标题：Generation and application of endogenously floxed alleles for cell-specific knockout in zebrafish

期刊：Developmental Cell

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.devcel.2023.07.02

摘要

斑马鱼适用于多种遗传学研究方法。然而，条件性缺失等位基因的缺乏限制了对特定发育阶段或特定细胞的基因敲除。本研究中，我们采用现有方案为 gata2a 基因构建 flox 等位基因，但由于脱靶整合和敲入不完全而未成功。为解决这些问题，我们利用 Cas12a 同时共靶向技术在顺式位置插入 loxP 位点，结合转基因反向筛选和全面的分子分析，鉴定脱靶插入并验证靶向敲入。随后，我们运用该方法在单一代中成功构建了 foxc1a、rasa1a 和 ruvbl1 基因的内源 flox 等位基因。通过验证 Cre 依赖的基因缺失，我们证实了这些等位基因的实用性，且每种情况下均出现了预期的表型。最后，我们利用 gata2a 的 flox 等位基因证明了其在内皮细胞自主调控淋巴瓣膜发育过程中的必要性。综上，本研究的结果为斑马鱼内源 flox 等位基因的常规构建与应用提供了可行框架。

引言

斑马鱼因其生命周期的多项显著优势，已成为研究发育生物学的公认模型系统。斑马鱼胚胎透明且体外发育，可实现体内形态发生的可视化。胚胎发育高度同步且速度快，受精后1-2天器官系统即可发挥功能。除这些优势外，斑马鱼还具有遗传可操作性。成体斑马鱼易于饲养，繁殖力强，一对成体斑马鱼在一天内通常可产下数百枚卵。斑马鱼研究人员利用这些特性开展了大规模正向遗传筛选，以研究多种胚胎表型。随后，序列特异性核酸酶（如细菌中靶向CRISPR的核酸酶）的开发，使得反向遗传研究中能够在斑马鱼基因组中实现靶向生殖系缺失因此，遗传可及性与独特胚胎特性的结合这些特性使斑马鱼成为研究发育过程中基因功能的理想模型。

几乎所有斑马鱼突变体都会从目标基因在发育过程中最早开始表达的时刻起就扰乱其功能，这使得研究该基因在后续过程中的直接作用成为一项挑战。尽管通过细胞移植进行的嵌合分析能够解决这些突变体中细胞自主性的问题，但要确定其在后期阶段的主要功能效应仍颇具难度。早期针对这一问题的研究依赖于鉴定温度敏感型等位基因，然而这类基因十分有限。近年来，条件性转基因系统已被开发出来，但这类系统需要使用显性激活或抑制性转基因片段，而这些片段可能会干扰无关的信号通路。 因此，斑马鱼中仍缺乏可靠且确定的条件性遗传学平台，这限制了对其胚后阶段和成体阶段的相关分析。

通过利用胚胎干细胞种系缺失技术，小鼠成为了一种成熟的遗传模型。此后，小鼠研究人员利用该平台可利用 Cre/lox 系统进行条件性遗传学研究。Cre是一种噬菌体重组酶，可刺激loxP序列之间的重组。当loxP位点以顺式方式直接排列时，重组会删除中间的序列。通过对内源小鼠基因座进行改造，使编码外显子两侧带有loxP位点（称为“floxed”），再结合细胞特异性Cre的转基因表达，就能够实现组织特异性的基因敲除。敲除的时间可通过将Cre与经修饰的雌激素配体结合域融合来控制，该结构域可与他莫昔芬结合((CreERT ^{15} ))）。迄今为止，已有超过3000个已发表的floxed等位基因对应约2300个小鼠基因，同时还有300多种表达CreERT的转基因品系，这使得在任何生物学背景下都能进行全面的遗传分析。

设计

在斑马鱼中，Cre/lox 系统已被用于谱系追踪和条件性转基因表达⁹。然而，由于难以制备内源flox等位基因，该系统在斑马鱼条件性基因敲除中的应用受到了限制。事实上，此前仅有两项研究成功在斑马鱼中制备了此类等位基因。Burg 等人利用带有短同源臂序列和一个 loxP 位点的单链寡脱氧核苷酸（ssODNs）16然而，这种方法按顺序插入每个loxP位点，需要两代才能建立一个浮动的等位基因。相比之下，Hoshijima等人依靠具有1-kb同源臂的质粒模板，在单代中用浮动版本替换钾电压门控通道、亚科H、成员6a（kcnh6a）的内源外显子。17在这两种情况下，浮动等位基因的再介导切除导致预期的心脏缺陷。16,17在这里，我们展示了我们应用Hoshijima等人的经验。技术来生成浮动的gata2a等位基因，并实际强调陷阱和改进点。我们利用我们的经验开发了一种改进的方案，我们应用该方案来生成foxc1a、rasa1a和ruvbl1的浮动等位基因。最后，我们使用具有组织特异性诱导的CreERT转基因的gata2a浮动等位基因来证明淋巴瓣发育过程中的内皮自主要求。

结果

gata2a条件敲门等位基因的产生

为了产生一个浮动等位基因，我们应用了星岛协议17为了靶向gata2a，它编码在血液、内皮细胞和神经元中表达的锌指转录因子。18-20我们构建了一个靶向质粒，其同源臂在外显子5的上下1kb处，两侧是loxP位点（图1A和图1B）。同源臂与用于生产注射用胚胎的成人中的单倍型序列相匹配，如推荐的那样。17在外显子5的下游，我们放置了一个晶体、αA（cryaa）启动子和增强型绿色荧光蛋白（egfp）盒（图1B；文件S1），通过绿色透镜荧光识别转基因个体。21该盒两侧是FLP重组酶靶（FRT）位点，如果它干扰正常基因功能，则由FLP重组酶去除。靶向盒两侧是I-SceI17外显子5缺失产生一个框架内外显子连接，去除C末端锌指（图S1A和S1B），这对DNA结合至关重要。22该等位基因在结构上与广泛使用的小鼠(Gata2 ^{tm1Sac })allele23（图S1C）相同。

为了刺激HDR，我们使用Cas9/单导RNA（sgRNA）核糖核蛋白（RNP）复合物引入gata2a外显子5下游的DSB5（图1A）。在靶向构建体中，我们突变了Cas9间隔物，并将其从原间隔相邻基序（PAM）序列中分离出来，带有30个loxP位点以防止切割（文件S1）。我们用Cas9 RNP，靶向质粒和I-SceI. At3 dpf，PCR跨30同源臂连接显示12个个体胚胎中有6个在cryaa：egfp阳性胚胎中表现出正确大小和连接序列的片段（图S2A-S2C）。我们重复注射，培养cryaa：egfp阳性胚胎到成年，并在115个将cryaa：egfp传递给后代胚胎的创始人中确定了12个。其中，只有一个（((gata2a a^{um295 })）给了带有上述引物的PCR阳性胚胎，这表明大多数创始人携带了

随后对(gata2a a^{um295 })的PCR分析显示，只有30个loxP位点和cryaa： egfp盒插入靶点（图S2D-S2F），而南方分析显示脱靶整合。精确敲门将分别在用ScaI或BstEII消化基因组DNA后产生7.7kb或15kb片段，在使用EGFP探针进行南方杂交后产生4.7kb片段（图1C和1D）。然而，额外的片段也明显表明载体的随机插入（图1D）。不幸的是，这种脱靶整合与(gata2a a^{um295 })证明连锁融合，尽管我们没有在(gata2a a^{um295 })胚胎中检测到脱靶和单插入loxP位点之间的Cre介导重组（图S3A和S3B）。因此，我们通过首先消除脱靶cryaa： egfp盒（图S3B和S3C；称为(gata2a a^{um329 })，它保留了一些靶向构建序列和脱靶位点的单个loxP），在靶向外显子5上游的序列和具有30 bp侧翼同源臂的双链（ds）ODN模板和相对于集成的30 loxPsite的直接定向的loxP位点（图S3C和S3D），在靶向外显子5上游引入了50 loxP位点。我们确定了具有精确的50 loxP整合的创始人（筛选了15条鱼中的1条；图S3E），由此产生的浮动等位基因（((gata2a a^{um345 })）被称为gata2afl（图1C和1E）。

图1. gata2a条件性基因的构建缺失等位基因。(A) 斑马鱼gata2a基因座。(B) 用于floxed gata2a等位基因的打靶质粒。egfp为增强型绿色荧光蛋白；cryaaP为晶体蛋白α启动子元件；ampr为氨苄青霉素抗性盒。(C) gata2afl基因的限制性酶切图谱，标注了PCR引物和探针。(D和E) 对应基因型胚胎的Southern印迹分析。印迹经地高辛（DIG）标记的egfp探针杂交，通过化学发光检测。箭头指示精确整合产生的预期片段，星号标注随机整合产生的片段。

为了测试gata2afl功能，我们将(gata2a+/)携带者杂交到(gata2a a^{+/ u m 27})成年人身上，这些成年人在Gata2a锌指结构域上游具有移码缺失。正如预期的那样，一半的后代胚胎显示cryaa： egfp表达，并在没有Cre的情况下保留外显子5（图2A和2B；表S1）。相比之下，cre mRNA注射引起cryaa：egfp和外显子5的损失（图2B；表S1）。正如预期的那样，24我们还观察到杂合子(gata2a a^{um27 })胚胎中鱼膀胱膨胀的完全渗透损失，其中Cre介导的外显子5缺失((gata2a a^{mu m 27 / Delta} ))），而兄弟姐妹是正常的（图2C；表S1）。未注射的跨杂合(gata2a a^{um27/11 })幼虫在5 dpf时使其鱼膀胱膨胀，并且似乎与gata2a+/fl兄弟姐妹没有区别（图2D）。始终，gata2afl/fl成虫是可行和可育的。未注射的gata2afl/fl幼虫来自两者之间的杂交EGFP并在6 dpf时显示正常的鱼膀胱膨胀（图2E；表S2）。相比之下，在1细胞阶段注射斑马鱼密码子优化cre mRNA（zfcre）的gata2afl/fl幼虫显示cryaa：egfp丢失，没有鱼膀胱膨胀（图2F；表S2）。

我们接下来评估了ga(ta2a)胚胎中的脊髓神经元和循环缺陷。18,19,24未注射的(gata2a a^{f / n})胚胎在底板最腹侧的KolmerAgduhr（KA）神经元中表达尾加压素相关肽1（urp1），在受精后24小时（hpf；图2G和2H），更多位于背部的KA神经元中表达生长抑素1，串联重复1（sst1.1）。相比之下，在注射zfcre mRNA的(gata2a a^{f/f })胚胎中不存在urp1阳性细胞，而存在表达sst1.1的KA神经元（图2I和2J），类似于(gata2a a^{um27 })突变胚胎。19(Gata2a ^{+/ prime})注射zfcre mRNA的兄弟姐妹胚胎在主动脉弓血管中表现出正常的心跳和循环，静脉循环从脑血管通过大脑后静脉和初级头窦返回（视频S1）。通过背主动脉（DA）和后枢椎静脉（PCV）的主干循环也正常（视频S1）在注射zfCre的(gata2a a^{f/f })胚胎中，我们观察到心跳和血细胞循环通过主动脉弓血管和颅静脉，尽管弱于gata2a+/fl兄弟姐妹（视频S2）。然而，主干循环不存在（视频S2），类似于(gata2a a^{um27 })突变体。

通过使用外显子5和6中的引物的定量reverse-transcriptionPCR（qRT-PCR）分析(gata2a)胚胎中的gata2a转录本表明未注射胚胎中的表达，但不是那些注射了zfcre mRNA的胚胎（图2K）。相比之下，使用30个非翻译区（UTR）引物检测到的gata2a转录本并未因外显子5缺失而减少，与框内外显子4/6融合一致（图2L和S1B）。总之，这些观察表明gata2afl提供野生型gata2a功能和(gata2a a^{f / f})phocopies(gata2a a^{prime m 27})突变体中外显子5的Cre依赖性缺失。因此，gata2afl表现为有条件的功能缺失等位基因。

图2.  floxed gata2a 等位基因的功能验证。(A–D) 来自 (gata2a+kum27) 与 (gata2a+) 个体杂交的胚胎 (( n=3 clutches))。误差棒代表标准差。(A) 2 天胚胎期（dpf）表达晶状体绿色荧光蛋白（Egfp，cryG+）的胚胎比例。(B) 未注射或注射 cre 信使核糖核酸（mRNA）的胚胎中第 5 外显子缺失的比例。(^{*} p<0.01)，配对t检验。(C) 注射 cre 信使核糖核酸（mRNA）后，指定基因型胚胎中鳔（sb）膨胀的比例。“("A")”代表经聚合酶链式反应（PCR）验证的第 5 外显子缺失。方差分析，(p<0.0001)，(^{* * *} p<0.0001)，图基多重比较检验。(D) 5 天胚胎期（dpf），指定基因型未注射晶状体晶体蛋白αA（cryaa）:绿色荧光蛋白（Egfp）阳性胚胎中鳔膨胀的比例。Ns，无统计学意义，威尔科克森检验。(E–J) 5 天胚胎期（dpf）的纯合子 gata2afl/fl（E 和 F）幼虫或 24 小时胚胎期（hpf）的纯合子 gata2afl/fl（G–J）胚胎。侧视图，左侧为前方，上方为背侧。(E、G、H) 未注射，(F、I、J) 1 细胞期注射斑马鱼 cre（zfcre）信使核糖核酸（mRNA）。(E 和 F) 5 天胚胎期（dpf）透射光与绿色荧光叠加图。箭头头表示晶状体绿色荧光蛋白（Egfp）表达与否，箭头指示鳔（sb）。比例尺 250 微米。(G–J) 24 小时胚胎期（hpf）胚胎经全胚胎原位杂交后，针对指定转录本的反义核糖探针的差示干涉对比（DIC）图像。比例尺 50 微米。(K 和 L) 24 小时胚胎期（hpf）未注射或注射斑马鱼 cre（zfcre）信使核糖核酸（mRNA）的 gata2afl/fl 胚胎，针对含（K）第 5、6 外显子或（L）3'非翻译区（UTR）的 gata2a 转录本的定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）。配对t检验，(^{*} p<0.05) t检验，*p < 0.05；ns，无统计学意义。误差棒代表标准差。

同时进行双靶点CRISPR靶向可提高完整敲入的频率

在生成(gata2a)这一序列时，我们未能实现完整的敲入，我们推测这是由于双链断裂（DSB）的位置所致。我们的打靶策略参考了以往的研究成果，将Cas9间隔序列置于3'loxP插入位点，即5'loxP位点下游340个碱基对处（图1A和1B）。这一段同源序列可能仅允许同源定向修复（HDR）介导的cryaa转基因和3'loxP位点的插入。我们推断，若两个loxP插入位点同时发生双链断裂，将迫使同源定向修复利用loxP位点外侧的同源臂进行，从而提高完整敲入的效率。或者，仅针对5'loxP插入位点进行打靶，或许能更好地实现完整敲入，因为筛选出表达cryaa:egfp的胚胎很可能也携带了相邻的3'loxP位点。为验证这些可能性，我们在foxc1a基因两侧设计了CRISPR靶向序列，该基因编码一种叉头转录因子。由于foxc1a是单外显子基因，我们在DANIO-CODE数据库鉴定的启动子下游紧邻位置，以及注释的3'非编码区（UTR）下游150个碱基对处进行靶向（图3A和3B；文件S2）。loxP位点两侧是一段2.2千碱基对的片段，包含foxc1a的编码区和非编码区序列，单倍型匹配的同源臂在这些位点上游延伸400个碱基对、下游延伸1千碱基对（图3B；文件S2）。

我们选用Cas12a作为核酸酶，因为它能诱导比Cas9更高的同源定向重组（HDR）效率，且凭借其5'-TTTN原间隔序列临近基序（PAM），适用于靶向富含AT的非编码序列（CDS）。为比较双链断裂（DSB）位置的影响，我们注射靶向任意一个loxP插入位点的单个Cas12a核糖核蛋白（RNP），或共注射两种RNP，同时加入打靶质粒和I-SceI酶。我们在三次重复注射实验中，于72小时胚胎期（hpf）对10个cryaa:venus阳性胚胎的5'和3'连接区进行PCR，以此评估基因敲入情况（图3C；5'产物的反向引物锚定在loxP位点，无法检测内食蟹猴foxc1a基因）。仅注射质粒和I-SceI酶、未注射RNP的胚胎未出现基因敲入，但对照引物可扩增出内源性基因座（图3D）。仅注射3'端RNP的胚胎在3'连接区实现了高效敲入，而5'端则无此效果（图3D、3E）。相反，(5')号RNP不仅能高效实现5'端敲入，还能诱导(3'')号位点的敲入，不过3'端的扩增结果一致性较差、效率也相对较低（图3D、3E）。同时注射两种RNP可进一步提升3'端的敲入效率同时实现50号敲入且保持高敲入率（图3D和图3E）。相应地，与单独使用(3') RNP相比，双靶向处理后同时出现50号和30号敲入的个体比例显著更高（图3D和图3F）。我们还发现仅靶向(5')插入位点也能带来一定效果，但该效果的一致性相对较差（图3F）。综上，这些结果表明同时进行双CRISPR靶向有助于促进loxP侧翼靶向盒的完整敲入。

图3.双重CRISPR定位改进了浮动盒的完全敲击。（A）斑马鱼foxc1a基因座；同源臂（绿松石色）和Cas12a核糖核蛋白（RNP）靶点指示，编码序列（CDS）、开始（ATG）和停止密码子（TGA）也是如此。（B）foxc1a的靶向质粒。cryaaP，cryaa启动子。不按myl7比例缩放：mcher盒紧邻30同源臂；见文件S2。（C）Fox1afl基因座，PCR引物位置指示。（D）50和30junctionPCRsfrom2dpfVenus/m樱桃阳性个体胚胎注射了指示的RNPs。（E）注射了指示的RNP的胚胎数量显示(5'')和(3'')敲门。单向方差分析，(p=0.0114)；Holm-Sidak多重比较测试，p值指示。（F）注射了指示的RNP的胚胎数量，50和30敲门。Tukey的多重比较测试，p值显示。（E和F）每个点都是来自10个正常胚胎的复制。

转基因反向筛选可鉴定出脱靶插入的种系携带者

我们的 foxc1a 打靶载体包含一个心肌细胞特异性肌球蛋白轻链 7（myl7）启动子：mcherry 盒在同源臂之外检测脱靶插入（图3B；补充文件2）。携带该盒式结构的质粒此前已有报道，但从未得到应用¹⁷。为验证该标记物的实用性，我们重复了双RNP注射实验，并根据2天龄胚胎的金星和mCherry荧光表达对其进行分选，随后进行PCR在同源连接位点（图3C）。三分之一的注射胚胎共表达金星荧光蛋白（venus）和樱桃荧光蛋白（mcherry）（52个中有19个），或仅表达金星荧光蛋白（52个中有19个）。少数胚胎仅表达樱桃荧光蛋白或无任何表达（两类各52个中有7个）。令人意外的是，只有同时表达两种转基因的胚胎持续表现出完全敲入的迹象（图4A），这表明在该阶段，myl7启动子驱动的樱桃荧光蛋白（myl7:mcherry）无法区分靶向和脱靶整合。

我们重复注射，培养共同表达cryaa： venusandmyl7：mcherrytoadulthoodandidentifiedfounders的胚胎。从45条P0鱼中，7gaveprogenythatwereonlydouble-positiveforcryaa：venusandmyl7：mcher，有allbutonebeingnegativefor50和30个连接PCR（例如，参见图4B和表S3中的胚胎池#4、8和10）。两位创始人传播了cryaa：venus的混合物；myl7：mcher双阳性和cryaa：venus单阳性兄弟姐妹胚胎，其中一个给了胚胎，有完全敲门的证据（图4B，创始人7；表S3）。我们分别培养了cryaa：venus阳性；myl7：mcher-阴性((foxc1a a^{um383 } ))和cryaa：venus；myl7：mcher双阳性（((foxc1a a^{um384 } ))）胚胎来自创始人7。然后我们将单个(foxc1a+/um383)或携带者杂交，并根据转基因分离后代表达，随后进行南方印迹分析。在cryaa：来自(foxc1a ^{um383 })父母的金星阳性胚胎中，我们观察到与精确敲击目标一致的片段大小，而来自cryaa：金星阴性胚胎的基因组DNA没有与金星探针杂交（图4C和4D；(foxc1a ^{um383 })在下文中被称为狐(c1a)）。相比之下，我们观察到来自双阳性cryaa：venus的多个片段，没有预期的大小；myl7：mcher(foxc1a ^{um384 })胚胎（图4D），表明多个脱靶插入。这些观察证实了多个种系插入独立发生在P0创始人7中，并证明转基因反筛选可以区分F1后代携带的脱靶插入。

我们接下来将foxc(1 a^{prime prime})携带者与杂合(foxc1a ^{p 162})成人进行交叉，这些成人在叉头结构域中具有无意义的突变。30无论基因型如何，所有产生的胚胎都显示正常，表明cryaa： venus盒不影响foxc1a功能（图4F）。所有注射cre mRNA的兄弟姐妹胚胎都缺乏cryaa：venus表达，而(foxc1a ^{p 162 / 11})胚胎显示出浮动等位基因的缺失（((foxc1a ^{p 162 / 4})），并表现出小眼睛和心脏水肿（图4E和4G），正如预期的那样。31与相对正常的杂合和纯合野生型兄弟姐妹相比，我们也没有观察到任何狐狸(c1a ^{p 162 / 4})胚胎的循环（图4E），这与我们之前的发现一致。18野生型胚胎中偶尔出现的循环缺陷表明在这些实验中Cre本身有轻微的毒性（图4E）。(Foxc1a a^{n / n})纯合成人正常且可育，而注射zfcre mRNA的foxc(1a)胚胎表现出主动脉弓和躯干循环的丧失（视频S3和S4因此，我们观察到(foxc1a a^{f / f / f})幼虫注射zfcre mRNA后foxc1a表达的丧失，foxc1b的表达不变（图4H）。观察结果表明，在Cre介导的缺失后，foxc1afl表现为条件性功能丧失等位基因。

图4. 利用转座子技术构建foxc (1a")突变体。(A和B) 展示了对3天龄胚胎（3 dpf）进行的PCR检测，其金星（Venus）表达值已统计。误差棒代表标准差。通过指定引物对（F5/R5或F3/R3，见图3C）检测(绿色荧光蛋白，G+)和mCherry（红色荧光蛋白，R+）的表达。星号表示条带大小与预期相符。(A) 单独注射Cas12a核糖核蛋白（RNPs）、靶向载体和I-SceI的胚胎。(B) 来自指定首建者（founder）的混合F1代胚胎。(C) (Foxc1a)的限制性酶切图谱。(D) 对指定基因型的F2代胚胎进行Southern印迹分析，筛选其金星（“G”）或mCherry（“R”）表达。印迹膜用地高辛（DIG）标记的金星探针杂交，通过化学发光法检测。(E) 指定基因型的3天龄幼虫（3 dpf）中存在或不存在血液循环的比例。总胚胎数：foxc (1 a^{+/+})，费希尔精确检验，(cdots+p<0.0001) (F和G) 3天龄时透射光与绿色荧光的叠加图。幼虫来自(foxc1a+/R)与foxc1a+/p162携带者的杂交后代。(F) 指定基因型的未注射胚胎，形态正常。(G) 注射cre信使核糖核酸（mRNA）的胚胎。箭头头表示小眼，箭头指示心脏水肿（下方）。(F和G) 比例尺，250微米。(H) foxc1afl/fl胚胎中foxc1a和foxc1b的定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析。胚胎在单细胞阶段未注射或注射zfcre信使核糖核酸（mRNA）。配对t检验，p值26；foxc (10162/+)，12；(foxc1a+/d)，14；(foxc1a a^{0162 / Delta})，16。

额外floxed等位基因的构建

为进一步验证我们的敲入方法，我们为rasp21蛋白激活因子1a（rasa1a）和ruvbl样AAA ATP酶1（ruvbl1）构建了floxed等位基因，其中ruvbl1由共同作者（H.-M.Y.、C.E.B.和C.G.B.）在独立实验室中进行了靶向研究。Ruvbl1（也称为pontin）编码一种染色质修饰和纤毛组装所必需的ATP酶。32,33由于小鼠中条件性(Ruvbl1 1^{tm1a })等位基因是floxed外显子3，我们基于上述研究结果（见图3D-3F），使用靶向50 loxP插入位点的单个Cas12a RNP，构建了用于在斑马鱼ruvbl1外显子3两侧插入loxP位点的打靶载体（图5A和5B）。除此之外，打靶策略和后续分析均保持一致。我们从注射的胚胎中通过群体互交筛选了11只P0代成鱼，从中观察到同时表达cryaa:venus和myl7:mcherry的胚胎，或仅表达cryaa:venus但同时存在(5')和16d1e037-4c08-4b04-ad95-9881ad9baac插入的胚胎（图5D）。随后的个体回交鉴定出三只Founder，其后代可同时表达cryaa:venus和myl7:mcherry。其中一只P0代成鱼产生的后代中，既有同时表达两种转基因的个体，也有仅表达cryaa:venus的个体。金星，后者在50和30连接端的PCR检测均呈阳性，并被培育至成年，命名为(ruvbl1 ^{chb10 })（图5C和5D；以下简称ruvbl1fl）。我们通过对F2代cryaa:金星阳性后代进行Southern印迹分析，验证了精准插入且无脱靶整合（图5C和5E）。纯合ruvbl1fl/fl幼虫外观正常（图5F和5G），成体存活且可育。相比之下，注射zfcre mRNA的(nuvbl1)幼虫出现躯干弯曲和心脏水肿（图5F和5G），这与此前在(ruvbl1 ^{hif055b })突变体幼虫中观察到的结果一致33，同时缺失了包含外显子3的ruvbl1转录本，且整体转录本水平下降（图5H）。这些研究结果表明ruvbl1fl可作为条件性敲除等位基因。

RASA1是一种GTP酶激活蛋白（GAP），它能刺激与Ras结合的三磷酸鸟苷（GTP）转化为二磷酸鸟苷（GDP），从而使Ras失活。在人类中，RASA1功能缺失突变会引发毛细血管和动静脉畸形，而小鼠基因敲除实验则显示胚胎期血管和淋巴管缺陷。斑马鱼基因组编码编码两个RASA1同源基因rasa1a和rasa1b，目前尚未有相关突变体的描述。因此，我们首先在每个基因中构建了缺失等位基因。在Rasa1a GAP结构域中携带5个碱基纯合缺失的斑马鱼幼鱼会导致移码突变，这些幼鱼在受精后4天会表现出低外显率的眼部、肠道和心脏水肿，以及血液循环丧失。在(rasa1b ^{um290 })纯合突变背景下，表型外显率显著增加，所有双纯合胚胎均表现出这些缺陷（图S4A–S4C），而仅纯合的幼鱼针对 (rasa1b ^{um290 }) 的情况均属正常且可行。基于这些表型，我们在编码 GAP 结构域部分区域的 rasa1a 第20和21号外显子两侧插入了 loxP 位点，若将该外显子删除，会引发移码突变，这与 (rasa1a ^{um255 }) 所导致的突变类似（图6A、图6B 及图S4A；文件S4）。显微注射后，我们在64只成鱼中发现4只可传递 cryaa:venus 标记但不传递 myl7:mcherry 标记，其中1只在 (5') 和 (3') 两个连接位点处均扩增出了PCR产物（图S4D、图S4E；奠基者5，命名为 (rasa1a a^{mu m 414})）。对 rasa (1aumd14) 子代的Southern印迹分析证实了靶位点的敲入，不过MscI酶切片段的大小比预期更大（图6D）。在 (rasa1a ^{um414 }) 胚胎中，采用利于长片段扩增的条件对 (5') 连接位点进行PCR扩增，获得了一个4.5kb的片段，该片段包含来自myl7:mCherry 表达盒、氨苄青霉素抗性基因和 lacZ 基因，以及完整的 I-SceI 酶切位点（图 S4F；文件 S5）。这表明 ra (sa1a a^{4 m 414}) 源于 3' 端的同源依赖性修复（HDR）以及 5' 同源臂和载体序列的非同源末端连接（NHEJ）介导的插入。最初的 5' 端 PCR 阳性结果（见图 S4D）很可能是由串联重复的 5' 同源臂序列之间的虚假内部引物结合导致的，这与之前的观察结果类似。尽管发生了这种插入，(rasa1a";rasa1b"m290) 双纯合个体仍表现出正常的胚胎发育（图 6E 和 6G），成年后存活且可育；但在 1 细胞阶段注射编码 zfCre 的 mRNA 后，这些个体均出现了完全外显的水肿和血液循环丧失（图 6E–6G）。定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）检测显示在rasa1a纯合突变体中，Cre介导缺失了包含外显子21的rasa1a mRNA，导致总rasa1a转录本减少，但rasa1b转录本未受影响（图6H）。这些观察结果表明，插入在外显子20上游的外源性载体序列不影响rasa1a的功能，且rasa (1 a^{n})可作为条件性缺失等位基因。

图5. 一个loxP侧翼化的ruvbl1等位基因（ruvbl1fl）。(A) Ruvbl1 基因座。(B) Ruvbl1fl 打靶载体。(C) Ruvbl1fl 限制性酶切图谱。标注了 5' 和 3' PCR 筛选片段。(D) 家系 P0 互交组中单个 F1 胚胎的 PCR 检测结果。cryV 代表 Venus 荧光表达，myl7R 代表 mCherry 荧光表达。通过单个个体回交鉴定出仅传递 cryV 表达胚胎（方框标注）的家系 2 首建者。(E) 对 (F1 nuvbl1) 携带者回交产生的 F2 代 cryV 阳性和阴性同胞的 Southern 印迹分析（B，BsrGI 酶切；N，NcoI 酶切；H，HindIII 酶切）。印迹经地高辛（DIG）标记的 Venus 探针杂交，通过化学发光法检测。(F) 3 天龄（dpf）的 Ruvbl1fl/fl 幼虫；侧视，前方朝左，背侧朝上。为落射荧光与透射光图像的叠加图。上图，未注射的表达 cryaa:venus 的胚胎。下图，注射 zfcre mRNA 的胚胎表现出躯干背侧（中图）或腹侧（下图）弯曲、心脏水肿（箭头所示）以及 cryaa:venus 表达消失。比例尺为 250 微米。(G) 未注射（((n=113))）或注射 zfcre mRNA 的 ((n=379) n v b / 1^{6 / 6}) 幼虫的躯干弯曲外显率。费希尔精确检验。(H) 针对指定外显子连接区或 3' 非翻译区（UTR）的实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）。邓尼特多重比较检验，标注 p 值。误差棒代表标准差。

图6. 一个 flox 型 rasa1a 等位基因（rasa1afl）。(A) Rasa1a 的第20和21号外显子。(B) Rasa1fl 打靶载体。(C) Rasa1afl 限制性酶切图谱。(D) 对 cryaa:venus 阳性和阴性的 F1 代斑马鱼，或注射 zfCre 信使核糖核酸的斑马鱼进行的Southern印迹分析。膜用地高辛标记的 venus 探针杂交，通过化学发光法检测。星号表示比预期更大的片段。(E和F) 4天龄的 rasa1afl/fl;rasa1bum290/um290 斑马鱼幼鱼。比例尺，250微米。(E和E0) 未注射的幼鱼，分别为侧面和背侧视图。(F) 注射 zfcre 信使核糖核酸的幼鱼侧面视图，显示心脏水肿（箭头）。(F0) (F) 中幼鱼的背侧视图，显示眼部水肿（箭头）和肠道水肿（箭头头）。(E0和F0) 比例尺，100微米。采用Sidak多重比较检验，标注p值。(G) 不同基因型4天龄幼鱼的水肿外显率。采用费希尔精确检验，标注p值。(H) 不同基因型未注射或注射 zfcre 信使核糖核酸的胚胎中，指定转录本的定量实时聚合酶链式反应结果。误差棒代表标准差。

内皮细胞特异性gata2a基因敲除导致淋巴瓣膜发育异常

为了展示floxed等位基因在斑马鱼细胞和阶段特异性敲除中的应用，我们使用gata2afl来确定gata2a的内皮细胞自主需求。为此，我们构建了一个转基因品系，其中(CreERT2)由gata2aECE驱动，gata2aECE是一种在内皮细胞中表达的内含子gata2a增强子元件18（图7A）。在本实验中，我们引入cryaa:mcherry作为标记物以鉴定转基因携带者。我们筛选到一只首建鱼，其后代胚胎表现出内皮特异性重组（Tg(gata2aECE:CreERT2;cryaa:mcherry)um337；称为gata2aECE:iCre），并将该品系繁育以获得单拷贝插入体（图7B）。为了验证诱导型内皮特异性Cre活性，我们将gata2aECE:iCre与携带Tg(ubb:loxP-cerulean-loxP;h2b-mcherry)jh63的斑马鱼杂交，在该品系中表达Cre的细胞将转而表达核定位mCherry40 的标准化形式（称为 ubb:SwitchRed）。

Gata2aECE:iCre;ubb:SwitchRed 胚胎在 1 至 3 天龄（dpf）时暴露于 5 毫摩尔的 4-羟基他莫昔芬（4OHT），在 6 天龄时表现出内皮细胞特异性的 H2B-mCherry 表达（图7C和7D）。我们在面部淋巴管、主动脉弓和脑血管的内皮细胞中均观察到了 H2B-mCherry 信号（图7C）。在躯干血管中，H2B-mCherry 仅局限于后主静脉（PCV）和胸导管（TD）内的内皮细胞，在节间血管中呈镶嵌表达，而在背主动脉（DA）中则仅有极少细胞表达（图7D）。

我们将 gata2a+/fl;gata2aECE:iCre 成年鱼进行互交，并从受精后第1天至第3天（dpf）用二甲基亚砜（DMSO）或4-羟基他莫昔芬（4OHT）处理其后代。通过 cryaa:egfp 而非 cryaa:mcherry 鉴定并经基因型验证的、无 iCre 的纯合 (gata2a a^{f / / 1}) 幼虫表现出膨胀的鱼鳔和正常的血液循环（图7E和7G）。相比之下，经4OHT处理的 gata2afl/fl;gata2aECE:iCre 幼虫（简称此后（(gata2a a^{j triangle E C})）出现眼周水肿且其外显率与全身gata2a基因敲除幼虫18相似（图7F和7H）。在这些实验中，我们首先通过mCherry和Egfp的晶状体表达鉴定出(gata2a a^{j triangle E C})幼虫，随后对(gata2a a^{f i / t})进行基因分型。与cre mRNA注射（见图2F）不同，gata2aiDEC幼虫因CreERT2表达的特异性而保留cryaa:egfp（图7F）。尽管存在淋巴水肿，(gata2a a^{triangle A E C})幼虫在其他方面均正常，鱼鳔充盈且躯干循环活跃（图7E和7F），与(gata2a a^{um27 }) 突变体。此外，(gata2a a^{j triangle E C}) 胚胎在 6 至 24 小时受精后（hpf）用 4-羟基他莫昔芬（4OHT）处理的胚胎，其腹侧 KA 神经元中 urp1 的表达正常（图 7I 和 7J），这与注射了斑马鱼 Cre（zfcre）信使核糖核酸（mRNA）的 gata2a 基因敲除纯合子（gata2afl/fl）胚胎不同（图 2I）。对组蛋白 2B-单红色荧光蛋白（H2B-mCherry）阳性细胞中 gata2a 转录本的定量分析通过荧光激活细胞分选（FACS）从携带 ubb:SwitchRed 的 (gata2a a^{j triangle E C}) 幼虫中分离出的细胞（即已发生 Cre 介导重组的细胞）表现出显著的包含外显子5的转录本数量显著减少，但未影响(3')UTR，与野生型或 (gata2a a^{+/ i Delta E C}) 幼虫相比（图7K）。与注射 zfcre 的 (gata2a) 胚胎相反mRNA，在 (gata2a a^{j triangle E C}) 中仍可检测到野生型转录本低水平的幼虫表明，使用 gata2aECE:iCre 时重组具有稳健性但并不完全（对比图 2K 和图 2L）。

(gata2a a^{um27 })突变体胚胎的水肿与淋巴瓣膜形成缺陷同时发生¹。因此，我们通过电子显微镜观察淋巴瓣膜的形态。与此前研究的描述一致，在7天post-fertilization（dpf）的野生型幼虫中，我们观察到扁平的双尖瓣瓣膜小叶分隔着面部集合淋巴管（FCLV）和面部外侧淋巴管（LFL）（图7L）。相比之下，经处理的(gata2a a^{j triangle E C})幼虫的淋巴瓣膜小叶呈现出紊乱的状态在受精后1至3天用4OHT处理。我们观察到FCLV与LFL之间的管腔存在多个瓣叶，排列杂乱无章（图7M），这与我们之前在(gata2a a^{um27 })突变体幼虫中观察到的情况相似。

图7. 内皮gata2a对于淋巴瓣膜的功能和形成是必需的。(A) Tol1 gata2aECE:iCre 转基因的限制性酶切图谱。(B) Tg(gata2aECE:iCre)um337 胚胎的Southern 印迹分析。印迹用地高辛标记的 mcherry 探针杂交，通过化学发光法检测。(C和D) 血管共聚焦显微图像叠加图，ISVe：体节间静脉；TD：胸导管；DA：背主动脉；PCV：后主静脉。从受精后第1天到第3天用10微摩尔4-羟基他莫昔芬处理的指示样本。(G和H) 比例尺，100微米。(E和G) 无iCre的 gata2afl/fl 幼虫。(F和H) gata2afl/fl; Tg(gata2a (EC:iCre) ^{mu m 337}) 幼虫，简称 (gata2a/dEC)。(E和F) 透射光、绿色和红色荧光叠加图。白色箭头头表示晶状体，白色箭头表示膨胀的鱼鳔。比例尺，250微米。(F和H) 黑色箭头表示肠道水肿。(H) 白色箭头(E–H) (E和F) 受精后第6天的幼虫，(G和H) 受精后第7天的幼虫，来自经5微摩尔4-羟基他莫昔芬从受精后第6小时处理的指示基因型胚胎的全 mounts 原位杂交。比例尺，50微米。(K) 从 gata2aiDEC; ubi:switchRed 幼虫的 H2B-mCherry 阳性细胞中提取的 gata2a 外显子5/6或3'非编码区的定量实时聚合酶链式反应，这些幼虫从受精后第6小时到第4天用5微摩尔4-羟基他莫昔芬处理，在受精后第5和第6天检测。外显子5/6：方差分析，(p<0.005)；3'非编码区：无显著差异。使用Dunnett多重比较检验进行成对比较，标注p值。误差棒为标准差。(L和M) 指示基因型的幼虫从受精后第1天到第3天用5微摩尔4-羟基他莫昔芬处理后，受精后第7天淋巴系统的扫描电子显微镜图像，LFL：面外侧淋巴管；aa：主动脉弓瓣膜。侧视图，背侧朝上，前方朝左。正常的二尖瓣瓣膜小叶用箭头标注。gata2aiDEC 幼虫中出现多个异常小叶（黑色箭头头）。FCLV：面收集淋巴管。LFL：面外侧淋巴管。比例尺，5微米。血管。FCLV：面收集淋巴管；左侧，背侧朝上。(C) 头部血管；(D) 躯干淋巴管造影（白色）。侧视图，前方朝左，(I和J) 受精后第7天的幼虫，显示 H2B-mCherry（红色）的表达，(Tg(gata2aECE:iCre) ^{um337 })；(ubb:switchRed)jh63，通过幼虫引入的天青（蓝色）和 Qtracker 705。(E–H) (E和F) 受精后第6天，(G和H) 受精后第7天的幼虫，来自经5微摩尔4-羟基他莫昔芬从受精后第6小时处理的指示基因型胚胎的全 mounts 原位杂交。(K) 从 gata2aiDEC; ubi:switchRed 幼虫的 H2B-mCherry 阳性细胞中提取的 gata2a 外显子5/6或3'非编码区的定量实时聚合酶链式反应，这些幼虫从受精后第6小时到第4天用5微摩尔4-羟基他莫昔芬处理，在受精后第5和第6天检测。(L和M) 指示基因型的幼虫从受精后第1天到第3天用5微摩尔4-羟基他莫昔芬处理后，受精后第7天淋巴系统的扫描电子显微镜图像。

讨论

本研究阐述了我们在斑马鱼中构建并应用条件性敲除等位基因的相关工作。我们最初采用已有的敲入方案开展相关研究时，发现了若干关键问题及可改进之处。基于这些经验，我们开发了一套高效的实验流程，并利用该流程在单代内为三个基因位点成功构建了条件性敲除等位基因。值得一提的是，其中一个等位基因由独立实验室完成构建，这充分证明了我们的方法在斑马鱼研究领域的实用性。综上，本研究为斑马鱼中条件性敲除等位基因的广泛构建与应用提供了可行的技术方案。生成 flox 等位基因的起点是靶外显子的考量。对于 gata2a 和 ruvbl1 基因，我们基于小鼠等位基因制定了靶向策略。斑马鱼和小鼠基因的结构与功能结构域通常具有保守性，这使得该方法可靠。事实上，gata2afl 和 ruvbl1fl 均表现出条件性敲除等位基因的预期特性。另外，应考虑现有斑马鱼突变体的基因型和表型特征，我们对 rasa1a 基因就采用了这一做法。确定靶序列后，对野生型成体的该区域进行测序至关重要，以确保同源臂序列与注射胚胎的单倍型相匹配。这也能保证 PCR 引物和 CRISPR 靶点的设计合理。虽然我们未直接测试使用非同源序列的影响，但野生型斑马鱼品系之间及品系内部存在显著的遗传变异。而斑马鱼野生品系之间及品系内部存在相当大的序列差异，且小鼠中微小的序列变异会显著降低敲入效率。

在制备条件性等位基因时，一个重要的打靶考量是CRISPR诱导的双链断裂（DSB）相对于loxP位点和同源臂的位置。在gata2a基因座，于3'端loxP插入位点产生的双链断裂仅实现了部分敲入，这可能是由于打敲载体中5'端loxP位点下游存在足够的同源序列用于同源定向修复（HDR）。将双链断裂位点移至5'端loxP位点，在foxc1a基因座的P0个体中敲入效率略有提升，我们采用该方法成功构建了ruvbl1fl等位基因。对于loxP位点之间跨度更大的foxc1a基因座，双靶点同时CRISPR打靶的效果甚至更稳定。因此，对于较短的打靶片段（例如单个小于500 bp的外显子），我们建议将双链断裂靶向至与cryaa标记基因相邻的loxP插入位点相反的位置（即我们设计中的5'端loxP靶点）。尽管仅靶向5'端位点时仍可能发生部分敲入事件，但通过筛选cryaa:venus的表达情况，应能减少这类插入事件的发生。我们采用Cas12a而非Cas9来引入双链断裂。与产生平末端的Cas9不同，Cas12a会产生粘性末端，且其PAM序列位于切割位点的对侧，间隔序列最长可达24个核苷酸。因此，Cas12a切割产生的初始插入缺失（indel）通常可以被重新靶向。综合来看，这些特性可能是Cas12a在刺激同源定向修复效率上高于Cas9的原因斑马鱼和哺乳动物细胞中。所使用的 TTTN PAM 序列由Cas12a介导的作用也使其更适用于靶向富含AT的非编码序列，这些序列可用于在floxed等位基因中构建内含子loxP插入位点。

在多个模型中进行靶向敲入存在一个问题，即作为修复事件，非同源末端连接相较于同源定向修复更具优势，这会导致靶向构建体稳定地随机插入。事实上，在小鼠胚胎干细胞中生成靶向敲除的首批方案就采用了反向选择策略以减少脱靶插入。因此，在本研究的所有靶向位点中，大多数P0首建个体都发生了随机整合。为了可靠地识别这些事件并确认靶向敲入，我们成功结合了转基因筛选和分子生物学方法。转基因反向筛选使我们能够清晰区分具有靶向和脱靶插入的F1个体。但该方法在注射胚胎中效果不佳，因为表达cryaa:绿色荧光蛋白和myl7:红色荧光蛋白的随机插入占主导地位，而罕见的同源定向修复事件很可能会掩盖对后者的识别。我们还证实，通过Southern分析进行分子验证对于确认精确整合并进一步排除随机整合至关重要。尽管考虑尽管被视为一种过时的技术方法，但它为以无偏倚的方式识别脱靶插入提供了最简单且最确定的手段。我们在rasa1afl上的研究结果进一步强调了将Southern印迹分析作为最终分子验证步骤的重要性，因为对F1代子代的初步PCR筛选结果被证实是虚假的。以往有多项研究证实了类似的案例，即假阳性PCR会干扰真实敲入 founders 的鉴定，这使得正交验证方法成为必要。事实上，考虑到我们在研究中观察到的多种不同插入事件类型，我们强烈建议结合PCR分析与转基因反筛选，并通过Southern印迹分析进行后续验证，以确定性地验证内源floxed等位基因。

我们使用gata2afl/fl获得的结果证明了floxed等位基因在斑马鱼幼虫阶段遗传分析中的实用性。我们之前依赖的是gata2aum27等位基因，该等位基因会导致大量胚胎会在幼虫阶段产生干扰分析的胚胎缺陷，这是大多数斑马鱼突变体的常见问题。值得注意的是，gata2aum27突变体胚胎存在循环系统缺陷，这可能会间接影响淋巴瓣膜的发育，而在其他模型中，淋巴瓣膜的发育对机械感觉输入较为敏感。相比之下，gata2aiDEC幼虫的循环系统和神经元特化均正常，但其淋巴瓣膜功能和形态发生存在缺陷，严重程度与外显率与(gata2a a^{mu m 27})突变体相似。这一观察结果与小鼠Gata2在淋巴瓣膜形成过程中已知的内皮自主性作用相符。需要指出的是，考虑到gata2aum27胚胎存在严重的循环系统缺陷，且gata2a在胚胎的内皮细胞中表达，gata2aiDEC胚胎的循环功能正常这一点多少有些出人意料。gata2a可能在实验中使用的4-羟基他莫昔芬（4OHT）处理之前的阶段发挥作用。另一种可能是，gata2a在gata2aECE:iCre未靶向的内皮亚型中发挥作用。例如，gata2aECE:iCre未在动脉内皮细胞中诱导重组，这表明躯干血管中仅该细胞类型可能因gata2a缺失而受到影响。此外，gata2aum27胚胎的循环系统缺陷也可能并非内皮自主性的。无论如何，gata2afl等位基因与其他Cre品系的结合使用，使我们能够更好地研究早期循环系统缺陷的细胞本质。

高效 CRISPR 核酸酶的研发如今使斑马鱼研究人员能够构建敲入等位基因。这方面的初步工作引入了短表位标签或报告转利用单个双链断裂（DSB）插入外源序列的基因。近期更多研究采用单重双链断裂（DSB）结合质粒打靶载体，通过同源定向重组（HDR）将条件性剪接捕获盒插入内含子中。这些等位基因还整合了报告转基因，用于观察内源表达并评估Cre介导的重组。然而，剪接捕获并非总能导致基因功能丧失，且可靠的报告基因表达仅局限于高表达基因。此外，剪接捕获法不适用于仅含一到两个外码的小基因。总体而言，loxP侧翼缺失等位基因更有可能实现明确的基因功能丧失。尽管构建这类等位基因的难度更大，但我们已发现的优化方法应能为研究人员提供助力。目前，小鼠研究领域已拥有数千个loxP侧翼等位基因和数百种Cre工具鼠，可在任意实验场景中开展遗传分析。这些工具使小鼠成为首要的遗传模式生物。作为研究脊椎动物发育的模型，斑马鱼目前正因缺乏此类工具而受到限制。我们希望此处的研究工作能作为一个初步框架，培育出更多可在斑马鱼中实现条件性基因操作的flox品系。

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