题目：Widefield Targeted Illumination Microscopy Enables Optically-Sectioned, Motion-Resilient Imaging of Neuronal Fibers and Their Dynamics

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/lpor.202501980

期刊：Laser & Photonics Reviews

摘要

在神经元的宽场荧光成像中，来自明亮胞体的离焦光和散射光常常会遮挡附近微弱的神经纤维，降低其对比度。扫描技术虽能解决这一问题，但受限于成像速度降低和成本增加。本研究通过将照明强度调制为不同结构，大幅降低了宽场成像中的杂散光。研究采用迭代方法，借助普通宽场显微镜加装的数字微镜器件，通过实时图像处理识别神经纤维，并对其进行靶向照明：明亮的胞体以最低光照强度照明，处于焦平面的神经纤维则以高光强照明。该方法在保持快速成像速度、低光漂白率和低成本的同时，最大限度地减少了背景干扰，提升了神经纤维的可见度。即便样本处于运动状态，通过更新靶向图案，照明也能持续聚焦于目标结构。利用这种靶向照明策略，本研究在麻醉的秀丽隐杆线虫、体外小鼠脑切片以及固定的斑马鱼幼虫样本中，实现了复杂神经元的高对比度光学切片成像，还对秀丽隐杆线虫的动态变化进行了高速成像。

关键词：荧光成像、神经元成像、靶向照明

引言

宽场（WF）成像是一种传统的光学显微技术，在该技术中，整个视场都被照亮同时被照亮并观察。虽然它具有图像采集速度快的优势，但由于光学切片能力有限且无法抑制散射，往往存在对比度较低的问题散射光的影响被放大。在神经元成像中，这些 （注：原文存在断句情况，结合上下文语义，此处“those”指代前文“lower contrast due to limited optical sectioning and an inability to reject scattered light”这些问题，译文按语境补充完整语义以保证通顺）缺点因细胞体和神经元纤维（神经突）之间亮度的显著差异而被放大。神经元细胞体在尺寸和体积上比纤维大得多。当被典型的可溶性荧光团，如绿色荧光蛋白（GFP）标记时，细胞体可以出现比附近纤维亮20-30倍，并且可能会遮住附近的纤维（图1a）。相比之下，扫描显微镜技术，如共焦或多光子显微镜，消除离焦光并减少光散射的影响以增加signal-to-background比（SBR）（图1b）。然而，扫描显微镜通常更复杂和昂贵，在成像速度和视场（FOV）之间进行权衡，而WF成像与大FOV保持几乎相同的速度。HiLo显微镜将单speckle-illumination与标准WF照明相结合，以在高速下通过光学切片增强图像对比度。然而，它容易产生残余散斑噪声，需要更广泛的研究它可以调整多个参数以获得最佳成像。Struc光照显微技术（SIM）已成为光学切片和超分辨率成像的重要技术，但它需要获取多个图像以进行最终图像重建，这反过来又降低了成像速度并增加光漂白和光毒性。其他像light-sheet-microscopy这样的广域成像技术可以实现具有光学切片能力的高速成像，但轴向分辨率低（通常是亚细胞但不是亚微米）或需要复杂的硬件设置。WF成像可以如果SBR可以在没有复杂设置、低成像速度或强光漂白等缺点的情况下得到改善，则成为强大的成像工具。

在这项研究中，我们展示了一种我们称之为靶向照明显微镜（TIM）的新方法，以提高WF显微镜中神经突图像的质量。这项技术扩展了通用掩蔽照明概念最近用于跟踪神经元活动。TIM使用简单的数字微镜设备（DMD）插件优先照亮神经元纤维WF显微镜，其目标是降低荧光非纤维结构的强度，以便能够在单个图像中清晰地观察整个神经元。成功的TIM依赖于从WF图像生成用于纤维照明的精确掩码，这是具有挑战性的执行，因为WF图像包含神经突、非神经突结构和显着噪声。从WF神经元图像开始，我们执行几个图像处理步骤，包括强度反演、卷积滤波、归一化、基于密度的分割和噪声抑制，以生成照明掩码。我们使用反馈迭代步骤，以更好地容忍不完美的图像处理，生成改进的掩码，并最终产生优越的结果。这种策略减少了细胞体和其他背景光的不需要的荧光，从而改善了神经元纤维的画质和对比度。TIM使WF显微镜能够清晰地可视化纤维和其他复杂的神经元结构。使用我们的TIM方法，我们展示了概念验证实验，该实验显示体内和体外样品（包括秀丽隐杆线虫、小鼠大脑切片和斑马鱼）的光学切片和SBR显着改善。TIM图像中神经元纤维的SBR与共焦图像很好地对应。TIM的开发和应用代表了神经元纤维WF成像的重大进步，为高质量的神经成像提供了一种更容易获得、更具成本效益和更高效的方法。

结果

靶向照明显微镜概述

广泛定义的TIM的总体原则是将照明光引导到感兴趣的结构，以增加它们与背景的对比度。我们专门实施TIM以增加神经元纤维的对比度，这些纤维在WF显微镜中通常难以区分。在WF显微镜中，纤维通常相对于细胞体暗淡，并以3D形式排列（图1a，b），因为纤维和细胞体都被均匀照明。我们利用照明光束路径中的DMD选择性地照明聚焦纤维（图1c）。这种照明策略增强了这些纤维的信号，并降低了细胞体和其他背景结构的强度，从而增加了纤维对比度。实施这样的策略具有挑战性，因为它需要识别它旨在增强的纤维结构。我们提出了一种迭代方法，通过利用来自图像的反馈来生成照明掩模，从而逐步改进图像。

图1d，e分别显示了整体TIM工作流程和掩模生成过程。如图1d所示，我们首先捕获uniformly-illuminatedWF图像，然后采用图像处理程序生成理想情况下仅包含聚焦光纤的掩模。然而，由于原始WF图像中存在显着噪声，算法只能生成不精确的掩模。掩模显示在DMD上以控制照明的空间图案。因为这种掩模消除了在大多数背景结构上的照明，与原始WF图像相比，生成的“中间”图像呈现的背景和细胞体雾度要少得多。然后，使用这个中间图像，我们重复基本相同的图像处理程序，以生成第二个，更精确，掩模，以进一步细化照明，以实现最终的TIM图像。图1e展示了掩模生成过程的简化描述。如下文进一步描述的，我们在主动照明显微镜的新WF应用中反转像素值。我们还通过新颖的卷积滤波器增强图像，并执行光纤分割。最后，我们结合这些方法来创建用于DMD照明的掩模。图S1（支持信息）提供了整个TIM工作流程的全面描述，以供参考。

图1。A）WF和B）共聚焦显微镜成像的TIM。秀丽隐杆线虫ASJ神经元概述。WF缺乏神经突对比度和光学切片。C）TIM设置。准直LED光在平面共轭到焦平面处照亮DMD。DMD图案光到样品中的目标结构。D）秀丽隐杆线虫PVD神经元示例图上的TIM工作流程。来自广域照明的图像被处理以生成DMD掩模1。处理产生的中间图像以生成精制掩模2，产生最终的TIM图像。E）TIM掩模生成的简化步骤。输入图像（D部分中的广域图像或中间图像）被强度反转并卷积滤波和分割以生成DMD掩模（D部分中的掩模1或掩模2）。

反向掩模增强昏暗的信号对比度

在本节中，我们减少细胞体荧光以暴露附近的纤维。在WF图像中，细胞体通常比神经突起亮得多。明亮的细胞体荧光与光散射和失焦光锥相结合，产生周围的雾，并遮蔽附近的暗淡纤维。自适应/主动照明显微镜（AIM），也称为控制光曝光显微镜（CLEM），是一种扫描技术，可以在空间上调节照明强度，通常使用电光调制器、声光调制器或DMD。AIM通常用减少的光照亮明亮的结构，用增加的光照亮昏暗的结构。通过在很大程度上保持emis强度常数，AIM增加动态范围，通过减少对明亮结构的过度照明，目的减少照片损坏。在一个新应用程序中，我们将AIM应用于WF暴露弱信号（暗淡的纤维）并抑制强信号（明亮的细胞体）。我们使用DMD以其发射强度的倒数照亮每个位置（图1c）。

我们首先获取样本的均匀照明WF图像。例如，在图2a中，16位图像的强度值约为60000（细胞体）、(≈22000)（轴突信号）、(≈20000)（轴突背景）。我们利用逆亮度的概念，在指定的宽范围内对其强度进行反转，以生成一个掩模（图2b）。该范围的上限通常设置在相机饱和值附近，而下限一般设置在CMOS相机暗计数/噪声基底略上方，或略低于最低信号值（例如，在图2中，上限）上限：50000，下限：10000）。 鉴于细胞体的亮度 （注：原文中“53c885e0-6bd9-4643-97ed-de1739649821”“5d0c9b18-803d-4f78-84c7-6ba367cd639b”“aa7ec8a0-50ea-45c2-b203-701ad002b913”为UUID，按规则保留；“16-bit”为技术术语，保留原文；“WF”“DMD”“CMOS”“SBR”为专业缩写，保留原文；“Laser Photonics Rev.”为期刊名，保留原文）亮度比相邻的神经纤维高出一个数量级以上，根据我们的常规成像参数，我们凭经验发现该范围很容易覆盖神经纤维，但会排除亮度极高的细胞体。我们在数字微镜器件（DMD）上利用该反向掩模对照明光进行图案化。对细胞体的减少照明会降低其荧光强度以及周围的光晕，从而提升相邻神经纤维的对比度（图2c），所获取的16位图像强度值分别约为≈5000（细胞体）、(≈3000)（轴突信号）、≈2000（轴突背景）。如图2d、e中的强度分布量化所示，神经纤维的信号背景比（SBR）提升了约1.4倍。

在我们的宽场（WF）反向照明中，尽管我们尽量减少焦平面上细胞体的照明，但细胞体仍会被离焦光照射。因此，来自细胞体和周围的模糊区域仍然存在，这会掩盖一些细微的纤维细节，使其难以识别或可视化。尽管如此，反向照明会使细胞体变暗，并增强神经突的信号。因此，我们将AIM的反向掩模程序作为生成TIM掩模的一部分来使用。

图2. 反向照明提升纤维对比度。秀丽隐杆线虫ASJ细胞体及附近轴突。A) 均匀照明的宽场（WF）图像；轴突采用部分反向（实线）照明。通过数字微镜器件（DMD）上的(≈1.4 x)反向掩模，轴突的信噪比（SBR）得到提升。细胞体的荧光和雾影有所降低，轴突对比度提高。D、E) 轴突的强度分布曲线；宽场均匀照明（虚线）及受细胞体雾影遮挡的状态。B) 通过反转指定范围内的宽场图像强度生成的反向掩模。C) 对样本进行照明后得到的图像

定制卷积滤波器突出纤维特征

在本节中，我们通过将图像与特定于纤维的滤波器进行卷积来增强纤维的可见性。增强后的可见度有助于对纤维进行分割，从而生成光照掩码。神经纤维的宽度基本均匀且长度延伸，因此线条检测器是识别神经突的一种潜在工具。线条检测器是用于识别和提取线条的图像滤波器图像中的耳朵特征或结构。 我们使用一种变体使用线条检测器突出显示与典型纤维形状匹配的结构。具有确定宽度的结构会被高亮显示。

图S2a（支持信息）展示了一张秀丽隐杆线虫中神经突的小图像，其信背比（SBR）较低，使用强度阈值法难以分割，甚至难以清晰观察。我们的物镜与相机组合成像的神经突宽度约为5个像素。我们设计了一个简单的卷积使用卷积滤波器识别出宽度为5个像素的结构（支持信息图S2a，底部）。我们将滤波器的绿色部分称为“中心”，黄色部分称为“周边”。当这些区域分别与纤维和背景对齐时，滤波后的像素值会较高。我们将该滤波器与低对比度纤维图像进行卷积运算，并校正负值，从而生成对比度显著提高的新图像（支持信息图S2b）。如支持信息图S2c的量化结果所示，原始图像的神经突信号背景比（SBR）为1.5，而滤波后的图像信号背景比高达145，这极大地简化了分割过程（见下文）。

为突出任意方向的纤维，我们在水平和垂直方向上对滤波器进行卷积、校正，然后将它们合并（公式(1)–(5)）。

图S2d（支持信息）展示了对秀丽隐杆线虫ASJ神经元的WF图像进行滤波处理的示例。纤维的信号强度得到了显著增强，而其他信号和背景则被大幅抑制。由于细胞体的宽度与纤维存在显著差异，滤波处理大幅降低了细胞体的信号强度。该滤波器需根据纤维宽度（以像素为单位）进行调整，而纤维宽度会受到纤维粗细、放大倍数和相机阵列的影响。为了将我们的纤维滤波器与通常仅检测单像素线条的其他线条检测器区分开来，本文后续部分将我们的神经元纤维结构滤波器称为“Neuf”（神经突滤波器）。

统一纤维强度以显现微弱纤维

阈值法是一种从背景中分割纤维的概念上简单的方法；然而，由于纤维亮度存在异质性，设置全局阈值往往具有挑战性。在原始WF图像（图3a）中，由于背景增强，细胞体附近的纤维比远处的纤维具有更高的强度。即使经过Neuf增强（图3b），附近纤维的强度仍高于远处纤维，这是因为滤波后的像素值在很大程度上与原始值成正比在局部区域（公式(1)至(5)）。如此大的强度范围使得基于全局阈值法进行精准分割变得困难甚至无法实现。此外，不同的成像条件和样本可能具有截然不同的整体亮度，这就要求不同的图像需采用不同的阈值。对纤维信号进行归一化处理将极大地简化分割流程。为解决此问题，我们通过逐像素比值将 Neuf 增强图像（图3b）归一化至原始宽场（WF）图像（图3a）。 

我们在下文将这种归一化方法称为“比率”。该比率量化了Neuf对每个像素的增强程度，本质上是评估局部区域成像结构与纤维的相似程度，且该比率在很大程度上与结构的绝对亮度无关。比率图像（图3c）进一步突出了弱纤维并减弱了明亮信号，尤其是那些不具备纤维形态的信号。因此，纤维得到了显著增强，而细胞体则被进一步抑制。不过，我们注意到细胞体周围具有纤维外观的散射信号和背景信号也可能被不当地增强，但在我们流程的后续迭代中，这些伪影将被抑制。

图3 纤维增强与分割。秀丽隐杆线虫PVD神经元。A）原始宽场（WF）图像的二维平面。纤维比细胞体暗得多。B）原始图像的“Neuf”滤波处理。纤维得到增强，细胞体被抑制。C）比率图像（Neuf图像除以原始图像）进一步提升了纤维对比度并抑制了细胞体。D）通过对前4%像素进行阈值处理实现的比率图像分割。E、F）从D的图像中去除背景（黄色插图）和小物体（绿色插图）。G）局部密度约束减少了细胞体附近的噪声（橙色插图）。缩写：thresh：阈值处理；BG：背景；LDC：局部密度约束。

基于全局纤维密度的分割

增强型比率图像通过利用整体纤维密度，能够将纤维与背景分离开来。纤维占据视场的一小部分，因为纤维非常细，且神经元通常会被选择性标记以进行成像。因此，我们前在图像中，包含纤维的荧光像素仅占总像素的一小部分。在秀丽隐杆线虫神经元的图像中，我们发现纤维仅覆盖不到1%的像素。在小鼠大脑和斑马鱼后脑等密度更高的样本中，纤维覆盖的像素比例可能略高。整体密度，即纤维占据的总体积百分比，为纤维分割提供了一种简单直观的方法。此前的Neuf和Ratio步骤通过将每个像素的数值转换为衡量局部区域与纤维相似程度的指标，共同实现了这一分割过程（见上文）。如实验部分进一步所述，给定纤维密度百分比d%，我们会在Ratio图像中分割出最靠前（即“最亮”）的d%像素，也就是局部区域与纤维最相似的d%像素。图S3e（支持信息）展示了在不同密度阈值下分割的Ratio图像。随着阈值“升高”，杂散像素（尤其是靠近细胞体的像素）会被逐步抑制，最终真实的纤维像素也会被抑制。顶部0.5%–1%的密度阈值显然会遗漏含纤维的像素，而顶部10%这一低得多的密度阈值则会保留细胞体附近大量的噪声和离焦纤维（见图S3ab，支持信息）。不过，正如我们后续所述，迭代方法对密度阈值的选择具有很强的鲁棒性：广泛的密度阈值范围都能生成良好的最终图像。需注意，上述Ratio步骤对于抑制细胞体的分割至关重要，因为其像素是原始宽场（WF）图像（图S3a，支持信息）和Neuf图像（图S3d，支持信息）中最亮的像素之一。我们通过实验确定，4%的密度阈值能在有效抑制无关信号与保留聚焦纤维信号之间取得良好平衡。在我们测试的大多数样本中，4%的密度阈值足以优化图像，为下一次迭代提供支持，同时信号丢失的风险极低。图3d展示了在4%密度阈值下对Ratio图像的分割结果。

我们还将通过密度阈值对 Ratio 图像进行分割（支持信息图 S4b），与对原始宽场（WF）图像采用传统分割方法的结果（支持信息图 S4a）进行了对比。应用广泛的大津法通过寻找并应用一个能使类内方差最小化的全局阈值，将像素分为前景（信号）和背景两类。将该方法应用于宽场图像时，几乎不会将纤维识别为神经元的一部分（支持信息图 S4c），这是因为纤维的亮度比胞体更接近背景。索贝尔（Sobel）算子和坎尼（Canny）算子主要通过逐像素梯度检测边缘，而高斯拉普拉斯（LoG）算子则通过图像强度二阶导数的零交叉点（即拐点）来检测边缘。这些边缘检测算子能够提取出大部分纤维，但在去除组织散射产生的噪声方面效果不佳，尤其是在胞体周围（支持信息图 S4d–f）。这是因为被膜状组织折射和散射的光线在二维图像中往往呈现出纤维的形态。局部阈值分割法是 Ratio 图像去噪分割的一种潜在替代方法密度阈值法，但该方法往往无法检测到细胞体附近的纤维特征，如图补充信息中图S4g–k的插图所示。同时，局部阈值法对样本特性高度敏感，且难以自动设置。我们提出的基于密度的比率阈值法（图补充信息中图S4b）能更准确地将纤维与细胞体和背景分离开来。

降低纤维分割噪声的步骤

对比率图像进行密度分割后，由于不同原因，多个区域仍可能存在持续的噪声背景。明确这些原因后，我们可通过三个连续步骤去除该噪声。首先，如图3d的密度阈值处理插图所示，由于原始宽场（WF）图像（图3a）中像素值较低，远离细胞体的背景区域仍存在明显噪声。根据公式（6），这些低像素值可能使比率图像中对应位置的数值高于阈值，从而产生噪声。这种噪声源于原始WF图像中背景像素值偏低，且这些低数值在Neuf图像中依然保持不变。我们对Neuf图像（图3b）设置相对较低的阈值，并将该图像（图像矩阵点积）与经过比率密度阈值处理的图像（图3d）相结合，以清除该背景噪声（图3e）。选择对Neuf图像而非原始WF图像进行阈值处理，是因为Neuf图像能突出信号与背景的差异，简化阈值处理过程。在我们的样本中，为Neuf图像选择2000的低阈值，这代表中心区域与周围区域之间仅存在40个计数的微小差异。而16位图像中信号与背景的差异通常远高于40个计数。尽管此步骤可在Neuf滤波前完成，但我们将其安排在Neuf增强和阈值处理之后执行，以便用户确认该步骤不会去除真实的纤维信号。

其次，在背景去除步骤后，我们仍能观察到许多仅由1至4个连通像素构成的小物体。在神经元标记的样本中，这些离散的小物体并非源自神经元或其神经纤维。此外，我们的成像系统分辨率约为2×2像素，因此更小的物体无法被真正分辨。我们使用MATLAB的小物体去除函数来移除这些物体，如图3e、f中的绿色框所示。此步骤为可选步骤，因为照射无荧光组织的小区域通常不会在后续步骤中产生明显荧光。但我们倾向于执行该步骤以最大限度减少光损伤和光毒性。研究人员需根据不同的显微镜物镜和相机组合，确定其分割图像中需要移除的最大物体尺寸。

第三，高散射组织或细胞体附近的区域即使在全局密度阈值处理后也可能产生极其密集的信号。这是因为如上所述，在二维图像中，组织可能会散射呈现出纤维状外观的光线。针对这一问题，我们为了处理组织中的噪声，我们采用局部密度约束（LDC）来限制局部区域中等大小区域的信号密度。密集信号很可能是伪影或噪声，因为纤维在整个样本中通常是稀疏的。对于我们的样本，我们通过实验发现，LDC 在保留纤维的同时，还能降低分割后的假阳性率。我们将图 3f 分割为 50×50 像素的子图像像素（为典型纤维宽度的10倍且以Neuf中心为基准）并应用了局部密度控制（LDC）。由于部分区域本身具有更高的信号密度，我们将局部密度控制阈值设定为全局密度的4倍（本研究样本中为4%）。清晰化图像（图3f）中密度低于局部密度控制阈值（16%）的子图像保持不变。对于密度更高的子图像，通过保留比率图像（图3c）中“最亮”的对应像素，将其密度降低至16%。局部密度控制阈值需针对不同的神经元和生物体进行调整，但后续迭代版本可采用粗略的阈值设定。图3f、g展示了应用局部密度控制前后的分割图像。该步骤可降低密集区域的噪声，这些区域通常位于细胞体附近以及高散射组织中。在图3f、g的橙色插图区域，分割像素的密度降低了30%，这将在后续对细胞体进行光照处理时抑制这些区域的背景。我们预计在密集区域（例如多个细胞体以及高反射或高折射组织中）会实现更强的背景抑制。此外，还可以采用更精细的图像分块策略，不过这会以计算时间为代价。

生成的掩模优先照亮纤维以优化成像效果

在先前的章节中，我们描述了对原始宽场（WF）图像进行后处理的方法，以去除无用信号并突出纤维信号（图1e）。在本节中，我们将对这些流程进行总结，这些流程将用于为数字微镜器件（DMD）生成掩模，以对照明光进行图案化（图1c、d）。我们从原始的宽场图像（图4a）出发，生成一幅强度反转图像以实现信号的均匀化（图4b）。同时，我们采用Neuf卷积滤波及后续的处理和分割操作，使纤维信号相较于细胞体、伪影和背景得到显著增强（图4c）。将强度反转图像与纤维分割图像做点积运算，即可得到发送至数字微镜器件的掩模（图1e和图4d）。图4e以红色显示该掩模，并与绿色的原始宽场神经元图像叠加，结果表明该掩模包含了焦平面上的纤维，同时在很大程度上避开了明亮的细胞体。通过数字微镜器件掩模对照射样本的光进行图案化，我们实现了一种调制

图像得到了适度增强（图4f）。具体而言，增强后的图像中散射光和离焦光（即杂散光）显著减少（图1d和图4f）。原始宽场（WF）图像中的多个位置存在杂散光，其中一些位置受到图案化照明的照射。然而，这些位置不存在荧光团，因此在生成的图像中基本没有强度信号（图4f）。需注意，掩模也会照亮细胞体附近区域，从而实现对该区域的成像。这是因为细胞体位于焦平面之外的深度会对光线产生影响细胞体附近被照亮区域的光锥。因此，图案化照图案化照明提供了一张经过改进但尚未优化的中间图像。

图4 单次迭代结果汇总。秀丽隐杆线虫PVD神经元。A) 增强后的原始宽场（WF）图像的二维平面。B) 图A中图像的带限强度逆变换结果。C) 图3g中的神经纤维分割图像。D) 由图B和图C中的图像点积生成的照明掩模。E) 掩模（红色）包含原始宽场（WF）图像中的神经纤维（绿色）。F) 经掩模照明生成的图像。

迭代优化成像同时最大限度保留细节

尽管中间图像已得到显著增强，但仍可进一步优化，因为细胞体周围仍存在雾状模糊，纤维附近也有失焦光线（对比图1d的中间图像与最终图像）。在原始宽场（WF）图像的某些位置，难以判断是存在真实荧光基团，还是仅观测到杂散光。若仅在先前的分割步骤中使用更高（即更严格、更低密度）的阈值，虽能生成更清晰的掩模，但存在丢失信号的风险，因为原始宽场输入图像本身对比度低且噪声较大。相反，通过迭代该流程（图1d），我们将优化后的中间图像重新输入掩模生成步骤（图1e），从而得到一种风险更低的精细化掩模。迭代过程会逐步限定光照区域，聚焦于真实纤维，并剔除虚假信号与背景。中间图像可反馈出光照位置是否存在真实的荧光基团。我们采用与上述流程相似的步骤生成精细化掩模（图1d中的掩模2）。由于该掩模是基于优化后的中间图像生成的，即便采用更高的分割阈值（例如全局密度阈值为2%，参见支持信息中的图S5），该掩模仍能更精确、更稳定地避免信号丢失。经实验验证，迭代超过两次后，图像质量不会再得到显著提升，因此第二次生成的掩模即为最终掩模。

中间图像中的纤维比原始宽场（WF）图像中的相对更亮。因此，我们不执行强度反演来生成最终掩模，因为这会降低纤维上的光强。我们复用从原始宽场图像计算出的强度反演图像，但通过将所有非零值设为最大值对其进行二值化处理，使最终掩模成为二值掩模而非灰度掩模（参见支持信息中的图S1）。用于生成第一个掩模的图像为灰度图像，以辅助将光精准对准纤维；而最终掩模为二值图像，以便最终图像可用于实际应用中的定量测量。利用中间图像，我们以与之前相同的方式执行其他步骤（归一化、比值计算、密度阈值处理和噪声抑制）。

可以重复这一迭代过程来进一步优化掩模，/或更平缓地收敛到最终图像，以避免丢失真实信号。然而，迭代次数受实际因素限制，例如成像速度，以及长时间曝光可能导致的光漂白现象。我们通过实验发现，两次迭代（图1d）能得到最佳的在图像质量、成像速度和光漂白之间实现最佳平衡。

TIM 图像增强效果评估

接下来，我们在关键步骤中评估TIM成像在宽场成像的单一平面内对神经突对比度的提升效果。目前有多种方法可用于比较图像质量，包括目视检查、强度分布分析以及分割质量的定性比较。在本研究中，我们综合运用这三种方法对神经元图像进行对比。在图像分割环节，我们采用前文所述的大津法，该方法操作简便且直接，能够有效分离信号与背景。若所有信号像素的强度均与背景像素存在明显差异，那么大津法可实现对图像的完美分割。

为进行对比，我们使用了秀丽隐杆线虫PVD神经元的商用激光扫描共聚焦显微镜图像（图5a）。该共聚焦扫描图像作为样本的金标准参考。我们在不同硬件配置上分别运行共聚焦显微镜和TIM技术，随后对二者进行比较。将样本从一种设备（TIM）转移到另一种设备（共聚焦显微镜）会导致秀丽隐杆线虫出现轻微的样本畸变和旋转。因此，我们采用了多种对比方法，包括结构相似性指数测结构相似性指数（SSIM）、强度分布分析以及目视检查以判断 TIM 相对于共聚焦显微镜的性能。

由于共聚焦显微镜能生成具有高神经突信背比的图像（图5a），大津分割法可准确区分神经元与背景（图5b）。相比之下，原始宽场图像中细胞体的亮度远高于神经纤维（图5c），与共聚焦参考图像的结构相似性指数仅为0.69，数值较低。因此，大津分割法仅将细胞体识别为前景区域（图5d）。我们通过给图像叠加假色来进行视觉检查：两张完全相同的图像叠加后会完全共定位，呈现出黄色或橙色的统一图像，不会出现红色或绿色。在图5e中，共聚焦图像（绿色）与宽场图像（红色）叠加后，神经纤维荧光出现部分共定位，且细胞体周围存在大量呈红色的宽场荧光。细胞体的亮度远高于神经纤维，严重干扰了其周边区域的成像。使用第一个掩模进行照明（图5f）后，得到了优化的中间图像（图5g），该图像与共聚焦参考图像的结构相似性指数为0.91，处于中等水平。与原始宽场图像相比，中间图像中的细胞体亮度更低、雾影更少，神经纤维的亮度则显著提升且分布更均匀。大津法对该中间图像的分割效果有所改善（图5h），能识别出更多的神经纤维，但仍不及共聚焦图像的分割效果（图5b）。如图5i所示，与共聚焦图像叠加后可见，中间图像与共聚焦图像的相似度大幅提升——细胞体周围的红色区域更少，神经纤维处的绿色区域也更少。使用第二个掩模进行照明（图5j）后，得到了TIM最终图像（图5k），该图像除了亮度极高的细胞体附近区域外，与共聚焦图像高度相似，与共聚焦参考图像的结构相似性指数高达0.93。大津分割法对该最终图像的分割效果（图5l）与共聚焦图像的分割水平相当。图像叠加结果（图5m）显示，细胞体和神经纤维区域的荧光均实现了良好的共定位，强度对应关系也十分明显。分割后的图像叠加结果（图5n）则清晰展现出各区域的区分度针对共聚焦显微镜和TIM成像技术，分别测量神经元（包括神经纤维和细胞体）与背景之间的信号背景比。结果显示，典型的强度分布证实TIM的信号背景比显著高于宽场显微镜（WF），且与共聚焦显微镜成像结果接近（图5o）。

图5. TIM逐步提升成像效果。秀丽隐杆线虫PVD神经元图像及分割结果。A）共聚焦图像与B）大津法分割。C）原始宽场图像与D）大津法分割。E）宽场（红色）与共聚焦（绿色）叠加图像，结构相似性指数（SSIM）为0.69。F）由宽场图像生成的掩模1。G）掩模1照明下的中间图像与H）大津法分割。I）中间图像（红色）与共聚焦图像（绿色）叠加图像，结构相似性指数（SSIM）为0.91。J）由中间图像生成的掩模2。K）掩模2照明下的TIM最终图像与L）大津法分割。M）TIM图像（红色）与共聚焦图像（绿色）叠加图像，结构相似性指数（SSIM）为0.93。N）TIM图像（红色）与共聚焦图像（绿色）分割结果的叠加。O）图A、C、G、K中线条的强度分布。在叠加图像（E、I、M、N）中，黄色/橙色表示图像共定位，绿色或红色表示图像存在差异。

为评估 TIM 在 3D 成像中的性能，我们接下来测量了 PVD 神经元 25 微米厚的 3D 图像堆栈（即 z 堆栈）中的像素强度（图 6），并与宽场（WF）成像和共聚焦成像进行了对比。在单张 xy 切片中（图 6a–c），TIM 显著减少了宽场图像中的杂散光和离焦光，其成像效果接近共聚焦图像，但共聚焦图像背景中显示的光电倍增管电增益噪声更少。3D 堆栈的最大投影结果显示，由于荧光强度降低，细胞体和离焦纤维方面，在宽场（WF）图像中被遮挡的细胞体附近纤维，通过结构照明显微技术（TIM）变得清晰可见，远处的纤维也更为分明（图6d-f）。对最大投影图像中xy剖面的定量分析（图6j）表明，TIM揭示了许多原本在明亮细胞体附近不可见的微弱信号，将纤维的信噪比（SBR）提高了三倍，并降低了背景。此外，我们通过对三维图像堆栈进行重切片来检查xz视图的图像质量。图6g-i所示的xz切片清晰显示，TIM有效消除了离焦的细胞体光和散射光。另外，图6k展示了图6a-c中10个选定纤维位置的平均z剖面。TIM的半高全宽（FWHM）约1.4微米的数值证实，其共聚焦切片能力与共聚焦金标准完全一致，这与宽场（WF）成像中观察到的微弱切片能力形成鲜明对比。带有颜色编码深度的z轴堆叠图像的三维重建结果（图6l–n）表明，即便在明亮的细胞体附近，该技术也能实现清晰的三维成像。我们还评估了微弱纤维恰好位于细胞体正下方的情况。在宽场成像中，由于离焦的细胞体光线产生背景干扰，纤维的信号背景比（SBR）可能较低。支持信息中的图S6（4–6微米）显示，TIM技术在保留纤维可见性的同时，还能降低细胞体的荧光强度。

图6. 成像技术对比。通过z-stack成像的秀丽隐杆线虫PVD神经元。A-C) 原始宽场（WF）、共聚焦和TIM成像的单xy切片。青色、绿色和红色箭头头指示K部分轴向轮廓的选定位置。D-F) 宽场（WF）、共聚焦和TIM z-stack的最大投影图。彩色线条指示J部分轮廓的路径。G-I) D-F部分虚线位置的代表性xz切片，顶部深度较浅。2倍放大插图显示横向取向纤维的横截面。虚线箭头指示K部分轴向轮廓的代表性示例。J) D-F部分图像的xy轮廓。TIM的信噪比比（SBR）是宽场（WF）的3倍以上。TIM可显示细胞体附近在宽场（WF）中不可见的结构。K) A-C部分10个位置的平均轴向轮廓。宽场（WF）背景明亮且无光学分层效果。共聚焦和TIM均呈现光学分层效果，半高全宽（FWHM）为1.4微米。L-N) 宽场（WF）、共聚焦和TIM z-stack的三维体积渲染图，采用深度颜色编码。

我们进一步将 TIM 图像与我们之前使用数字微镜器件（DMD）对点阵进行光栅扫描所获得的图像进行了对比已被证明与共聚焦成像相当。 如图所示在图S7（支持信息）中，TIM和DMD的网格扫描图像几乎完全一致，这表明TIM与商用共聚焦成像之间的任何差异，均源于商用共聚焦系统更先进的仪器设备，而非两种技术在性能上的本质差异。

将TIM与另一种图案照明技术——光学切片结构照明显微镜（OS-SIM）技术进行比较也很有帮助。OS-SIM可通过经典的均方根算法以及更先进的改进的 HiLo 算法（支持信息图 S8）。我们证明，尽管采用了先进的OS-SIM算法，在活体动物神经元图像中，TIM的结果在大多数区域仍优于OS-SIM。首先，在较浅深度下，TIM的图像质量与OS-SIM相当或更优。其次，在较深深度下，TIM的图像质量优于OS-SIM，因为OS-SIM的照明光会发生散射，使其正弦（或栅格）照明图案的对比度降低，最终导致更低的对图像重建后的对比度。 第三，尽管光学结构照明显微镜（OS-SIM）在部分区域背景更低时，背景会被人为抑制，从而产生成像伪影，例如支持信息中图S8g的细胞体环和图S8j的中空细胞体。此外，一旦生成最终照明掩模，TIM就能以相机的原生帧率实现高速成像，如下一节所示，而OS-SIM最多只能达到相机帧率的三分之一或二分之一。

基于 TIM 的高速、低光漂白与运动自适应成像

高速成像是追踪神经元活动、捕捉神经元信号快速动态的关键手段。神经元通过毫秒级的快速动作电位和突触事件进行信号传递。现有的钙指示剂（如 GCaMP8f）被设计为具有快速动力学特性，以精准反映细胞内钙水平的快速变化。其衰减时间短至约10至20毫秒。随着如果没有高速成像技术，这些转瞬即逝的钙瞬变可能会被遗漏或模糊，从而导致关键时间信息的丢失。

与其他定向照明技术类似，二维平面的 TIM 全图流程包括采集三张图像、图像处理/分割/掩模生成、数据从计算机传输至数字微镜器件（DMD）以及数字微镜器件（DMD）的响应时间。

对于一张2304×2304像素的图像，整个过程耗时约1秒，对于512×512像素的图像则耗时约0.4秒，这使得TIM成像的帧率可达1-3帧每秒。不过，一旦照明掩模生成，我们可将其保留在数字微镜器件（DMD）上，以静态方式对照明进行构图，从而实现高速成像。我们开展了概念验证实验，证实TIM能够以至少40赫兹的速率捕捉快速变化的信号，这也是我们照明设备调制能力的上限。此外，若样本存在运动干扰，我们可实时更新TIM掩模，对运动进行追踪与补偿。

在图7a中，我们展示了在宽场（WF）和时间成像（TIM）条件下，经40赫兹调制的光（由光电二极管探测器确认）照射的绿色荧光蛋白（GFP）标记的秀丽隐杆线虫ASJ神经元。根据根据奈奎斯特-香农采样定理，捕捉该40赫兹动态信号需要至少80赫兹的成像采集速率。在图7a中，我们使用100帧每秒的TIM对神经元突起的动态变化进行成像，从周期性照明中可清晰观察到40赫兹调制的荧光信号。该实验表明，TIM能够分辨至少40赫兹的荧光信号。我们认为，TIM的最终成像速度仅受限于相机的固有帧率以及为图像捕获足够光子的能力。

在长期神经元成像中，光漂白是获取可靠数据的主要障碍。我们在相同光照强度下，分别采用 WF 和 TIM 对六个神经元进行了90秒成像（图7b）。经过90秒光照暴露后，TIM 的信号背景比（SBR）是 WF 的3倍以上（图7c）。TIM 条件下的光漂白速率比 WF 条件下慢至少五倍（图7b）。WF 导致的光漂白程度低于扫描技术诸如共聚焦显微镜等扫描技术。[43] 因此，我们认为TIM造成的光漂白远少于共聚焦显微镜，同时还能提供相当的成像质量。

进行体内实验时，运动伪影会降低信号检测的准确性。我们在电动载物台上对秀丽隐杆线虫PVD神经元进行成像，该载物台可将线虫移动至一系列随机位置，移动速度最高可达5微米/秒，这对于亚微米级分辨率成像是相对较快的运动速度。我们在静态和动态TIM掩模两种条件下进行成像时，均执行了该移动程序（图7d）。TIM成像是以100赫兹的频率进行的，照明掩模以10赫兹的频率更新，并以最新的图像作为中间图像（图1）。我们证实，在持续运动过程中若不更新TIM掩模（即使用静态掩模），则无法对神经元纤维进行精准成像。相比之下，通过动态更新掩模来追踪运动，TIM能够在整个运动过程中成功解析神经元纤维，并保持较高的纤维信号背景比（图7e）。

图7. TIM 动态与长期成像。通过 TIM 或宽场（WF）对秀丽隐杆线虫神经元进行成像。A）使用 TIM 掩模在40 Hz调制照明下，以100帧/秒（FPS）对ASJ神经元成像。强度曲线显示TIM观测到的光纤荧光以40 Hz调制。内嵌曲线展示了包含40个周期的1秒时段。内嵌图像展示了弱光和强光照明下的宽场（WF）与TIM图像。B）在90秒宽场（WF）或TIM成像过程中ASJ光纤的强度（((n=6))）。阴影区域表示强度的标准差。宽场（WF）照明使神经突的光漂白速度比TIM快5倍以上。内嵌图展示了在相同照明强度下，0秒和90秒时的宽场（WF）与TIM图像。C）沿B部分红色和青色线条，0秒和90秒时宽场（WF）与TIM的强度曲线。TIM引起的光漂白程度最低。所有曲线均归一化为90秒内的最大值。D）通过TIM对移位的PVD神经元成像，分别使用静态和动态TIM掩模。动态掩模在30秒内追踪神经突，而静态掩模会立即丢失神经突。白色箭头头指示神经元上的基准结构。叠加图展示了不同时间点的位置。配准叠加图显示动态掩模在各时间点照亮整个结构，实现完全共定位（白色）；而静态掩模仅照亮部分结构，产生部分共定位（彩色区域）。E）在30秒时，静态和动态掩模成像图像中沿线条的强度曲线。静态掩模未能充分照亮结构，导致信噪比（SBR）较低。

小鼠皮层切片的TIM成像

为了展示 TIM 对多种样本进行成像的能力，我们对小鼠皮层切片进行了成像，其肾上腺素能神经元由绿色荧光抗体标记。该小鼠品系含有一种会损伤神经纤维的突变，该沿其长度呈现珠状形态。 TIM 是为正常的 圆柱形纤维形态设计的圆柱形纤维形态，因此这些突变形态为TIM提供了严格的测试。我们对40微米的大脑切片进行了成像如前所述准备的。在imag期间然而，我们改变的唯一TIM特异性成像参数是密度，我们根据经验将其设置为2%，用于成像小鼠脑组织。

然而，我们改变的唯一TIM特异性成像参数是密度，我们根据经验将其设置为2%，用于成像小鼠脑组织。

WF显微镜下的脑片出现高度散射，导致大量杂散光。此外，WF显微镜缺乏光学切片，无法拒绝外焦光，导致神经突对比度低（图8a，e），对于明亮的分支，SBR为约3。如前所述，TIM优先照亮焦点内光纤，照明强度在远离焦平面的地方迅速降低。这种光分布最大限度地减少了离焦结构上的照明，并减少了它们的发光，提供了光学切片。因此，TIM成像显着提高了神经突质量，并产生了更清晰、更高的质量Trast神经突图像（图8b，e），对于明亮的分支，SBR为约22。

使用传统的WF显微镜和TIM，我们以0.5-μm的步长对整个40μm厚的大脑切片进行成像，以获得3D z堆栈图像。在WF图像的最大强度投影（图8c）中，失焦光遮挡了许多神经突，阻止了它们从背景中辨别出来。相比之下，TIM最大强度投影（图8d）揭示了更多的神经突结构，背景基本上较低（图8f）。请注意，即使许多神经突具有珍珠状的形态，TIM也足够健壮，可以产生准确的图像。通过TIM实现的增强对比度和清晰度可以更准确地可视化错综复杂的神经元结构，有助于更好地理解正在研究的生物过程。

图8. 小鼠皮层切片的TIM成像。通过宽场成像（WF）和TIM z-stack成像的荧光肾上腺素能神经元。A）7微米深度下单张xy切片的原始WF图像，纤维对比度较低。B）与A中同一平面的TIM图像，纤维对比度更高且离焦光减少。C）WF z-stack的最大强度投影图。D）TIM z-stack的最大投影图。E）A和B中线条的轮廓图。F）C和D中线条的轮廓图。与WF相比，TIM显示出更多的峰值和更高的纤维信号背景比（SBR）。

TIM体内成像结果

斑马鱼是一种复杂的模型生物，用于研究生物学的各个领域。其透明的身体（图S9a，支持信息）、快速的发育和与人类的同源性使斑马鱼成为研究脊椎动物发育、检查器官功能、建模疾病和药物发现的流行体内模型。与其他一些样本相比，斑马鱼由于其体积、透明度降低、神经元深度以及在受到限制时增加的运动而对图像具有挑战性。大多数高分辨率斑马鱼神经成像发生在先进的显微镜平台上，例如作为旋转圆盘共焦和双光子。我们进行了斑马鱼后脑区域的WF显微镜和TIM（图S9b，支持信息），对三叉神经细胞进行成像。后脑包含弯曲的神经组织区域，我们从最浅的神经元以0.5μm的z步长成像45μm深的区域。我们根据经验将密度阈值设置为致密斑马鱼大脑的4%。图9显示了使用WF（左）和TIM（右）成像获得的单个切片（顶部），最大投影（中间）和3D渲染（底部）。TIM提供的改进似乎比其他样本更加明显。WF图像在单个切片中包含来自后侧线神经节的失焦光的强背景（图9a右上角），这完全掩盖了3D中的神经突（图9c，e，g）。相比之下，TIM显著减少了靠近和远离神经突的背景（图9b中神经突的“带”）。3D图像强烈改善了神经突对比度，即使在更深的位置也能清楚地显示神经突（图9d，f，h）。xy轮廓的定量分析（图9i）表明，TIM使纤维SBR增强了两倍以上。图9j显示了从图9a，b中的切片中选择的10个选定斑点的平均z轮廓。TIM轮廓表明即使在密集标记的体内样本中也存在光学切片。Movie S1（支持信息）中显示了演示TIM成像期间生成的图像和掩模的视频。这些结果证明了TIM在成像高度散射、致密和深部组织方面的显着能力。

图9. 活体斑马鱼的TIM成像。通过宽场成像（WF）和TIMZ轴堆叠成像获得绿色荧光蛋白（GFP）标记的视网膜神经节细胞和三叉神经元图像。A、B：原始WF和TIM拍摄的单张xy切片。红色和青色线条表示I部分轮廓线的路径。红色和青色十字标记了J部分轴轮廓的选定位置。C、D：WF和TIMZ轴堆叠图像的最大投影。E、F：白色虚线位置的代表性xz切片，顶部深度较浅。插图为2倍放大视图。红色和青色虚线箭头展示了J部分轴轮廓的代表性示例。G、H：WF和TIMZ轴堆叠图像的三维体积渲染。I：WF和TIM的xy轮廓。整体而言，TIM的信号背景比（SBR）相比WF提升了2倍。J：A、B部分中10个位置的平均轴轮廓。WF背景明亮且不具备光学切片能力，而TIM则实现了光学切片，其半高全宽（FWHM）为2.9微米。

讨论

TIM是神经突成像的开创性和经济的解决方案，解决了传统宽视场显微镜的一些关键缺点。将照明对准荧光结构可以最大限度地减少散射和失焦荧光，从而增强图像清晰度并提供光学切片能力。首先，宽视场照明均匀地激发明亮和暗淡的结构，因此来自明亮结构的散射光使暗淡的纤维不那么明显。相比之下，有针对性的照明将光强烈集中在纤维上，最大限度地减少来自细胞体等主体结构的明亮光的发射。因此，明亮细胞体周围的散射光减少，使纤维更加突出。其次，WF照明贯穿整个FOV，导致失焦结构的强烈激发（参考文献中的图2c-e），并模糊聚焦信号。相比之下，在目标照明下，焦平面中的激发区域（即光纤上）明显较小，并且光束的横截面积在远离焦平面的情况下迅速增加。因此，激发光照亮低入射的离焦结构张力，这显着降低了它们的发射。通过有效地抑制散射光和失焦光，TIM减少了背景光，提高了SBR，并实现了光学切片。一般来说，可以通过图像处理分割的结构可以使用TIM概念进行照明。在这项工作中，由于我们的研究兴趣和成像这些结构的固有挑战，我们专注于神经元纤维。较小的结构可能从靶向照明中受益最大，因为成像有效地等同于广场成像的较大结构的优势会减弱。

除了画质的显著提高之外，TIM还有四个重要优势。首先，因为它是一种宽视场技术，TIM图像在高速下。单个2D切片只需要三个相机获取的图像，而扫描技术必须在FOV中顺序探测位置才能获得图像。在很大程度上，TIM放宽了牺牲FOV来获得成像速度的需要，这是扫描的一个普遍弱点技术。在我们的实现中，TIM比共聚焦显微镜。其次，TIM减少了光漂白和光损伤。扫描技术通常照亮所有区域Gigons系统，通常具有高强度光，增量ing光漂白和光损伤。相比之下，TIM初始广场曝光用低强度光照明，随后的曝光仅照亮目标斑点，从而减少焦点内和焦点外组织照明。这种减少的光子曝光导致光漂白率低得多。第三，虽然TIM确实需要配置几个参数来成功成像，例如像素中的纤维厚度（用于Neuf设计）和纤维结构密度（用于分割阈值），但这些参数很容易获得。神经元的初始WF图像指示了纤维厚度，甚至近似的纤维密度值也允许成功的TIM执行，如图S3和S5（支持信息）所示。因此，TIM对大多数研究人员来说是用户友好且可访问的。最后，与具有类似性能的其他技术相比，TIM对于大多数生物实验室来说具有很高的成本效益。所需的DMD或类似的空间光调制器[4]附加与旋转盘共聚焦和双光子显微镜等更复杂的平台相比，标准宽视场显微镜是一个相对经济的补充。在我们的概念验证实验中，我们使用从投影仪中提取的DMD，成本仅为几百美元。我们在实验部分详细介绍了照明图案装置。这种成本效益使TIM可用于广泛的实验室和机构。

目标照明的总体策略是优先照亮感兴趣的结构，同时最小化其他地方的照明。这种选择性照明最小化光漂白ing和光损伤同时保持高对比度。其他最先进的目标照明策略需要初始获取高质量的神经元图像和手动选择体积大的目标，如细胞体。相比之下，我们的策略实现了对神经元纤维等精细靶点的自动选取，还能应对难度更高的任务。该策略广泛适用于宽场和扫描类技术，对高要求应用场景尤为实用，例如利用钙指示剂或电压指示剂追踪神经元活动。对钙信号的长期追踪这通常会导致严重的光漂白现象。此外，膜电位的毫秒级变化需要对电压指示剂进行快速成像，这就需要更高的光照强度以获取足够的信号。这会加剧光漂白、光损伤以及热效应。靶向照明通过将光照聚焦于目标特定结构来应对这些挑战，从而降低了上述不利影响。

TIM的迭代反馈范式可应用于其他成像模式和场景，为图像质量和分割精度至关重要的情况提供了一种通用解决方案。例如，用于荧光图像分割、复原或增强的机器学习技术，通常需要人工生成金标准或进行检验训练过程中的结果。这限制了训练的数量集合。在 TIM 范式下，我们可以利用机器学习的输出生成一个掩码，以在被认为含有荧光结构的位置（图像中强度较高的位置）对样本进行照射。样本发出荧光的位置将证实荧光团的存在，并验证输出结果的准确性。与 TIM 类似，这一过程可以反复迭代以逼近真实结构，同时进一步训练机器学习模型。

借助TIM等技术实现的纤维及相关结构的高分辨率、高速成像，为神经科学研究的发展带来了巨大潜力。首先，高速与高分辨率的结合能力，可通过追踪对理解信息处理至关重要的快速变化，助力突触动力学的研究。其次，光学切片TIM技术能够清晰观察轴突导向、树突分支和突触形成等较慢的过程，从而以高分辨率研究神经元的发育、学习与记忆。第三，高速TIM技术可实现对胶质细胞-神经元相互作用、局部突触谷氨酸摄取的详细检测，还能在突触水平直接读取与神经元放电锁定的信号以及神经元活动的电压信号。

TIM 还存在技术局限性，我们正设法解决这些问题。首先，在迭代过程中，TIM 仍有可能丢失部分位置的信号。尽管我们很少观察到这种信号丢失情况，但它令人担忧，因为信号丢失可能是永久性的。未被照射的位置可能无法产生信号。目前，我们通过对 TIM 中的密度阈值进行经验优化，将此问题的影响降到最低。我们借鉴 Canny 边缘检测器的思路，探索了双阈值策略，依据计算出的角度判断像素是否属于纤维。在 Neuf 算法中，我们计算出表示像素角度（即纤维方向）的 x 分量和 y 分量（公式(1)和公式(2)）。当 Ratio 图像中某一像素的强度处于低阈值和高阈值之间时，我们会将该像素的角度与已知含纤维的相邻像素进行对比，若角度相似，则将这类像素判定为纤维。然而，在我们当前的 TIM 实现中，在不考虑纤维方向的情况下进行 Ratio 密度分割时，几乎不会出现信号丢失的情况。因此，为节省图像处理时间，我们决定取消这一步骤。其次，某些几何结构本身可能难以成像，例如纤维束和密集结构。Neuf 算法具有固定的宽度，因此每次只能突出显示特定形状和尺寸的结构。当前的 Neuf 实现仅能突出显示单根纤维，无法清晰分辨纤维束中的纤维。虽然我们可以专门为纤维束设计新的滤波器，其多样的形状和紧凑程度增加了滤光片设计的难度。此外，结构非常致密的样本会产生一个对视场（FOV）进行密集照明的掩模，相比稀疏样本，这类样本可能会引入更多杂散光。第三，物镜数值孔径（NA）会影响细胞体的可视化效果。目前，最终的TIM图像之所以能显示出细胞体，是因为细胞体受到离焦光的照射。较低的数值孔径会限制离焦平面的照明区域，可能无法充分照亮细胞体以实现清晰可视化。第四，TIM无法克服宽场显微镜的一些固有局限性。例如，对于稀疏样本，TIM的最大成像深度并不优于宽场显微镜。照明光必须穿过组织以激发荧光分子，发射光则必须以弹道方式穿出组织，才能对结构进行成像。第五，我们完整的TIM实现方案需要三次相机采集、两次生成掩模的计算流程以及三个数字微镜器件（DMD）的响应时间。这些过程的总持续时间通常超过1秒，这可能对部分应用构成挑战。不过，存在多种提升TIM效率和速度的潜在方法，我们将在下文进行探讨。

我们目前的工作重点是改进TIM程序，并将其应用于更多实验场景。首先，为提升速度，我们正将投影仪中现有的商用数字微镜器件（DMD）升级为响应速度更快的科研级数字微镜器件（DMD）。这款改进后的数字微镜器件将大幅缩短图案显示所需的时间。其次，近期关于高速、大规模神经元活动测量的演示实验……使光照聚焦于细胞体。 TIM 可以将这一方法进行拓展一种用于测量多个神经突活动的技术。借助我们的动态掩模TIM方法，我们能够长时间照亮大量神经纤维，并以高速进行宽场成像。目前大多数光学活动测量均在细胞体中进行。神经突的活动测量为众多研究打开了大门，这些研究可区分亚细胞区室的作用，以确定其来源并对其进行调控在精细尺度上的活动。 第三，我们正在研究使用机器学习，替代我们现有的算法，以生成生成掩模。机器学习方法有望实现验证我们的掩码生成方法。将机器学习与 TIM 中的迭代反馈相结合，能够以更快的速度生成更高质量的图像。

实验部分

实验设计：采用现有的尼康 Ti2-E 倒置显微镜进行落射荧光成像。荧光图像通过以下设备采集：Chroma 49020 增强型绿色荧光蛋白滤光片组；尼康 Plan Apo Lambda 1.4 数值孔径、60 倍油浸物镜，Plan Fluor 0.5 数值孔径、20 倍空气物镜，以及 Plan Achro UW 0.06 数值孔径、2 倍空气物镜；滨松 ORCA-Fusion BT 科学互补金属氧化物成像相机。通过导光管连接的发光二极管光源（Lumencor SOLA 光引擎）用于荧光照明。光线经 20 毫米焦距转接器（Thorlabs SM1U25-A）准直后，射向数字微镜器件。数字微镜器件置于照明光路上，以实现靶向照明。

DMD 搭建：与先前研究类似[4,61]，从数字投影仪（Vivitek DW814）中取出一个数字微镜器件（DMD）。该 DMD 包含 1280×800 个微镜元件（即像素），对角线长度为 0.65 英寸。如图 1 所示，将 DMD 放置在与成像焦平面共轭的平面上，该成像焦平面通过在显微镜的照明输入端口放置一个焦距为 200 毫米的透镜（Thorlabs TTL200）来形成显微镜。数字微镜器件（DMD）安装在五轴位移台（索尔斯博 PY005）和1英寸光学运动安装座（索尔斯博 KS1）上。使用搭载Psychtoolbox-3（http://psychtoolbox.org/）的MATLAB 2021a（迈斯沃克）在数字微镜器件（DMD）上显示掩模图案，以对光照进行空间控制[4]。相关代码可在GitHub平台获取（https://github.com/wormneurolab/TargetedIllumination-Microscopy）。

数字微镜器件（DMD）校准：利用DMD像素的中心行和列，将十字形图像投射到薄荧光膜上。制作薄膜的方法为：用记号笔在显微镜载玻片上画出直径3毫米的斑点，盖上盖玻片并施加压力，这样会在盖玻片和载玻片之间形成一层薄膜。将薄膜玻片的两个边缘用胶带固定，使其在室温下干燥1小时。通过五轴位移台调整DMD的位置和方向，使十字形图像处于对焦状态并位于相机阵列的中心。

动物培养：本研究使用了daf-11; jhEx560[ptrx-1::trx-1::gfp]秀丽隐杆线虫菌株，该菌株在ASJ神经元中具有细胞特异性GFP表达。同时也使用了TV15911 (wyIs592 III (ser2prom3::myr-GFP(pOL020, 20ng/ul) + Podr-1::RFP)菌株，其在PVD神经元中具有细胞特异性GFP表达。秀丽隐杆线虫按照既定方案在Bacto琼脂平板上于20℃培养。本研究使用了TH-Cre小鼠品系。小鼠脑片经荧光抗体染色处理，制备方法如前所述。本研究使用了isl2b:Gal4, UAS:Dendra斑马鱼品系，该品系可通过GFP通道标记视网膜神经节细胞和三叉神经。斑马鱼按照既定方案养殖。所有斑马鱼实验均经东北大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并符合美国国立卫生研究院（NIH）关于动物研究与教学使用的指导原则。

用于成像的动物制备：对处于年轻成虫阶段的线虫进行成像。将秀丽隐杆线虫置于显微镜载玻片上的2%琼脂糖垫中，用5 mM叠氮化钠使其固定，再用盖玻片覆盖线虫。 叠氮化钠可在成像过程中阻止线虫活动。

孵化后1周的斑马鱼幼鱼进行了成像。我们将斑马鱼幼鱼包埋在含有2%低熔点琼脂糖（Sigma公司）的显微镜载玻片上，并用盖玻片覆盖幼鱼。琼脂糖可在不使用麻醉剂的情况下固定幼鱼。 

TIM成像参数：除图7中的动态变化成像采用0.01秒曝光时间外，所有实验的宽场和TIM成像均采用0.05秒曝光时间，三维堆叠成像的步长为0.5微米。通过该配置，我们可在约1秒内完成TIM流程并获取一张二维图像。该时间主要由商用数字微镜器件（DMD）的响应时间和我们的MATLAB图像处理算法构成。图像为16位深度。网格扫描成像采用“最大值”策略，包含6×6个网格，其余所有参数与图S7（支持信息）中的TIM成像一致。图S8（支持信息）中使用的OS-SIM算法，以及高斯滤波器和缩放因子的参数优化，均遵循既定流程。

图像处理：在 TIM 成像过程中，使用 MATLAB 定制代码对图像进行处理。相机采集图像后，首先扣除相机暗电流，再进行后续处理。采用带有矩阵边缘“复制”模式的‘imfilter’函数对图像进行滤波（公式(1)和(2)）。滤波完成后，使用‘prctile’函数确定图像中与密度阈值对应的强度值，再通过‘bwareaopen’函数去除小的连通区域。为补偿成像过程中的微小位移，使用‘imdilate’函数将分割区域膨胀5个像素。随后，利用“imresize”将分割矩阵调整至数字微镜器件（DMD）的尺寸。相关代码可在 GitHub 平台获取（https://github.com/wormneurolab/TargetedIllumination-Microscopy）。

TIM 运动追踪：为模拟动物运动，我们每100毫秒将承载动物的显微镜载物台随机移动最多0.5微米（相当于5微米/秒的运动速度）。这种微小的随机位移会导致照明区域与神经纤维之间出现失配。我们通过改进的 TIM 程序来补偿这一移动：将每个掩模扩张0.4微米（对应样本平面共轭因子）。我们使用 TIM 掩模以100赫兹的频率持续成像，同时每10帧更新一次掩码，将最新图像用作中间图像（图1d）。一次掩码更新的处理步骤分布在100毫秒周期内的十次10毫秒成像曝光中。生成掩码的图像处理在相机曝光、计算机等待相机数据的阶段进行。这种并行化方式在相机曝光期间高效利用处理器时间，能够以足够的速率持续优化掩码，以跟踪典型的生物运动（10赫兹更新），同时不影响较高的成像帧率（100赫兹采集）。并行处理使用了配备8GB内存的Nvidia Quadro P4000显卡。基于不同的计算资源，可实现的运动跟踪速度会有所不同。

图像分析：在对图像强度进行定量分析之前，先减去相机的暗计数。对于大津法分割，先将整幅图像归一化至0到1之间，然后使用‘graythresh’函数确定大津阈值，再通过‘imbinarize’函数对图像进行分割。图像叠加操作借助ImageJ软件完成（图像→颜色→合并通道）。绘制轮廓图时，使用ImageJ的轮廓图绘制功能（分析→绘制轮廓）。背景强度通过二次拟合进行估算。将图像重切片以获得xz视图时，采用ImageJ软件（图像→堆栈→重切片）。

在计算SBR时，将目标结构的峰值作为信号值，选取距离至少5微米的背景像素值作为背景值，随后通过信号值除以背景值计算SBR。在计算半高全宽时，我们对强度分布进行归一化处理，并确定信号衰减至0.5时的宽度。