题目：The microbiome protects against septic hyperinflammation and bacterial proliferation in a zebrafish model of blood infection with Escherichia coli and mycobacteria

原文链接:：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2026.1837804/full

期刊：Frontiers in Immunology

摘要

微生物组是重要的免疫调节因子，但共生微生物在血流感染期间塑造宿主全身防御的机制仍未被充分阐明，且常用的临床前模型存在实际、伦理和科学层面的局限性。本研究建立了无菌斑马鱼幼虫模型，以探究微生物组对大肠杆菌（一种早期新生儿败血症的重要致病菌）引起的全身性血液感染的保护作用。同时，本研究利用非结核分枝杆菌感染斑马鱼幼虫，探究Toll样受体2（TLR2）在防御反应中的作用。从同一批鱼卵孵化出的无菌（GF）和常规化（CONVD）幼虫经大肠杆菌全身感染后，结果显示微生物组定植显著降低了幼虫早期死亡率。转录组测序（RNAseq）结果显示，无菌幼虫和常规化幼虫均存在保守的核心免疫激活程序，但无微生物组定植的幼虫表现出更广泛的转录反应，且对代谢通路的抑制更强，这表明共生微生物可缓冲感染引发的代谢抑制。将这一研究框架拓展至非结核分枝杆菌感染，本研究在无菌和常规化条件下，利用荧光标记的海分枝杆菌和鸟分枝杆菌对TLR2野生型及突变型幼虫进行全身感染。尽管幼虫存活率未发生显著变化，但成像定量分析表明，TLR2突变型幼虫和无菌幼虫的细菌增殖更为显著，而微生物组对细菌载量的限制作用仅在野生型宿主中明显，在TLR2缺陷型宿主中则不存在。综上，本研究数据表明微生物组定植可通过重塑全身炎症和代谢程序来缓冲败血症相关不良结局，并证实TLR2是非结核分枝杆菌感染期间连接微生物定植与有效宿主防御的关键节点。

关键词：大肠杆菌、微生物组、非结核分枝杆菌、Toll样受体2、斑马鱼

引言

微生物组已成为宿主免疫的核心调节因子，影响免疫发育、炎症状态和代谢稳态（1）。生命早期的微生物定殖尤为重要，因为它塑造免疫系统的成熟过程，并调节宿主对微生物刺激的反应能力。例如，无菌动物模型研究表明，共生微生物的缺失会导致先天和适应性免疫反应出现严重缺陷、代谢发生改变，同时还会增加感染易感性（2, 3），但目前尚不清楚这种保护效应在功能层面是如何实现的。免疫刺激作用、抗炎信号激活等多种因素可能参与其中，但宿主与微生物组相互作用的复杂性和动态性，使得这一研究主题极具挑战性。败血症小鼠模型为探究宿主-病原体与宿主-微生物组的相互作用提供了有价值的见解（4, 5），但要将感染挑战和微生物组改变整合到幼崽模型中仍存在困难，这也凸显了开发新型动物模型的必要性。

新生儿败血症是导致新生儿和婴儿死亡的最常见原因之一（6）。根据发病时间，该病可分为早发型和晚发型。此外，早发型和晚发型败血症的常见致病病原体也存在差异，早发型败血症主要由无乳链球菌和大肠埃希菌（大肠杆菌）引起（7）。临床治疗采用经验性抗生素疗法，但该方法亟待优化，这需要识别可靠的生物标志物来指导治疗决策（8, 9）。健康的微生物组对新生儿败血症具有显著的保护作用（10），这表明基于微生物组修饰的临床前模型能够为免疫反应的调控提供有价值的见解。未来，此类模型也可用于新治疗方案的筛选与验证。

Toll样受体（TLRs）在识别微生物产物和协调先天免疫反应中发挥关键作用（11, 12）。其中，Toll样受体2（TLR2）可识别多种细菌配体，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的脂蛋白与细胞壁成分，以及分枝杆菌（13-15）。TLR2信号通路与炎症反应、代谢调节及宿主对多种病原体的防御相关（16-19）。重要的是，越来越多的证据表明，TLR2并非独立发挥作用，而是整合来自共生微生物的微生物信号，以微调免疫和代谢程序（20-22）。在全身感染过程中，TLR2依赖性信号如何与微生物组定植相互作用以调节宿主反应，目前尚不清楚。

斑马鱼（斑马拟丽鱼）是一种强大的脊椎动物模型，可用于在体内研究宿主与微生物的相互作用（23, 24）。其具有光学透明性、先天免疫系统保守，且适用于无菌和共生微生物研究方法，使其特别适合在整体生物层面研究系统性感染和免疫动态（23, 24）。基于脂多糖（LPS）刺激（25）以及活大肠杆菌（26, 27）的斑马鱼幼体败血症模型已被开发出来，并且发现这些模型能重现人类败血症的诸多特征。

我们利用斑马鱼幼虫开展了一系列实验，以阐明微生物组如何调节免疫反应和炎症状态（28,29）。本文通过将微生物组作为变量引入现有败血症感染模型，旨在探究微生物组与免疫系统的串扰如何影响感染结局。我们的主要目标是确定微生物组是否能抵御败血症性过度炎症和细菌增殖，并阐明这种保护作用背后的分子机制，重点关注TLR2信号通路。本研究为微生物组与免疫系统的串扰提供了新见解，并表明调控微生物组来源的信号或TLR2依赖性通路或可成为增强宿主对血流感染抵抗力的潜在策略。

结果

微生物组定殖为斑马鱼胚胎抵抗大肠杆菌感染引发的早期死亡提供保护

为评估微生物组对脓毒症感染的保护作用，将无菌（GF）和常规饲养（CONVD）斑马鱼幼虫感染不同剂量的大肠杆菌ATCC 25922菌株（该菌株为源自临床分离株的大肠杆菌参考菌株），并持续监测其存活率随时间的变化（图1A）。结果显示，在低感染负荷（500菌落形成单位）下，GF组与CONVD组的存活率无显著差异（图1B）。然而，在较高感染负荷（1000和4000菌落形成单位）下，微生物组的存在对早期死亡具有显著的保护作用，因为CONVD组幼虫的存活率高于GF组（图1C、D）。具体而言，感染1000菌落形成单位后，CONVD组在感染后48小时的存活率为76%，而GF组仅为52%（图1C）。感染4000菌落形成单位后，CONVD组的存活率为32%，而在48小时感染后（hpi），无菌（GF）组中没有幼虫存活（图1D）。值得注意的是，CONVD组在感染时仅定植了6小时，其死亡率低于GF组，这表明即使是相对短暂地接触共生微生物也能提供一定的保护作用。这些研究结果表明，微生物组定植为生命早期提供了对抗系统性大肠杆菌感染的保护，凸显了微生物预刺激在塑造宿主防御能力方面的重要性。

图1 无菌或常规化条件下感染不同剂量大肠杆菌的斑马鱼幼虫存活曲线概率。(A) 实验流程示意图。胚胎在受精后0小时（hpf）收集。受精后6小时（hpf），通过化学处理对胚胎的外层绒毛膜进行灭菌处理，并将胚胎在无菌（GF）条件下维持至受精后3天（dpf）。受精后3天（dpf），当幼虫脱去绒毛膜并发育出开放的口腔和胃肠道时，通过引入常规饲养组的微生物构建常规化（CONVD）组。分组后6小时进行大肠杆菌全身显微注射，以便在感染前稳定微生物状态。无菌组和常规化组的幼虫通过向库维管显微注射的方式全身感染大肠杆菌。每个处理组共选取25只成功注射的幼虫进行后续分析。在注射后20、40和48小时（hpi）进行存活率监测。(B、D) 幼虫感染不同感染剂量大肠杆菌（500菌落形成单位（CFU）(B)、1000菌落形成单位（CFU）(C)和4000菌落形成单位（CFU）(D)）后的存活曲线。数据来自三次独立实验。卡普兰-迈耶生存曲线代表三次实验的合并数据。采用曼特尔-考克斯检验进行生存曲线统计比较。*P<0.05、***P<0.001，ns表示无显著性差异。

大肠杆菌感染引起的转录组学改变在微生物组存在或缺失情况下存在差异

为了更深入地研究微生物组对致死性的保护作用这一现象，我们开展了RNAseq研究，以对比无菌（GF）和常规饲养（CONVD）条件下大肠杆菌感染引起的转录组变化（图2A）。在无菌（GF）在该条件下，与PBS模拟注射对照组相比，大肠杆菌感染的幼虫中鉴定出了2025个显著差异表达基因（DEGs）的特征集（错误发现率：P value <0.05），其中包括1388个上调基因和637个下调基因（图2B）。在CONVD条件下，与PBS模拟注射对照组相比，大肠杆菌感染的幼虫中检测到1288个差异表达基因的特征集（错误发现率：P value <0.05），包含1009个上调基因和279个下调基因（图2B）。其中，CONVD和GF条件下共有854个上调差异表达基因和160个下调差异表达基因，这表明大肠杆菌感染触发了一个核心转录程序，无论微生物组定殖状态如何，该程序的调控方式均相同（图2C）。此外，无微生物组定殖的情况下差异表达基因的总数显著高于定殖状态，提示微生物组定殖会缩小并减弱宿主对全身性感染的转录应答。这一模式与共生微生物预先调节宿主免疫系统、限制对细菌性脓毒症的过度或失调应答的观点相一致。

图2 无菌（GF）条件下的差异表达基因（DEGs）（E）。（F、G）上调差异表达基因的前15个基因本体（GO）生物学过程（BP）条目富集分析 图2 无菌或常规化条件下经大肠杆菌全身感染后产生的差异基因表达谱。（A）实验流程示意图。受精后3天（dpf），斑马鱼幼体维持无菌（GF）状态，或通过暴露于特定微生物群落实现常规化（CONVD）。分组后6小时进行大肠杆菌全身显微注射，以便在感染前稳定微生物状态；注射后4小时（hpi）收集注射幼体，用于RNA提取和Illumina RNA测序（8条幼体为1个样本池，每组3个样本池）。对两组比较进行差异表达分析：（i）无菌（GF）条件下，大肠杆菌注射幼体与PBS对照注射幼体的比较；（ii）常规化（CONVD）条件下，大肠杆菌注射幼体与PBS对照注射幼体的比较。（B）无菌（GF）和常规化（CONVD）条件下，大肠杆菌注射幼体与PBS对照注射幼体的差异表达基因（DEGs）数量。差异表达基因通过(P value < 0.05)进行评估，并经Benjamini和Hochbery错误发现率（FDR）校正（FDR P值<0.05）。上调基因集以红色显示，下调基因集以蓝色显示。（C）韦恩图展示大肠杆菌全身感染后，无菌（GF）和常规化（CONVD）幼体中鉴定出的差异表达基因（DEGs）的重叠情况。标注了共有和条件特异性的上调（红色）及下调（蓝色）差异表达基因。（D、E）常规化（CONVD）条件下，上调差异表达基因（D）和下调差异表达基因（G）的前15个基因本体（GO）生物学过程（BP）条目富集分析。

针对上述鉴定出的差异表达基因特征集进行基因富集分析时，我们使用DAVID生物信息学工具完成了基因本体论（GO）生物学过程（BP）条目富集分析。总体而言，对于上调的差异表达基因，在无菌（GF）和常规饲养（CONVD）两种条件下其富集的通路相似，且均以免疫反应相关过程为主（图2D、F）。相比之下，下调的差异表达基因则呈现出微生物组定植条件特异性的富集模式。例如，脂质代谢过程通路仅在GF条件下的下调基因中富集（图2E、G），这表明在无微生物组的情况下，全身性大肠杆菌感染会更强地抑制宿主的脂质代谢。这些结果表明，尽管GF和CONVD幼鱼共享一套核心的免疫激活程序，但微生物组定植重塑了宿主免疫应答的代谢层面，缓解了感染诱导的脂质代谢通路抑制。

为补充GO分析，我们对相同的差异表达基因集进行了KEGG富集分析。在GF和CONVD两种条件下，大肠杆菌感染上调的差异表达基因均显著富集于免疫相关通路，包括细胞因子介导的信号传导、模式识别受体信号通路、细胞凋亡和细胞坏死（图3A、C）。这些共有的富集结果表明，大肠杆菌感染触发了一套保守的核心免疫激活程序，其在很大程度上不依赖于微生物组定殖状态。相比之下，下调的差异表达基因在GF和CONVD幼虫之间表现出显著差异（图3B、D）。在GF幼虫中，下调基因优先富集于代谢过程，包括一般代谢过程、淀粉和蔗糖代谢、甘油脂代谢、半乳糖代谢以及脂肪酸代谢，这表明在无微生物组的情况下发生的全身性感染会伴随宿主代谢功能的广泛抑制（图3B）。值得注意的是，这些代谢通路在CONVD幼虫的下调差异表达基因中的富集程度要低得多，这表明微生物组定殖可缓冲感染引起的代谢基因程序抑制（图3D）。

图3 无菌或常规化条件下大肠杆菌全身感染导致的差异表达基因的KEGG富集通路分析。(A、B) 无菌条件下上调差异表达基因(A)和下调差异表达基因(B)的KEGG通路富集分析。(C、D) 常规化条件下上调差异表达基因(C)和下调差异表达基因(D)的KEGG通路富集分析。采用超几何检验/费希尔精确检验确定差异表达基因的KEGG通路条目，阈值为P value < 0.05，并通过本雅明尼-霍赫贝格错误发现率校正进行调整。

全身性大肠杆菌感染期间依赖微生物组的免疫与代谢通路调控

为了进一步阐明微生物组定殖如何调节宿主对全身性大肠杆菌感染的反应，我们比较了在无菌（GF）和常规化（CONVD）条件下，感染组与磷酸盐缓冲液（PBS）注射组幼虫之间的差异表达基因（DEGs），重点关注关键的免疫相关和代谢通路（图4）。对于每个通路，差异表达基因被分为共同调控的GF 与 CONVD 幼虫共有的基因，或在单一条件下被特异性调控的条件特异性基因。GF 条件下代表性通路中差异表达基因（DEGs）的详细信息见补充表 1，CONVD 条件下的相关信息见补充表 2。

在包括Toll样受体信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、凋亡以及干扰素（IFN）通路在内的多种免疫相关通路中，有一组核心基因在GF和CONVD两种条件下均受到共同调控。这些共有基因包括经典的先天免疫调控因子，如髓样分化初级反应蛋白88（myd88）、白细胞介素-1受体相关激酶3（irak3）、活化B细胞核因子κ轻链增强子（nfkb）家族成员、信号传导与转录激活因子（stat）基因、转录因子（AP-1基因）、干扰素调节因子（irf基因）、基质金属蛋白酶（mmp）家族成员以及趋化因子（cxcl和ccl家族成员），这表明大肠杆菌感染会触发一套保守的转录程序，且该程序与微生物组状态无关（图4）。

图4 无菌或常规化条件下经大肠杆菌全身感染后产生的共同及特异性基因表达谱。在可视化结果中，展示了无菌（GF）或常规化（CONVD）条件下，注射大肠杆菌的幼虫与注射磷酸盐缓冲液（PBS）对照的幼虫之间的基因表达差异，颜色用于标识：深橙色代表GF条件下上调的基因；深蓝色代表GF条件下下调的基因；浅橙色代表CONVD条件下上调的基因；浅蓝色代表CONVD条件下下调的基因。FDR P value <0.05。

相比之下，条件特异性转录特征在几个途径中很明显。在GF幼虫中，大肠杆菌感染独特地调节参与细胞因子信号传导（例如il10、il10ra）、凋亡（例如tnfrsf1b、tp63）和代谢途径的基因，表明在没有微生物定植的情况下宿主反应夸大或失调。值得注意的是，在GF条件下，一些补体成分（例如c3A.3、c1s）也优先诱导，与高度炎症信号一致。相反，CONVD幼虫显示了一组更受限制的条件特异性基因，包括选择性调节细胞因子受体（il17ra1b）、phagosome-associated基因（ncf2、mrc1b）和自噬相关基因（sqstm1、soga3a）。这些发现表明微生物群定植微调免疫和组织重建模型反应，潜在地限制过度炎症，同时保持抗菌防御。

TLR2和微生物组的缺失促进全身感染后分枝杆菌增殖

为了评估微生物群定植是否会改变宿主对非结核分枝杆菌感染的依赖性，我们系统地将M. marina Mma20和M.avium MAC 101细菌注射到GF和CONVD幼虫（图5A）。Mma20和MAC 101感染后所有组的存活率在微生物条件之间没有显着差异，表明早期与大肠杆菌的情况不同（图5B至G），在本实验条件下，死亡率并非反映微生物组依赖性效应的敏感指标。

图5胃肠道，常规化（CONVD）组通过引入来自常规饲养组的微生物而产生。M.图5在无菌或常规化条件下感染一系列剂量M. marina Mma20或M.avium MAC 101的斑马鱼幼虫的存活概率曲线。（A）实验工作流程的示意图概述。在受精后0小时（hpf）收集来自AB/TL系的胚胎。在6 hpf时，通过化学处理对胚胎的外部绒毛膜进行消毒，并将胚胎维持在无菌（GF）条件下，直到受精后3天（dpf）。在3 dpf时，当幼虫脱落绒毛膜并张开嘴并且marina Mma20或M.avium MAC 101细菌系统微量注射在组划分后6小时进行，以允许在感染前稳定微生物条件。来自GF和CONVD组的幼虫通过显微注射入Cuvier导管系统地感染Mma20或MAC 101细菌。每个实验组共纳入25只成功注射的幼虫用于以下分析。在注射后20、40和48小时（hpi）进行存活率监测。（B-D）Kaplan Meier图感染后幼虫存活率增加Mma20、250 CFU（B）、500 CFU（C）和1000 CFU（D）的传染负担。（E-G）Kaplan Meier图感染后幼虫存活率增加MAC 101、1000 CFU（E）、2500 CFU（F）和5000 CFU（G）的传染负担增加。数据收集自三个独立实验。Kaplan-Meier生存曲线代表来自所有三个实验的汇总数据。通过Mantel-Cox检验的统计曲线比较；ns，非显着性。

为进一步确定TLR2和微生物组对非结核分枝杆菌全身宿主防御的作用，我们在无菌（GF）和常规化（CONVD）条件下，向tlr2野生型和突变型斑马鱼幼虫注射荧光菌株（Mma20 DsRed和MAC 101 mCherry），并在感染后2天（dpi）进行共聚焦成像（图6A、B，图7A、B）。与初始存活实验结果一致，无论是感染Mma20还是MAC 101，在感染后2天各条件下均未检测到幼虫存活率存在显著差异（图6C）。相比之下，定量成像显示细菌增殖情况受基因型和微生物组的双重调控，且存在明显的依赖关系。感染Mma20时，在GF和CONVD两种条件下，tlr2突变型幼虫的全身及前部区域细菌载量均显著高于野生型幼虫（图6D、E）；而后部区域仅在CONVD条件下，tlr2突变型幼虫的细菌载量才出现明显升高（图6F）。在同一基因型内比较微生物组状态时，GF条件下的野生型幼虫Mma20载量高于CONVD条件下的野生型幼虫；但tlr2突变型幼虫中未观察到这种由微生物组介导的细菌载量降低现象，这表明微生物组对Mma20生长的抑制作用需要具有功能的TLR2信号通路参与。

在MAC 101感染期间也观察到了类似的模式。尽管各组的存活率保持不变（图7C），但在GF和CONVD两种条件下，tlr2突变体全身和后部区域的细菌载量均高于野生型（图7D、F）。在前部区域，tlr2突变体的细菌载量增加仅在CONVD条件下明显（图7E）。与Mma20的情况一致，GF野生型幼虫的MAC 101载量高于CONVD野生型幼虫，而在tlr2突变体中未检测到显著差异，这再次表明，在缺乏TLR2的情况下，微生物组对细菌增殖的调控作用被削弱。

综合来看，这些结果表明，TLR2的缺失始终能显著促进Mma20和MAC 101的增殖，且微生物组定植会限制野生型幼虫体内的分枝杆菌生长，但对tlr2突变体则无此作用。这支持了这样一种模型：TLR2依赖性信号传导直接参与全身抗分枝杆菌防御，而微生物组则提供了至少部分依赖TLR2的额外保护机制，这一机制可能通过启动或调控先天免疫效应程序来限制细菌的增殖。

图6在无菌或常规条件下全身感染后，tlr2突变体和野生型斑马鱼幼虫的M. marina Mma20的细菌负荷。（A）实验工作流程的示意图概述。在受精后3天（dpf），tlr2突变体和野生型幼虫通过暴露于定义的微生物群落而保持为无菌（GF）或常规化（CONVD）。DsRed标记的M.marina Mma20细菌全身微量注射在分组后6小时进行，以允许在感染前稳定微生物条件，并在注射后48小时（hpi）收集注射的幼虫进行共聚焦成像。（B）显示Mma20传播到幼虫前后区域的代表性荧光图像。细菌显示在洋红色中。标尺条：100µm。（C）Mma20感染后所有组的存活率显示基因型或微生物条件之间没有显着差异。结果基于3个独立实验。误差条代表平均值±SD。（D-F）全身（D）、前区（E）和后区（F）Mma20细菌负荷（荧光像素计数）的定量。ThedatafromGF(tlr2+i+)(n=24)组、(GF thr2)(n=22))组、CONVD(tir2+i+)(n=20)组和CONVD(triz)（n=22）组基于三个独立实验。统计显著性差异由单向方差分析确定，红色arrowspointtothemedian、ns、非显著性、*P<0.05 * * P<0.01 L **P<0.001 L****P<0.0001

图7 无菌或常规化条件下全身感染后tlr2突变体与野生型斑马鱼幼虫中鸟分枝杆菌MAC 101的细菌载量。(A) 实验流程示意图。受精后3天（dpf），将tlr2突变体和野生型幼虫分为无菌（GF）组和常规化（CONVD）组，常规化组通过暴露于特定微生物群落实现。6小时后进行mCherry标记的鸟分枝杆菌MAC 101全身显微注射，以在感染前稳定微生物状态，并在注射后48小时（hpi）收集注射的幼虫用于共聚焦成像。(B) 代表性荧光图像显示MAC 101在幼虫前后区域的扩散。细菌呈品红色。比例尺：100微米。(C) MAC 101感染后各组的存活率，基因型或微生物条件之间无显著差异。结果基于3次独立实验。误差线表示平均值±标准差。(D-F) 对幼虫全身（D）、前部区域（E）和后部区域（F）中MAC 101细菌载量（荧光像素数）的定量分析。(GF thr2 ^{+/ 4})组、GF tlr2-/- (n=26)组、CONVD (tir2+/+) 1 (n=23)组和CONVD (tlr2) (n=20)组的数据均基于3次独立实验。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）确定统计学显著性差异，红色箭头指向中位数，ns表示无显著性差异，*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.0001

讨论

微生物组定植可减轻全身性大肠杆菌感染后的早期死亡并缓解感染引发的代谢抑制

本研究证实，微生物组定植能为早期死亡提供快速且强效的保护作用斑马鱼幼虫系统性大肠杆菌感染后的相关情况。在低感染负荷下，无菌（GF）和常规（CONVD）幼虫的存活率相当，但在较高细菌剂量下，微生物组的存在显著降低了早期死亡率（图1）。研究结果表明，微生物定植可提高宿主在感染早期对系统性细菌攻击的耐受性。健康的微生物组在预防新生儿败血症方面的重要性已在人类中得到充分证实；然而，据我们所知，大多数研究都集中于晚发性败血症（LOS）和坏死性小肠结肠炎（NEC）（10, 39-41），而早期微生物定植在预防早发性败血症（EOS）中的潜在作用仍未得到充分探索。这很可能是因为EOS是一种用该领域一些主流研究方法（如前瞻性队列研究，这些方法为LOS领域的研究做出了重大贡献（40, 42））开展研究的难度本就更高的疾病，而在EOS队列中开展此类研究将极为困难。我们的斑马鱼模型采用了与EOS相关的病原体大肠杆菌（7），并探究了极短期早期微生物定植的影响，与EOS的研究范式最为接近。因此，我们关于定植对败血症具有明确保护作用的研究结果，应被视为认识到与LOS类似，微生物组定植也可能在预防EOS中发挥重要作用的第一步。值得注意的是，即使微生物组暴露仅局限于感染前六小时，也观察到了这种保护作用，这表明短期微生物定植足以增强宿主对败血症攻击的抵抗力。这些发现支持了微生物启动的概念，即共生微生物可在生命早期快速校准宿主的免疫反应性，提高宿主对系统性感染的耐受性（43, 44）。

微生物定植对晚发性败血症（LOS）和新生儿坏死性小肠结肠炎（NEC）的保护作用被认为通过多种机制介导，包括增强肠道屏障功能、直接和间接的免疫调节、代谢效应以及对潜在病原体的生态位排斥（39、45、46）。在我们的斑马鱼微生物组模型中，转录组分析显示，大肠杆菌感染在无菌（GF）和常规（CONVD）幼虫中均诱导了显著的转录反应，包括大量共有的上调差异表达基因，这些基因富集于免疫相关通路。这种保守的反应可能代表了一种核心的感染诱导程序，其在很大程度上独立于微生物组状态，反映了血流感染时激活的基础宿主防御机制（47）。然而，无菌幼虫中转录扰动的总体幅度明显更大，这表明微生物组的缺失会导致宿主对感染的缓冲作用减弱，系统性反应更为广泛。这一观察结果与无菌宿主存在免疫成熟改变、免疫稳态受损的证据一致，这些宿主通常伴随炎症状态失调以及对感染的易感性增加（48-50）。未来的研究应聚焦于蛋白质水平的验证和细胞类型特异性分析，以更深入地揭示微生物组介导免疫调节的细胞基础。

本研究的一项关键发现是，微生物组定植会选择性地调节宿主对感染的反应的代谢维度。而免疫激活通路在GF和CONVD两种条件下的上调基因中均富集，而下调基因则表现出显著的微生物组依赖性差异。具体而言，脂质代谢过程以及多种碳水化合物和脂肪酸代谢通路仅在GF幼虫的下调基因中高度富集（图2、图3）。这表明，在没有微生物组的情况下，全身性大肠杆菌感染会广泛抑制宿主的代谢程序，而微生物定殖抵御感染诱导的代谢抑制。这些结果表明，微生物组有助于将有效的免疫激活与广泛的代谢关闭解偶联，从而在脓毒症应激期间维持代谢稳态。从机制上讲，这种缓冲效应可能源于持续的微生物信号传导，该信号会设定免疫激活阈值，防止过度的炎症扩散影响代谢调节（51、52）。此外，感染期间微生物组产生的代谢物可能直接支持宿主能量代谢或线粒体功能，从而降低免疫激活的代谢成本。尽管全转录组测序限制了组织特异性分辨率，但我们的数据表明，微生物组是全身感染期间免疫代谢平衡的关键调节因子。未来采用组织解析或单细胞方法的研究对于阐明微生物信号如何在细胞水平协调免疫和代谢反应至关重要。

TLR2与微生物组在限制全身感染后分枝杆菌增殖中的保护作用

我们此前已证实，幼虫先天免疫系统的设定值可通过对Toll样受体（TLR）衔接分子髓样分化初级反应基因88（myd88）的转录调控，受细菌定植影响（28），但此前未在感染条件下探究过这一现象。因此，我们进一步研究了微生物组和TLR2如何在宿主对抗系统性非结核分枝杆菌感染的防御过程中发挥作用。通过荧光标记的(M.)海分枝杆菌和鸟分枝杆菌，我们发现TLR2缺陷以及微生物组缺失均会导致血流感染后细菌载量增加。尽管在实验时间范围内存活率未发生显著变化，但tlr2突变体幼虫的细菌增殖持续增强，这凸显了TLR2依赖性信号传导在限制分枝杆菌生长中的关键作用。未来研究可在常规饲养（CONVD）和无菌（GF）幼虫中采用药理学方法（如TLR2激动剂或抑制剂），进一步验证这一结论。

重要的是，微生物组介导的抗分枝杆菌增殖保护作用在野生型幼虫中表现明显，但在TLR2缺失的情况下会减弱或消失。在野生型条件下，无菌（GF）幼虫的细菌载量高于常规饲养（CONVD）幼虫，而这种差异在tlr2突变体中不再明显。这些发现表明，微生物组所赋予的部分保护作用依赖于完整的TLR2信号通路。一个合理的解释是，共生微生物提供持续的低水平模式识别信号，使先天免疫细胞（尤其是巨噬细胞）处于更有效的抗菌状态（22、53）。在TLR2缺失的情况下，这种由微生物组驱动的免疫调控可能会受损，导致对细胞内分枝杆菌的控制能力下降。同样值得注意的是，已有研究表明斑马鱼和小鼠模型中TLR2缺陷本身会改变共生微生物的组成和多样性（54、55），这或许能部分解释为何TLR2突变体微生物组的感染控制。未来研究可重点比较TLR2野生型和突变体斑马鱼幼虫之间存在差异的特定微生物类群，以确定能赋予抗分枝杆菌感染保护作用的关键细菌类群。揭示这些关键保护性菌属可为基于微生物组的治疗策略提供新见解。

空间分析进一步揭示了细菌载量的区域特异性差异，以及海分枝杆菌与(M.)鸟分枝杆菌之间的病原体特异性模式。这些差异可能反映了不同的组织微环境、巨噬细胞募集动态，或细菌复制策略的内在差异。尽管在测试条件下存活率未受影响，但细菌载量的增加可能是免疫控制受损的早期指标，这一状况在后期或更高感染压力下可能导致病情恶化。

我们的研究结果共同凸显了Toll样受体2（TLR2）与微生物组在宿主对抗分枝杆菌感染的全身防御中所发挥的互补且相互依存的作用。TLR2是实现有效细菌限制所必需的关键先天识别通路，而微生物组则通过调节免疫状态和抗菌能力增强全身抵抗力。这些研究结果强调了宿主-微生物组-免疫串扰在决定感染结局方面的重要性。越来越多的人类临床证据为本研究结果的转化应用价值提供了支持。在早产儿中，以微生物多样性降低和致病共生菌过度生长为特征的肠道菌群失调，始终与败血症风险增加相关（56, 57）。我们的实验模型与临床观察之间的这一相似性，进一步印证了宿主免疫与微生物组之间的相互作用是早期生命阶段感染易感性的关键决定因素。因此，靶向微生物组相关信号或TLR2相关通路，有望为提高宿主对机会致病菌和致病菌引起的血流感染的抵抗力提供新策略。

结论

本研究利用无菌共生斑马鱼幼虫模型，证实早期微生物组定殖能为系统性大肠杆菌感染引发的早期死亡提供快速保护。RNA测序结果显示，无菌幼虫和常规饲养幼虫均存在一套保守的核心免疫激活程序，但微生物组缺失会导致更广泛的转录反应以及代谢通路的更强抑制，这表明共生微生物可缓冲感染诱导的代谢抑制。将这一研究框架拓展至非结核分枝杆菌时，基于成像的定量分析表明，无菌幼虫和tlr2突变体的细菌载量均有所增加；而在野生型宿主中观察到了微生物组介导的分枝杆菌增殖抑制作用，TLR2缺陷型宿主则未出现该效应。综上，这些研究结果表明微生物组定殖是生命早期系统性感染结局的关键决定因素，并揭示TLR2是重要的一个将微生物信号与有效控制分枝杆菌生长联系起来的节点。未来的研究应聚焦于识别驱动TLR2依赖性保护的特定微生物信号，并评估其在人类疾病中的转化相关性。

材料与方法

斑马鱼饲养与突变体品系构建

本研究中所有成年和幼体斑马鱼的饲养，以及所有动物实验，均依据欧盟《动物保护指令2010/63/EU》开展，并在莱顿大学动物福利委员会的监督下进行。成年斑马鱼的养殖已获得该校当地动物福利委员会的批准（DEC；许可证号：方案14，198）。本研究未对成年斑马鱼进行处死。成年斑马鱼饲养在28℃环境中，光照周期为14小时:10小时（明:暗），并按照标准流程进行养护（http://zfin.org）。胚胎和幼体饲养在实验室配制的卵用水（含60毫克/升即时海洋海盐）中，温度28℃，光照周期同样为14小时:10小时（明:暗）。所有涉及细菌注射和RNA测序分析的实验均在受精后5天内（dpf）的幼体上进行，此时幼体尚未开始自主进食。根据欧盟《动物保护指令2010/63/EU》的规定，此类早期幼体不受动物实验法规的约束。

(t / r 2^{s a 19423})突变体（后续称为(t l r 2^{-/-})或tlr2突变体）品系购自英国剑桥欣克斯顿的桑格研究所斑马鱼突变资源库，并由德国卡尔斯鲁厄理工学院斑马鱼资源中心寄送。该品系通过对ENU诱变的斑马鱼文库进行测序鉴定（斑马鱼信息网络目录号ZDB-ALT-131217-14694，RRID：ZFIN_ZDB-ALT-131217-1469）（30）。所有突变等位基因均经测序确认，突变的纯合子携带者与野生型斑马鱼（AB/TL品系）回交至少三次，以最小化背景突变。本研究中使用纯合突变体及其野生型同胞（后续称为t / r 2^{+/+}）构建模型。

细菌接种物制备

市售的大肠杆菌（ATCC 25922）经质粒 pMP2463（31）化学转化后获得了庆大霉素抗性。为制备细菌接种物，将冷冻保存的菌种接种至液体LB（Luria-Bertani）培养基中将细菌接种于含庆大霉素（40毫克/毫升）的培养基中，置于37摄氏度、200转/分钟振荡的培养箱中培养，直至菌液的光密度600值达到0.5±0.02（培养时间约12小时）。以4500相对离心力轻柔离心3分钟收集菌体，用冰浴无菌磷酸盐缓冲液洗涤菌体，再次离心后，将菌体重悬于冰浴磷酸盐缓冲液中，使工作菌液的光密度600值为5.0。该浓缩工作菌液用于显微注射，经斑马鱼胚胎匀浆后的菌落计数分析，约1纳升该菌液注射量对应约800菌落形成单位。通过稀释或浓缩该工作菌液，可制备不同浓度的细菌悬液用于注射。该细菌接种物在显微注射前一直置于冰上保存。

本研究使用两种非结核分枝杆菌（NTM）菌株感染斑马鱼幼虫，分别是表达mCherry荧光蛋白的鸟分枝杆菌人型亚种Chester（MAC 101，ATCC，700898™）菌株和表达DsRed荧光蛋白的海分枝杆菌m20（Mma20）菌株（32, 33）。将MAC 101 mCherry菌株在37℃条件下培养72小时，Mma20 DsRed菌株在28℃条件下培养24小时，所用培养基为添加了10%酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶（ADC）富集培养基（新西兰奥克兰的Fort Richard公司产品）和50微克/毫升潮霉素的Middlebrook 7H9肉汤，潮霉素用于筛选荧光阳性菌株。将细菌以4500相对离心力轻柔离心3分钟形成沉淀，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后再次离心，重悬于含2%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）40溶液（德国默克公司Calbiochem品牌产品）的无菌PBS中。

无菌幼虫的制备

按照先前描述的“自然繁殖法”并稍作修改，我们制备了无菌（GF）和常规化（CONVD）斑马鱼胚胎（28、34）。简要而言，将新收集的胚胎分为两组。所有组使用的孵化水均含60毫克/升的Instant Ocean盐（美国布莱克斯堡的Spectrum Brands公司生产）。其中一组在胚胎收集后，使用含氨苄青霉素（250微克/毫升）、卡那霉素（5微克/毫升）和两性霉素B（250纳克/毫升）的抗生素混合物处理，并置于高压灭菌的无菌孵化水中培养。受精后6小时（hpf），该组胚胎用0.2%的聚维酮碘和0.003%的漂白粉进行表面灭菌，随后用无菌孵化水冲洗。受精后3天（dpf），将一半灭菌后的幼鱼随机转移至含有从常规饲养培养皿中收集的水体的孵化水中，重新引入微生物暴露，构成常规化（CONVD）组；剩余的灭菌幼鱼则保留在无菌孵化水中，作为无菌（GF）组。仅选取形态正常的幼鱼进行后续实验。通过每日从GF组培养皿中取2毫升水样，在28℃的有氧条件下接种于胰蛋白酶大豆琼脂和LB琼脂平板上培养2天，以此监测GF组的无菌环境。

系统性细菌显微注射

按照先前描述的实验方案，通过向库维管显微注射的方式建立系统性细菌感染模型（35）。在受精后第3天，按照之前的方法制备AB/TL品系的无菌（GF）和常规饲养（CONVD）斑马鱼幼鱼。随后进行细菌显微注射在CONVD建立6小时后进行操作，此时既能保证微生物充分适应，又能满足显微注射的技术可行性，因为日龄较大的幼虫越来越难以稳定注射。将幼虫置于经灭菌的卵水配制的0.02%三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯；Sigma-Aldrich，荷兰赞丹德雷赫特）中麻醉，并排列在涂有1%琼脂糖的培养皿上。按设定的光密度制备大肠杆菌菌悬液。所有显微注射均采用每只幼虫约1纳升的固定注射体积。通过相应调整菌悬液浓度，获得了500、1000和4000菌落形成单位的系列注射剂量。使用配备细尖玻璃毛细管的显微注射器（FemtoJet 4i，德国汉堡艾本道夫），将各剂量菌悬液注入居维叶氏管。通过观察菌悬液瞬时进入循环系统来确认注射成功。采用相同方法将MAC 101 mCherry菌株（1000、2500和5000菌落形成单位）和Mma20 DsRed菌株（250、500和500菌落形成单位）注入居维叶氏管。作为假注射对照，按相同程序向居维叶氏管注射等量无菌磷酸盐缓冲液。对AB/TL幼虫进行大肠杆菌显微注射时，每个处理组均纳入25只成功注射的幼虫用于后续分析；对AB/TL幼虫进行MAC 101和Mma20显微注射时，每组分析25只注射幼虫；对tlr2野生型或突变体幼虫进行MAC 101和Mma20显微注射时，每组分析30只注射幼虫。所有数据均来自三次独立实验。

注射后，将无菌幼虫轻轻释放到新鲜的无菌卵水中，将CONVD幼虫放回正常卵水中，使其从麻醉状态恢复，然后进行进一步培养。只有在恢复后形态和循环正常的幼虫才被纳入后续实验。在注射后20、40和48小时（hpi）检查并记录存活率。

RNA测序数据处理与分析

为对全身性大肠杆菌注射后的幼虫进行深度测序，在感染后4小时（4 hpi）收集四组样本（大肠杆菌注射的无菌幼虫、磷酸盐缓冲液注射的无菌幼虫、大肠杆菌注射的常规饲养幼虫、磷酸盐缓冲液注射的常规饲养幼虫）。为确定转录组分析的最佳时间点，开展了初步的时间进程实验。在感染后2、4和18小时，每只大肠杆菌注射组取8只幼虫，在200微升无菌磷酸盐缓冲液中匀浆，将溶液点种于LB培养基上进行菌落形成单位（CFU）计数。基于无菌幼虫与常规饲养幼虫在感染后4小时的细菌载量差异最为显著这一观察结果（补充图1），该时间点被选为后续RNA测序分析的时间点。按照制造商的说明书，使用TRIzol试剂（美国卡尔斯巴德市生命技术公司）从各组幼虫中提取总RNA。为去除DNA污染，使用脱氧核糖核酸酶I试剂盒（美国沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司）进行脱氧核糖核酸酶处理。各组幼虫的核糖核酸测序由荷兰莱顿市GenomeScan公司按照先前描述的方法完成（30）。三组生物学重复的测序数据每组的重复序列均经过比对，并使用 Salmon v1.2.1 软件（36）比对至斑马鱼基因组 GRCz11。利用 DESeq2 v1.24.0 软件（37）分析差异基因表达。统计显著性通过 padj 值 (≤0.05) 确定（38）。在 DAVID 生物信息学资源 6.8 数据库（https://davidbioinformatics.nih.gov/）中进行了基因本体论（GO）术语和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。

共聚焦成像与定量分析

对于在GF和CONVD条件下的(t / r 2^{+/+})和(t / r 2^{-/-})幼虫进行MAC 101和Mma20注射，每个处理组共选取30只成功注射的幼虫用于后续分析。注射后48小时，收集所有存活的幼虫，使用徕卡Stellaris 5共聚焦激光扫描显微镜（德国韦茨拉尔徕卡显微系统公司）进行成像。采用ImageJ软件对四个实验组（GF tlr2野生型组、GF tlr2突变型组、CONVD tlr2野生型组和CONVD tlr2突变型组）幼虫的全身、身体前部和后部的细菌载量进行定量分析。以肠道末端作为解剖边界定义身体的前部和后部，细菌载量均通过ImageJ软件进行定量。

统计学分析

本研究采用 Graphpad Prism 软件（10 版；美国加利福尼亚州圣地亚哥市 GraphPad 软件公司）进行统计分析。本研究中所有实验数据均以均值±标准误表示标准差（SD）。采用 D'Agostino-Pearson 检验和 Shapiro-Wilk 正态性检验来判断数据是否符合高斯分布。组间的统计学显著性差异采用单因素方差分析（ANOVA）进行分析，事后分析则使用 Tukey-Kramer 法。显著性判定标准为 *P<0.05、** P<0.01、P<0.001以及****、P<0.0001