标题：Fatty Acid Oxidation in Zebrafish Adipose Tissue Is Promoted by 1α, 25(OH)2D3

期刊：Cell Reports

原文链接：http://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2017.04.066

研究亮点

l 斑马鱼Cyp2r1是体内25(OH)D的主要但非唯一贡献者

l Cyp2r1基因敲除斑马鱼的体细胞生长减缓且出现肥胖症状

l 维生素D信号通路通过诱导过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（Pgc1a）的表达来促进脂肪酸氧化

摘要

1a (, 25(OH)_{2} D_{3})（维生素 (D_{3})）对哺乳动物的矿物质稳态至关重要，但 (1 alpha, 25(OH)_{2} D_{3}) 在脂肪组织中的具体效应仍需在体内进一步阐明。初始的25-羟化反应由脊椎动物中保守的肝微粒体细胞色素P450 2R1（CYP2R1）催化。为探究(1 alpha, 25(OH)_{2} D_{3})在硬骨鱼中的生理功能，我们构建了两个独立的CYP2R1缺陷型斑马鱼品系。这些突变体表现出生长迟缓和肥胖程度增加的表型，在内脏脂肪组织（VAT）中尤为明显。(25(OH) D_{3})处理可挽救这些缺陷表型。染色质免疫沉淀-聚合酶链式反应（ChIP-PCR）分析表明，pgc1a是斑马鱼肝脏和内脏脂肪组织中维生素D受体的靶基因。在CYP2R1突变体的内脏脂肪组织中，还观察到Pgc1a蛋白水平显著降低、线粒体生物发生受损以及游离脂肪酸氧化能力下降。本研究结果表明，斑马鱼内脏脂肪组织中，(1 alpha, 25(OH)_{2} D_{3})的调控通过影响Pgc1a来调节线粒体生物发生和氧化代谢，进而参与脂质代谢过程。

图形摘要

引言

在早期化石中已发现维生素(D_{3})分子，但其最初存在形式本质上是7-脱氢胆固醇或其麦角固醇对应物的无活性终产物。(1 alpha, 25(OH)_{2} D_{3}) ([1,25(OH)_{2} D_{3}])，即维生素(D_{3})的活性代谢物，主要通过维生素D受体（VDR）发挥多种生理功能。在100年的时间范围内，营养性维生素D（VD）缺乏、VDR信号通路改变（包括VDR突变，即遗传性VD抵抗性佝偻病）以及(1,25(OH)_{2} D_{3})（Cyp27b1突变；假性VD缺乏）的生成不足，均被发现会导致与佝偻病相同的表型。这表明(1,25(OH)_{2} D_{3}) 对钙和磷酸盐代谢的调节以及骨骼的矿化至关重要（Malloy 和 Feldman，2012）。

维生素D受体（VDR）存在于大多数细胞中，而非仅存在于参与骨骼和矿物质稳态的细胞，这表明(1,25(OH)_{2} D_{3})对许多其他生理过程具有广泛作用，例如慢性代谢性疾病、心血管疾病和肿瘤性疾病（Rosen等人，2012年）。过去十年中，关于(1,25(OH)_{2} D_{3})对脂肪细胞生理学和脂质代谢的影响出现了重大争议。有研究报道，(1,25(OH)_{2} D_{3})的血清水平偏低与肥胖、糖尿病和代谢综合征的病理生理学相关（Arunabh等人，2003年；Pittas等人，2007年；Wortsman等人，2000年）。然而，多项关于维生素D（VD）补充剂的随机对照试验的系统评价发现，并无证据支持VD补充剂可降低肥胖、2型糖尿病、代谢综合征风险或减少脂肪含量这一假说（Elamin等人，2011年；Rosen等人，2012年）。此外，在(V D R^{-1-})小鼠中已证实，其整体脂肪量减少、能量消耗增加的表型（Narvaez等人，2009年）。因此，尽管VD似乎在脂肪细胞生理学中发挥积极作用，但来自不同人群的多项观察性和纵向队列研究数据与许多临床试验及现有的动物模型研究结果相悖。目前，关于VD在脂肪组织（AT）中的具体功能，仍存在明显的研究空白。

VD内分泌系统在整个脊椎动物进化过程中可能高度保守，这一点从CYP P450家族中存在高度相似且特异性的VDR代谢酶这一共同特征中可得到印证（戈德斯通等人，2010；科利茨等人，2015）。研究人员已从非洲爪蟾（李等人，1997）、斑马鱼（林等人，2012）、许多其他硬骨鱼类，甚至七鳃鳗（一种无颌鱼类，彼得罗米宗·马林努斯）中克隆出功能性VDR（惠特菲尔德等人，2003）。该内分泌系统的古老起源表明，与陆生动物中VD/VDR系统与矿化骨骼相关的现代功能相比，其可能发挥着更为基础的作用。此外，已有研究证实，VD/VDR信号通路可能参与(Ca^{2+}) 摄取的调控（Lin 等人，2012）。然而，对斑马鱼受精后7天（dpf）经 (1,25(OH)_{2} D_{3}) 处理后的全转录组分析显示，大多数差异表达转录本具有更广泛的活性谱，其中脂质代谢是受影响最显著的通路（瘦素、过氧化物酶体增殖物激活受体以及脂肪细胞分化相关基因的上调）（Craig 等人，2012）。综合来看，这表明 (1,25(OH)_{2} D_{3}) 调控着脊椎动物中多种生物学特性不同的通路以及尚未被发现的进化通路。

(1,25(OH)_{2} D_{3})是维生素(D_{3})的主要活性激素形式，它负责维生素D的大部分生物学作用。维生素(D_{3})由7-脱氢胆固醇生成，后者先被分解代谢为(25(OH)D)，随后转化为(1,25(OH)_{2} D_{3})。在小鼠体内，CYP2R1是负责肝脏组织中维生素(D_{3}) 25-羟化的主要酶之一，且已观察到(Cyp2r1)小鼠血清中(25(OH)D)水平下降超过50%。值得注意的是，(Cyp2r1-1-)小鼠血清中1,25(OH)(I, 25(OH)_{2} D_{3})水平与野生型（对照）小鼠维持在相近水平，这可能是观察到Cyp2r1缺陷小鼠相对健康的原因（Zhu等人，2013年）。在硬骨鱼中，(1,25(OH)_{2} D_{3})也被证实由肝脏和肾组织生成。由于斑马鱼是常见的硬骨鱼模型，斑马鱼的cyp2r1、cyp27b1和cyp24a1基因已被鉴定。具有功能的斑马鱼维生素D受体也被证实能对(1,25(OH) _{2} D_{3})产生响应并参与钙的调节过程（Lin 等人，2012）。然而，目前尚未有体内遗传模型被用于研究硬骨鱼（包括斑马鱼）中维生素 (D_{3}) 的生理功能。此外，斑马鱼模型为探索硬骨鱼在进化过程中维生素D/维生素D受体（VD/VDR）信号通路的基础功能提供了无可比拟的潜力。

鉴于现有研究对维生素D/维生素D受体（VD/VDR）信号通路在脂质代谢中潜在作用的深入认知，本研究以斑马鱼为模型探究该课题。研究构建并使用了两株独立的CYP2R1基因敲除斑马鱼品系。与CYP2R1基因敲除小鼠和野生型小鼠体内(1,25(OH) _{2} D_{3})水平相当不同，CYP2R1基因敲除斑马鱼的血浆（血清）、肝脏和脂肪组织（AT）中(1,25(OH)_{2} D_{3})水平显著降低。CYP2R1基因敲除斑马鱼表现出明显的躯体生长迟缓及脂肪组织（AT）蓄积增加的现象。令人意外的是，研究检测到突变体与野生型斑马鱼的血浆钙和磷酸盐水平相似。补充(25(OH)D)可挽救其躯体生长缺陷和脂肪组织含量异常。CYP2R1基因敲除突变体在饥饿状态下脂肪储备难以动员的现象，也表明营养缺乏时脂质动员过程受到了损伤。通过染色质免疫沉淀（ChIP）-PCR技术，研究发现斑马鱼肝脏和内脏脂肪组织（VAT）中，参与脂质代谢（尤其是线粒体功能）的过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（pgc1a）的基因组调控区可与维生素D受体（VDR）相互作用。实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）结果显示，pgc1a及众多线粒体相关基因的转录水平显著下调。最后，CYP2R1基因敲除斑马鱼内脏脂肪组织（VAT）中线粒体生物发生相关指标显著降低，具体表现为Pgc1a蛋白、其他线粒体蛋白水平、线粒体膜电位及游离脂肪酸（FFA）氧化活性均有所下降。本研究表明，CYP2R1基因是维持斑马鱼脂质代谢稳态的重要基础功能之一硬骨鱼中维生素D/维生素D受体的作用之一是通过调节脂肪组织中的线粒体生物发生来促进脂质代谢。

结果

斑马鱼Cyp2r1、维生素D受体与维生素D代谢酶

在斑马鱼基因组中，cyp2r1基因已被鉴定为人类CYP2R1的直向同源基因，该基因编码一种微粒体维生素D 25-羟化酶（Cheng等人，2003；Goldstone等人，2010）。对预测的斑马鱼Cyp2r1与其他脊椎动物的蛋白质序列进行比对分析发现，斑马鱼Cyp2r1与人类CYP2R1和小鼠CYP2R1的序列一致性分别为70%和69%。作为细胞色素P450家族的成员，经InterProScan 5鉴定发现，斑马鱼Cyp2r1具有E类细胞色素P450 I组特征序列，同时存在一个半胱氨酸残基，该残基是与血红素辅因子结合的推定配体（图S1A）（Cheng等人，2003）。系统发育分析表明，与斑马鱼自身亲缘关系最近的细胞色素P450家族成员cyp2u1和cyp2v1相比，斑马鱼cyp2r1与红鳍东方鲀、非洲爪蟾、小鼠和人类的该基因同源性更近（图S1B）（Goldstone等人，2010）。综上，这些特征表明斑马鱼Cyp2r1是哺乳动物CYP2R1的直向同源基因，且具有潜在的维生素D 25-羟化酶活性。

采用RT-PCR技术分析斑马鱼cyp2r1、vdra和vdrb基因在早期发育阶段及成体中的表达模式（图1A和1B）。图1A展示了这些基因的母源及胚胎表达模式。成体中，cyp2r1主要在肝脏、内脏脂肪组织和肌肉中表达。vdra和vdrb基因呈广泛表达，且vdra转录本的丰度高于vdrb转录本（图1B）。

维生素D的生物活性形式(1,25(OH)_{2} D_{3})的水平由参与维生素D代谢的多种酶动态平衡，这些酶包括细胞色素P450（CYP）超家族成员CYP2R1、CYP27B1和CYP24A1（Omdahl等人，2002；Prosser和Jones，2004；Schuster等人，2006）。研究测定了野生型斑马鱼不同年龄阶段下，编码这三种CYP成员转录本的基因表达水平、总脂质含量，以及(1,25(OH)_{2} D_{3})的血浆水平。编码活性维生素D相关酶的两个基因cyp2r1和cyp27b1在幼体斑马鱼（受精后1、2、3个月[mpf]）的肝脏中高表达，而在性成熟后的阶段（4和6个月）其表达水平显著下降（图1C和1D）。编码与(1,25(OH)_{2} D_{3})失活相关的酶的基因cyp24a1在成年阶段前表达水平极低，并在4和6个月时显著升高（图1E）。3个月时的血浆(1,25(OH)_{2} D_{3})水平较2个月时升高69%，显著更高。与3个月时相比，4和6个月时该血浆水平分别显著下降75%和80%（图1F）。1个月和2个月斑马鱼的总脂质含量无显著差异。与2个月时相比，3个月和4个月时的脂质含量显著下降，分别降低36.8%和44.1%。与4个月时相比，6个月时的总脂质积累增加了50%。（图1G）。这表明血浆中(1,25(OH)_{2} D_{3})的水平与机体脂质含量之间存在现有的负相关关系。

图1. 斑马鱼cyp2r1、维生素D受体及三种参与维生素D代谢的细胞色素P450基因的相对表达水平与全身体脂含量的动态变化。(A和B) cyp2r1、vdra和vdrb在(A)早期阶段和(B)成体组织中的表达模式。(C–E) 在1、2、3、4和6月龄时检测了野生型斑马鱼肝脏中(C) cyp2r1、(D) cyp27b1和(E) cyp24a1的表达水平。靶基因的表达水平以1月龄时的水平为参照。(F) 2、3、4和6月龄时野生型斑马鱼血浆中(1,25(OH)_{2} D_{3})的浓度。(G) 1、2、3、4和6月龄时野生型斑马鱼的总脂质含量。误差棒表示平均值±标准差。柱形上方不同字母表示存在显著差异。另见图S1。

靶向敲除cyp2r1基因导致斑马鱼生长迟缓

为研究斑马鱼中 (1,25(OH)_{2} D_{3}) 的功能，本研究采用转录激活子样效应物核酸酶（TALENs）技术敲除 cyp2r1 基因。TALEN 靶位点如图 2A 所示。获得两个独立的突变品系，分别为突变体 1 号（M1）和突变体 2 号（M2），其基因分别存在 8 个碱基对和 2 个碱基对的缺失（图 2B）。这些突变导致提前出现终止密码子，使 M1 和 M2 中的 Cyp2r1 分别截短为含 72 个氨基酸（aas）和 74 个氨基酸（aas）的蛋白（图 2C）。图中展示了突变体（((cyp2r1-1-))）和杂合子（((cyp2r1+/-))）典型的 AluI 酶切图谱。对照组（((cyp2r1+/+))）的F2代同窝幼鱼相关结果如图2D所示。与对照组同窝幼鱼相比，突变体肝脏中cyp2r1的转录水平显著升高（图2E）。突变体肝脏中cyp27a1和cyp27b1的表达水平也显著升高，而cyp24a1的表达水平则明显降低（图S2A）。细胞色素P450家族成员转录水平的变化体现了cyp2r1缺陷鱼中(1,25(OH)_{2} D_{3})减少的典型负反馈调节（Lechner等人, 2007; Sundaram等人, 2014），这一点通过检测鱼血浆、肝脏和内脏脂肪组织（VAT）中(1,25(OH)_{2} D_{3})的含量得到了证实（表1）。如表1所示，与对照组同窝幼鱼相比，突变体的内脏脂肪组织、肝脏和血浆中f7418d69-e722-40f3-a946-5878e2b7a626水平均明显下降，其中内脏脂肪组织下降87%、肝脏下降53%、血浆下降68%。

尽管在突变体的早期发育阶段未观察到明显缺陷（图2F），但成年突变体表现出体型矮小的生长迟缓表型（图2G）。突变体的存活率与野生型对照个体相似，但在25天龄后，其体重和标准体长均明显下降（表S1）。

维生素D的经典作用是维持钙和磷酸盐的稳态（Holick，2011）。尽管部分矿物质含量有所降低，但本研究突变体中的钙含量与体型匹配的对照鱼相似（表S2）。突变体的血浆钙和磷水平与同龄野生型鱼相比无明显差异（图S2B和S2C）。在幼体阶段采用了阿尔辛蓝染色观察软骨、钙黄绿素染色观察骨骼的检测方法。成年阶段则通过显微计算机断层扫描（microCT）进行骨骼扫描。相关检测结果显示，突变体的软骨和骨骼完整性及形态无明显差异（图S2D–S2G）。

图2. 利用TALENs技术敲除斑马鱼中的cyp2r1基因截短的突变体Cyp2r1蛋白。(A) 工程化TALENs在cyp2r1基因外显子(E)1上的结合位点（外显子以方框标出）。蓝色下划线字体表示TALENs两条靶向臂的序列，红色字体为限制性内切酶AluI的酶切位点。(B) 突变验证，展示了M1和M2品系cyp2r1基因转录本的测序结果。(C) 野生型(WT)和两种截短型蛋白的示意图。(D) (F_{2})品系鱼类cyp2r1基因位点经AluI酶切后的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。+/+，野生型；+/−，杂合子；−/−，纯合子。(E) 突变体品系成年鱼肝脏中cyp2r1的相对表达水平及其野生型对照同窝鱼。与对照组相比。(F和G) (F) 5 dpf和(G) 100 dpf时(cyp2r1-1-)品系鱼类与野生型对照的形态特征对比。另见图S2及表S1、S2。

Cyp2r1基因敲除导致斑马fish内脏脂肪过度积累

研究观察到，随着衰老进程，脂质含量与1 (,25(OH) _{2} D_{3})水平呈负相关（图1F和图1G）；因此，本研究分析了cyp2r1缺陷型鱼体内脂质代谢的特征。研究人员使用体视显微镜（图3A，a1和a2）和共聚焦显微镜（图3A，a3和a4），对大小匹配的突变型斑马鱼与野生型对照斑马鱼的尼罗红染色幼虫内脏脂肪进行了观察。与大小 （注：原文末尾“size”未完整，翻译保留该不完整状态）与匹配的对照组幼鱼相比，突变体的内脏脂肪组织（VAT）脂肪细胞数量显著增加（图3B）。两种基因型的幼鱼脂肪细胞面积频率相似（图3C），成鱼也是如此（图3F和3G）。与体型匹配的对照组相比，突变体成鱼的脂肪组织（尤其是内脏脂肪组织）也出现了扩张（图3D和3E）。此外，与年龄匹配的对照同窝仔鱼相比，雄性和雌性突变体的总脂质含量显著增加，分别升高了63%和41%（图3H）。这些结果表明，cyp2r1基因缺失导致的(1,25(OH)_{2} D_{3})水平不足，引发了内脏脂肪组织的过度积累，这主要是由于脂肪细胞数量增加而非脂肪细胞面积扩张所致。此外，与年龄匹配的对照同窝仔鱼相比，突变体的瘦体重含量（干重百分比）和水分含量（湿重百分比）均有所降低（表S3）。尽管总脂质过度积累，但突变体肝脏的甘油三酯水平与年龄匹配的对照同窝仔鱼相似（图S3）。

图3. cyp2r1基因敲除斑马鱼出现内脏脂肪组织过度发育。(A) 对幼年突变体和体型匹配的对照组（体长均为7.6毫米）的中性脂质进行尼罗红染色，随后通过体视显微镜（a1和a2）以及共聚焦显微镜（a3和a4）进行观察。(B和C) 图中展示了：(B) 共聚焦视野下（a3和a4）的内脏脂肪细胞数量以及(C) 内脏脂肪组织的面积分布频率。(D和E) 图中展示了：(D) 尼罗红荧光信号以及(E) 成年突变体与其体型匹配对照组的躯干横截面图像，可见突变体的皮下脂肪组织（箭头）增多且内脏脂肪组织过度堆积（箭头头）。比例尺为1毫米。(F) 成年突变体与其体型匹配对照组的内脏脂肪组织的苏木精-伊红染色切片。比例尺为100微米。(G) 脂肪细胞表面积的频率分布。(H) 突变体和年龄匹配的对照组在(100 dpf. cyp2r1+)、(n=5)、(cyp2r1)、(n=4)阶段的雌雄个体总脂质含量。误差棒表示平均值±标准差。(^{prime prime} p<0.01)；N.S.表示无统计学显著差异。另见图S3和表S3。

(25(OH)D) 处理可挽救突变体的缺陷

(25(OH)D) 作为CYP2R1的直接产物，被用于挽救突变体的缺陷。经(25(OH)D)处理后，与赋形剂处理的对照组同窝鱼相比，突变体不再出现发育矮小的情况（图4A）。对(25(OH)D)处理组和赋形剂处理的F2代同窝鱼的体重、标准体长及总脂质含量进行了统计分析。经(25(OH) D_{3})处理的突变体，其体重和标准体长不再低于对照组，甚至略高于赋形剂处理的对照组同窝鱼（图4B、4C）。经(25(OH)D)处理的突变体总脂质含量与赋形剂处理的对照同窝仔相比，即使下降了22%，其数值也显著降低（图4D）。除此之外，突变体中不足的(1,25(OH)_{2} D_{3})水平得到了恢复（表1）。这些结果表明，(VD_{3})的生物活性形式对于斑马鱼脂质代谢和体细胞生长的调控至关重要。

图4。(25(OH)D) 拯救实验。(A–D) 图中展示：(A) 100 dpf 时野生型对照组、cyp2r1 突变体以及经 (25(OH)D) 处理的 cyp2r1 突变体斑马鱼的形态学特征，(B) 体重，(C) 标准体长，(D) 总脂质含量。(N=11) 误差线表示平均值±标准差。柱形上方不同字母表示在 (p<0.01) 水平存在显著差异。

突变体中的脂解过程未受影响

此前针对哺乳动物的研究表明，在饥饿状态下，脂肪细胞会激活脂解作用，将甘油三酯分解为游离脂肪酸，并将游离脂肪酸转运至线粒体，推动脂肪酸氧化以产生三磷酸腺苷供机体生存（伊顿，2002；芬恩与戴斯，2006；克勒纳与霍佩尔，2000；奥尼尔等人，2013）。与对照组同胞相比，突变体在普通饲料喂养和饥饿状态下的血浆游离脂肪酸水平均显著升高，分别增加了85.7%和85.9%（表1）。另一方面，突变体在饥饿刺激下血浆游离脂肪酸水平相较于普通饲料喂养状态的增幅为42.9%，与对照组同胞的增幅（42.7%）相近，这表明突变体的脂质动员过程中存在正常的脂解过程。然而，通过尼罗红染色检测发现，经过10天或35天的饥饿处理后，突变体的脂肪组织仍远多于对照组同胞（图S4），这说明饥饿状态下突变体的脂质动员过程受到了阻碍。

由于我们的cyp2r1突变斑马鱼表现出与生长激素（gh1）突变体相似的表型（McMenamin等人，2013年），因此我们检测了生长激素（GH）信号通路的激活情况（图S5）。与对照组同胞鱼相比，突变体垂体中GH1蛋白的含量以及肝脏和内脏脂肪组织中ghra的表达水平显著升高（图S5A和S5C），肝脏中Stat5的磷酸化水平明显降低（图S5B），且内脏脂肪组织和肝脏中igf1的表达水平均有所升高（图S5C）。这些结果表明，在我们的突变体中GH信号通路的状态尚不明确，其具体机制也尚未清楚。

VD 受体结合 pgc1a 的内源性启动子

由于PGC1α是线粒体生物发生的主要调节因子（Ventura-Clapier等人，2008年），而线粒体生物发生对于游离脂肪酸（FFA）的氧化过程至关重要，因此我们进一步探究了维生素D/维生素D受体（VD/VDR）信号通路在PGC1α调控中的潜在作用。我们通过染色质免疫沉淀-聚合酶链式反应（ChIP-PCR）实验证实，在白色脂肪组织（VAT）中（图5A）以及肝脏中（数据未展示），维生素D受体（VDR）均能与pgc1α的启动子区域结合。pgc1α的转录和蛋白水平显著降低与对照同窝仔相比，突变体的VAT中该指标有所降低，而经(25(OH)D)处理后，这种降低得到了恢复（图5B和图5C）；同时在肝脏中，突变体的Pgc1a含量有所升高（图S6）。我们在pgc1a的启动子区域发现了VDR和RXR（类视黄醇X受体）的推定DNA结合结构域（DBD）（Carlberg和Campbell，2013）。为了评估pgc1a启动子区域是否能通过VDR与(1,25(OH) _{2} D_{3})的协同作用介导转录激活，以及VDR和RXR的推定DNA结合结构域在体内对此激活是否必需，我们构建了一系列荧光素酶报告基因载体（图5D）。实验结果表明，(1,25(OH)_{2} D_{3})处理可有效增强pgc1a:荧光素酶活性，但无法刺激突变型pgc1a:荧光素酶活性（图5E）。这些结果证明，VDR和RXR的推定DNA结合结构域均是(1,25(OH)_{2} D_{3})激活pgc1a所必需的。这表明(1,25(OH)_{2} D_{3})对pgc1a的刺激作用由VDR-RXR异二聚体介导，这是VDR信号通路的一个共同特征。

图5. 维生素D/维生素D受体信号通路调控pgc1a的转录。(A) ChIP-PCR 实验显示维生素D受体（VDR）与pgc1a启动子区域结合。该实验使用VDR抗体或对照兔免疫球蛋白G（IgG）进行。Input 代表未进行免疫沉淀的组织裂解物。(B 和 C) 突变体内脏脂肪组织（VAT）中pgc1a的(B) 转录本和(C) 蛋白水平均因(25(OH)D) 浸泡处理而恢复。(D) 斑马鱼pgc1a启动子荧光素酶报告基因的野生型（WT）以及VDR/RXR 推定DNA结合结构域（DBD）突变体（M1、M2 和 M3）的示意图。VDR 的ChIP 靶标位点显示在灰色框中（293 bp 至55 bp）。RXR 和 VDR 的推定DNA结合结构域分别用绿色和红色框表示。(E) (1,25(OH) _{2} D_{3}) 处理可增强斑马鱼胚胎中pgc1a 野生型启动子的活性，但对突变体启动子无此作用。误差棒代表平均值± 标准差；(" p<0.01) 标准差；**p < 0.01，与对照组相比。柱形上方不同字母表示存在显著差异。NS，无统计学显著差异。vdr-ab，VDR 抗体。另见图S6。

(cyp2r1)斑马鱼的内脏脂肪组织中线粒体功能受损

接下来，检测了两种PGC1α靶转录因子——核呼吸因子1（nrf-1）和雌激素相关受体α（erra）的转录水平，PGC1α正是通过这两种因子调控线粒体生物发生和脂质氧化（Scarpulla, 2011）（图6A）。突变体中这两个基因的下调表达可通过(25(OH)D)处理得到挽救。(PPAR gamma)在脂肪组织功能中发挥核心作用（Sharma and Staels, 2007），其在突变体的内脏脂肪组织（VAT）中表达上调。部分线粒体相关基因的转录水平显著降低，包括解偶联蛋白1（ucp1）、线粒体核糖体蛋白L15（mrpl15）、线粒体核糖体蛋白L2（mrpl2）、线粒体核糖体蛋白S10（mrps10）、线粒体分裂过程蛋白1（mtfp1）、线粒体钙单向转运体（mcu）以及溶质载体家族25（肉碱/酰基肉碱转位酶）成员20（slc25a20），而(25(OH)D)处理可逆转这些降低效应（图6A）。

最后，我们在突变体和对照同窝幼鼠的内脏脂肪组织（VAT）与肝脏中检测了多项线粒体相关参数。突变体内脏脂肪组织的相对线粒体基因水平下降了约50%，表明其内脏脂肪组织中的线粒体数量减少（图6B），而肝脏中未观察到差异（图S7A）。此外，两种线粒体蛋白标志物——线粒体细胞色素c氧化酶亚基1（由……编码）的蛋白水平mtDNA）以及细胞色素c氧化酶IV（由核DNA编码的Cox IV）在内脏脂肪组织中显著降低（图6C），而在突变体的肝脏中两者均有所升高（图S7B）。突变体内脏脂肪组织的线粒体膜电位损失显著增加（图6D），而在肝脏中则有所降低（图S7C），这表明突变体的内脏脂肪组织中线粒体功能受损，而肝脏未受影响。线粒体中([1-^{14} C])棕榈酸的氧化进一步支持了这一结论（图6E和图S7D）。整体耗氧率为突变体中该指标有所下降（图S7E）。这些结果表明，cyp2r1突变体的内脏脂肪组织（VAT）存在线粒体功能障碍和生物发生过程受损的情况，而肝脏中并未出现此现象，这可能是其内脏脂肪组织过量堆积却未发生肝脂肪变性的原因。综上，cyp2r1基因缺失会导致斑马鱼出现维生素D（VD）缺乏，进而通过调控线粒体生物发生和氧化代谢的关键调节因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（Pgc1a），损害线粒体的脂质氧化过程。

图6. cyp2r1基因敲除内脏脂肪组织中线粒体生物发生和功能受损。(A) 两个Pgc1靶基因nrf-1、erra、ppary以及一些线粒体相关基因（如ucp1、mrpl15、mrpl2、mrps10、mtfp1、mcu和slc25a20）在(25(OH)D)处理的突变体与载体处理的突变体及野生型同胞的内脏脂肪组织（VAT）中的转录本水平；(B和C) 突变体内脏脂肪组织（VAT）中的线粒体DNA相对水平（B）以及线粒体蛋白Mtco1和CoxIV的含量（C）降低；(D) 突变体内脏脂肪组织（VAT）中线粒体膜电位受损；线粒体膜电位的相对降低程度通过JC-1单体与聚集体的比值表示；(E) 突变体及其野生型同胞的内脏脂肪组织（VAT）中线粒体氧化([1-^{14} C])棕榈酸的能力；误差棒表示均值±标准差；(^{*} p<0.01)与对照组相比，柱形上方不同字母表示存在显著差异。另见图S7。

讨论

脂肪组织（AT）是机体最大的能量储存库，也是代谢燃料的主要来源。当食物供应短缺或能量消耗突然激增时，脂肪组织中储存的脂质对生物体的生存至关重要。脂肪组织是生命的基本特征，受到严格的调控。脂质储存与动员的调控必须精准调节，以维持生物体能量稳态的精确平衡（齐默尔曼等人，2004）。动物体内脂肪组织过多可能是脂质动员缺陷导致的结果，包括脂解、游离脂肪酸（FFA）运输和游离脂肪酸氧化过程异常（麦克梅纳明等人，2013；齐默尔曼等人，2004）。例如，斑马鱼内脏脂肪组织（VAT）中脂质的过度储存以及生长激素1缺陷突变体中脂质动员受损，会对机体生长产生不利影响（麦克梅纳明等人，2013）。在众多被赋予的功能中对于(1,25(OH)_{2} D_{3})，其在脂质和能量代谢调控中的作用被认为对肥胖、糖尿病和非酒精性脂肪肝等慢性疾病具有潜在影响（Arunabh等人，2003；Pittas等人，2007；Wortsman等人，2000），不过由于相关研究结论存在矛盾，其具体作用机制尚不明确（Elamin等人，2011；Rosen等人，2012）。基于斑马鱼不同生长阶段中与(D_{3})代谢相关的细胞色素P450家族成员的表达谱，鱼类体内的(1,25(OH)_{2} D_{3})水平与鱼体脂肪含量呈负相关（图1C-G），这表明VD参与了脂质代谢过程。我们的斑马鱼模型在基因编辑和脊椎动物组织可视化方面具有无可比拟的潜力，因此可利用该模型在体内对比e5b20d2b-4ab1-43c6-9726-6009733a405b缺陷型斑马鱼与野生型同胞鱼的脂质波动情况。本研究证实，cyp2r1缺陷型斑马鱼的内脏脂肪组织（VAT）相对体型比例偏高。较低的(1,25(OH)_{2} D_{3})含量还导致内脏脂肪组织中游离脂肪酸（FFA）水平升高、线粒体生物发生减少以及游离脂肪酸氧化功能异常（图6；表1）。此外，研究还观察到斑马鱼维生素D受体（VDR）与pgc1α（参与脂肪酸氧化的游离脂肪酸传感器）之间存在相互作用。内脏脂肪组织中Pgc1α及两种线粒体组成蛋白的含量降低，同时伴随线粒体膜电位异常（图5、图6）。

有研究表明，维生素 (D_{3}) 最初可能是在硬骨鱼中进化而来的钙调节激素，这一点可由以下证据表明进化和生理学研究。有研究表明，维生素(D/VDR)信号通路可上调斑马鱼中trpv6的转录（Lin等人，2012）。与对照组同胞相比，(1,25(OH)_{2} D_{3})成分在cyp2r1缺陷型斑马鱼血浆中的留存率约为32%，这可能是对照组和突变体斑马鱼血浆中钙和磷酸盐水平相近的原因（图S2；表1）。在幼体阶段（5天龄）和成体阶段（100天龄），cyp2r1缺陷型斑马鱼和对照组斑马鱼鳃中trpv6的转录水平无显著差异（数据未显示）。

肝脏在维持全身脂质稳态中发挥核心作用，而脂肪组织则专门负责能量储存。储存的甘油三酯会促使脂肪组织中的脂肪细胞肥大，并在禁食等能量不足的情况下被有效动员。然而，无论处于进食还是禁食状态，脂肪组织中的脂肪细胞都会发生甘油三酯水解、再酯化以及游离脂肪酸氧化的循环过程。斑马鱼cyp2r1的主要表达部位为肝脏、脂肪组织、肌肉和卵巢（图1B），而维生素D受体在斑马鱼体内呈广泛表达。这一发现表明，(1,25(OH)_{2} D_{3})的主要产生部位包括肝脏、脂肪组织和肌肉。尽管突变体鱼出现了严重的脂肪组织蓄积，但在组织病理学分析中并未观察到明显的肝脂肪变性（数据未展示）。关于线粒体生物发生方面，过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α的转录及表达水平在线粒体mRNA、线粒体蛋白含量和线粒体膜电位水平方面，在脂肪组织（VAT）中，cyp2r1缺陷型鱼与对照鱼之间已观察到重大变化（图5和图6）。然而，在cyp2r1缺陷型鱼的肝脏组织中未观察到类似的缺陷表型（图S7）。这可能是由于肝脏或脂肪组织中存在的维生素D受体（VDR）辅因子组合不同所致。此外，与cyp2r1缺陷型鱼的肝脏或血浆相比，其脂肪组织中(1,25(OH)_{2} D_{3})的含量降低幅度更大（表1）。这可能是脂肪组织成为cyp2r1缺陷型鱼主要靶器官的原因之一。维生素D受体（VDR）调控过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（pgc1a）和脂质氧化的机制仍有待研究。与对照组同窝仔鱼相比，CYP2R1 缺陷鱼的血浆中 (1,25(OH)_{2} D_{3}) 水平约保留 32%，由此我们可推测可能存在另一种潜在酶（或多种酶），这与小鼠中的情况类似（Zhu 等人，2013）。例如，在 CYP2R1 缺陷的肝脏中观察到 CYP27A1 的表达水平升高（图 S2A）；此前研究已表明，该酶是动物肝脏中另一种可行的潜在 (VD3) 25-羟化酶（Zhu 等人，2013）。血浆、肝脏和内脏脂肪组织（VAT）中 (1,25(OH)_{2} D_{3}) 含量分别减少约 68%、53% 和 87%；内脏脂肪组织过度积累；同时观察到躯体生长存在严重缺陷。此前，(1,25(OH)_{2} D_{3}) 对脂肪生成既有促进作用也有抑制作用已有研究在包括3T3-L1细胞在内的细胞培养模型中报道了其对脂肪生成的促进或抑制作用以及棕色脂肪细胞（Blumberg 等人，2006；Ricciardi 等人，2015）。在维生素D/维生素D受体（VD/VDR）信号通路被完全敲除的(VDR ^{-1-})和(Cyp27b1-1-)两种小鼠中，均观察到瘦型表型、对高脂饮食诱导的肥胖具有抵抗力、能量消耗减少、耗氧量增加以及(CO_{2})生成增加的现象（Narvaez 等人，2009；Wong 等人，2011；Zhu 等人，2013）。本研究中，突变体的血浆(1,25(OH)_{2} D_{3})水平约为对照组的32%，血浆钙和磷酸盐水平与对照组鱼相似，这可能是本研究结果与VD/VDR信号通路完全缺失且伴随严重低钙血症（如佝偻病）的(VDR ^{-1-})或(Cyp27b1-1-)小鼠在常规啮齿动物饲料喂养下的研究结果存在差异的原因。此外，由于硬骨鱼中典型的白色和棕色脂肪组织（AT）尚未明确界定（Minchin 和 Rawls，2011），鱼类内脏脂肪组织（VAT）脂质代谢的潜在机制以及解偶联蛋白（ucp）表达与非颤抖性产热或能量消耗之间的关联仍未被阐明。另一方面，本研究数据与众多流行病学研究结果一致，这些研究均报道了肥胖与循环系统之间存在负相关关系(25(OH)D) 水平（Arunabh 等人，2003；Pittas 等人，2007；Wortsman 等人，2000）。也有研究报道，维生素D补充剂可限制高脂饮食诱导的小鼠体重增加，同时使棕色脂肪组织中的过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（pgc1α）表达、线粒体代谢及脂质氧化水平升高（Marcotorchino 等人，2014）。本研究结果明确证实了斑马鱼维生素D/维生素D受体（VD/VDR）信号通路在促进pgc1α转录和游离脂肪酸（FFA）氧化过程中的作用。配体结合型维生素D受体与脂质代谢中关键的其他核受体（如过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPAR）和类视黄醇X受体（RXR））之间的潜在串扰机制目前仍不明确。

尽管大量观察和流行病学证据表明维生素D（VD）状态、肥胖与代谢综合征之间存在关联，但目前所有针对临床试验数据的系统综述均无法证明VD补充治疗能带来统计学上的阳性改善（Elamin等人，2011；George等人，2012）。我们推测，在整个脊椎动物进化过程中，VD/VDR系统的药效动力学关系一定发生了变化，而这种变化可能是由维生素D受体（VDR）与其共调节因子之间的蛋白质-蛋白质相互作用改变所驱动的。然而，根据我们实验中的观察，只有(1,25(OH)_{2} D_{3})，即维生素D3的活性形式，才能有效当 (1,25(OH)_{2} D_{3}) 的血浆水平升高时改善相关状况含量有所下降。成年动物体内cyp2r1的低表达水平，或许无法将所有随机临床试验中补充的、无活性形式的维生素(D_{3})（或胆钙化醇）充分转化（Elamin等人，2011；George等人，2012）。本研究基于斑马鱼模型的数据表明，(1,25(OH)_{2} D_{3})是动物体内脂质代谢的重要调节因子；深入了解该激素的作用机制，对于应对全球肥胖流行具有重要意义。

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苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。