内分泌细胞和杯状细胞）相关（图7D，箭头）。在与best4+细胞相关的祖细胞中，我们检测到RANKL受体tnfrsf11a以及转录因子atoh1b、ascl1a、sox4a和sox4b的表达（图7E、7F）。随着best4+细胞逐渐分化，这些因子的表达水平下降，同时Notch信号通路被激活（notch2以及Notch响应基因her2和her15.1表达上调）（图7E、图S9G）。随后，best4+细胞表达多种细胞类型特异性转录因子（包括dacha、meis1b和pbx3a），接着表达一系列细胞类型特异性分化标志物，如best4、cftr和otop2（图7E、图S9G、图S10A、图S10B；表S6）。原位杂交实验证实部分best4+细胞表达pbx3a（图7G–7H）。在其他研究体系中，Pbx3与Meis1可协同激活转录¹⁰⁹,¹¹⁰，我们推测pbx3a和meis1b也可能在best4+细胞中协同发挥作用。

LRE 与其他肠上皮细胞相关的祖细胞群相连。这些祖细胞的转录状态差异较小，但我们观察到早期肠道转录因子 foxd2 和 satb2 的表达最初出现下降（图 7E、7I 和 S9H）。随后，多个转录因子以多波次的方式上调表达（首先是 foxd2 和 satb2 的重新上调，随后是 cdx1a 和 skilb，接着是 mafa 和 tfeb，再之后是 mafbb 和 atoh1b）（图 7E、7I 和 S9H）。LRE 功能特征基因 67,111（cubn、dab2、amn 和 lgmn）从 mafa 和 tfeb 开始同步上调（图 7I 和 S9H）。在该细胞类型的特化过程中，瞬时表达的基因并不多。在肠道细胞中，mafbb 和 tfeb 的表达是 LRE 特有的。tfeb 调控溶酶体的生物发生¹¹²,¹¹³——这是这些细胞最具特征性的特征细胞——这表明这些其他转录因子也可能参与长链非编码RNA元件的特化或其功能特化。

总之，我们对斑马鱼发育过程中的内胚层衍生物进行了分类，描述了斑马鱼中分子特性尚未明确的气导管以及包括best4+细胞在内的多个非典型肠道群体中的基因表达情况。我们确定了斑马鱼与人类best4+细胞的分子相似性，并通过轨迹分析方法鉴定出潜在的祖细胞群体，以及可能对这些肠道群体的特化或分化起重要作用的候选发育调控因子。

图7. 斑马鱼 best4+ 细胞的转录轨迹分析及与人类对应细胞的比较。(A) 基于所有肠道细胞类型的标记，成人结肠（x 轴）和幼虫斑马鱼肠道细胞类型之间的转录组相关性。 (B) 与成人结肠和小肠（x 轴，任一组织中的最高富集度）和幼虫斑马鱼肠（y 轴）中的其他肠细胞相比，best4+ 细胞中基因的平均对数富集度。黑色基因是共享的，蓝色是人类特有的，红色是斑马鱼特有的 best4+ 细胞标记。图 S9 包含与结肠和小肠分别的比较。(C) 人结肠、103 人小肠、108 和斑马鱼幼虫肠中 best4+ 细胞的整个转录组之间共享的基因数量。 (D 和 E) 斑马鱼肠细胞 URD 推断转录轨迹的力导向布局，按发育阶段 (D) 和基因表达 (E) 着色。 (F) 沿着 best4+ 细胞级联的选定基因的时间动态。 (G–H”) best4 和候选转录调节因子 pbx3a 在 5 dpf 斑马鱼肠道中的 RNA 原位杂交。比例尺：100 μm。 (I) 沿后 LRE 级联的选定基因的时间动态。在(F)和(I)中，x轴：伪时间，y轴：缩放表达式。另请参见图 S9 和 S10 以及表 S6。

讨论

要全面了解存在哪些分子细胞类型/状态以及每种细胞表达哪些基因，极大地有助于理解不同细胞类型的特化与分化过程。本研究以高时间分辨率绘制了斑马鱼发育过程中的基因表达图谱。在全转录组水平上对不同细胞类型、组织和发育时间点进行比较，我们构建了发育重复使用的基因表达程序（GEPs）目录，并识别出存在时间异常长的分裂细胞群。此外，这些数据还发现了未被描述过的或罕见的细胞类型/亚型，对已知标记基因较少的组织实现了分子水平的特征解析，使我们能够就细胞功能和细胞特化的关键调控因子提出可验证的假说。我们期待其他研究人员对这些数据进行的再分析将带来更多新发现。

聚焦分析确定了分子特性未被阐明的细胞亚型（包括气导管和肠道平滑肌层）的基因表达谱，这些基因表达谱为解析这些组织的发育和功能提供了所需的分子靶点。例如，在气导管中，我们鉴定出可能调控其发育的细胞类型特异性转录因子（sim1b 和 sim2）以及表面活性物质蛋白 Sftpb，这一机制可防止人肺部终末气道塌陷¹¹⁴,¹¹⁵。研究还检测到其他与肺表面活性物质代谢功能障碍相关的基因（如abca3）¹¹⁶，以及与肺部疾病相关的基因（包括ceacam1、cd151和abca12）的表达，这表明气导管可作为研究这些疾病并开发治疗方法的有价值模型。同样，本研究还鉴定出肠道平滑肌细胞间的转录差异，包括环形平滑肌中的kcnk18/fsta以及推测为纵行平滑肌中的il13ra2。有趣的是，许多仅在环形平滑肌中特异性表达的转录因子（foxq1a、foxq1b和tcf21）可通过拮抗Foxf和心肌素通路的活性来抑制哺乳动物平滑肌分化⁹⁷，这一现象在我们研究的两种肠道平滑肌细胞类型中均有观察到。这为环形平滑肌分化可能涉及抑制其他平滑肌命运（包括纵行平滑肌）提供了有趣的可能性，不过这些转录因子的下游靶点及其功能作用仍有待验证。目前已明确调控肠道平滑肌层形成的发育信号⁹⁰，而我们对不同下游基因表达的鉴定将为通过基因操作来研究这些信号的功能作用、发育起源及其调控机制提供基础。

针对部分细胞类型，聚焦分析揭示了具有潜在功能意义的分子异质性。例如，本研究鉴定出多种转录特征不同的斑马鱼周细胞亚群。我们观察到2型周细胞与特定的后脑血管相关，这表明斑马鱼周细胞也可能表现出组织依赖性的转录差异，这与哺乳动物周细胞在大脑和肺部表达不同跨膜转运蛋白的研究结果一致。79 值得注意的是，部分亚型特异性基因在啮齿动物周细胞中表达，这暗示了潜在的功能差异。例如，肽激素不对称二甲基精氨酸是1型周细胞的标志物，同时也由大鼠脑周细胞产生，在大鼠体内它能触发相关血管的血管舒张。同样，2型周细胞标志物（内皮PAS结构域蛋白1a和内皮细胞粘附分子）在小鼠周细胞中表达。内皮细胞粘附分子与白细胞外渗相关；由于这些周细胞并非始终与血管直接接触，周细胞-2的表达或许有助于形成特定的形态或迁移特性。未来需要开展长期成像实验来确定这些独特的转录谱是代表周细胞稳定的身份特征，还是特定解剖位置周细胞会进入并退出的瞬时细胞状态，同时也需要反向遗传学方法来验证它们是否执行不同的功能。

本研究还重构了描述best4+细胞发育轨迹的路径，这类细胞是近期在人类，且在斑马鱼的不同发育阶段也有此发68,104,105。best4+细胞数量减少溃疡性结肠炎患者的细胞以及结直肠中环状鸟苷单磷酸（cGMP）信号的紊乱癌症相关研究14、103、120表明BEST4+细胞在人类疾病中可能具有重要作用，人类疾病中，小鼠体内不存在best4+细胞，因此斑马鱼为研究这类细胞的功能和发育提供了绝佳的研究模型。人类与斑马鱼的best4+细胞在转录组上具有相似性，提示二者可能存在潜在的功能同源性。两类物种的best4+细胞均表达BEST4和OTOP2离子通道，这可能使这些细胞能够响应管腔pH值变化]；同时表达CFTR和碳酸酐酶，这两种基因可能调控肠道内离子或液体稳态；还表达ADRA2A，这表明该基因在两种生物的肠道蠕动中均可能发挥作用。人类best4+细胞是关键激素尿鸟苷素/GUCA2B的来源，该激素是一种鸟苷酸环化酶激动肽，可通过升高cGMP水平来调节饱腹感及肠道张力[125]。尽管斑马鱼肠道不表达尿鸟苷素的同源基因，但其best4+细胞却能产生肠道激素胆囊收缩素，该激素也可通过激活cGMP生成，部分调控饱腹感、肠道pH值和肠道蠕动。这表明，响应pH变化或其他信号而产生cGMP可能是一种保守的特征，只是人类和斑马鱼通过不同的方式实现这一过程。此外，人类肠道不同区域的best4+细胞展现出独特的基因表达谱，而对OTOP2的原位杂交实验显示，斑马鱼的best4+细胞同样存在区域化分布的特征。阐明best4+细胞的发育与功能，对于开发靶向调控这类细胞的治疗策略至关重要。因此，本研究鉴定了分化为best4+细胞的推定祖细胞状态的分子特征（该祖细胞为atoh1b+/ascl1a+/sox4a/b+/tnfrsf11a+），筛选出潜在的发育信号（Notch2），确定了推定的转录调控因子（如dacha、pbx3a、meis1b），并识别了best4+细胞的细胞类型特异性标志物。这些发现为开展相关实验、构建遗传工具以操控这些细胞、解析其基因调控网络（GRN）奠定了基础，有助于深入理解它们在肠道稳态维持中的作用，以及与邻近细胞类型间的细胞间通讯机制。

单细胞基因组学已在发育生物学家群体中得到广泛应用，相关数据与斑马鱼单细胞RNA测序的互补数据集相结合。这些数据集均对完整个体进行了测序，但每项研究聚焦的组织或发育过程各不相同，例如早期胚胎与轴中胚层²、早期胚胎与咽弓⁹、肠道与非骨骼肌（本研究）、肝脏与脊索³⁷、索旁软骨与脑神经节，以及神经肌肉前体细胞。这凸显了对这些数据进行复用和再分析以获取更多新发现的潜力，也表明了让这些数据易于获取、便于分析的必要性。为此，我们开发了Daniocell工具，帮助研究人员快速浏览我们的数据集，以解答简单的研究问题。

我们预计这些数据能够助力构建模型或探究发育机制的大规模研究。例如，我们设想将标签转移方法结合我们的注释使用将加速未来斑马鱼单细胞RNA测序数据的注释。因此，我们鼓励其他人通过Daniocell提交对注释的改进。与通过转基因或CRISPR条形码标记的数据进行整合技术可将谱系信息归因于每个细胞种群并帮助理解其发育起源。本研究中，我们根据候选调控因子在不同细胞类型中的表达时机对其进行预测，但未分析其潜在靶基因或顺式调控元件。未来，这些数据还为解析脊椎动物发育背后的基因调控网络（GRN）提供了框架，尤其是结合单细胞染色质可及性分析等方法时计算性基因调控网络推断方法。值得庆幸的是，通量越来越高的CRISPR筛选技术意味着对基因调控网络（GRN）预测进行功能测试也变得愈发容易。随着斑马鱼研究共同体内部的合作不断加强，能够共同整合多个实验室采用不同技术、不同发育阶段以及不同转基因和突变体品系所产生的结果，使其更具广泛适用性，这些方法将取得最大成效。

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苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。