标题：Design and synthesis of new donepezil-based chalcones as multi-target-directed ligands against Alzheimer's disease: biological evaluation, molecular dynamics, and zebrafish model studiesDesign and synthesis of new donepezil-based chalcones as multi-target-directed ligands against Alzheimer's disease: biological evaluation, molecular dynamics, and zebrafish model studies

期刊：RSC Advances

原文链接：https://doi.org/10.1039/d6ra04932j

摘要

阿尔茨海默病（AD）是一种多因素神经退行性疾病，具有胆碱能功能障碍、β淀粉样蛋白（Aβ）聚集、氧化应激和金属离子稳态失衡等多种特征。本研究合成了一系列多奈哌齐衍生的查尔酮7a–q，并测试了其抑制胆碱酯酶（ChE）和β淀粉样蛋白（Aβ）聚集的能力、抗氧化特性及金属螯合能力。其中，含2-氯芳基基团的化合物7j表现出中等强度的抗乙酰胆碱酯酶（AChE）活性((IC_{50}=17.96 mu M))），在自身诱导（抑制率72.5%）和乙酰胆碱酯酶诱导（抑制率77.6%）条件下均能有效抑制Aβ聚集，且具备良好的(Cu2+)螯合能力，紫外-可见（UV-vis）光谱法验证了这一特性。含呋喃环的类似物7p同时具有抗胆碱酯酶活性（对AChE和丁酰胆碱酯酶（BuChE）的抑制活性分别为((IC_{50}=22.70 mu M)和19.14 mM）、中等强度的(A beta)抗聚集活性及抗氧化活性。这两种化合物在PC12细胞和SH-SY5Y细胞中均被证实具有安全性。研究结果为其作为抗阿尔茨海默病的多靶点导向配体（MTDLs）的应用提供了令人鼓舞的依据。此外，化合物7j在乙酰胆碱酯酶活性位点的分子动力学模拟结果显示，其结合状态可稳定维持100纳秒。斑马鱼体内实验表明，与对照药物多奈哌齐相比，化合物7p能显著提升斑马鱼的运动能力和探索行为，具有治疗潜力；化合物7j则表现出中等程度的治疗效果。

引言

阿尔茨海默病是一种进行性神经退行性疾病，也是最常见的痴呆类型。目前约有5000万人患有痴呆症在全球范围内，阿尔茨海默病（AD）占病例的60%至70%。老年人口数量的不断增加加剧了相关的医疗和社会经济问题，凸显出对新型高效治疗策略的迫切需求。AD以记忆和认知功能的进行性衰退为特征。尽管AD的确切病因尚未完全明确，疾病进展却最常与β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块的沉积以及由过度磷酸化tau蛋白构成的神经原纤维缠结（NFTs）的聚集相关。然而，AD的多因素特性还受其他病理特征的影响，体现出其复杂且多靶点的特点。其中之一是胆碱能假说，该假说认为AD患者的认知障碍是由胆碱能神经元的丧失以及神经递质乙酰胆碱（ACh）的显著减少所致，而乙酰胆碱是大脑中记忆和学习过程的关键神经递质。乙酰胆碱通常由两种酶降解：乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BuChE）。乙酰胆碱酯酶在胆碱能神经传递过程中发挥关键作用，它能将乙酰胆碱快速水解为胆碱和乙酸，从而终止胆碱能突触的突触传递。近年来的研究进展重新定义了乙酰胆碱酯酶在AD中的作用，靶向其多功能作用。除了在乙酰胆碱（ACh）水解中的传统作用外，该酶还通过其外周阴离子位点（PAS）参与(A beta)的聚集，并与淀粉样蛋白病理过程相关。因此，乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂，尤其是那些影响该酶外周阴离子位点的抑制剂，能够抑制Aβ聚集。美国食品药品监督管理局（FDA）批准的现有胆碱酯酶（ChE）抑制剂，如多奈哌齐、加兰他敏和卡巴拉汀，仅能缓解症状；然而，它们无法改变疾病进展，且常引发副作用。

丁酰胆碱酯酶在阿尔茨海默病发病机制中的作用已得到综述，有证据表明其作用远不只是对乙酰胆碱酯酶的一种代偿机制。人们认为丁酰胆碱酯酶可能是胆碱能功能衰竭与淀粉样蛋白病理之间的分子纽带，而抑制它则一种潜在的治疗策略。

金属离子稳态失衡，尤其是(Fe^{2+})、(Cu^{2+})和(Zn^{2+})，已成为阿尔茨海默病（AD）的关键致病因素。大脑中过量的金属积累可能促进Aβ肽形成毒性低聚物并推动斑块形成。金属离子可加速活性氧（ROS）的产生，引发氧化应激、线粒体功能障碍和神经元损伤。它们能与(A beta)肽结合，形成金属-(A beta)复合物，从而增强神经毒性。金属离子稳态的破坏作用还会增加斑块沉积速率。

基于这些病理学研究成果，新型药效团策略应运而生，其中包括将胆碱能增强与抗淀粉样蛋白、抗氧化和金属螯合作用相结合的多靶点导向配体（MTDLs），该策略可针对与(A beta)和tau蛋白相关的氧化还原活性金属离子发挥作用。

多奈哌齐通过提高乙酰胆碱（ACh）水平来控制阿尔茨海默病（AD）的认知和功能症状。它可与乙酰胆碱酯酶（AChE）的催化活性位点（CAS）和外周阴离子位点（PAS）结合，与连接Y337和Y341侧链的水分子形成氢键相互作用，并与W86和W286的侧链发生相互作用。这些相互作用参与乙酰胆碱的水解，因此多奈哌齐能增强胆碱能神经传递。该化合物有望作为高效核心结构应用于新型多靶点配体（MTDLs）的设计与合成中。基于这一研究方向，研究人员合成了大量以多奈哌齐为母核的查尔酮类化合物，并对其胆碱酯酶抑制活性进行了评估。同时，还对活性较强的化合物进行了β-淀粉样蛋白（Aβ）聚集抑制潜力（以预防斑块形成）以及金属螯合能力（以降低金属离子诱导的毒性）的检测。此外，也评估了这些化合物在PC12和SH-SY5Y细胞中的抗氧化能力和细胞毒性。另外，通过计算机模拟研究，探究了强效乙酰胆碱酯酶抑制剂与靶酶的相互作用机制，为深入理解其潜在的作用机理提供了依据。

结果与讨论

化学

方案1展示了制备化合物7a–q的合成路线。首先，4-氨基苯乙酮(1)发生反应在碱性条件下（乙醇中的氢氧化钠），与多种芳香醛或杂芳醛（2）在室温下反应，生成查尔酮衍生物3a–q。随后，这些衍生物在碳酸钾存在下，于室温在DMF中与氯乙酰氯（4）反应，得到化合物5a–q。最后，在DMF中，以(K_{2} CO_{3})为试剂，使化合物5与5,6-二甲氧基-2-(哌啶-4-基甲基)-2,3-二氢-茚-1-酮（6）发生亲核取代反应，得到目标化合物7a–q。所有化合物均通过红外（IR）光谱和核磁共振（NMR）光谱进行了表征。此外，活性化合物的纯度通过高效液相色谱（HPLC）分析得到了确认。

方案1 化合物7a–q的合成

设计

为开发针对阿尔茨海默病（AD）的多功能化合物，本研究基于多奈哌齐（化合物A，图1）设计了一系列杂合分子，多奈哌齐的作用机制与神经递质乙酰胆碱（ACh）的缺乏相关。然而，现有治疗方法和杂合策略仍需进一步优化，以成为更有效的研究工具。双结合位点的乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂在恢复胆碱能功能方面展现出良好潜力，这类抑制剂可与外周位点（PAS）结合，从而减少(A beta)的沉积与聚集。  基于此，Sang等人[16]报道了多奈哌齐-查尔酮-卡巴拉汀杂合物的合成及其抗AD活性评价。研究发现，化合物B（图1）是一种可逆的人乙酰胆碱酯酶（huAChE）和人丁酰胆碱酯酶（huBuChE）抑制剂，其半数抑制浓度（IC₅₀）值分别为0.87 mM和3.30 mM。该化合物还表现出显著的抗炎活性，对Aβ1-42聚集具有抑制作用（抑制率达60.6%），并对(A beta_{1-42})诱导的PC12细胞损伤具有神经保护作用。此外，PET-CT成像结果证实，化合物B能够快速穿透血脑屏障进入大脑。

我们的设计引入了查尔酮部分和酰胺连接子，因为酰胺键连接的查尔酮衍生物（C，图1）是一类独特的化合物，以其广泛的生物活性而闻名¹⁷。查尔酮骨架也是一种多用途的结构，因其在开发阿尔茨海默病的治疗方法的潜力而备受关注。

Hasan 等人[1]合成了一系列新型香豆素-查尔酮杂合物作为抗乙酰胆碱酯酶抑制剂，其活性范围为0.201至1.047毫摩尔。化合物D（图1）表现出强效的抗乙酰胆碱酯酶活性，其(IC _{50})值为0.20毫摩尔。对乙酰胆碱酯酶的分子对接研究显示，其与外周阴离子位点区域的苏氨酸75和酪氨酸72存在相互作用。查尔酮部分通过π-π相互作用与苯丙氨酸338和色氨酸86结合，而连接臂则与缬氨酸294形成烷基相互作用。分子动力学模拟显示其均方根偏差为(2.6 A)

查尔酮中的两个芳香环和一个氢键受体羰基使其在抑制Aβ肽聚集方面具有强效。查尔酮中的芳香环可与(A beta)肽提供疏水作用和π-堆积相互作用。因此，与淀粉样蛋白假说靶点相关的出版物数量一直在增长。20 查尔酮衍生物E（图1）对(A beta)聚集表现出更高的抑制活性，抑制百分比范围从还对芳基（Ar）位置的部分结构以及构效关系（SAR）展开了研究。这些修饰旨在实现胆碱酯酶（ChE）抑制、Aβ聚集抑制、抗氧化活性以及金属螯合能力。 体外胆碱酯酶抑制活性与多奈哌齐的效果相当。构效关系分析表明，查尔酮片段芳环（Ar）上取代基的类型、位置及其电子效应对抑制活性具有显著影响。

图1 新型多奈哌齐-查尔酮杂合物的设计

对乙酰胆碱酯酶的抑制作用。带有2-氯芳基取代基的化合物(7 j)表现出最强的乙酰胆碱酯酶抑制活性（((IC_{50}=)为17.96 mM）。将氯原子移至间位或对位会显著降低活性（7k (IC_{50}=75.31 mu M)对应的79517d1b-295c-498b-859d-ad8d30aea06d值），这凸显了邻位氯原子对于实现最佳相互作用的关键作用。其他卤素（如氟和溴）取代则会产生不同的活性。在氟取代衍生物（7g–7i）中，仅3-氟化合物7h表现出中等活性（((IC_{50}=38.18 mu M))），而7i无活性（((IC_{50}>100 mu M))）。对于溴取代化合物（7m–7o），7m表现出显著活性（IC ([IC_{50}=)为41.44 mM），7n和7o的活性则较低（(IC_{50}>100 mu M)对应的(IC_{50}=)值分别为75.87 mM）。

7p中的呋喃-2-基对乙酰胆碱酯酶具有强烈抑制作用（((IC_{50}=) 22.70 mM），效果仅次于7j。将呋喃替换为噻吩（7q）后，其抑制活性完全消失（((IC_{50}>100 mu M))），这凸显了氧原子在酶与底物相互作用中的重要性。

进一步的评估表明，无芳基取代（7a）、引入硝基基团（7f）或甲基取代（7b）均消除了乙酰胆碱酯酶抑制活性（((IC_{50}>) 100 mM）。然而，甲氧基取代的衍生物（7c–7e）其活性优于甲基衍生物，其中 7c（3-甲氧基）和 7d（4-甲氧基）的半数抑制浓度（IC50）分别为 81.55 微摩尔和 75.50 微摩尔。当甲氧基增加至三个（如 7e）时，活性有所降低，这表明空间位阻可能发挥了一定作用。

氯咪唑（Cl）是目前发现的抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）效果最显著的替代物，尤其是在邻位时效果更佳。2-氯衍生物在空间结构上或许能与氨基酸残基形成有利的相互作用。

对丁酰胆碱酯酶的抑制作用。在测试的化合物中，呋喃-2-基取代衍生物7p表现出最强的丁酰胆碱酯酶抑制活性，其(IC _{50})值为19.14微摩尔。然而，将呋喃-2-基替换为噻吩-2-基基团（化合物7q）后，活性完全丧失（((IC_{50}>)值为100微摩尔）。这一结果与乙酰胆碱酯酶抑制的规律相似。

第二强效的化合物为7m，即一种2-溴取代衍生物，其值为21.39 mM。改变芳环上溴的位置会显著降低活性。间位溴取代衍生物（7n）无活性，而对位取代衍生物（7o）则表现出中等活性。用其他卤素取代（7g–7l）并未带来显著的活性提升，因为大多数衍生物无活性或仅具有中等活性。

与乙酰胆碱酯酶抑制活性的观察趋势不同，无取代基的化合物（7a）表现出中等强度的丁酰胆碱酯酶抑制活性（((IC_{50}=58.70 mu M))）。引入强吸电子吸电子基团（如硝基（7f））也具有中等活性（((IC_{50}=85.35 mu M))

给电子基团也会影响丁酰胆碱酯酶抑制活性，尤其是在对位。对甲基（7b）和对甲氧基（7d）衍生物表现出中等活性（(IC _{50}) 值分别为 89.91 微摩尔和 89.96 微摩尔）。然而，将甲氧基移至间位或增加甲氧基数量（如化合物 7e 所示）会导致活性丧失 ((IC_{50}>100 mu M))

合成化合物7a–q的乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BuChE）抑制活性研究表明，这些化合物具有不同的构效关系（SAR），这归因于两种酶活性位点的结构差异。化合物7j的尺寸似乎能完美适配乙酰胆碱酯酶（AChE）的活性位点。但在丁酰胆碱酯酶（BuChE）这一体积更大的酶的活性位点中，该基团难以提供合适的相互作用能来稳定复合物，这也是其表现出抑制活性缺失的原因((IC_{50}>100 mu M))

含有呋喃-2-基的化合物7p表现出最高的丁酰胆碱酯酶抑制活性（(IC_{50}=19.14 mu M)）。它在乙酰胆碱酯酶抑制方面也位列第二（IC ([IC_{50}=22.70 mu M))），表明其具有双重抑制潜力。溴取代的衍生物对两种酶均表现出中等活性，其中7m（2-溴）是效果最强的丁酰胆碱酯酶抑制剂（(IC_{50}=21.39 mu M)）。它对乙酰胆碱酯酶也表现出中等抑制活性（(IC_{50}=41.44 mu M)）。氟取代的化合物（7g–7i）对两种酶基本无活性，唯有7h（3-氟）对乙酰胆碱酯酶表现出中等抑制活性（((IC_{50}=38.18 mu M))）。未取代的化合物（7a）或带有强吸电子基团的化合物诸如硝基（7f）等基团会消除乙酰胆碱酯酶活性，但会对丁酰胆碱酯酶产生中等程度的抑制作用（分别对应 (IC_{50}=58.70 mu M) 和 85.35 mM）。给电子基团（如甲基（7b）和甲氧基（7c-7e））对两种酶通常表现出弱至中等的抑制活性。对位取代的衍生物（7b 和 7d）对丁酰胆碱酯酶的抑制效果更佳。总体而言，构效关系趋势表明，乙酰胆碱酯酶的抑制作用对卤素取代基的位置和电子效应更为敏感，尤其是氯原子。相比之下，杂芳基和给电子取代基对丁酰胆碱酯酶的抑制作用影响更大。

值得注意的是，与参比药物多奈哌齐相比，这些合成衍生物对胆碱酯酶的抑制活性更低（(IC_{50}=0.026 mu M)（针对乙酰胆碱酯酶）。这在分子杂交策略中经常被观察到，例如引入查尔酮骨架等大体积结构基序，会增加分子量和空间体积。

动力学研究

为确定抑制机制，本研究对主要的乙酰胆碱酯酶抑制剂（化合物7j）开展了动力学研究。双倒数莱恩维弗-伯克图（图2）呈现混合型抑制模式，表明(7 j)可与游离酶和酶-底物复合物均发生结合。这种双重结合会影响米氏常数((K_{m}))以及最大反应速率((V_{max }))。此外，通过斜率与不同抑制剂浓度的关系图，可估算出抑制常数(K_{i}=8.74 mu M)（图3a）；同时，通过1/V与不同浓度化合物7j的关系图，也可估算出抑制常数(K_{is }=94.75 mu M)（图3b）。

图2 化合物7j对抗乙酰胆碱酯酶的莱因韦弗-伯克图

图3 (a) 斜率与化合物7j不同浓度的二次图。(b) 1/V与化合物7j不同浓度的二次图。

抑制7j和7p对(A beta)的聚集

为评估先导化合物对淀粉样蛋白-β（Aβ1-42）的抗聚集潜力，分别针对其自诱导聚集以及开展了乙酰胆碱酯酶（AChE）诱导的聚集实验。如表2所示，化合物7j在10和100毫摩尔浓度下被发现是两种模型中活性最强的抑制剂，对自身诱导的(A beta)聚集的抑制率分别为72.5%，对AChE诱导的聚集的抑制率为77.6%。这种双重功效表明7j可能同时干扰自发成核和AChE促进的聚集途径。可能通过与 (A beta) 单体直接相互作用或调节乙酰胆碱酯酶的 PAS 来实现。

化合物7p也表现出中等程度的抑制作用，在相关测定中，在10和100 mM时分别有58.9±1.5%和60.4±1.5%的抑制作用。虽然这些值不如7j有效，但仍然是一个显著的减少，表明7j和7p之间的结构变化可能影响它们与Aβ聚集的结合亲和力或构象干扰。

相比之下，多奈哌齐作为一种临床获批的胆碱酯酶抑制剂，在两种检测中均表现出显著更低的抑制活性：在10毫摩尔浓度下，对自身诱导聚集的抑制率仅为14.6±1.7%；在100毫摩尔浓度下，对乙酰胆碱酯酶诱导聚集的抑制率为26.5±1.5%。这些结果凸显了新合成化合物（尤其是7j）优异的抗聚集功效，也彰显了其作为多功能药物的潜力，可同时针对阿尔茨海默病中的胆碱能功能障碍和淀粉样蛋白病变发挥作用。

PC12细胞的细胞毒性

为评估化合物7j和7p的毒性，将PC12细胞暴露于不同浓度（0.01–100 mM）的上述化合物中24小时，并用MTT法检测细胞活力。两种化合物均表现出极低的细胞毒性，在测试浓度范围内均保持较高水平的细胞活力。具体而言，化合物7p的细胞活力保留率达92.6±1.5%的存活率，而(7 j)保持在90.4±1.4%，表明其在100毫摩尔浓度下具有优异的细胞耐受性。

这些结果表明，7j和7p在测试浓度下对神经元细胞无毒性，这支持了它们适用于进一步生物学评估的结论。高存活率百分比也意味着其他实验中观察到的生物活性不太可能受到细胞毒性的干扰，从而进一步增强了这些化合物在神经退行性疾病相关场景中的治疗潜力。

化合物7j在SH-SY5Y细胞中的细胞毒性

作为最有效的乙酰胆碱酯酶抑制剂，化合物7j对人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞的细胞毒性进行了评估，以确定该化合物是否对细胞有害（图4）。

本实验专门针对化合物7j展开，旨在在人类神经元模型中验证先导乙酰胆碱酯酶抑制剂的安全性。实验设置了10、30、100和200毫摩尔的浓度梯度，同时以顺铂作为参考细胞毒性试剂（对照组），以此验证检测系统的灵敏度，并确认细胞对已知毒素的易感性。将化合物7j处理组的细胞活力与对应浓度下顺铂处理组的细胞活力进行对比。结果发现，即便在高浓度下，7j也未造成显著的细胞死亡（((P<0.0001))）。

图4 化合物7j对SH-SY5Y细胞的细胞毒性。细胞用指定浓度的化合物7j和顺铂处理72小时。数据以三次独立重复实验的平均值±标准差表示。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey多重比较检验进行统计学显著性分析（与对照组相比，(int^{* * * *} p<0.0001)）。

抗氧化能力

基于2,2-二苯基-1-苦基肼基（DPPH）和2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）自由基清除实验，以托洛司特为参照，对化合物7j和7p的抗氧化能力进行了评估（见表3）。结果见表3。DPPH实验更适用于能发生氢原子转移（HAT）的化合物，而ABTS实验对电子转移（SET）更为敏感²²。在DPPH和ABTS两项实验中，化合物7p的表现均优于7j，这表明在合成的系列化合物中，7p 展现出更优的自由基清除特性。但需注意的是，与标准药物 Trolox 相比，这两种化合物的抗氧化活性均显著更低。化合物 7p 中呋喃环的给电子特性使其在自由基清除方面相较于氯代类似物 7j 略具优势，不过与已有的抗氧化剂相比，其整体活性仍较为温和。

金属螯合

像 (Fe^{2+} / Fe^{3+})、(Cu^{+} / Cu^{2+})、(Zn^{2+}) 这样的过渡金属，通过与生物路易斯碱配位，对细胞信号传导和酶催化至关重要。然而，在神经退行性疾病（尤其是阿尔茨海默病）的背景下，这些金属的稳态失衡被认为与疾病进展相关。本文测定了 7j 和 7p 对 (Fe^{2+})、(Zn^{2+})、(Cu^{2+}) 离子的金属螯合能力。为此，首先测定了 7j 和 7p 甲醇溶液的紫外-可见吸收光谱在20毫摩尔浓度下，于200至700纳米波长范围内进行记录。如图5所示，7j和7p分别在307纳米和352纳米波长处出现吸收峰。

图5 化合物7j和7p的金属螯合能力。 (a) 化合物 7j 与金属离子相互作用时的紫外-可见光谱变化。 (b) 化合物 7p 与金属离子相互作用时的紫外-可见光谱变化。

当化合物7j与(Fe^{2+})、(Zn^{2+})溶液（终浓度为20 mM）处理时，(lambda_{max })中未观察到明显的吸收峰位移，表明螯合作用较弱或范围有限。然而，记录到了吸光度强度的变化。与(Cu^{2+})相互作用后，吸光度增强，且在341 nm处出现明显的红色吸收峰位移。

对于化合物7p，在347纳米处出现的轻微蓝移归因于与(Fe^{2+}) (Zn^{2+})离子的相互作用。而(Cu^{2+})离子在356纳米处则表现出红移。

考虑到金属离子对Aβ聚集和活性氧生成的影响，化合物7j和7p靶向金属-Aβ复合物的能力似乎是一种有前景的策略。

分子对接

为预测化合物7j与乙酰胆碱酯酶（AChE）的相互作用方式，进行了分子对接实验（图6）。研究发现，7j的茚酮结构单元在乙酰胆碱酯酶催化三联体（Ser203、His447和Glu334）内形成了两个关键相互作用，该催化三联体位于酶的活性中心，对乙酰胆碱（ACh）的水解反应和过渡态稳定化至关重要。具体而言，茚酮结构单元的芳基与His447发生阳离子-π和π-π相互作用，而甲氧基的氧原子与Ser203形成了氢键。

此外，组氨酸287与2-氯芳基部分之间存在的(pi-pi)堆积相互作用，以及催化活性位点（CAS）中另一个甲氧基的氧原子与甘氨酸121之间的氢键相互作用，共同促成了酶的抑制作用。(7 j)还与乙酰胆碱酯酶的外周阴离子位点（PAS）形成了有利的相互作用，该位点位于活性位点裂隙入口附近，参与底物结合。这些相互作用包括两种氢键相互作用：一种是酰胺NH基团与酪氨酸341之间的相互作用，另一种是羰基基团与酪氨酸337之间的相互作用。

图6 化合物7j在乙酰胆碱酯酶活性位点内的相互作用：(a) 二维相互作用图。(b) 三维相互作用图。

分子动力学

为了研究化合物 (7 j) 在乙酰胆碱酯酶活性位点内的行为，进行了时长为100纳秒的分子动力学（MD）模拟。采用均方根偏差（RMSD）分析评估了酶-配体复合物相对于游离酶的稳定性（图7）。

如图7所示，基于RMSD值，7j-乙酰胆碱酯酶复合物相对稳定，在初始平衡（约10–20纳秒）后，其RMSD值通常稳定在(1.0-1.5)附近。与游离的乙酰胆碱酯酶相比，该复合物的RMSD值持续更低，这表明7j有助于稳定蛋白质的结构。相比之下，无配体结合的乙酰胆碱酯酶的RMSD曲线波动更大，说明在缺乏7j的情况下，其结构柔性有所增加。

图7 7j-乙酰胆碱酯酶复合物与单独的乙酰胆碱酯酶在100纳秒分子动力学模拟中的均方根偏差对比

图8a展示了参与配体结合的酶中关键区域稳定性的均方根波动（RMSF）分析，表明(7 j) -乙酰胆碱酯酶复合物的整体稳定性。图8b展示了7j在超过30%的模拟时间内与结合位点关键残基的相互作用。

图8 (7 j) -乙酰胆碱酯酶复合物的分子动力学分析：(a) 蛋白质主链Cα原子的均方根波动图。(b) 模拟时间内出现频率超过30%的7j乙酰胆碱酯酶相互作用示意图

甲氧基的氧原子显著与催化三联体的His447形成氢键相互作用。另一个甲氧基的氧原子参与了两个水介导的氢键相互作用，一个与CAS的Gly122作用，另一个与催化三联体的Ser203作用。茚酮的芳香部分与PAS的Phe338形成了强烈的(不一兀)堆积相互作用，而其羰基与PAS的Tyr337构建了氢键相互作用。酰胺羰基表现出两种水介导的氢键相互作用：一种与Ser293作用，另一种与Arg296作用。此外，还观察到2-氯芳基部分与His287之间存在(不一兀)堆积相互作用。

根据图9，化合物7j的原子配体均方根波动值较低，表明在整个模拟过程中存在稳定且有利的结合相互作用。这些发现证实，该配体在乙酰胆碱酯酶的活性位点内形成了稳定的相互作用并紧密结合。

图9 7j在乙酰胆碱酯酶活性位点的均方根波动值

7j和7p的药代动力学及理化性质预测

化合物7j和7p的理化性质、亲脂性、药代动力学性质以及类药性已列于表4中。

表4 化合物7j和7p的理化性质

化合物7j有六个氢键受体（HBA）和一个氢键供体（HBD），因此具有中等极性。相比之下，化合物7p（(HBD=1)、(HBA=7)）的极性比(7 j)略高。7j的摩尔折射度经计算为169.47，表明该分子具有较高的极化率和分子量，这会影响结合相互作用。相反，化合物7p的摩尔折射度为156.72，意味着其占据的体积更小，极化程度也更低。7j的拓扑极性表面积（TPSA）为(84.94 AA^{2})，符合口服可接受的标准。7p的TPSA为(98.08 AA^{2})，略高于穿透血脑屏障（BBB）的最佳值，且与7p 未表现出预测的血脑屏障通透性这一事实。化合物 7j 的 MLOGP 为 3.25（(log P_{o / w})），属于中度亲脂性化合物，这使其能够穿透细胞膜，但非特异性结合的概率更高。另一方面，化合物 7p 的 log 值为 1.68（(P_{o / w})），表明其亲脂性较弱，因此虽有可能降低细胞膜通透性，却能提升其溶解度。从药代动力学角度来看，7j 和 7p 在胃肠道（GI）中具有高吸收率，可口服使用。然而，二者均无法穿透血脑屏障，这可能限制其在中枢神经系统（CNS）领域的应用，除非对其进行结构改造。它们同时也是 P-糖蛋白（P-gp）的底物，即可能被细胞主动外排，从而降低细胞内浓度。二者并非 CYP1A2 的代谢抑制剂（多奈哌齐则是），但均为 CYP2C19、CYP2C9 及 CYP3A4 的抑制剂。不过，与 7j 不同，化合物 7p 并非 CYP2D6（细胞色素 P450，((CYP=)）的抑制剂。这种广泛的抑制作用可能需要设计前药或联合使用中枢神经系统药物，同时还需进行严谨的药代动力学建模。二者还存在一次违反 Lipinski 规则的情况，这会影响其成药性，但仍处于可良好开发的范围内。

斑马鱼模型中的体内评价

对最有效的乙酰胆碱酯酶（化合物 7j）和丁酰胆碱酯酶（化合物 7p）抑制剂，在阿尔茨海默病的斑马鱼模型中进行了体内测试，以评估其对认知和运动的影响。运动活动包括斑马鱼的移动距离（((m))）、斑马鱼穿越进入水箱边界的次数、平均速度（((m h^{-1}))）以及在水箱上部区域停留的时间（秒），这是衡量探索行为和焦虑缓解程度的重要指标（图 10a–d）。

根据图10a，各实验组在总移动距离上无统计学显著差异。这表明AD模型未对斑马鱼造成严重的运动损伤或身体残疾，证实其他参数中观察到的行为变化并非由运动功能缺陷继发引起。

图10b展示了各实验组的平均游泳速度（((m h^{-1}))）。与对照组相比，AD组的平均速度显著降低（((p<) (0.05)) 0.05），这表明该疾病表型与多动/焦虑或运动不足/运动功能缺陷相关。与AD组相比，化合物7p（((p<0.05))）和多奈哌齐（((p<0.001))）处理显著逆转了这一变化。值得注意的是，7p组和多奈哌齐组的游泳速度与对照组无显著差异，提示运动行为恢复正常。7j处理组也表现出改善趋势，但该差异未达到统计学显著性。

图10c展示了水箱内鱼穿越线条的频率（即鱼穿越水箱中指定线条的次数）。与对照组相比，AD组的穿越次数显著减少（((p<0.001))），这表明其存在认知障碍且探索动机减弱。与AD组相比，多奈哌齐治疗组展现出极显著的治疗效果（((p<0.001))）。给予7p可显著恢复探索行为((p<0.01))，逆转疾病诱导的被动状态。与AD组相比，7j的疗效无统计学显著性。

图10d展示了斑马鱼在上层区域的停留时间（s），这是测量类焦虑行为的关键参数。斑马鱼在焦虑时会自然潜至底部，并逐渐探索上层区域。与对照组相比，AD模型组在上层区域的停留时间显著更短（((p<0.001)) 验证了斑马鱼存在高度焦虑和类抑郁行为）。相反，多奈哌齐和7p处理组在上层区域的停留时间比AD模型组更长（((p<0.05)) 表明其具有抗焦虑作用，帮助斑马鱼克服恐惧并探索上层区域）。尽管化合物7j延长了斑马鱼在上层区域的停留时间，但与AD模型组相比，该增加并无统计学显著性。

图10 化合物7j、7p和多奈哌齐处理后斑马鱼的行为学评估。柱状图展示了(a)总移动距离、(b)平均游泳速度、(c)穿越线次数（代表探索行为）以及(d)在上方区域停留的时间（代表类焦虑行为）。数据以平均值±标准误（SEM）表示。组间显著差异用星号标注（(*p<0.05)、(^{* *} p<0.01)、(**p <0.001)），而“ns”表示无显著差异

未来展望

未来优化多奈哌齐查尔酮类化合物药效的潜力应聚焦于增强胆碱酯酶抑制活性和提高血脑屏障通透性。卤素取代模式的优化、查尔酮部分空间位阻的降低、分子量和亲脂性的优化以及生物信息学分析，都是后续研究需要考虑的方向。此外，开发纳米制剂有助于解决血脑屏障通透性问题。同时，转基因阿尔茨海默病小鼠模型可用于评估对Aβ斑块负荷、tau蛋白病理及认知功能的影响，以验证这些化合物的治疗潜力。

结论

本研究设计并合成了一系列新型的多奈哌齐基查尔酮衍生物，以探究其针对阿尔茨海默病多因素病理的潜在治疗作用。这些杂合物的抑制活性弱于多奈哌齐，但其中7j和7p两种杂合物展现出良好的多靶点药物特性，且药理性质达到平衡。7j化合物不仅具有强效的乙酰胆碱酯酶抑制作用，还兼具优异的双重聚集抑制活性和良好的螯合能力，在抗淀粉样蛋白实验中表现优于多奈哌齐。相反，7p化合物表现出双重胆碱酯酶抑制作用，同时具备显著的抗氧化能力，可应对多奈哌齐无法靶向的氧化应激问题。这些研究结果表明，降低胆碱酯酶活性是获得多靶点活性的合理折中方案，这类杂合骨架可被视为治疗阿尔茨海默病的下一代治疗药物。此外，斑马鱼体内研究揭示了这些杂合物的治疗潜力。7p化合物在改善认知和运动功能障碍方面表现出良好的活性，其行为特征与标准药物多奈哌齐相似。这些结果证实了多靶点药物设计策略的有效性，尤其是针对7p化合物而言。