标题：Gene expression mapping of conserved GABAergic interneuron markers in developing zebrafish

期刊：frontiers in Molecular Neuroscience

原文链接：https://dx.doi.org/10.3389/fnmol.2026.1849805

摘要

表达γ-氨基丁酸（GABA）的中间神经元在调控大脑活动中发挥关键作用，其功能受损或缺失与多种神经系统疾病相关。哺乳动物研究已证实胚胎神经节隆起是GABA能神经元的主要来源，但斑马鱼中与之同源的时空发育通路及标志物谱仍未被充分阐明。我们在受精后1-2天的端脑区域发现一个独特的腹侧脑区，该区域共表达内侧神经节隆起（MGE）特征性转录因子nkx2.1和lhx6a。尾侧神经节隆起（CGE）转录因子sp8在端脑表达，并延伸至中脑和后脑；而prox1a的表达定位于间脑背侧区、视前区、中脑及后脑。我们还观察到，在受精后3天和5天，经典MGE中间神经元标志物生长抑素1.1（sst1.1）和小白蛋白6（pvalb6）在端脑、间脑和中脑呈现非重叠表达模式。综上，本研究明确了保守的神经节隆起转录因子及中间神经元亚型标志物在发育中斑马鱼脑内的时空表达模式，为利用斑马鱼模型研究GABA能中间神经元发育及抑制性功能异常相关疾病奠定了重要基础。

关键词：γ-氨基丁酸、中间神经元、祖细胞、端脑、转录因子

引言

从感官感知到复杂的认知与行为，大脑的正常功能依赖于兴奋性与抑制性信号的精准协调。这一微妙的平衡主要由异质性极高的抑制性γ-氨基丁酸能中间神经元（INs）介导，这类神经元可调控兴奋性活动、控制神经放电的时序与同步性，并塑造神经元环路（Hu等人，2011；Klausberger等人，2003；Pouille与Scanziani，2001）。γ-氨基丁酸能中间神经元的缺失或功能异常与多种神经疾病相关，包括癫痫、阿尔茨海默病、自闭症以及各类神经精神疾病（Baraban等人，2009；Gogolla等人，2009；Verret等人，2012）。要探究抑制性环路的工作机制，首要关键是明确其细胞多样性的时空起源。由于γ-氨基丁酸能中间神经元包含多种具有独特分子、形态和生理特性的亚型，阐明这些神经元的发育轨迹仍是神经科学领域的核心难题。

在哺乳动物的大脑中，γ-氨基丁酸能中间神经元（GABAergic INs）主要起源于一种被称为神经节隆起（GE）的暂时性胚胎结构，该结构位于发育中的端脑内（Anderson 等人，1997）。神经节隆起被细分为三个亚区：内侧神经节隆起（MGE）、外侧神经节隆起（LGE）和尾侧神经节隆起（CGE），每个亚区都有独特的分子标志物和解剖位置。内侧神经节隆起最早出现在端脑-间脑连接处，表达经典标志物 Nkx2.1 和 Lhx6（Du 等人，2008；Liodis 等人，2007；Sussel 等人，1999）。它主要产生表达小白蛋白（PV）和生长抑素（SST）的中间神经元（Xu 等人，2004）。在哺乳动物中，近70%的皮质中间神经元起源于内侧神经节隆起。外侧神经节隆起位于内侧神经节隆起的腹外侧，主要参与嗅球中间神经元的生成（de Carlos 等人，1996；Stenman 等人，2003；Wichterle 等人，1999；Yun 等人，2001）。尾侧神经节隆起位于分隔内侧神经节隆起和外侧神经节隆起的沟的后方，缺乏明确的物理边界，这使得其精确的解剖定义和转录因子谱一直存在争议（Miyoshi 等人，2010；Nery 等人，2002）。目前，在尾侧神经节隆起中高表达的 Coup-tfII、Sp8 和 Prox1 是其主要的分子标志物（Kanatani 等人，2008；Miyoshi 等人，2015；Wei 等人，2019）。尾侧神经节隆起主要产生晚期生成的中间神经元，这些细胞表达钙视网膜蛋白、钙结合蛋白、血管活性肠肽和Reelin，最终定位于皮质、海马和杏仁核（Lee 等人，2010；Miyoshi 等人，2010；Touzot 等人，2016）。一小部分起源于视前区（PoA）的神经胶质形皮质中间神经元也表达同源盒编码的 Prox1 基因（Niquille 等人，2018；Rubin 和 Kessaris，2013）。

尽管这一发育框架在哺乳动物中特征明确，但在斑马鱼（Danio rerio）等硬骨鱼中是否存在类似的三重结构，相关研究记录却远不如前者详尽（Mueller 等人，2006；Mueller 等人，2008）。这是一个关键的研究空白，因为斑马鱼已成为转化神经科学领域的重要模式生物，广泛用于人类基因突变的功能分析、高通量药物筛选以及全脑网络功能成像研究（Ahrens 等人，2013；Baraban 等人，2005；Griffin 等人，2021；Howe 等人，2013；Moog & Baraban，2022；WhyteFagundes 等人，2024）。例如，与斑马鱼中间神经元相关的脑部疾病模型——如由中间神经元特异性钠通道亚基突变（SCN1A）引发的癫痫——已为理解癫痫发生机制和研发新型抗癫痫药物带来了重要进展（Moog & Baraban，2022）。目前关于幼体斑马鱼γ-氨基丁酸能神经元的神经递质含量和神经元结构的研究，大多集中在脊髓区域（Bernhardt 等人，1990；Higashijima 等人，2004；Pallucchi 等人，2024；Satou 等人，2012；Wyart 等人，2009），而针对幼体前脑或中脑结构的相关研究文献则相对较少（Mueller 等人，2008；Ramaswamy 等人，2020；Robles 等人，2011）。

为解决这一研究空白，我们采用全装多重杂交链反应（HCR）染色技术，评估了保守的γ-氨基丁酸能中间神经元（GE）特异性转录因子以及成熟中间神经元（INs）分子标志物的表达情况。斑马鱼幼体体型小、离体发育速度快且具有光学透明度，这为全装HCR技术的应用提供了便利，使得我们能够对整个神经系统的基因表达进行细致分析（Choi 等人，2018；Schulte 等人，2024）。本研究中，我们绘制了受精后1.5天、3天以及5-6天的斑马鱼端脑、间脑、中脑和菱脑各亚区中，nkx2.1、lhx6a（内侧神经节隆起，MGE）、coup-tfII、sp8（外侧神经节隆起，CGE）、prox1a（外侧神经节隆起与尾侧神经节隆起，CGE & LGE）以及dlx5a/6a（内侧神经节隆起、外侧神经节隆起与尾侧神经节隆起，MGE, LGE & CGE）基因转录本的表达图谱。研究结果表明，nkx2.1与lhx6a的共表达清晰地识别出发育端脑（皮质下区）内的一个MGE区域；sp8、prox1a和coup-tfII未在该皮质下区表达。此外，我们发现成熟中间神经元标志物（sst1.1、pvalb6、vip、calb2a/2b）的表达不存在重叠。这项研究不仅为跨物种比较提供了发育层面的参考依据，也为未来研究中解析抑制性中间神经元的成熟机制、多样性及功能奠定了基础资源。

结果

斑马鱼脑中保守中间神经元特征的转录组学可视化

为了开始探究中间神经元的发育起源，我们首先利用一个公开的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据库对基因表达模式进行了可视化分析，该数据库覆盖了受精后3小时至5天胚胎（Sur等人，2023）（图1A）。我们假设未成熟的斑马鱼大脑中存在与哺乳动物内侧神经节隆起（MGE）、外侧神经节隆起（LGE）和尾侧神经节隆起（CGE）类似的离散前体区域，每个区域均由转录因子（TFs）的保守组合所界定。在这一拟议模型中，类MGE区域以nkx2.1和lhx6a的表达为特征，而类LGE和CGE区域则与dlx5a/6a、prox1a、sp8以及coup-tfII的表达相关。

从斑马鱼细胞统一流形逼近与投影（UMAP）数据集获取的可视化结果证实了与这一拟议的三方组织相一致的分子特征。具体而言，典型的内侧神经节隆起（MGE）标记基因nkx2.1和lhx6a在腹侧前脑神经元的特定簇中高度富集且共表达（神经元簇[neur.10, neur.40]，图1B）。代表腹侧间脑的神经元簇[neur.21]以及γ-氨基丁酸能神经元簇[neur.12和neur.19]仅富集nkx2.1。在同一个腹侧前脑神经元簇中，还观察到了dlx5a和dlx6a的共表达——这两种转录因子是斑马鱼大多数γ-氨基丁酸能中间神经元的标记物（Robles等人，2011；Yu等人，2011）。然而，通常与外侧神经节隆起/尾侧神经节隆起（LGE/CGE）相关的基因转录因子标记物，例如后脑神经元簇[neur.3和neur.4]或端脑神经元簇[neur.20]中的prox1a和sp8，并未与nkx2.1共定位（图1B）。此外，在视顶盖和间脑（结节）处富集γ-氨基丁酸能神经元的神经元群体簇[neur.5、neur.19和neur.12]中，鉴定出了主要的内侧神经节隆起γ-氨基丁酸能亚型sst1.1和pvalb6（图1B）。

图1 斑马鱼脑中保守中间神经元特征的转录组学可视化。(A) DanioCell 单细胞RNA测序数据集的注释UMAP投影，展示主要神经元簇。颜色对应不同细胞身份，突出关键前脑簇。(B) 显示保守的祖细胞和中间神经元标记基因表达的特征图。上图：转录因子的表达定义不同的祖细胞结构域；nkx2.1与lhx6a在腹侧前脑簇中共表达，而prox1a与sp8分别标记不同细胞群。下图：全GABA能标记基因gad1b和典型内侧神经节隆起(MGE)亚型标记基因的分布；值得注意的是，sst1.1与pvalb6在广泛的GABA能簇中被解析为不重叠的神经元群。

1–2天pf时腹侧限制性MGE样结构域的解剖学特征

虽然转录组图谱支持一个保守的分子框架，但它们缺乏定义GE祖细胞区物理边界所需的解剖学分辨率（图2A）。为了解析MGE祖细胞的时空表达模式，我们在受精后1天和2天对nkx2.1和lhx6a进行了多重HCR染色（图2B）。利用DAPI蓝色荧光染色或HuC、PolyA等泛神经元标记物，我们对斑马鱼脑区进行了鉴定。在特化起始阶段（受精后1天），nkx2.1的表达广泛分布于亚大脑皮层（图2C；补充图2-1）。我们观察到lhx6a的表达在很大程度上与nkx2.1结构域重叠，但被限制在nkx2.1区域内一个更局限的亚群中（图2C、3A）。到受精后2天，nkx2.1和lhx6a的共表达仍保持高度稳定（图2D），这与在前脑早期模式形成过程中该结构具有MGE样特征的结论一致（图2A）。然而，nkx2.1的空间分布范围显著扩大，从端脑边界延伸至下丘脑（图2E）。这一模式表明，尽管nkx2.1是亚大脑皮层中间神经元特征的主要调控因子，但它也可能作为斑马鱼腹侧前脑特化的一个更广泛的标记物。

为进一步将类内侧神经节隆起区域界定为一个独立的解剖结构，我们接下来以sp8和prox1a作为相邻非内侧神经节隆起结构域的标志物，对其表达特征进行了分析。在受精后1天（1 dpf），sp8定位于端脑，具体为大脑皮层和嘴侧纹状体，并延伸至中脑的后半部分，跨越中脑-后脑边界（MHB）进入菱形区域，这一分布模式在受精后2天（2 dpf）保持稳定（图2E、图3A、B）。与此同时，受精后1天，prox1a定位于背侧间脑、视前区、中脑前半部分以及菱形区域（图3A）。到受精后2天，prox1a的表达结构域扩展至间脑的缰核（图2E、图3B）。值得注意的是，sp8和prox1a的表达区域在很大程度上不重叠，仅在菱形区域存在交汇。最重要的是，sp8和prox1a的表达区域与nkx2.1的表达结构域相互排斥（图3A、B）。此外，在受精后2天，couptfII未在大脑皮层表达，仅局限于中脑前部和后脑的小斑块区域（图3B）。总体而言，这种表达分布的分离进一步证实，富含nkx2.1/lhx6a的区域构成了一个分子和空间特征明确的类内侧神经节隆起结构。综合来看，这些发现提供了有力证据，表明斑马鱼腹侧前脑存在抑制性中间神经元的保守发育起源，该起源在空间上与其他纹状体前体细胞群相区别（图2A）。

图2 1-2天pf时亚 pallium 内侧神经节隆起样结构域的解剖学特征。(A) 斑马鱼腹侧神经节隆起的假设示意图，列出了用于鉴定的标志物组合。(B) 整体多重原位杂交链式反应（HCR）实验方案的流程示意图。(C、D) 1天pf时背侧前脑视图的最大/平均强度投影（C，样本ID：(n=3)；2天pf时样本ID：(n=5)）。对nkx2.1（品红色）和lhx6a（青色）进行原位杂交链式反应染色，在亚 pallium 区域检测到稳定的共表达结构域。Huc（灰色，平均强度投影）作为全神经元对照染色。(C)中的插图标注了成像平面。(E) 2天pf时的矢状光学切片，显示内侧神经节隆起样结构域与相邻区域的边界。nkx2.1的表达仅限于亚 pallium 和下丘脑。相比之下，prox1a和sp8在整个间脑、中脑和菱脑中均有表达，且sp8向头侧延伸至端脑。Eomesa（端脑背侧）、lef1a（视顶盖、下丘脑）和nkx2.4a（下丘脑，均为青色）作为区域解剖学标志物（每个条件n=4-8条幼体）。Hypo，下丘脑；Mes，中脑；OP，嗅基板；Pal，端脑背侧；PoA，视前区；Rhomb，菱脑；SubP，亚 pallium；Tel，端脑。

3天龄斑马鱼端脑中γ-氨基丁酸能标志物的分布

在建立早期前体细胞区域的基础上，我们接下来研究了3天胚胎期（3 dpf）时γ-氨基丁酸能中间神经元身份的出现。为了描绘更广泛的次脑盖区域特征，我们首先检测了dlx5a/6a的表达。dlx5a/6a除了作为全次脑盖标志物外，还是决定γ-氨基丁酸能细胞命运的关键因子，会影响多种抑制性细胞谱系的特化（MacDonald等人，2010；Yu等人，2011；Zerucha等人，2000）。在端脑（前脑）中，dlx5a/6a的表达在次脑盖区域显著，呈现出这样的模式这种状态一直持续到受精后5天（补充图3-1）。双重HCR染色显示dlx5a/6a与全GABA能标记物gad1b之间存在较高程度的空间相关性，证实背侧脑区中dlx5a/6a的表达是抑制性中间神经元特化的主要位点（图3C）。相比之下，sp8的表达在端脑吻端、中脑顶盖以及后脑中线处占据高度受限的区域（图3C）。在这些区域内，sp8与dlx5a/6a及gad1b的空间重叠范围有限，二者的共分布主要集中在sp8表达区域的后缘（图3C）。综上，该定位明确斑马鱼背侧脑区为表达dlx5a/6a的GABA能前体细胞区，且该区域与吻端的sp8表达区域在空间上相互分离。

图3祖细胞结构域的空间分离和GABAergic身份的建立。（A-C）中间神经元标记表达的共聚焦分析。对于所有代表性的堆叠图像（左图），huc/polA复染（灰色）显示为平均强度投影，以可视化解剖结构，而基因标记是最大强度投影。相应的串行z堆叠蒙太奇（右图）光学显示间隔为8μm的切片。（A，B）GE标记基因表达在1 dpf（A）和2 dpf（B）。用于prox1a，sp8和nkx2.1的多路复用显示基本上不重叠的领土。（C）GABAergic建立在3 dpf。dlx5a/6a（洋红色）和gad1b（青色）具有高度的空间相关性，确认大脑皮层下是主要的GABAergic祖细胞区。（(=4-6)=4-6幼虫每个条件）。电话，端脑；迪，间脑；Mes，中脑；菱形，菱形脑；帕尔，苍白；SubP，苍白下；OTn，光学顶盖；OTspv，光学顶盖层外周。

3至5天龄期间成熟中间神经元亚型的渐进性空间分布

为评估分化中间神经元群体的分布，我们针对成熟中间神经元亚型标志物开展了多重杂交链式反应：来自内侧神经节隆起（MGE）的 sst1.1 和 pvalb6、来自外侧神经节隆起（CGE）的 calb2a/2b 和 vip，同时结合泛GABA能标志物 gad1b，检测时间为受精后3至5天（图4；补充图4-1）。受精后3天，gad1b 信号在斑马鱼脑中广泛且强烈分布（图3C、图4A）。在这一广泛的抑制性神经框架内，MGE 中间神经元亚型经典标志物的表达呈现出高度区域化的模式。例如，pvalb6 的表达在视顶盖和小脑中最为显著，而其在端脑（前脑）的分布仍较为稀疏（图4C）。与pvalb6广泛的前-后分布不同，sst1.1的表达主要局限于腹侧前脑。分散的标记在前脑结构（包括缰核、丘脑、下丘脑）和后脑（图4B）中观察到了这一现象。对皮质纹状体迁移区中间神经元标志物的检测显示，其区域表达模式同样具有显著差异。值得注意的是，calb2a/2b 在视顶盖、顶盖前区和小脑中均呈现稳定的表达（补充图4-1）。然而，vip 的分布则较为稀疏且范围显著更窄，仅以零星的单个细胞形式存在于丘脑和下丘脑之中（补充图5-1）。到5天龄时，这些成熟中间神经元标志物的空间分布模式与3天龄时观察到的结果基本一致（图4；补充图3-1、4-1），这与斑马鱼幼体早期的功能发育能力相符。

为了表征内侧神经节隆起衍生的中间神经元群体之间的空间排列，我们还检测了6天post-fertilization（dpf）时双重染色的斑马鱼。我们发现生长抑素1.1（sst1.1）和副肌球蛋白B6（pvalb6）占据严格离散的区域，表明MGE来源的中间神经元的两个标记物占据不重叠的区域（图4D）。

图4 3至5天胚胎期末端中间神经元亚型的渐进式空间分布。(A–D) 末端中间神经元亚型的共聚焦分析。针对所有图像中，HUC 复染剂（灰色）以平均强度投影的形式显示，以可视化解剖结构，而基因标志物则采用最大强度投影。(A) 泛GABA能标志物gad1b（品红色）在3天胚胎期（上图）和5天胚胎期（下图）的表达情况。代表性的堆叠图像（左）和z轴切片（右）显示，一个稳定的抑制性框架分布在斑马鱼大脑的所有主要亚区。(B) 内侧神经节隆起衍生的中间神经元亚型标志物sst1.1（品红色）的空间分布。其表达分散于前脑、下丘脑和菱脑中。(C) 内侧神经节隆起衍生的中间神经元标志物pvalb6（品红色）的分布。与sst1.1相比，pvalb6在前脑的表达较为稀疏，但在视顶盖和小脑中高度富集。(D) 6天胚胎期的多重HCR双标实验，显示了sst1.1（品红色）和pvalb6（青色）的表达。高分辨率光学切片表明，这些标志物占据互不重叠的区域，未观察到共表达现象，证实它们界定了不同的神经元群。((n=4-7) = 每个条件4-7条幼鱼)。端脑（Tel）、间脑（Di）、中脑（Mes）、菱脑（Rhomb）、延髓（M）、小脑（Cb）、大脑皮层（Pal）、纹状体下区（SubP）、视顶盖（OTn）、室周层视顶盖（OTspv）。

构建中间神经元特化的时空表达矩阵

为了整合早期幼体发育过程中观察到的复杂表达模式，我们生成了二元热图，总结了受精后1至5天（1-5 dpf）主要基因表达（GE）和中间神经元标志物的区域分布（图5）。由于体内样本的杂交链式反应（HCR）染色强度存在差异，未进行定量分析。作为描述性总结，使用简单的二元评分系统生成热图：每个大脑区域内“没有基因表达”（0，蓝色）或“观察到的基因表达”（1，红色）。这种方法提供了每个标记在发育中的斑马鱼大脑的已建立解剖细分中表达位置的全球总结。在早期祖细胞阶段（1-2 dpf），我们观察到端脑（前脑）中不同的区域偏好。值得注意的是，规范的MGE标记nkx2.1和lhx6a仅在大脑皮下检测到，对比CGE和LGE相关标记sp8、prox1a和CouptfII与更广泛的表达模式，包括中脑和菱形脑。随着发育进展到3和5 dpf，中间神经元特异性标记的分布反映了GABAergic中间神经元的预期迁移和成熟。虽然在所有主要脑部分区都检测到了gad1b，但上游像dlx5a/6a这样的选择器仍然严格局限于前脑区域（图5C，D）。在成熟的中间神经元亚型标记中，calb2a/2b主要出现在中后脑区域，而端脑则不存在。而sst1.1位于腹侧前脑和后脑，pvalb6在前后轴表现出广泛的表达。总的来说，本摘要说明了整个早期斑马鱼发育过程中GABAergic标记表达的动态空间景观。

图5发育中的斑马鱼大脑中中间神经元标记的时空表达矩阵。（A）发育中的斑马鱼大脑在2 dpf（左）和3-5 dpf（右）的示意图。说明主要的解剖细分。区域被颜色编码以与热图列相对应。（B）热图总结了1-2 dpf处祖细胞转录因子的区域表达。行表示特定基因，列表示解剖细分。红色表示检测到的表达，蓝色表示缺失。（C，D）泛GABAergic（dlx5a/6a，gad1b）和中间神经元亚型标记（sst1.1，pvalb6，calb2a/2b）在3 dpf（C）和5 dpf（D）的表达谱。Tel，端脑；Di，间脑；Mes，中脑；菱形，菱形脑；OP，嗅觉基板；Pal，Pallium

讨论

斑马鱼中间神经元的内侧、外侧或尾部神经节隆起区域特异性起源、路线和目的地可能存在，如哺乳动物所示（Casalia et al.，2021； Hansen et al.，2013；Nery et al.，2002；徐et al.，2004）。然而，发育中的斑马鱼中GE区域的综合地图是不可用的。Mueller等人使用dlx5a/dlx6a-GFP转基因系进行的迁移研究表明，在28 hpf处出现GABAergic祖细胞的背侧端脑位点（Mueller et al.，2006），但这并未使用定义神经节隆起亚区域的标记得到证实。在这里，我们使用了主要关注MGE特异性转录因子的多路复用方法来首次解决这一祖区域的精确边界。我们的研究表明，哺乳动物MGE在中间神经元发育背景下的分子逻辑在硬骨中是保守的。

在1-2 dpf处对幼虫进行全贴面HRC染色的背侧视图显示，在对应于背侧端脑的区域中，nkx2.1和lhx6a的表达基本上是重叠的（图2）。以前利用显色原位杂交的解剖学研究（Manoli和Driever，2014年）表明，在幼虫早期发育期间，nkx2.1的表达定位于基底端脑和下丘脑区域。我们的多路复用HRC方法直接建立在这些基础观察的基础上。从矢状面角度成像nkx2.1和eomesa（Tbr2，一种大脑皮层特异性标记）在2 dpf幼虫中的共表达证实了nkx2.1表达的亚大脑皮层的明显细分（图2E）。此外，矢状面图像进一步显示，假定的MGE结构域与相邻区域分离，nkx2.1表达与sp8和prox1a一起大部分不重叠，进一步延伸到端脑和下丘脑/PoA区室（图这compartmentalization反映了哺乳动物GE的空间组织，其中不同的祖细胞池在物理上是分开的，以促进独立的发育计划（Nery等人，2002年；Sussel等人，1999年；云等人，2001年）。

将谷氨酸转化为GABA的谷氨酸脱羧酶（例如gad1a和gad1b）的基因通常用作泛神经元GABAergic中间神经元标记。在几个物种中的Immunohistochemistry研究表明，gad1a和gad1b在发育中的大脑中的表达很大程度上是重叠的，包括对4 dpf斑马鱼大脑的研究（Filippi等人，2014年）。以前的斑马鱼工作还表明，在含有背侧大脑皮下向大脑皮下延伸的组织切片中可以看到gad表达细胞（Mueller等人，2008年）在2-3 dpf暗示相当于斑马鱼MGE。在这些研究中，还描述了大脑皮下lhx6a的表达。与这些发现一致，我们观察到在受精后1-2天，全标本研究显示nkx2.1和lhx6a在脑下皮区域存在显著的共表达（图2C）。早在受精后3天，gad1b的表达就延伸至中脑（视顶盖）和菱脑前部（小脑），表明这些神经元以从前到后的方向发生迁移（图4A）。如先前研究所示，受精后5天时gad1b的表达已覆盖幼鱼脑的所有区域（图4A）。这些表达模式与成年斑马鱼中的情况大体相似（Mueller与Guo，2009），表明成熟且具有功能的γ-氨基丁酸能网络在发育早期便已建立。早在受精后5天，就可通过γ-氨基丁酸受体拮抗剂（戊四唑）诱发同步的癫痫发作活动（Baraban等人，2005），这与上述结论相符。

在受精后3天（3 dpf），我们观察到了典型的内侧神经节隆起（MGE）衍生的中间神经元亚型标志物的表达，如sst1.1和pvalb6（图4B、C）。sst1的表达呈散在分布，沿中线出现在丘脑前体、丘脑和被盖对应的区域，在受精后5-6天（5-6 dpf）时表达更为显著，主要集中在间脑（缰核）（图4B）。Devos等人（2002年）首次报道了前生长抑素（PPS1）在受精后55小时至5天（55 hpf至5 dpf）期间在间脑的表达。拜尔实验室开发的Gal4:UAS sst3报告基因品系显示，在受精后6天（6 dpf）时，后脑存在散在的单个细胞（Forster等人，2017年）。相比之下，pvalb6的表达在受精后3天（3 dpf）时于中脑呈弥散分布，并在受精后5天（5 dpf）时延伸至菱脑（小脑）（图4C）。使用识别小白蛋白的抗体进行的免疫组织化学研究发现，在受精后5天（5 dpf）的矢状视图中，视顶盖室周层（OTspv）区域存在小白蛋白阳性的细胞体，其位置靠近神经纤维网（Nevin等人，2008年）。使用pvalb6探针进行的整体原位杂交背侧视图证实了上述发现，同时还显示其在5-6天（5-6 dpf）时在神经纤维网中呈更散在的表达，且在小脑中存在显著表达。与哺乳动物一致的是，在斑马鱼脑中，sst1和pvalb6的非重叠表达在受精后6天（6 dpf）时最为明显。

本研究虽为内侧神经节隆起样前体细胞区及主要内侧神经节隆起中间神经元亚型构建了整合性分子参考图谱，但二者间的直接谱系关系仍有待实验验证。在哺乳动物中，已有充分证据表明内侧神经节隆起可产生前体细胞，这些细胞经切线迁移后最终分化为PV阳性和SST阳性中间神经元。然而，由于缺乏遗传命运图谱或延时成像技术，我们将硬骨鱼中鉴定出的nkx2.1+/lhx6a+结构域视为后期sst1.1和pvalb6阳性细胞群主要来源的这一假说，仍存在局限性。接下来的关键一步，是从标记基因表达研究转向确定性的遗传谱系示踪。借助nkx2.1和lhx6a启动子驱动的Cre/loxP重组系统等工具，可对该前体细胞群进行标记并追踪细胞分化过程。利用dlx1a/2a或dlx5a/6a转基因品系开展的谱系示踪研究显示，这些前体细胞主要分化为γ-氨基丁酸能细胞。但这些荧光标记的细胞并非总能与HuC或gad65的表达共定位，且可能仅代表成年斑马鱼γ-氨基丁酸能中间神经元的一个亚群（Solek等人，2017）。未来的研究可结合γ-氨基丁酸能神经元特异性启动子，搭载荧光标记的谱系特异性报告基因品系，并结合活体光片照影显微镜技术，实现对其迁移路径的实时直接可视化。这将明确斑马鱼中间神经元是否经历与其哺乳动物同类相似的切线迁移过程，或是采用独特的迁移策略。填充成熟硬骨鱼的大脑。本研究为更好地理解斑马鱼中间神经元的起源奠定了基础。

材料与方法

斑马鱼饲养

斑马鱼（斑马拟丽鱼）饲养于温度可控的设施中，遵循14小时光照/10小时黑暗的昼夜节律，饲养条件为标准参数（28–30摄氏度、pH值7.5–8、电导率690–740毫西门子/厘米）。繁殖时，成年斑马鱼成对 overnight 用隔板分隔过夜，次日清晨移去隔板以同步收集鱼卵。胚胎和幼鱼在E3培养基（反渗透蒸馏水中添加0.03%即时海水盐）中于28.5摄氏度下饲养至受精后6天（dpf）。所有实验操作均严格遵循机构动物护理与使用指导原则开展。所有实验均从包含100–200枚健康胚胎的鱼卵群中随机选取幼鱼进行实验。

多重杂交链式反应（HCR）

利用第三代原位杂交链反应（HCR，Choi 等人，2018）对中间神经元标志物的空间表达进行了定位。设计带有分裂起始子序列的DNA反义寡核苷酸探针组（每个基因12–20对）以实现自动背景抑制，该探针组由整合DNA技术公司（IDT，补充表1）合成。染色过程按照既定方案进行（Lovett-Barron 等人，2020）。简要而言，将幼鱼（1–6天胚胎期）在4%多聚甲醛（PFA）中于4°C固定过夜，在-20°C的100%甲醇中脱水20分钟，随后通过甲醇/SSCT梯度进行复水。将样本置于杂交缓冲液（2×SSCT中含4 nM探针、10%硫酸葡聚糖和10%甲酰胺）中，于37°C孵育过夜。洗涤（2×SSCT中含30%甲酰胺）后，使用与Alexa Fluor 488、546或647偶联的B1–5发夹结构（分子仪器公司，240 nM）进行信号扩增。发夹结构经快速冷却（95°C 1分钟，随后室温20分钟）后，在扩增缓冲液（5×SSCT中含10%硫酸葡聚糖）中于黑暗中孵育过夜。样本保存在4°C的1×PBST中，直至成像。

共聚焦显微镜成像

HCR染色的幼虫被包埋在35毫米玻璃底FluoroDish培养皿（WPI公司）中的1%低熔点琼脂糖内。成像在尼康共聚焦显微镜上进行，使用10×/0.45（Plan Apo）或20×/0.70（Plan FL）空气物镜。XY分辨率设置为512或1024像素，z轴步长间隔（体素深度）根据所需的体积细节分别为2微米或8微米。为确保在所有样本中保持一致的信号，激光功率和探测器增益均针对特定标记物和载物台进行了校准。由于光衰减和物镜工作距离的影响，成像深度聚焦在大脑的前80微米处，以维持最佳的信噪比。

机器学习去噪与图像处理

为提高信号清晰度，我们使用 Noise2Void（N2V）自监督深度学习框架（Krull 等人，2018）对三维堆叠图像进行了去噪处理。为最大限度减少与标准上采样相关的网格状伪影，我们对 U-Net 架构进行了修改，将整个网络的卷积核从 3×3 增大至 5×5。该模型在具有代表性的图像数据集（64×64 像素图像块，批量大小 128）上训练了 100 个轮次，采用盲斑掩码方案，从局部邻域预测像素强度。优化过程通过均方误差（MSE）损失函数实现。训练好的模型在所有通道上逐切片应用。所有计算流程均基于 Python（3.10 版本），使用 n2v（0.3.2 版本）、csbdeep 库以及 TensorFlow（2.12 版本）后端实现。