题目：Humanized zebrafish as a tractable tool for in vivo evaluation of pro-myelinating drugs

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36126653/

期刊：Cell Chemical Biology

研究亮点

l 少突胶质细胞中Gpr17的表达与功能在斑马鱼到哺乳动物中均具有保守性

l 人类（h）-GPR17 在体内环境中可有效替代斑马鱼同源物

l 在GPR17人源化斑马鱼中，一种h-GPR17拮抗剂可模拟gpr17敲除鱼的表型

l GPR17人源化斑马鱼用于促髓鞘再生药物发现的原理验证

摘要

通过促进髓鞘再生来发挥神经保护和轴突存活作用的疗法，是预防多发性硬化症患者残疾进展的未满足需求。众多潜在有益化合物均来自表型筛选，但在临床试验中均以失败告终。显然，目前基于细胞和动物的疾病模型难以有效预测有效的治疗方案，这表明需要新的实验方法。本研究探讨了人源化斑马鱼的实验价值，旨在通过特异性抑制GPR17来筛选促髓鞘再生化合物。研究人员利用生化和成像技术，可视化观察了斑马鱼gpr17（zf-gpr17）在少突胶质细胞发育不同阶段的表达，证实了其在斑马鱼与哺乳动物之间的物种保守性表达。同时，通过基因敲除和回补实验，验证了斑马鱼Gpr17（zf-Gpr17）的物种保守性功能。最后，借助GPR17人源化斑马鱼模型，为通过靶向抑制人源GPR17来分析化合物的体内作用提供了原理验证。研究人员认为，GPR17人源化斑马鱼将显著推动有效促髓鞘生成药物疗法的研发进程。

图形摘要

引言

髓磷脂是由成熟少突胶质细胞形成的保护性脂质鞘，包裹并绝缘神经元轴突，从而确保动作电位的快速传导（Marinelli 等人，2016）。髓磷脂受损会导致严重的神经功能缺损（Fields，2008；Shukla 等人，2021），也是多发性硬化症（MS）等脱髓鞘疾病的标志性特征（Filippi 等人，2018），在这类疾病中，髓磷脂鞘会被自身反应性B细胞和T细胞破坏。这一破坏过程之后，中枢神经系统（CNS）会启动内源性修复机制以修复受损的髓磷脂鞘，这一过程被称为髓鞘再生（Fancy 等人，2011；Dendrou 等人，2015）。目前多发性硬化症的治疗方法通常以免疫功能为靶点，以减轻中枢神经系统炎症，从而降低疾病严重程度、减缓疾病进展并减少复发率，这些都是多发性硬化症的典型临床特征（Lubetzki 等人，2020）。多发性硬化症治疗的另一个方向是促进髓磷脂再生，进而提高轴突存活率并发挥神经保护作用（Franklin 和 Ffrench-Constant，2017；Bebo 等人，2022）。因此，开发能够促进髓鞘再生的新型治疗剂已成为研究的热点领域。表型筛选已发现大量潜在的促髓鞘再生化合物，包括重新利用的药物和新研发的药物，这些化合物均能促进少突胶质细胞的分化与成熟（Lubetzki 等人，2020；Balestri 等人，2021）。然而，其中仅有少数最终进入了2期临床试验，且只有一种药物——组胺H1受体拮抗剂氯马斯汀，在视神经炎（多发性硬化症的常见症状）患者身上展现出了一定的可喜成果（Green 等人，2017）。因此，目前获批用于多发性硬化症的疾病修正治疗药物中，没有任何一种是专门为促进髓鞘再生而设计的（Balashov，2020），而旨在阻止残疾进展的多发性硬化症治疗药物研发，也仍是亟待满足的关键需求（Lubetzki 等人，2020）。

表型药物研发存在固有挑战，这些挑战通常与针对未知蛋白质靶点和/或作用机制不明的化合物筛选有关，也与基于细胞的检测方法无法捕捉小分子对少突胶质细胞生物学影响的应用问题相关。以及髓鞘形成（莫法特等人，2017年）。作为一种解决方案，可采用全生物测定法，但能深入探究活性与毒性的典型啮齿动物模型无法进行大规模筛选。基于以上所有原因，一项旨在促进髓鞘再生的成功药物研发项目，理想情况下应结合（1）对具有疾病修饰作用的特定蛋白靶点的认知，以及（2）全生物筛选法，以解决体内生理学的复杂性以及引发脱髓鞘疾病的动态相互作用问题。此外，一个需要考虑的关键要点是，实验药物需在不同动物物种中发挥作用，因为它们最终需能促进人类少突胶质细胞的成熟过程。遗憾的是，从啮齿动物多发性硬化症研究中得出的潜在药物在临床试验中的成功率极低，这表明了该方法的局限性（贝克与阿莫尔，2015年）。因此，研究人员正采用更新、更具“人源化”的动物模型来筛选具有促髓鞘形成作用的新型化合物，这类模型会引入并表达此前被鉴定为多发性硬化症治疗干预靶点的人类基因（菲泽等人，2006年；本-努恩等人，2014年；拉斯曼与布拉德尔，2017年）。

斑马鱼（斑马 Danio）已成为研究发育过程和药物测试的热门脊椎动物模型（Taylor 等人，2010；Chen 等人，2020；Patton 等人，2021）。具体而言，斑马鱼幼虫已被确立用于少突胶质细胞生物学和髓鞘形成的体内研究（Preston 和 Macklin，2015；Ackerman 和 Monk，2016；Czopka，2016），同时也用于促髓鞘形成化合物的表型筛选（Buckley 等人，2010；Early 等人，2018）。本研究利用斑马鱼的实验和遗传优势，构建了人源化斑马鱼模型，作为原理验证，以助力促髓鞘再生化合物的筛选。我们选择 GPR17 作为蛋白靶点，它是一种孤儿 G 蛋白偶联受体（GPCR），也是调控少突胶质细胞分化时机的信号程序的重要组成部分。GPR17 是少突胶质细胞成熟的抑制剂，调控未成熟的前髓鞘形成少突胶质细胞与成熟的髓鞘形成少突胶质细胞之间的转化（Chen 等人，2009；Simon 等人，2016；Merten 等人，2018）。在多发性硬化症（MS）患者的活性白质斑块以及药物和损伤诱导脱髓鞘的小鼠模型中，GPR17 均高度富集（Chen 等人，2009；Ou 等人，2016；Wang 等人，2020）。小鼠中 Gpr17 基因的敲除不仅能抵抗溶血卵磷脂诱导的脱髓鞘，还能加速溶血卵磷脂损伤后的髓鞘再生（Ou 等人，2016）。因此，学界普遍认为 GPR17 在多发性硬化症中发挥关键作用，作为少突胶质细胞分化抑制剂损害髓鞘再生过程，而对其进行药理学抑制有望促进脱髓鞘轴突的髓鞘再生（Mogha 等人，2016；Merten 等人，2018；Dziedzic 等人，2020）。

本研究以斑马鱼为模型，结合不同的斑马鱼报告品系、成像技术、基因功能缺失及拯救实验，探究gpr17是否在少突胶质细胞系细胞中表达，并验证其作为少突胶质细胞成熟抑制剂的功能是否保守。随后，我们在斑马鱼中表达人源GPR17，并评估人源化GPR17斑马鱼作为体内系统，用于分析通过靶向抑制人源GPR17发挥作用的化合物的外推能力。

结果

斑马鱼少突胶质细胞发育过程中表达gpr17

我们在Ensembl基因组浏览器（www.ensembl.org）中鉴定出预测的gpr17基因，该基因定位于斑马鱼6号染色体，最初命名为si:ch73-194h10.4（ZDB-GENE-100922-133；ZFIN.org）。该预测基因包含一个外显子，内含一个1020个碱基对的开放阅读框，可翻译为339个氨基酸的Gpr17蛋白。简单模块化结构研究工具（SMART）分析预测，斑马鱼Gpr17将具备G蛋白偶联受体（GPCRs）的共同结构特征，包括七个疏水跨膜结构域、一个细胞外氨基末端和一个细胞内羧基末端。斑马鱼Gpr17与其同源物的比对显示，其与人类GPR17的氨基酸相似性为56%，与小鼠和大鼠GPR17的相似性为54%（图S1）。我们通过聚合酶链式反应（PCR）从基因组DNA中扩增后对gpr17序列进行了分析，证实该基因的编码区无内含子。此外，通过互补DNA（cDNA）5'端快速扩增技术（RACE）分析了gpr17 mRNA的转录起始位点，确定在受体起始密码子上游6282个核苷酸处存在一个104个碱基对的5'侧翼区（图S2）。因此，斑马鱼gpr17基因由两个外显子组成，中间被一个6273个碱基对的内含子分隔，开放阅读框位于第二个外显子上（图1A）。

在啮齿类动物和人类中，GPR17 在发育过程中的未成熟非髓鞘形成少突胶质细胞中表达（Chen 等人，2009；Ou 等人，2016；Satoh 等人，2017；Merten 等人，2018；Wang 等人，2020）。为了检测斑马鱼中 gpr17 的表达是否具有可比性，我们首先通过跨越外显子-外显子连接的逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析了其在斑马鱼发育过程中的时间表达模式。我们在胚胎发生期和幼体早期检测到了 gpr17 的表达（图1B），此时斑马鱼少突胶质细胞谱系细胞首次被特化并随后分化（Kucenas 等人，2008）。与这一观察结果一致，RNAscope 整体原位杂交（WISH）分析显示，从受精后56小时（hpf）到受精后4天（dpf），gpr17 mRNA 定位于转基因 Tg(olig2:EGFP) 斑马鱼脊髓背侧的 olig2+ 细胞内（图1C–1E）。olig2 是少突胶质细胞谱系细胞的特异性标志物，存在于其从少突胶质前体细胞（OPCs）向背侧靶轴突迁移，再到前髓鞘形成和髓鞘形成少突胶质细胞的整个发育过程中（Buckley 等人，2010；Ackerman 和 Monk，2016）。值得注意的是，与所有背侧 olig2+ 细胞均表达 gpr17 的56 hpf（图1C）相比，在少突胶质细胞髓鞘形成开始的3 dpf 和4 dpf（Preston 和 Macklin，2015；Ackerman 和 Monk，2016），也检测到了不表达 gpr17 的背侧 olig2+ 细胞（图1D、1E）。这些数据表明 gpr17 可能不在分化程度更高的少突胶质细胞中表达。为验证这一假设，我们在 Tg(claudinK:EGFP) 转基因品系中进行了额外的 RNAscope 原位杂交分析，该品系可特异性标记髓鞘形成早期的分化少突胶质细胞（Münzel 等人，2012）。在3 dpf 时，脊髓背侧的 claudinK+ 细胞内未检测到 gpr17 mRNA（图1F）。同样，位于在4天龄（dpf）的成熟髓鞘少突胶质细胞转基因报告系Tg(mbp:EGFP)斑马鱼的背侧脊髓中（图1G）（Jung等人，2010）。我们得出结论，终末分化的少突胶质细胞不表达gpr17。

为进一步评估gpr17的表达情况，我们使用了Tg(nkx2.2a:mEGFP)转基因报告基因，该报告基因可标记出髓鞘形成前少突胶质细胞的细胞膜，这类细胞会伸出长膜突起以包裹轴突，但尚未启动髓鞘的形成（Kirby等人，2006；Ackerman等人，2015；Ackerman和Monk，2016）。我们发现gpr17 mRNA在转基因斑马鱼背侧的nkx2.2a阳性细胞中具有显著的定位分布。在受精后2.5天的脊髓中（图1H），此时少突胶质前体细胞会转化为预髓鞘少突胶质细胞（Takada和Appel，2010；Ackerman和Monk，2016）。综上，我们的研究数据表明，在斑马鱼中，gpr17以发育调控的方式在少突胶质细胞谱系中表达，当少突胶质细胞开始终末成熟时，其表达会被下调。这些发现与在小鼠和人类少突胶质细胞中观察到的时间表达谱一致（Chen等人，2009；Satoh等人，2017），并支持GPR17表达在斑马鱼到哺乳动物中具有保守性的观点。

图1. gpr17在少突胶质细胞发育过程中的表达情况。（A）斑马鱼gpr17基因的示意图，该基因包含两个外显子（绿色方框），外显子之间由一个内含子分隔。开放阅读框（蓝色）位于第二个外显子中。（B）通过RT-PCR评估斑马鱼幼体发育过程中gpr17表达的代表性凝胶图像，以翻译延伸因子1-α eef1a1l1作为阳性对照。在受精后不同天数（dpf）使用完整幼体制备RNA。（C–H）对56小时胚胎至4天幼体（C–E）表达Tg(olig2:EGFP)、3天幼体（F）表达Tg(claudinK:EGFP)、4天幼体（G）表达Tg(mbp:EGFP)以及2.5天幼体（H）表达Tg(nkx2.2a:mEGFP)的幼体脊髓中gpr17（红色）进行RNAscope分析的代表性侧视荧光图像。括号标注背侧脊髓（dSC）和腹侧脊髓（vSC）；左侧为前端，上方为背侧。比例尺：50微米。另见图S1和图S2。

gpr17调控斑马鱼少突胶质细胞的分化

为探究 Gpr17 的功能在斑马鱼中是否也具有保守性，我们利用 CRISPR-Cas9 技术构建了 gpr17 种系突变体。我们设计了单链向导 RNA（sgRNA），靶向编码序列内的 gpr17 外显子 2。完成基因组编辑后，我们在 gpr17 基因的编码序列中鉴定出一段 43 个碱基对的缺失，后续将该突变体命名为 gpr17-Δ43（图 2A）。Gpr17-Δ43 存在移码突变，会导致提前出现终止密码子，进而使蛋白产物严重截短（图 2B 和图 S3）。由于该 gpr17 突变等位基因缺失了胞内环 2、跨膜结构域 4-7（包含其相连的胞外环与胞内环）以及完整的 C 端胞质尾，因此我们将 gpr17-Δ43 斑马鱼认定为 gpr17 功能缺失突变体。

Gpr17-D43 斑马鱼具有生存能力，可产生可存活的后代，与野生型（WT）同窝仔鱼相比未表现出任何形态学缺陷（图2C），这与在(Gpr17)小鼠中的观察结果一致（Chen等人，2009）。为了探究少突胶质细胞分化是否也如Gpr17缺陷小鼠中所报道的那样在gpr17-D43斑马鱼中加速（Chen等人，2009），我们将其与转基因报告品系Tg(nkx2.2a:mEGFP)或Tg(mbp:EGFP)进行杂交。我们发现，与野生型斑马鱼相比，gpr17-D43幼鱼在56小时胚胎龄（hpf）时脊髓腹侧通路中的nkx2.2a表达增强（图2D和2E），这表明突变体斑马鱼该区域中髓鞘形成前少突胶质细胞的数量增加。事实上，对Tg(mbp:EGFP)幼鱼的分析显示，与野生型不同，gpr17-D43斑马鱼在2.5天胚胎龄（dpf）时脊髓腹侧已可检测到mbp+少突胶质细胞胞体（图2F），而在该幼鱼阶段，野生型斑马鱼的轴突尚未发生髓鞘化（Buckley等人，2010）。此外，在3天胚胎龄时，突变体幼鱼脊髓腹侧通路中mbp+细胞的数量增加（此时腹侧轴突开始发生髓鞘化）（Buckley等人，2010；Koudelka等人，2016；Karttunen等人，2017）（图2G和2H）。对脊髓切片进行增殖细胞核抗原（Pcna）免疫染色（Herce等人，2014；Nagarajan等人，2020）显示，gpr17-D43斑马鱼与野生型相比无差异（图2I），这表明细胞增殖率未发生变化，无法解释mbp+细胞数量的增加。值得注意的是，尽管gpr17-D43斑马鱼中mbp表达提前启动，但随着时间推移，少突胶质细胞的分化最终在4天胚胎龄时达到与野生型相同的mbp+细胞数量（图2J），这一发现与(Gpr17)小鼠中先前的报道观察结果一致（Chen等人，2009）。

综合来看，我们的数据表明，在gpr17-D43突变体斑马鱼中，向mbp阳性成熟少突胶质细胞的分化过程早于野生型斑马鱼。因此，我们得出结论，gpr17-D43表现出的表型与此前报道的Gpr17基因敲除小鼠的表型相似（Chen等人，2009；Ou等人，2016）。

图2. gpr17调节斑马鱼少突胶质细胞分化。（A）gpr17 WT和种系CRISPR突变体gpr17-D43 DNA序列；sgRNA靶（蓝色）和PAM位点（红色）显示在WT序列上；破折号表示核苷酸缺失。（B）Gpr17蛋白图（跨膜结构域用黄色框），其中包含突变鱼中核苷酸缺失引起的早期停止位置。（C）WT和gpr17-D43兄弟姐妹在4 dpf处的苏木精和伊红染色图像；比例尺：300毫米。（D）WT和gpr17-D43幼虫在56 hpf处表达Tg（nkx2.2a：mEGFP）的脊髓段的说明性侧视图。（E）从表达Tg（nkx2.2a：mEGFP）的WT和gpr17-D43腹侧脊髓的z叠中获得的平均投影的平均荧光强度。（F）显示WT和gpr17-D43侧视图的代表性合并明场和荧光图像（G和H）描述脊髓侧视图的说明性图像（G），以及在3 dpf处量化WT和gpr17-D43幼虫的腹侧脊髓mbp+细胞（H）。（I）WT和gpr17-D43幼虫在56 hpf处的可比矢状石蜡切片的说明性图像，显示脊髓内用抗Pcna标记的增殖细胞（棕色染色）；切片用苏木精复染。（J）WT和gpr17-D43幼虫在4 dpf处表达Tg（mbp：EGFP）的腹侧脊髓mbp+细胞的定量。括号在（D）和（G）中标记腹侧脊髓（vSC）；前部向左，背侧向上。标尺条（C中除外）：50 m。误差条表示平均值+SD。(p<0.05)8(^{*} p<0.01)；ns，不显著。双尾未成对t检验；分析了(n,)数量的鱼幼虫。

gpr17失活影响斑马鱼背侧少突胶质前体细胞的迁移

为进一步探究 gpr17 在斑马鱼少突胶质细胞生物学中的作用，我们还分析了 gpr17 失活对少突胶质前体细胞迁移的影响。为可视化少突胶质前体细胞的迁移，我们使用了转基因报告品系 Tg(olig2:EGFP)，并对占据脊髓背侧的 olig2+ 细胞进行了定量分析在受精后56小时，少突胶质前体细胞（OPCs）从运动神经元原基（pMN）区域向背侧目标轴突迁移时（Buckley等人，2010；Takada和Appel，2010），我们观察到，与野生型（WT）对照组相比，gpr17-D43突变体幼虫的背侧olig2阳性细胞数量减少（图3A和3B）。与这一发现一致，在受精后3天，gpr17-D43；Tg(claudinK:EGFP)突变体幼虫中背侧claudinK阳性细胞的数量（图3C和3D），以及在受精后4天，gpr17-D43；Tg(mbp:EGFP)突变体幼虫中背侧mbp阳性细胞的数量（图3E和3F），也均较野生型鱼减少。我们发现，随着时间推移，gpr17-D43突变体的背侧mbp阳性细胞最终在受精后5天达到与野生型相同的水平（图3G和3H），这表明髓鞘形成少突胶质细胞在脊髓背侧目标轴突处的出现存在延迟。

细胞数量的这种减少并非由细胞死亡增加导致，因为使用裂解半胱天冬酶3抗体进行的免疫染色分析（Jänicke等人，1998；Nagarajan等人，2020）显示，脊髓内的凋亡细胞数量并未增加（图3I）。此外，检测乙酰化微管蛋白（图3J，可标记轴突，Takada与Appel，2010）和突触囊泡蛋白2（Sv2，图3K，可标记轴突突触前神经支配，Wan等人，2010）的免疫染色分析结果显示，gpr17-D43突变体与野生型（WT）幼虫无显著差异，这表明神经元发育不存在可能影响少突胶质细胞发育的缺陷。最后，为排除CRISPR脱靶效应导致突变鱼出现该表型的可能性，我们在单细胞阶段向gpr17-D43;Tg(olig2:EGFP)胚胎中注射zf-gpr17信使核糖核酸（mRNA）开展mRNA回补实验。对背部olig2阳性细胞的定量分析显示，与注射对照tdTomato信使核糖核酸（mRNA）的情况相反，注射zf-gpr17信使核糖核酸（mRNA）后突变体表型得到逆转（图3L、3M及图S4）。因此，我们的回补实验证实，gpr17基因失活与本次斑马鱼突变幼虫中观察到的表型之间存在直接关联。

为了通过另一种遗传策略进一步验证我们的研究结果，我们使用反义翻译阻断吗啉寡聚核苷酸（MO）敲低了gpr17基因。与注射对照吗啉寡聚核苷酸（CoMO）的幼虫相比，注射gpr17 MO的幼虫在体型或整体发育上未出现异常（图S5A），活化的半胱天冬酶3的表达量未升高（图S5B），神经元发育也无明显缺陷（图S5C、S5D），这排除了gpr17 MO注射对细胞存活和增殖的非特异性影响。相反，对注射MO的Tg(olig2:EGFP)幼虫中迁移的少突胶质细胞进行定量分析发现，与未注射及注射CoMO的幼虫相比，背侧分布的olig2+细胞数量显著减少（图S5E、S5F）。我们还发现Tg(claudinK:EGFP)幼虫中背侧claudinK+细胞数量减少（图S5G、S5H），Tg(mbp:EGFP)幼虫中mbp+细胞数量也减少（图S5I、S5J）。将gpr17 MO与斑马鱼gpr17 mRNA共同注射到Tg(olig2:EGFP)胚胎中的mRNA拯救实验表明，MO诱导的表型得到逆转（图S5K、S5L）。因此，通过MO敲低gpr17基因可重现gpr17-D43突变幼虫中观察到的表型，从而证实了我们在突变鱼中的先前研究结果。

综合来看，我们的数据支持这样一种模型：gpr17的失活会加速驱动少突胶质细胞谱系细胞分化的细胞程序，从而导致早期少突胶质细胞成熟的启动以及其迁移至正常靶位点的能力出现缺陷。该模型还解释了有髓鞘形成能力的少突胶质细胞在脊髓背侧区域的目标轴突上出现延迟的现象。总体而言，我们的研究结果支持Gpr17是斑马鱼少突胶质细胞分化的负调控因子这一观点，并揭示了该受体从斑马鱼到哺乳动物的保守功能作用。

图3. gpr17影响斑马鱼背侧少突胶质细胞迁移。（A-H）代表性图像描绘脊髓（A、C、E和G）的侧视图，以及背侧阳性标记细胞（B、D、F和H）的定量，在WT和gpr17-D43幼虫表示Tg（寡2：EGFP）在56 hpf（A和B），Tg（claudinK：EGFP）在3 dpf（C和D），和Tg（mbp：EGFP）在4 dpf（E和F）和5 dpf（G和H）。（I）3 dpf幼虫的石蜡切片的可比矢状图的说明性图像用抗切割caspase 3（棕色染色）标记以识别脊髓内的凋亡细胞；切片用苏木精复染。（J和K）代表性脊髓全贴装免疫组织化学染色与抗乙酰化微管蛋白抗体（红色）标记轴突（J）和抗Sv2抗体（红色）标记突触前终端（K）在WT和gpr17-D43幼虫携带Tg（寡2： EGFP）报告员（绿色）在56 hpf。（L和M）描述脊髓（L）的侧视图，以及在56 hpf注射tdTomato（作为注射控制）或zf-gpr17 mRNA时在WT和gpr17-D43幼虫的背侧寡2+细胞（M）的定量。荧光图像中的括号标记背侧脊髓（dSC）；前面是左边，背侧是向上。标尺条：50 pm。误差条表示平均值+SD；(^{* * *} p<0.0001)；ns，不显著。双层不成对t检验（B、D、F和H）；Tukey事后检验的单向方差分析（M）；n，分析的鱼幼虫数量。另见图S4和S5。

斑马鱼 Gpr17 对小分子 GPR17 激动剂 MDL29,951 无响应

鉴定能够抑制GPR17以促进髓鞘再生的化合物是治疗人类脱髓鞘疾病的一种有前景的策略（Merten等人，2018；Dziedzic等人，2020）。我们希望利用斑马鱼作为模型系统来筛选此类化合物。然而，斑马鱼Gpr17（zf-Gpr17）与人类GPR17（h-GPR17）的氨基酸同源性仅为56%，这就提出了一个问题：能够结合h-GPR17的配体是否也能与zf-Gpr17相互作用。为阐明这一问题，我们构建了重组表达这两种受体同源物的哺乳动物人胚肾（HEK）293细胞系。酶联免疫吸附试验（图4A）和免疫细胞化学染色（图4B）证实，在该细胞背景下，zf-Gpr17和h-GPR17均能正确定位于质膜。然而，利用基于动态质量重分布（DMR）的无标记全细胞生物传感技术分析受体功能时，我们发现了显著差异——该技术平台可表征G蛋白偶联受体（GPCR）沿四种主要G蛋白通路的信号传导（Schröder等人，2010，2011）。与h-GPR17 HEK293细胞不同，后者经合成型小分子GPR17激动剂MDL29,951处理后会出现显著且浓度依赖性的信号变化（Hennen等人，2013），而zf-Gpr17-HEK293细胞则无任何反应，与转染pcDNA3.1空载体的对照细胞一致（图4C）。显然，已知能在异源细胞表达系统（图4C）（Hennen等人，2013；Simon等人，2017；Baqi等人，2018；Conley等人，2021）以及啮齿动物少突胶质细胞培养物中特异性激活h-GPR17的MDL29,951，并非zf-Gpr17的合适化学激活剂。为区分zf-Gpr17的无活性是源于配体识别缺陷，还是鱼类受体同源物与哺乳动物HEK293信号传导机制的相互作用不足，我们设计并构建了嵌合受体：将h-GPR17的胞外区和跨膜区与zf-Gpr17的胞内环及C端尾区结合，得到h/zf-GPR17；反之则构建zf/h-Gpr17（图4D）。事实上，两种嵌合受体均能在细胞表面表达（图4E），尽管其表达丰度低于野生型（WT）受体（图4F），但只有h/zf-GPR17对MDL29,951的刺激敏感，反向嵌合体zf/h-Gpr17则无此反应（图4G、4H）。这些数据使我们得出结论：zf-Gpr17对MDL29,951的无反应性很可能源于其推定配体结合位点内的同源性不足，这使得MDL29,951无法与斑马鱼受体同源物有效结合。

图4. 斑马鱼Gpr17对MDL29,951无响应。(A) 转染的HEK293细胞中细胞表面人GPR17（设为100%）、斑马鱼Gpr17以及空载体（pcDNA 3.1）的标准化ELISA定量分析。(B) 转染的HEK293细胞中，空载体、斑马鱼Gpr17和人GPR17的代表性荧光图像。(C) 转染空载体、斑马鱼Gpr17和人GPR17的HEK293细胞中，通过无标记动态质量反射（DMR）测定法检测MDL29,951的代表性轨迹图。(D) 本研究中构建并分析的野生型和嵌合受体的示意图。(E) 显示在HEK293细胞中表达的嵌合受体人/斑马鱼GPR17和斑马鱼/人Gpr17的免疫荧光检测代表性图像。(F) 细胞表面人GPR17（设为100%）及嵌合受体的标准化ELISA定量分析。(G) 瞬时转染指定受体并用不同浓度MDL29,951处理的HEK293细胞中，全细胞DMR的代表性时间进程轨迹图。(H) 不同浓度MDL29,951触发的GPR17功能对比，并针对每种转染受体构建体的相对细胞丰度进行校正。数据以31.6 mM MDL29,951的百分比表示（设为100%）。比例尺：20微米。无标记特征以代表性轨迹图（平均值±标准误均值）展示，进行三次重复测量；卡巴胆碱（100 mM）激活细胞内源性毒蕈碱受体作为活性对照。误差棒代表平均值±标准误均值。实验独立重复三次。

h型和h/zf型GPR17 mRNA挽救了gpr17缺陷型幼虫的表型

MDL29,951对zf-Gpr17的不活性质疑使用斑马鱼作为体内动物模型来分析新的com磅在人类中具有前髓鞘作用。我们假设通过在鱼幼虫中表达h-GPR17来人性化斑马鱼可以规避这个问题，前提是斑马鱼和人GPR17在功能上是等效的。我们将hGPR17和h/zf-GPR17 mRNA注入gpr17-D43；Tg（寡聚2：EGFP）胚胎在单细胞阶段，并分析了类似于zf-gpr17 mRNA观察到的救援效果的发生（图3M）。事实上，与WT鱼相比，h-GPR17或h/zf-GPR17 mRNA注射完全恢复了gpr17-D43中背侧寡聚2+细胞的数量（图5A和5B）。同样，在gpr17-D43中观察到的腹侧mbp+细胞数量增加；在3 dpf处的Tg（mbp：EGFP）胚胎在这些mRNA注射后显着减少，基本上恢复了WT表型（图5C和5D）。手h/zf-GPR17 mRNA拯救gpr17缺陷幼虫表型的能力证明了注射受体的有效功能，并揭示了人类GPR17在体内有效取代斑马鱼同源的能力。此外，这些数据再次加强了在gpr17-D43鱼中观察到的表型是由特定和有效的斑马鱼Gpr17灭活引起的概念。

图5. 人源及人/斑马鱼杂合GPR17信使RNA挽救了gpr17缺陷型幼虫中观察到的表型。(A和B) 注射tdTomato（作为注射对照）、h-GPR17或h/zfGPR17信使RNA后，56小时受精阶段（hpf）携带Tg(olig2:EGFP)的野生型（WT）和gpr17-D43幼虫中，脊髓侧视代表性图像（A）以及背侧olig2+细胞的定量分析（B）。(C和D) 注射tdTomato、h-GPR17或h/zf-GPR17信使RNA后，携带Tg(mbp:EGFP)报告基因的野生型（WT）和gpr17-D43幼虫在3天受精阶段（dpf）的脊髓侧视示意图（C）以及腹侧脊髓mbp+细胞的定量分析（D）。图像中的括号标注了背侧脊髓（dSC；[A]）和腹侧脊髓（vSC；[C]）；比例尺：50微米。误差棒代表平均值±标准差；(p<0.05)、(^{*} p<0.01)、(^{* *} p<0.001)、(****p<0.0001) I；ns表示无显著性差异。采用Tukey事后检验的单因素方差分析（One-way ANOVA）；n为分析的斑马鱼幼虫数量。

小分子合成拮抗剂UCB6651在体外以高效力和高选择性抑制GPR17信号传导

为评估GPR17人源化斑马鱼在分析通过靶向抑制h-GPR17发挥潜在促髓鞘形成作用的化合物方面的外推能力，我们利用了GPR17拮抗剂UCB6651（图6A和图S6），该拮抗剂是为高效且选择性地抑制GPR17而开发的（Müller等人2018年研究中的化合物I-255）。在纳摩尔效力范围内，UCB6651有效逆转了MDL29,951介导的对cAMP生成的抑制（图6B）、内质网储存库中细胞内(Ca^{2+})的动员（图6C），以及通过动态质量反射（DMR）生物传感检测到的细胞形态变化（图6D）。G蛋白偶联受体（GPCR）配体发现中的另一项挑战是鉴定对目标受体具有特异性的分子。从系统发育角度来看，GPR17位于嘌呤能P2RY受体与半胱氨酰白三烯（CYSLT）受体之间（图6E）。因此，我们测定了UCB6651对GPR17相较于五个系统发育相关受体邻体的选择性。在浓度超过其(pIC_{50})达1000倍的情况下，UCB6651完全阻断了GPR17的信号传导（图6F），但对配体激活的P2RY受体以及半胱氨酰白三烯受体1型亚型完全无活性（图6G和图6H）。与对GPR17抑制的高选择性一致，UCB6651还促进了内源性表达GPR17的原代大鼠少突胶质细胞的成熟，髓鞘碱性蛋白（MBP）表达的增强证实了这一点（图6I）。这一体外特性使我们得出结论：UCB6651非常适合用于探究GPR17在体内人源化斑马鱼幼体发育过程中的作用。

图6.小分子合成拮抗剂UCB6651以高效力和选择性抑制体外GPR17信号传导。（A）UCB6651的化学结构。（B-D）UCB6651对h-GPR17介导的cAMP降低的归一化concentration-dependent抑制曲线，量化为MDL介导的cAMP降低forskolin-stimulated腺苷酸环化酶（B）、钙动员（C）和DMR细胞形状变化（D）的抑制作用，在用h-GPR17稳定转染的CHO细胞中，MDL29,951在其(EC_{80} / EC_{80})诱导。（E）显示GPR17和P2RY以及CYSLT受体之间关系的系统发育树。（F）在没有（w/o）或存在10 mM UCB6651的情况下，MDL29,951刺激的h-GPR17的代表性concentration-dependent激活痕迹，这是通过在CHO-GPR17细胞中的无标签DMR生物传感和相应的标准化浓度效应曲线确定的。（G）在稳定表达P2RY12并在没有（w/o）或用10 mM UCB6651预处理的1321N1细胞中ADP触发的全细胞DMR反应的代表性痕迹（H）10 mM UCB6651对GPR17密切相关的受体的配体介导的全细胞激活的影响，并在稳定的P2RY1-1321N1、P2RY131321N1、P2RY14-HEK293和CYSLTR1-HEK293细胞中测量。

GPR17人源化斑马鱼作为阻断GPR17的潜在促髓鞘形成化合物体内分析的原理验证模型

为了研究 UCB6651 是否影响斑马鱼幼鱼少突胶质细胞谱系的发育，我们注射了 h -GPR17 信使核糖核酸在单细胞阶段将其导入gpr17-D43；Tg(olig2:EGFP)胚胎中，并将去绒毛膜的幼虫暴露于UCB6651或溶剂中。与溶剂对照组相比，UCB6651处理可减少人源化GPR17幼虫背侧olig2+细胞的数量，这表明UCB6651对GPR17具有拮抗作用，同时也说明对人GPR17的药理学抑制可模拟基因敲除的效果（图7A和7B）。相反地，在注射了斑马鱼gpr17 mRNA的gpr17-D43；Tg(olig2:EGFP)幼虫中用UCB6651处理后，背侧olig2+细胞数量并未减少（图7C和7D），这提示GPR17阻滞剂与人类GPR17存在特异性相互作用，而与斑马鱼同源物无此作用。与该发现一致，当向gpr17-D43；Tg(olig2:EGFP)胚胎注射人/斑马鱼GPR17 mRNA时，UCB6651对背侧olig2+细胞的减少作用得到恢复（图7E和7F）。因此，我们的数据证实UCB6651与携带人类受体胞外环而非斑马鱼胞外环的GPR17存在特异性相互作用。为进一步证实我们的研究结果，我们还向gpr17-443；Tg(mbp:EGFP)胚胎中注射了人GPR17 mRNA胚胎，并在受精后3天用UCB6651处理后评估了腹侧脊髓中(mbp)细胞的数量。正如预期的那样，UCB6651（而非溶剂对照或无活性类似物EMI280422；图7G、7H及补充图S7）增加了GPR17人源化幼虫腹侧mbp+细胞的数量，其增加幅度与注射tdTomato mRNA而非h-GPR17 mRNA的gpr17-D43;Tg(mbp:EGFP)胚胎相当（图7I、7J）。

综合来看，我们的数据为以下观点提供了有力支持：人类和斑马鱼的Gpr17蛋白在功能上可互换，且UCB6651在斑马鱼中表达时仅能有效抑制人源GPR17。这也表明，我们构建的人源化斑马鱼模型既适用于也有必要用于后续通过靶向抑制人源GPR17来发挥作用的促髓鞘形成化合物的体内进一步分析。

图7. GPR17人源化斑马鱼作为GPR17阻滞剂的潜在髓鞘前化合物体内分析的原理证明。（A-F）代表性图像显示脊髓（A、C和E）的侧视图，并在56 hpf下在tdTomato（作为注射对照）或h-GPR17（A和B）、zf-gpr17（C和D）或h/zf-GPR17（E和F）mRNA注射时在Tg（寡2：EGFP）的gpr17-D43幼虫中定量背侧寡2+细胞（B、D和F），并在溶剂（DMSO）或UCB6651存在下处理。图像中的括号标记背侧脊髓（dSC）。（G）EMI280422的结构。（H）增加浓度的EMI280422和UCB6651对稳定表达h-GPR17的CHO细胞中MDL29,951介导的细胞内钙释放的影响。UCB6651的concentration-effect曲线与图6C所示相同。（I和J）说明性图像显示脊髓的侧视图（I），并定量腹侧脊髓mbp+细胞（J），在注射tdTomato或h-GPR17 mRNA时携带Tg（mbp：EGFP）报告者的gpr17-D43幼虫的3 dpf，并在没有和存在GPR17拮抗剂UCB6651或非活性类似物EMI280422的情况下进行处理。图像中的括号标记腹侧脊髓（vSC）。比例尺：50毫米。误差条表示平均值±SD；**p<0.01，(^{*} p<0.01)，(^{* * *} p<0.001)，(^{* * *} p<0.0001)；ns，不显著。Tukey的事后测试的单向方差分析；n，分析的鱼幼虫数量。另见图S7。

讨论

药物发现和生物医学研究高度依赖动物模型，以在细胞和分子层面深入理解人类疾病的病理机制，并为开发和测试新型治疗手段提供体内研究系统。在本研究中，我们提出了人源化斑马鱼模型，作为原理验证工具，助力筛选通过特异性抑制GPR17来促进髓鞘再生修复过程的药理试剂。与多发性硬化症（MS）等脱髓鞘疾病现有的治疗方案不同——这些方案均以免疫功能为靶点来降低中枢神经系统（CNS）炎症——抑制GPR17则可通过增强中枢神经系统髓鞘再生来发挥神经保护作用，促进轴突存活。事实上，研发能够促进新髓鞘形成的新型药物，已成为治疗多发性硬化症的重要策略。斑马鱼（斑马拟丽鱼）已成为一种极具价值的脊椎动物模型，可在体内环境中重现少突胶质细胞的生物学特性及髓鞘形成过程（普雷斯顿与麦克林，2015；阿克曼与蒙克，2016；佐普卡，2016）。作为脊椎动物，斑马鱼拥有与哺乳动物相似的完整器官，其分子和细胞功能具有高度保守性（陈等，2020）。值得注意的是，斑马鱼幼体阶段非常适合用于筛选和成像研究，原因在于：其一，其身体具有透明性，是实时观察细胞发育的理想材料；其二，体型小巧，可适配96孔板的培养环境；其三，将小分子物质直接加入水中后，斑马鱼皮肤可对其实现通透吸收（泰勒等，2010）。重要的是，新型基因工程技术可实现斑马鱼的基因编辑（科尼特等，2018）。这使得研究人员能够对那些被认为可促进脱髓鞘疾病中少突胶质前体细胞（OPC）分化与成熟的蛋白靶点进行操作。GPR17便是这类蛋白靶点之一，它在出生后发育过程中作为少突胶质细胞成熟的抑制剂发挥作用，调控未成熟与成熟髓鞘形成少突胶质细胞之间的转化（陈等，2009；默滕等，2018）。由于GPR17在多发性硬化症（MS）患者活跃的白质斑块中表达量极高（陈等，2009），因此脱髓鞘病灶中GPR17的上调可能是髓鞘再生停滞的关键致病因素。

本研究评估了斑马鱼的外推能力，旨在通过靶向抑制GPR17来筛选能够促进少突胶质细胞分化的化合物。初步分析显示，gpr17以发育调控的方式在斑马鱼少突胶质细胞中表达，这与此前在哺乳动物细胞中的研究结果一致（Chen等人，2009；Simon等人，2016；Merten等人，2018；Turan等人，2021）。此外，敲除实验结果有力表明，Gpr17在斑马鱼中同样是少突胶质细胞分化的负调控因子。因此，本研究证实了GPR17在少突胶质细胞发育过程中的表达和功能具有物种保守性，从而最大程度降低了斑马鱼与哺乳动物少突胶质细胞生理特性之间潜在的不匹配性。然而，MDL29951作为人和啮齿类动物GPR17的小分子替代激动剂（Hennen等人，2013；Simon等人，2017），在异源表达zf-Gpr17的细胞中并无活性。斑马鱼与人类受体的氨基酸序列同源性为56%，这一结果可能反映出MDL29951的结合位点不具有保守性，以及激动剂诱导的构象变化（对其活性至关重要）也未实现保守。事实上，将zf-Gpr17的细胞外区域和跨膜区域替换为人类受体的对应区域后，嵌合受体恢复了活性，这清楚地证明了不同物种同源物的配体结合位点同源性不足。其他研究也报道过斑马鱼与人类蛋白之间存在类似的差异，这些差异会影响化合物的结合（Laselva等人，2019）。

无论如何，与人类疾病相关的基因中有超过80%在斑马鱼中存在同源基因（Czopka, 2016）。因此，尽管序列保守性并不能为直接的药物筛选提供依据在斑马鱼中，斑马鱼与哺乳动物的蛋白质编码序列确实展现出足够的相似性，能够形成本研究中GPR17所观察到的、可类比的整体生物体生物学特性。人类GPR17能够挽救无效突变斑马鱼幼鱼的缺陷表型，这一能力证实了人类受体在该不同物种中具有等效功能。此外，我们关于UCB6651及其无活性类似物的研究结果，为利用GPR17人源化斑马鱼分析靶向GPR17的新型化合物提供了原理验证，这些化合物有望促进人类的髓鞘再生。该方法有望克服种间差异，而种间差异可能导致在其他动物模型中筛选出的药物最终在人体试验中失败。由于GPCR是药物研发史上最成功的蛋白质家族之一，本研究或可为斑马鱼体内平台的开发迈出重要一步，该平台可用于比对靶向GPR17的已成熟或优化的候选药物，从而更快地为多发性硬化症患者带来获益，而多发性硬化症是一个医疗需求尚未得到满足的重要领域。

研究意义

人们迫切希望发现能够促进髓鞘生成的治疗性化合物，以对抗多发性硬化症（MS）等脱髓鞘疾病。多发性硬化症是全球青年中最常见的致残性神经系统疾病，在该病中，少突胶质细胞是自身免疫攻击的目标，这会导致包裹神经元轴突的保护性髓鞘丢失，最终造成神经元损伤。目前所有治疗多发性硬化症的药物都仅能抑制免疫功能。然而，尚无治疗药物能帮助患者从未成熟前体细胞中生成新的少突胶质细胞，从而直接促进神经元修复。这一现状至少在一定程度上可能源于，从表型筛选和啮齿类动物多发性硬化症模型中发现的潜在有益化合物在临床试验中成功率极低，这也让当前临床前研究的整体转化价值受到质疑。

为了弥合这一转化差距，我们对斑马鱼进行人源化改造，使其表达人类Gpr17同源基因——该基因是髓鞘形成的细胞内在计时器和负向调控因子。通过人源化改造，我们能够利用这一动物模型在临床前药物研发方面的优势，即筛选能力和整体生物体生物学评估。同时克服与insufficienthomologyinthesiteswheredrugsbind相关的限制。因为任何药物都是物种特异性的，GPR17人性化可能是使斑马鱼像人类一样报告药物反应的先决条件，事实上，虽然我们提供了GPR17功能的跨物种验证，这是一种针对人类和啮齿动物GPR17的高效小分子抑制剂，但不是非活性类似物，但只有在人源化后才会出现基因缺失的影响。我们认为要成功将斑马鱼作为体内平台，真正弥合临床前药物研发中全细胞体外模型与啮齿动物模型之间的差距，就需将跨物种拯救与人源化改造相结合。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。