标题：Developmental toxicity and physicochemical characterization of cisplatin–loaded ginger oil nanoemulsion in casper zebrafish

期刊：frontiers in Toxicology

原文链接：https://dx.doi.org/10.3389/ftox.2026.1862521

摘要

引言：本研究以Casper斑马鱼胚胎和幼鱼为模型，对载顺铂生姜精油纳米乳（Cisp-GE-NE）的制备及安全性评价展开研究。

方法：采用吐温80，通过水包油超声分散法制备Cisp-GE-NE，并利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）、动态光散射（DLS）、Zeta电位及紫外-可见光谱对其进行表征。在pH值3.5、5.5和7.4的条件下，观察到顺铂具有持续释放特性。

结果：半数致死浓度（LC50）分别为5.3微克/毫升、14.4微克/毫升和3.7微克/毫升，暴露于不同浓度顺铂-姜黄素-槲皮素纳米乳液（Cisp-GE-NE）的斑马鱼胚胎出现外包进程减缓、形态异常且死亡率显著升高的情况。脊柱弯曲、心包水肿、眼部变小、鱼鳔充气不足以及体长缩短是幼鱼最显著的缺陷。行为学研究显示，斑马鱼幼鱼在明暗环境下呈现不同的游泳模式，这表明该纳米乳液具有神经发育毒性。

讨论与结论：研究结果指出了以姜油为基础的纳米乳液体系可能存在毒性，并强调了在将其用于临床或环境场景前开展安全性评估的重要性。

关键词：斑马鱼卡斯珀品系，发育毒性，胚胎毒性，胚胎发生，纳米乳液毒理学

引言

精油凭借其抗菌、抗氧化等生物特性，广泛应用于食品、化妆品和制药行业（巴索莱和朱利亚尼，2012）。然而，精油的应用仍面临溶解度低、挥发性强和生物利用度差等诸多挑战。因此，多位研究人员指出，将精油制成纳米乳是解决其传统应用难题的有效方案。纳米乳能够提升精油的溶解度、生物利用度和稳定性，从而充分发挥其在多个行业中的潜力。纳米乳是澄清或半透明的乳状体系，液滴尺寸通常在20至500纳米之间。凭借微小的液滴尺寸，纳米乳具备独特的性能，可提升其在药物递送、化妆品和食品领域的稳定性、生物利用度及功效。不过，若使用不当，以精油制备的纳米乳在植物疗法及其他领域的广泛应用，也可能对健康产生不利影响。实际情况是，任何药用植物，其毒性均取决于使用剂量和暴露时长，浓度过高时可能产生毒性作用（巴瓦尼拉米亚等人，）2019年；考尔等人，2024年）。然而，这些精油衍生纳米乳剂对生物体的潜在毒性效应研究尚显不足。许多植物源精油及其纳米制剂有可能对人类产生致突变、致畸和致癌作用（金等人，2016年；达席尔瓦等人，2023年）。因此，有必要利用动物模型开展多种体外研究进行毒性测试，其中包括通过实验筛选技术确定其安全性概况。例如，有一项研究针对多种啮齿动物开展了(LD_{50})相关治疗效果评估，以确定各类药物和草药的急性经口毒性。尽管如此，胚胎发育毒性的研究传统上以啮齿动物、兔子和绵羊为对象，但研究这些动物既耗时又耗资。为探究精油衍生纳米乳剂对胚胎发育的毒性，需要寻找一种替代动物模型。

除了节省资金和时间外，为了遵守3R原则（替代、减少、优化），斑马鱼（*Danio rerio*）等替代脊椎动物模型的使用频率也在不断提高，这一原则凸显了实验研究中的伦理责任。斑马鱼（*Danio rerio*）是一种广为人知的脊椎动物模型。其基因组与人类基因组的相似度超过70%，且基因组已完成全测序，是研究人类疾病致病机制的有效工具（Lachowicz et al., 2021; Lammer et al., 2009; Mendis et al., 2018; Karnchanatat et al., 2011; Dasari and Bernard Tchounwou, 2014; Siddik, 2003）。凭借其优良特性，斑马鱼也被应用于临床前研究和毒理学领域（Elmorsy et al., 2024; Alharbi et al., 2023）。斑马鱼的独特优势在于饲养成本低、体型小巧，使其成为理想的实验动物模型（Lachowicz et al., 2021; Siddik, 2003）。斑马鱼的繁殖力极强，雌性个体一次可产卵约300枚（Lachowicz et al., 2021; Shahrajabian et al., 2019）。由于斑马鱼卵为体外发育且生命力顽强，非常适合高通量实验应用，操作也十分简便。斑马鱼胚胎还具有光学透明的特性，无需剥离卵壳即可实时观察其发育过程和器官发生过程。发育中的斑马鱼的光学透明性使其能够通过荧光标记及其他标记物进行详细的可视化分析（Lammer et al., 2009; Siddik, 2003）。斑马鱼的生长发育速度也很快，受精后24小时（hpf）即可形成基本体轴，72 hpf完成胚胎发育，96 hpf时大多数器官发育完全。斑马鱼大约在3个月时达到性成熟（Lammer et al., 2009）。这使其在整个生命周期中适用于多种毒学研究应用。

顺铂（顺式二氨二氯铂（II））是一种常用的化疗药物，对多种实体瘤具有显著疗效，如非小细胞肺癌、睾丸癌、卵巢癌、膀胱癌以及头颈部癌症。其主要的细胞毒性作用机制为DNA交联，该作用会破坏转录与DNA复制过程，促使快速分裂的肿瘤细胞发生凋亡。然而，顺铂的临床应用存在诸多限制，其中最突出的是剂量限制性毒性。肾毒性、神经毒性、肝毒性、耳毒性以及胃肠道紊乱等常见副作用，不仅限制了其长期使用，还要求临床严格把控剂量并加强监测。此外，固有耐药与获得性耐药机制（如DNA修复能力增强）还会进一步降低其治疗效果。药物外排作用增强，同时药物蓄积减少。为克服这些限制，研究人员已探索基于纳米技术的药物递送方法（如载顺铂纳米乳），以提升肿瘤选择性、降低全身毒性并提高生物利用度。纳米乳的液滴尺寸处于纳米级，是热力学稳定的胶体系统，可实现靶向递送、控释，并能提升顺铂等疏水性药物的溶解度。

生姜（来源于姜科植物姜 Zingiber officinale Roscoe）是一种常见的香料，也是缓解疼痛、抗炎和改善消化问题的传统药材（Jayasinghe 与 Jayawardena，2019）。生姜油提取自姜的新鲜根茎（Lammer 等人，2009；Mendis 等人，2018）。其香气和风味与生姜香料相似，但浓度更低（Karnchanatat 等人，2011）。研究还发现生姜精油具有抗菌、抗病毒和抗真菌特性（Dasari 与 Bernard Tchounwou，2014）。  生姜油含有单萜类化合物，如水芹烯、莰烯、桉叶素、芳樟醇、柠檬烯、柠檬醛、香叶醇、香茅醇和龙脑，同时也包含倍半萜类化合物，如姜烯、姜黄烯、红没药烯、倍半水芹烯、姜萜和姜萜醇（Siddik，2003）。该油还含有抗癌成分，包括萜类、苯丙素类、黄酮类和倍半萜类（Elmorsy 等人，2024）。其中的生物活性物质（如6-姜酚和姜黄烯酮）已被证实可诱导癌细胞凋亡（Alharbi 等人，2023）。  近年来，研究人员开始采用纳米乳剂技术提升生姜油在临床应用中的治疗潜力。生姜油纳米乳剂具有诸多优势，如提高疏水性化合物的溶解度与稳定性、增强生物膜通透性、实现药物的可控与持续释放，以及降低毒性和副作用。生姜油纳米乳剂能够抑制环氧合酶-2（COX-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等关键炎症通路，因此在治疗关节炎等炎症性疾病方面展现出良好前景（Shahrajabian 等人，2019）。与传统剂型相比，纳米制剂能让生姜油吸收更好、作用更持久。  生姜油纳米乳剂还可用于缓解恶心、呕吐和肠易激综合征（IBS）等病症，能快速起效且减少胃部刺激。此外，该纳米乳剂可被设计为精准递送抗癌药物至肿瘤部位的载体（Munda 等人，2018；Farouk 等人，2022）。其微小的粒径使其更易穿透肿瘤组织，降低免疫系统的清除作用，同时减少非靶向效应。与传统化疗药物联用时，生姜油纳米乳剂有望在降低用药剂量的同时提升药效，从而减轻化疗引发的毒性（《印度生姜加工：姜科植物姜的综述》，2018）。

尽管基于纳米乳剂的药物递送方法受到的关注度日益增加，但极少有研究探讨其可能的发育毒性，尤其是当顺铂等化疗药物与植物来源的精油结合时。此外，目前尚无体内动物模型研究来评估载顺铂生姜精油纳米乳剂的理化特性和毒理学特征，包括其胚胎毒性和致畸效应。本研究旨在评估载顺铂生姜精油纳米乳剂（Cisp-GE-NE）及顺铂的理化特性，包括粒径、表面电荷和pH依赖性药物释放，并利用卡斯珀斑马鱼模型评估其发育毒性。该研究的研究结果为评估姜油基纳米乳递药系统在未来生物应用中的安全性提供了关键的基础数据。

结果

姜油纳米乳液的制备

通过相转变温度（PIT）法制备的生姜精油纳米乳液（GE-NE）在不同储存条件下均表现出显著的理化稳定性。在测试的配方中，与油水比为1:1和1:2的配方相比，油水比为1:3和1:4的配方展现出最稳定的特性和特征，如图1a所示，在4周的观察期内未出现可见的相分离或分层现象。

图1 (a) 不同油水表面活性剂比例（1:1、1:2、1:3和1:4）制备的纳米乳剂（NE）外观。表面活性剂浓度升高使制剂澄清度提升，表明乳化效果增强且液滴粒径减小。1:4比例制得的纳米乳剂透明度和稳定性最佳，是药物递送应用的最优配方。(b) 不同顺铂浓度（0–250 µg/mL）下空白GE-NE与Cisp-GE-NE的平均粒径分析。载药后粒径呈浓度依赖性增大，所有Cisp-GE-NE样品的粒径均显著大于GE-NE（P < 0.001）。这表明顺铂成功包封且未影响纳米乳剂的稳定性，粒径仍维持在利于药物递送的纳米尺度范围。数据以平均粒径（nm）±标准差（SD）表示。在所有浓度下，Cisp-GE-NE的粒径均较空白GE-NE出现统计学显著的增大（P < 0.001）。

对四种制剂的动力学稳定性进行了评估，结果显示GE-NE制剂（1.1、1.2、1.3和1.4）的与暴露在光线下（无论是室温还是37℃条件下）的样品相比，在室温避光条件下储存的样品始终保持最佳的澄清度和均一性，在3周后仅出现轻微浑浊，表明其稳定性开始下降。37℃避光条件下储存的样品，相较于同温度下暴露在光线下的样品，热稳定性略有提升，但在第四周结束时，其澄清度出现了轻微下降。所有制剂的动力学稳定性均见表1。总体而言，室温避光条件下储存的GE-NE具有最高的动力学稳定性，是适合进一步进行理化性质表征的候选样品。

表1 纳米制剂在四种不同条件下储存4周的稳定性概况：室温（避光）、室温（光照）、37℃（避光）和37℃（光照）。数据为活性化合物的平均相对浓度（n=3），以初始值归一化（第1周=1.00）。暴露于光照的样品稳定性显著下降，尤其是在高温（37℃）条件下，第4周时活性化合物仅剩余65%。单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey事后检验结果显示，与避光储存条件相比，室温和37℃光照暴露条件下的制剂稳定性均出现统计学显著降低（P < 0.01）。4周内，室温（避光）与37℃（避光）条件下的制剂稳定性无显著差异（P > 0.05），表明与光照暴露相比，温度单独作用对稳定性的影响较小。

顺铂-明胶-纳米乳液的制备与包封率

采用水包油分散法结合超声处理，成功将顺铂载入GE-NE中。该制剂是在不同顺铂浓度下制备的(100、150、200和250微克/毫升)。超声处理后，溶液在视觉上呈现均一状态，无可见相分离现象，表明乳化成功。未分散的药物经过滤后，通过紫外-可见光谱法进一步定量，以测定水油相中顺铂的浓度。顺铂的最大吸收峰出现在270纳米处。药物包封率是开发高效纳米载体系统的关键因素(Mura等人，2013)。水油纳米乳液体系可将95%的疏水性药物输送至其核心，用于靶向给药。因此，本研究选择姜油水油乳液体系开展研究。研究结果显示，我们测定了不同浓度(100微克/毫升、150微克/毫升、200微克/毫升和250微克/毫升)的顺铂在姜油水油纳米乳液核心的包封率，其中150微克/毫升浓度下的包封率(EE%)最高，为(81.5%±1.8%)，超过该浓度后包封率略有下降，具体见表2。这可能是由于油核达到饱和，或顺铂在纳米乳液体系中的溶解度有限(Qiang等人，2020)。各制剂的包封率详见表2。

这些结果证实，GE-NE 系统能有效包载顺铂，在 150 微克/毫升浓度下实现最佳包载量，为进一步评估其治疗学和毒理学特性提供了极具潜力的平台。

表2 不同药物浓度（100–250 μg/mL）下顺铂负载纳米乳的包封效率（%）。数据以平均值±标准差（SD）表示，基于三次重复测量（n = 3）。包封效率呈现浓度依赖性趋势，在150 μg/mL时达到最高（81.5%±1.8%），表明在此载药量下药物包封效果最佳。在250 μg/mL时包封效率有所下降（73.4%±2.9%），这表明较高浓度下纳米乳体系可能达到饱和或出现药物沉淀。单因素方差分析（one-way ANOVA）的统计分析显示，各组间存在显著差异（P < 0.05），尤其是150 μg/mL浓度组与100 μg/mL、250 μg/mL浓度组之间差异显著。

顺铂-生姜油-水纳米乳液的理化性质表征

动态光散射（DLS）分析

采用动态光散射（DLS）在37℃下评估了GE-NE和Cisp-GE-NE的理化特性。空白GE-NE的初始平均粒径约为120 nm，而Cisp-GE-NE的初始平均粒径为135 nm，略有增加，这表明药物成功负载，且由于顺铂的存在，液滴结构发生了轻微扩张。粒径分布（PSD）曲线也证实了乳剂的单分散性（Firoozi 等人, 2020）。为评估储存稳定性和液滴粒径，我们在四种不同储存条件下对GE-NE和Cisp-GE-NE进行了为期4周的持续监测：

室温（光照与避光条件下）以及37摄氏度（光照与避光条件下）。在所有条件下均观察到液滴粒径逐渐增大，且西他列布拉-明胶纳米乳液的粒径增大现象相较于空白明胶纳米乳液更为显著。在37摄氏度光照条件下储存的样品中，最明显的不稳定性出现在第4周时，西他列布拉-明胶纳米乳液的平均粒径增至约165纳米，这表明光照和热量引发了颗粒的聚结或降解，如图1b所示。相反，在室温避光条件下储存的乳液稳定性最高，明胶纳米乳液的粒径仅小幅增至130纳米，西他列布拉-明胶纳米乳液则增至145纳米。

此外，我们还分析了GE-NE和Cisp-GE-NE的Zeta电位值。我们测得的结果为-28.5 mV，表明其具有良好的静电稳定性；而Cisp-GE-NEs的电位值略有降低，为-25.2 mV，如表3所示，该数值仍处于胶体体系稳定的范围内。两种制剂的多分散性指数（PDI）均低于0.3，说明粒径分布窄且均匀。因此，本研究结果表明，载药会略微降低纳米乳的稳定性，而在低温、避光条件下储存可显著维持液滴的完整性，这对于基于纳米乳的药物递送系统维持治疗一致性至关重要（Anarjan等人，2014）。

表3 不同储存条件下纳米制剂中活性化合物4周内的保留率。该制剂分别在室温（避光和光照）及37℃（避光和光照）条件下储存，每周对其稳定性进行评估，第0周设为基线（100%）。纳米制剂在室温及37℃避光条件下均表现出高稳定性，至第4周时，化合物保留率分别超过93%和86%。值得注意的是，37℃避光储存的制剂在第3周时仍保持100%的保留率，表明其在无光照条件下具有良好的热稳定性。相比之下，光照条件下制剂出现明显降解，高温（37℃）光照环境下尤为显著，该组制剂第0周保留率仅为86%，至第4周降至81%。同样，室温光照条件下，制剂保留率在同期也逐渐降至85%。这些研究结果表明该制剂对光照敏感，而在避光、控温环境中储存可延长其保质期并保持其完整性。

傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析

采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）对顺铂在Cisp-GE-NE中的成功包封及相互作用进行了验证，如图2a所示。纯顺铂的FTIR光谱在(3,300-3,400 ~cm^{-1})处显示出对应N-H伸缩振动的特征峰（Ali等人, 2026），(1,600-1,650 ~cm^{-1})处的峰归因于N-H弯曲振动和Pt-N伸缩振动，(600-800 ~cm^{-1})区域的峰ref表明存在Pt-Cl键。相比之下，空白GE-NE在2920 cm⁻¹和2850 cm⁻¹处显示出脂肪族(-CH_{2})和(-CH_{3})伸缩振动的特征峰（Farshbaf-Sadigh等人, 2021），(1730 ~cm^{-1})处的峰对应姜油组分的酯羰基((C=O))伸缩振动，(1,050-1,250 ~cm^{-1})处的峰则与C-O-C和C-OH振动相关，(3,400 ~cm^{-1})附近存在一个宽峰，归因于水或吐温80中的羟基。将顺铂包封至纳米乳后，Cisp-GE-NE的FTIR光谱显示N-H和Pt-N峰出现明显位移或宽化现象，表明顺铂与表面活性剂/油相组分之间可能存在氢键或静电相互作用（Ali等人, 2026）。Pt-Cl键区域（600–800 cm⁻¹）((600-800 ~cm^{-1}))处峰强度的降低，说明其与乳剂基质发生了相互作用。GE-NE特征峰的保留，尤其是在2920 cm⁻¹和1730 cm⁻¹(1730 ~cm^{-1})处（Farshbaf-Sadigh等人, 2021），证实纳米乳基质的结构保持完整。光谱的这些变化证实了顺铂已成功在GE-NE基质中实现功能化与包封，其相互作用可能为非共价键合，这种作用既保证了药物的负载，又未对乳剂的结构造成显著破坏。

图2（a）顺铂、GE-纳米乳及顺铂- GE-纳米乳的傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析。纯顺铂的FTIR光谱在1066 cm⁻¹、1455 cm⁻¹、2060 cm⁻¹、2355 cm⁻¹以及(3,13050px)处出现特征峰，分别对应胺基、N-H弯曲振动和Pt-N键振动。GE-纳米乳在820 cm⁻¹、1091 cm⁻¹、1234 cm⁻¹、1628 cm⁻¹以及(2,23525px)处出现特征峰，归属于C-H伸缩振动、O-H弯曲振动以及酯基/烯烃基团。在顺铂- GE-纳米乳的光谱中，两组特征峰均存在且仅发生轻微位移、强度有所降低，这证实了药物成功包封并与载体发生相互作用，这种相互作用可能通过氢键或范德华力实现。这些光谱重叠现象表明顺铂与纳米乳体系具有化学相容性，且被稳定地整合其中。（b）不同pH值（3.4、6.5和7.4）条件下，顺铂从顺铂- GE-纳米乳中48小时的体外释放动力学，以累积释放百分率（%）表示。释放速率随pH值升高显著加快：48小时时，pH 7.4条件下释放率为95.4%±2.1%，pH 6.5条件下为78.2%±1.9%，pH 3.4条件下为52.6%±2.3%。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）结合Bonferroni事后检验进行统计分析，结果显示各组间存在极显著差异：1小时时P (P<0.05)，后续所有时间点（2、6、12、24、36和48小时）均为P<0.001。pH 7.4条件下的最高释放率表明药物在生理pH环境中扩散效果良好，而酸性pH条件下释放率降低则提示该纳米乳具有pH响应性控释特性，适用于肿瘤微环境的靶向递送。

体外药物释放动力学

采用透析法，参照图2b，在pH 3.4、6.5和7.4的模拟胃肠液中，对姜油纳米乳（Cisp-GE-NE）中顺铂48小时内的释放动力学进行了评估。对收集的样品进行紫外-可见分光光度法分析（250–270 纳米）的检测结果显示，顺铂从纳米乳基质中持续释放，且释放行为依赖于pH值。在酸性pH值（即3.4）条件下，该纳米乳制剂的初始释放速度较慢，48小时时药物累积释放量约达45%。相比之下，在pH值6.5和7.4的环境中，药物释放更为显著且持续，累积释放量分别达到67%和82%。这表明该纳米乳体系在酸性条件下性质稳定，而在模拟生理环境的近中性条件下能够高效释放药物。

稳定性评估

在室温下为期4周的储存期内，评估了Cisp-GE-NE释放后速率的物理和化学稳定性在光照和黑暗条件下，分别于室温以及37摄氏度环境中开展实验。每周监测粒径、颜色、相分离情况以及药物残留含量。4周后，结果显示在所有条件下均未出现可见的相分离，也未观察到明显的沉淀，证实了Cisp-GE-NE的物理稳定性。在室温避光条件下，超过93%的顺铂仍被包裹在内。在37摄氏度光照条件下，药物含量出现中等程度下降，药物保留率约为81%，表明发生了轻微的光热降解。具体的包封效率见表4。这些研究结果证实，Cisp-GE-NE制剂不仅稳定性良好，还能以pH响应的方式实现药物的控释，有望成为靶向化疗递送的理想制剂。具体的包封Cisp-GE-NE在不同储存条件下4周内的效率（%）见表3。

表4 暴露于GE-NE-顺铂后6天仔形斑马鱼幼鱼的形态计量分析

斑马鱼胚胎暴露于Cisp-GE-NE的暴露情况与存活率

暴露于不同浓度（100、150、200和250 μg/mL）Cisp-GE-NE的卡斯珀斑马鱼胚胎，从受精后1小时（1 hpf）暴露至受精后6天（6 dpf）时，其存活率呈现出剂量依赖性效应。从实验结果中我们观察到，对照组的存活率在整个暴露期间始终维持在100%±2.1%的高水平，证实实验条件处于最优状态。而在处理组中，随着Cisp-GE-NE浓度的升高，存活率呈逐步下降趋势。经100 μg/mL和150 μg/mL浓度处理的胚胎，存活率分别出现中等程度下降，为92.7%±3.5%和87.2%±4.9%，但与对照组相比，这些降幅均无统计学意义。然而，在高浓度条件下，存活率出现了显著下降。当浓度为200 μg/mL时，存活率降至78.5%±5.8%；浓度升至250 μg/mL时，存活率进一步下降至56.3%±7.2%。

Kaplan-Meier生存分析结合对数秩检验显示，在较高剂量下，这些存活率的降低具有统计学意义。具体而言，200 μg/mL组的存活率与对照组相比显著降低（p ((p<) 0.01），而250 μg/mL组的存活率降低则具有极显著意义（p ((p<0.001)) 0.001）。这些发现表明，Cisp-GE-NE纳米乳对斑马鱼胚胎活力具有浓度依赖性的毒性作用，尤其是在(≥200 mu g / mL)剂量下，如图3a所示。

图3外包层进展（分别为57.5%±7.6%和48.5%±9.2%），统计学显著性分别表示为p<0.01和p<0.001。数据代表来自生物学重复样本的平均值±均值标准误。采用Kaplan-Meier曲线进行统计分析，并通过对数秩检验进行比较。 （降幅分别为79.2%±5.3%和67.8%±6.0%；p (p>0.05) 0.05）。相比之下，用200和250 µg/mL处理的胚胎表现出显著受损，而对照组的胚胎显示出正常的外包层运动（82.8%±4.6%），而暴露于100和150 µg/mL的胚胎则出现轻微且无统计学意义的Meier曲线，并通过对数秩检验进行比较。（a）Casper的Kaplan-Meier存活曲线（b）在暴露于Cisp-GE-NE 6小时后，8小时受精阶段外包层进展（%）的定量分析。胚胎250 µg/mL（p ((p<0.001)) 0.001），表明Cisp-GE-NE在剂量≥200 µg/mL时具有浓度依赖性毒性。生存分析采用Kaplan-Meier法，在较高浓度下观察到依赖性下降。200 µg/mL时存活率降至78.5%±5.8%（p ((p<0.01)) 0.01），100和150 µg/mL时进一步降至56.3%±7.2%，仅观察到存活率小幅且无统计学意义的降低（分别为92.7%±3.5%和87.2%±4.9%），显著呈剂量依赖性，在整个暴露期间存活率持续较高（100%±2.1%），证实了最佳实验条件。用斑马鱼胚胎处理后，从1小时受精阶段到6天龄，暴露于浓度递增的Cisp-GE-NE（100、150、200和250 µg/mL）的斑马鱼胚胎。对照组显示Cisp-Ge-NE纳米乳液体系对斑马鱼胚胎存活和外包层进展的影响。

更高浓度的GE-NE-顺铂会抑制外包过程进展

外包是一种早期且关键的形态发生运动，发生在斑马鱼原肠胚形成过程中，研究人员在受精后8小时（对应暴露于GE-NE-顺铂6小时）对其进行了分析。在处理组中观察到外包进程呈现剂量依赖性抑制，当与对照组相比。我们的结果显示，对照组胚胎表现出健康的外包运动，平均进展率为83.62%±2.86%，表明在给定的实验条件下发育动力学正常。暴露于较低浓度Cisp-GE-NE（即100 μg/mL和150 μg/mL）的胚胎，其外包进展率出现轻微且无显著的下降，平均值分别为79.395±5.263和65.705±7.811，统计学p值为(p ((p>0.05)) 0.05)，提示这些剂量不会显著干扰早期细胞迁移过程。相反，经高浓度处理的胚胎则出现外包功能的显著损伤。与对照组相比，200 μg/mL浓度下外包进展率降至51.105±4.4 (p ((p<0.01)))，250 μg/mL浓度下外包进展率进一步降至42.555±11.4，对应p值为((p<0.001)) 0.001)。这些具有统计学意义的显著下降表明，高浓度的Cisp-GE-NE对原肠胚形成具有明显的抑制作用。

观察到的外包延迟表明细胞协同运动受到破坏，而细胞协同运动对于正确的胚胎模式形成和发育至关重要。这些结果强调了浓度小于或等于200 μg/mL的Cisp-GE-NE具有发育毒性（((≥200 mu g / mL))，该结果已用于实验后处理，如图3b所示）。采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行图基事后检验（Tukey’s post hoc test）来确定统计学显著性。

致畸效应与形态异常

为观察Cisp-GE-NE在卡斯珀斑马鱼模型中的致畸活性，本研究每日让斑马鱼胚胎暴露于梯度浓度（100、150和250 μg/mL）的Cisp-GE-NE中，以确定剂量-反应关系。研究结果表明，Cisp-GE-NE的致畸效应呈浓度依赖性增强。此外，还观察到成鱼的发育异常最早在受精后48小时开始出现，至受精后5天，异常的发生率和严重程度也均有所升高。在各处理组中，均观察到多种形态学异常，包括脊柱弯曲（轻度轴向弯曲）（出现严重的脊柱侧弯样畸形）、心包水肿、卵黄囊水肿、眼部缺陷（如小眼症或眼部发育不对称）以及尾部畸形（如弯曲和截断）。这些特征表明器官发生受损和胚胎发育紊乱。在受精后第5天，我们注意到在最高测试浓度（250 μg/mL）下，至少65%的胚胎出现了一种形态学异常，这一比例显著高于对照组的5%（((p<0.001))，P<0.001）。在较低浓度下也观察到了较不明显的影响。在100 μg/mL浓度下，仅有8%的胚胎受到影响，而在150 μg/mL浓度下，22%的胚胎出现了明显的畸形。这些数据表明，在150 μg/mL以上浓度时，致畸效应变得更加普遍和严重，这提示存在一种剂量依赖性的毒理学反应。图4a为各处理组畸形发生率的定量分析，图4b为250 μg/mL浓度下受影响胚胎的典型显微照片。

图4 顺铂-明胶酶纳米乳液对斑马鱼胚胎的致畸效应 （a）柱状图显示，斑马鱼胚胎暴露于顺铂-明胶酶纳米乳液后，胚胎异常率呈明显的剂量依赖性升高。在250微克/毫升浓度下，65%的胚胎出现畸形，而对照组仅为5%。较低浓度（100和150微克/毫升）则引起较轻微的效应。 （b）各处理组斑马鱼胚胎的代表性图像。对照组胚胎发育正常，而处理组胚胎出现眼部弯曲、脊柱畸形、尾部发育不全和卵黄囊水肿等异常。这些缺陷的严重程度随浓度升高而增加，在250微克/毫升浓度下变化最为显著。

孵化率与形态分析

暴露于不同浓度吉西他滨-顺铂-纳米乳液的斑马鱼胚胎，研究人员对其孵化率进行了长达3天龄的评估。尤其在较高浓度下，观察到孵化呈现显著的剂量依赖性延迟。到3天龄时，对照组95%±3.8%的胚胎已成功孵化，显示出正常的发育进程。同样，暴露于100微克/毫升吉西他滨-顺铂-纳米乳液的胚胎，其孵化率未出现统计学上的显著下降（90%±4.2%），该组的p值大于0.05，表明低浓度对胚胎出膜的影响较为温和。然而，随着浓度升高，孵化受到的抑制作用更为显著。与对照组相比，150 μg/mL 浓度下孵化率降至 73% ± 5.8%，但该下降仍无统计学意义（p ((p>0.05))）。200 μg/mL 浓度下，孵化率最初出现明显下降，受精后 3 天（3 dpf）仅有 52% ± 6.8% 的胚胎成功孵化（p ((p<0.01))）。250 μg/mL 浓度时，孵化过程受到显著抑制，仅 43% ± 7.2% 的胚胎成功从卵壳中脱出（p ((p<0.001))），该效应进一步加剧。这些结果表明，Cisp-GE-NE 以浓度依赖的方式干扰斑马鱼胚胎的正常孵化过程。这种损伤可能由纳米颗粒暴露引发的发育延迟、卵壳硬化或生理应激导致。图 5a 展示了各处理组的孵化率变化曲线，重点标注了 (≥200 mu g / mL) 处观察到的统计学显著下降。统计学显著性通过单因素方差分析（one-way ANOVA）结合 Tukey 事后检验进行判定。

图5 (a) 3天龄（dpf）斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的Cisp-GE-NE（100、150、200和250 µg/mL）后的孵化率。观察到孵化率呈剂量依赖性下降，在浓度≥200 µg/mL时出现显著降低。数据以平均值±标准差表示（(n=3)，n = 3次重复）。进行统计学显著性分析，并与对照组进行比较：***p (***p<0.001) (b) 用Cisp-GE-NE和游离顺铂处理的6天龄（dpf）斑马鱼幼鱼的剂量-反应死亡率曲线。Cisp-GE-NE的(LC50)为213.6 µg/mL（红色虚线），而游离顺铂的为280.87 µg/mL（绿色虚线），表明该纳米乳剂制剂的毒性增强。数据以平均值±标准差显示。

B 形态计量分析

在受精后第6天，对Casper斑马鱼幼鱼进行形态测量，以评估GE-NE-顺铂暴露对其发育的影响。选取100微克/毫升和150微克/毫升暴露组的幼鱼作为分析对象，因为未处理的幼鱼作为对照组时出现了更多畸形。测量指标包括眼长（EL）、头长（HL）、头宽（HW）和标准体长（SL）等测量的参数。处理组出现了显著的形态学变化，在较高浓度（即150微克/毫升）下变化尤为明显。两个处理组中，眼长均显著降低：100微克/毫升组（对应标识(p-value =0.03)）眼长降低了10.8%，150皮克/毫升组（对应标识(p-value <0.001)）眼长降低幅度更显著，达13.5%（p<0.001）。同样，头长（HL）和标准体长（SL）也出现显著降低，150微克/毫升组的降幅为12%（对应p值标识(p-value <0.01)），这表明轴向和颅面发育受到了损害。然而，对照组与处理组的头宽（HW）无显著差异（对应p值标识((p>0.05))，p>0.05），说明GE-NE-Cisp暴露对轴向和前后生长的影响大于对颅骨侧向发育的影响。这些结果证实，胚胎发育阶段暴露于GE-NE-Cisp会以浓度依赖的方式改变斑马鱼幼鱼的生长轨迹，尤其影响头部、眼部和总体长等特征，具体如表4所示。统计显著性通过单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey事后检验进行评估。

半数致死浓度（((LC_{50}))

通过概率单位分析，在斑马鱼幼鱼发育至6天龄（dpf）时，测定了Cisp-GE-NE对卡斯珀斑马鱼幼鱼的半数致死浓度（((LC_{50}))），结果如图5b所示。该分析得出的(LC50)值为213.6微克/毫升，95%置信区间（CI）为198.4至218.6微克/毫升。相比之下，游离顺铂的(LC50)经计算为280.87微克/毫升。这一显著差异表明，与未包封形式的顺铂相比，Cisp-GE-NE在更低浓度下表现出更强的毒性。Cisp-GE-NE的半数致死浓度低于游离顺铂，这说明纳米包封改变了顺铂在斑马鱼胚胎中的发育毒性特征。这些结果有力支持了以下结论：将顺铂包封在GE-NE纳米乳液体系中可显著增强其生物活性，较低的(LC50)值便是有力证据。因此，Cisp-GE-NE在斑马鱼胚胎模型中表现出更高的药效和毒性，实现50%死亡率所需的剂量远低于游离顺铂。

讨论

本研究为Cisp-GE-NE在卡斯珀斑马鱼模型中的发育毒性提供了新信息，显示其对形态测量参数、存活率和胚胎发生具有显著的浓度依赖性效应。本研究结果补充并拓展了以往关于顺铂毒性及基于纳米乳的药物递送方式的研究。在Cisp-GE-NE浓度为(≥200 mu g / mL)时，孵化率显著下降、外包进程受阻，这是本研究的关键结果。孵化率的大幅下降和外包进程的延迟与强等人（2020年）的研究结果一致，后者发现斑马鱼胚胎摄取银纳米颗粒会伴随生长迟缓和分子反应（强等人，2020年）。本研究结果还表明，更高浓度的Cisp-GE-NE会显著增加致畸异常，例如眼部缺陷、卵黄囊水肿以及脊柱弯曲。这些研究结果与胡等人2011年的研究一致，该研究利用斑马鱼胚胎检测了可生物降解的壳聚糖纳米颗粒，发现与游离药物暴露相比，纳米颗粒介导的药物递送会加剧器官特异性毒性和畸形（胡等人，2011）。尽管在哺乳动物系统中，肾毒性和神经毒性已被证实与游离顺铂相关，但本研究表明，纳米制剂可能会在发育中的胚胎体内增强这些毒性效应，这可能是由于纳米封装改变了相关的生物相互作用。

有趣的是，我们的形态测量分析显示，在150微克/毫升的Cisp-GE-NE处理下，斑马鱼的标准体长、头长和眼长均出现统计学上显著的降低，这表明其轴部和颅面模式形成受到干扰——这一结果与Gu等人（2021年）的研究相似，后者发现二氧化钛纳米颗粒会导致斑马鱼幼虫出现类似的体型缩小，且这种现象与细胞凋亡增加和细胞增殖紊乱相关，也进一步印证了我们的研究发现（Gu et al., 2021）。值得注意的是，本研究发现斑马鱼的头宽未出现显著变化，这意味着Cisp-GE-NE对颅骨侧面发育的干扰可能性较低；这一细节在其他毒理学研究中鲜有提及，值得进一步探究。Cisp-GE-NE的半数效应浓度（213.6微克/毫升）低于游离顺铂（280.87微克/毫升），表明纳米乳液体系使药物毒性有所增强。这些发现支持了这样一种假说：纳米制剂虽能改善药物递送，却也可能加剧毒理学效应。姜精油以其抗炎和抗氧化特性而闻名，但若调控不当则可能产生不良影响；包括Abd Ali和Ismail（2012年）在内的多项研究均提出，姜精油可用于缓解化疗引发的副作用（Abd Ali and Ismail, 2012）。然而在本研究中，将顺铂与姜精油共同包载于纳米乳液基质中，并未观察到毒性降低的效果。这一矛盾现象表明，在顺铂强大的细胞毒性作用面前，载体精油的有益特性可能被掩盖，尤其是当药物通过高穿透性的纳米载体给药时。纳米乳液体系或许改变了顺铂与胚胎组织的相互作用，从而加剧而非减轻了其毒性效应。

总体而言，我们的研究结果支持将斑马鱼作为一种高通量脊椎动物模型，用于检测轻微的发育毒性。斑马鱼能够在环境毒素的作用下同时表现出整体形态和行为表型，这使其成为纳米制剂测试的理想模型[40]。重要的是，研究结果强调，在将纳米乳剂应用于临床或环境场景之前，需要对其进行严格的毒性测试，尤其是那些含有细胞毒性物质的纳米乳剂。

结论

本研究表明，载顺铂的生姜精油纳米乳（Cisp-GE-NE）对卡斯珀斑马鱼胚胎和幼鱼具有浓度依赖性的发育毒性。尽管低浓度似乎具有生物相容性，但更高剂量（200 μg/mL）会显著破坏孵化、外包进程和轴向生长等关键发育过程。形态测量和致畸分析证实了这些负面影响，包括畸形率增加和机体发育受损高浓度下的图案化。与游离顺铂相比，Cisp-GE-NE 的 (LC50) 毒性更高，这表明纳米包封通过纳米乳液载体改变了顺铂在斑马鱼胚胎中的发育毒性特征。虽然这可能提高癌症治疗效果，但也强调了在将此类递送系统重新用于生物医学应用之前，进行全面毒理学分析的重要性。

总体而言，我们从这项研究中得出的结论强调了在基于纳米乳剂的药物制剂中采用平衡设计策略的重要性，这种策略能在最大化治疗效果的同时将研发风险降至最低。未来的研究应聚焦于长期研发结果、生物分布研究以及在荷瘤斑马鱼模型中的对比疗效，以全面评估Cisp-GE-NE制剂的转化潜力。

材料与方法

姜精油（纯度99.0%）和顺铂（纯度90.0%）购自Sigma Aldrich公司。吐温80（纯度99.0%）购自Hi-media公司。所用其他试剂均为分析纯级别。载姜精油纳米乳的顺铂储备液在实验前新鲜配制，并以0.1%（体积比）的浓度溶解于胚胎培养基中。

采用吐温80表面活性剂制备GE-NE

采用相转化温度法（PIT），参照M.菲罗齐等人的方案并稍作修改，制备生姜精油纳米乳液（NEs）（菲罗齐等人，2020）。简要而言，生姜精油纳米乳液（GE-NE）的配制使用磁力搅拌器Spin 4,010（印度塔森斯产品私人有限公司）完成。在室温下以300转/分钟的转速持续搅拌，同时逐滴加入水，制得生姜精油纳米乳液（GE-NE）。所制备的GE-NEs的油水比（有机相与水相之比）为1:1至1:4。将制备好的GE-NE分别置于不同温度条件下保存4周：室温（避光和光照）以及37℃（避光和光照）。选取具有长期动力学稳定性的GE-NE进行进一步表征和实验（阿纳詹等人，2014）。

负载顺铂的生姜精油纳米乳液的制备

通过将顺铂（即1毫克/体积分数溶解于20毫升超声法制备的生姜油纳米乳液中）并加水定容至总体积100毫升，将顺铂负载到GE-NE的核心部位。随后将整个装置置于超振水浴摇床中，在37℃条件下恒温振荡30分钟。针对其他顺铂浓度（100、150、200和250微克/毫升）重复上述操作。之后，将各分散液置于750瓦超声仪中超声处理30分钟，超声参数为脉冲开启15秒、脉冲关闭15秒，振幅40%（Mohamed和El-Naggar，2018）。通过0.45微米聚偏氟乙烯（PVDF）膜过滤去除未分散的药物。采用紫外-可见分光光度计在270纳米波长下测定油水相中药物的最终浓度。

载顺铂姜精油纳米乳液的理化表征

动态光散射

包含乳化剂层的平均粒径（Horiba Scientific-SZ-100 型仪器测定）、Zeta 电位值、多分散指数（PDI）、采用动态光散射实用分析仪（DLS）在37℃下测定了GE-NE的粒径及粒径分布（PSD）。通过监测纳米乳滴粒径在室温（避光和避光）及37℃（避光和避光）条件下储存4周内的变化，评估了合成GE-NE的稳定性（Mohamed和El-Naggar，2018）。

傅里叶变换红外光谱（FTIR）

按照Farshbaf-Sadigh等人（2021年）的方案进行了傅里叶变换红外光谱（Jasco公司）分析，以确定GE-NE、顺铂（Cisp）和顺铂-纳米凝胶-纳米乳液复合物（Cisp-GE-NE）在各阶段的成功功能化。采用溴化钾压片法，对顺铂和顺铂-纳米凝胶-纳米乳液复合物进行共价修饰前后的红外光谱分析，对比两种化合物的光谱，波数范围覆盖(400-3,000 ~cm^{-1})，分辨率为(4 ~cm^{-1})（Farshbaf-Sadigh et al., 2021）。

羟基化单壁碳纳米管-顺铂-生姜精油纳米乳液的稳定性与药物释放动力学

本研究采用Sigma Aldrich-默克公司（某国）生产的10毫升（w/v）透析袋纤维素膜进行体外药物释放研究，该膜的平均扁平直径为10毫米。简要而言，将Cisp-GE-NE填充至透析袋中，随后将透析袋分别浸入50毫升三种不同pH值（3.4、6.5和7.4）的1×模拟胃肠液中进行透析，实验过程中保持环境温度为37℃，并维持溶液体积恒定。使用磁力搅拌器持续搅拌溶液，同时用一层薄的帕拉菲尔膜覆盖容器以减少蒸发。按预定时间间隔，用3毫升胃肠液替换3毫升释放介质并收集样品（Sravani等人，2023）。采用紫外-可见分光光度计在250纳米至270纳米波长范围内测定每个样品中药物的释放量。累积药物释放量随时间的变化通过以下公式1表示：  [Cumulative Drug Release (%)=( Amount of drug released / Total amount of drug loaded ) × 100]

将各浓度的Cisp-GE-NE样品分别置于室温和37℃环境下，同时设置光照与避光条件，持续4周以考察其稳定性。4周后，计算Cisp-GE-NE的含量百分比，并与初始总浓度进行对比。

斑马鱼饲养与胚胎收集

所有实验均在湿实验室条件下进行。成年AB品系斑马鱼在卡斯特品系斑马鱼的标准条件下（系统水温28℃±2℃，电导率600至700微西门子）的自动化循环系统中饲养和维持，光周期为14小时光照/10小时黑暗。所有实验程序均符合经合组织第236号指南《鱼类胚胎急性毒性试验》的要求（达席尔瓦等人，2023；Oliveira 等人，2020；经济合作与发展组织，2013）。在繁殖缸中以雄性与雌性2:1的比例将成年雌雄鱼进行杂交，获得胚胎。自然产卵后收集受精胚胎，随后在体视显微镜下进行筛选，用于后续实验（Oliveira 等人，2020）。杂交20分钟后检查并收集受精卵，将其置于胚胎培养基中孵化。仅选取发育正常的胚胎纳入实验组。受精后2小时（hpf），将胚胎转移至培养皿中开展后续实验，并分析其致畸活性，包括死亡率、形态测量和胚胎毒性。

顺铂-明胶-乙基纤维素纳米乳液体系的暴露处理

为确保与斑马鱼发育需求相兼容，Cisp-GE-NE 最初悬浮于胚胎培养基（RO 水）中。将 Casper 斑马鱼品系的胚胎暴露于不同浓度（100、150、200 和 250 μg/mL）的 Cisp-GE-NE 中。于受精后 1 小时（hpf）向胚胎施加测试制剂，并持续监测至受精后 120 小时。每日更换暴露培养基以维持其稳定性与一致性。胚胎置于 24 孔培养板中，每孔放置四枚胚胎，并在温度、湿度和光周期均受控的培养箱中培养。每个处理组至少包含 32 枚胚胎，且进行重复实验以确保结果可重现。为进行对比毒性评估，额外的胚胎组在相同实验条件下暴露于游离顺铂，以测定半数致死浓度（LC50）。

外包层展开率的测定

细胞外包以细胞在卵黄细胞上的移动和扩张为特征，在受精后8小时（hpf）、即处理暴露6小时时对其进行评估。总共60个胚胎（6个实验组中的(n=10 per)组）在磷酸盐缓冲液（PBS）配制的4%多聚甲醛（PFA）中固定过夜。每个胚胎均视为生物学重复，实验独立重复两次以确保可重复性。使用体视显微镜（Leica DFC 450C）对固定后的胚胎进行成像，并量化细胞外包的进展程度。使用ImageJ软件（1.53 k版，2019年，美国马里兰州贝塞斯达市国立卫生研究院）进行测量，该软件通过测量卵黄的覆盖范围，依据Anand David等人（2016年）描述的公式计算细胞外包百分比。  [Distance of blastoderm margin from vegetal pole x_{0}]

胚胎发育/致畸性

每日监测斑马鱼Casper胚胎的发育参数，重点关注死亡率、孵化率以及体轴形态畸形情况。使用体视显微镜（Leica DFC 450C）进行观察。评估胚胎和仔鱼的死亡率每天早上，所有无存活能力的样本都被及时移除，以防止对剩余种群造成干扰。

死亡率评估

研究人员在卡斯珀斑马鱼胚胎中评估了Cisp-GE-NE相关的潜在致死性，将20个胚胎分配至六个实验组，共计120个样本。在受精后6天（dpf）前，研究人员每天通过体视显微镜（Leica DFC 450C）对胚胎进行观察。为观察经合组织236号标准（96小时受精后，hpf）之外的延迟形态恢复情况，研究人员将观察时长延长至受精后120小时或5天。研究人员对胚胎孵化后的发育情况进行评估，以确保人道终点、法规合规性及数据可靠性（阿南德·戴维等人，2016），保障实验符合法规要求且数据可靠。整个实验期间，对照组的存活率始终保持在90%以上，从而验证了实验条件及研究结果的有效性。致畸效应通过高分辨率成像进行定性评估，具体方法详见前文章节。观察到的畸形包括眼部异常、心包水肿及全身性水肿、轴骨畸形（包括尾部和脊柱弯曲）以及运动系统损伤（达席尔瓦等人，2023；阿南德·戴维等人，2016；卡德纳等人，2020；卡德纳等人，2022）。

形态测量

孵化标志着从胚胎阶段到自由游动幼虫阶段的关键转变，也是发育随时间进展的指标。研究人员每日监测孵化率，直至所有存活样本均完成孵化。在受精后第6天对斑马鱼幼虫进行形态测量分析，六个实验组每组各20只幼虫，实验组编号为((n=120))。幼虫在成像前固定于4%多聚甲醛（PFA）溶液中。由于较高处理浓度下死亡率升高，形态测量评估仅纳入各精油最低浓度暴露组。如前文所述，通过体视显微镜获取幼虫侧面图像。参考Cadena等人（2022年）描述的方法，使用ImageJ软件（1.53k版本）测量眼长（EL）、头长（HL）、头宽（HW）和标准体长（SL）等形态参数。

胚胎毒性

采用概率单位分析法计算半数致死浓度（((LC_{50}))），具体遵循da Silva等人（2023年）概述的方法。基于斑马鱼幼虫在6天龄（dpf）暴露于不同浓度的顺铂（cisp）、吉非替尼纳米乳（GE-NE）及顺铂-吉非替尼纳米乳制剂后的存活数据，估算出(LC50)值。

统计分析

采用单因素方差分析（ANOVA）和 Tukey 事后检验进行多组间的统计比较。采用 Kaplan-Meier 曲线进行生存分析，并使用对数秩检验进行组间比较。采用概率单位分析生成。(LC50) 组数值及95%置信区间。统计学显著性定义为P值小于0.05。所有数据以均值±标准差（SD）表示。