标题：A Phenotype-Driven Discovery of Pro-Revascularization Chalcone Derivatives Using Zebrafsh and CAM Models

期刊：Journal of Toxicology

原文链接：https://doi.org/10.1155/jt/6939974

摘要

血管生成对于组织修复和缺血性疾病的治疗至关重要，但临床实践中缺乏有效的小分子促血管生成药物。查尔酮类化合物因其多样的生物学活性而受到关注。本研究旨在合成并评价一系列新型查尔酮衍生物的促血管生成潜力，并利用计算化学阐明其构效关系（SAR）。我们合成并测试了六种查尔酮衍生物（1a–1f），其中化合物(((E)))-1-(3,4-二甲氧基苯基)-3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙-2-烯-1-酮（1c）表现出最高的活性。在斑马鱼模型中，1c处理显著增加了肠下静脉（SIV）的分支点形成和血管生长（分支点数：1c组2.28±0.19，对照组0.79±0.17；(p<0.001)）。利用Tg(fli1:egfp)转基因斑马鱼，我们观察到1c显著促进尾静脉丛（CVP）的重塑，导致毛细血管间隙数量显著增加（1c组16.3±1.9，对照组11.6±2）。机制研究表明，实时聚合酶链式反应（RT-PCR）结果显示1c处理上调了关键血管生成基因钙粘蛋白5和神经纤毛蛋白1a的表达，同时下调了Fms相关受体酪氨酸激酶1的表达。此外，鸡胚尿囊膜（CAM）实验证实1c能有效诱导血管网络形成。计算化学分析（密度泛函理论、分子静电势和前线分子轨道）与生物学活性高度一致。1c具有最高的亲电性指数(((w)))、化学势((( mu)))和电子转移能力(((Delta N)))，以及最强的亲电位点(((V_{s, max })))，这解释了其优异的生物学活性。本研究证实了查尔酮衍生物1c具有强效的促血管生成活性，为开发针对血管功能障碍疾病的新型小分子治疗药物提供了极具潜力的先导化合物。

引言

血管生成是指从已有的血管组织中生成新血管的过程，它是胚胎发育、伤口愈合等生理活动中不可或缺的过程组织修复。然而，血管生成失调与多种疾病的发生和发展密切相关。例如，血管生成过度与癌症和糖尿病性视网膜病变有关，而血管生成不足则与心肌缺血、中风等缺血性疾病相关外周动脉疾病。因此，发现并开发能够精准调控血管生成的化学制剂，对临床治疗具有重要的战略意义。

目前已发现多种能促进或抑制血管生成的药物。例如，靶向血管内皮生长因子（VEGF）的单克隆抗体贝伐珠单抗（阿瓦斯汀），以及舒尼替尼、索拉非尼等阻断血管生成相关受体的小分子药物，均已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，用于治疗转移性结直肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和胶质母细胞瘤。相比之下，促血管生成药物的数量仍相对有限。迄今为止，重组血管内皮生长因子、血管生成素-1、合成肽血管生成肽，以及尼古丁、丹酚酸B等小分子化合物和中药来源的成分，均被广泛用于治疗缺血性疾病[8-11]。尽管取得了这些进展，但耐药性等挑战依然存在，因此仍需研发新型、更有效的促血管生成药物，尤其是小分子药物。

查尔酮类化合物包含天然存在和人工合成的分子，其特征是具有由一个苯环连接一个(alpha, beta)不饱和羰基构成的骨架结构。这类化合物因具有抗癌、抗炎、抗氧化和调节血管生成等多种生物活性而受到广泛关注。例如，查尔酮-噻吩并嘧啶和查尔酮基吩噻嗪衍生物已被证实能抑制Hep G2（肝癌）和MCF-7（乳腺癌）细胞的生长]。另有研究报道，含有2,4-二氯苯磺酰胺基团的其他查尔酮衍生物可抑制HeLa（宫颈癌）和HL60（白血病）细胞的增殖。这些研究结果表明，查尔酮类化合物可能对多种癌细胞的生长具有抑制作用。

此外，多种查尔酮衍生物已被证实具有调节血管生成的能力。例如，α-氟代查尔酮、紫铆因（一种植物来源的查尔酮）以及基于查尔酮的2,2-二甲基苯并吡喃据报道具有抗血管生成作用，而磺酰胺-查尔酮杂合物、二羟基查尔酮等其他化合物则被发现能够促进血管生成。这些研究结果凸显了查尔酮在调控血管生成过程中所发挥的重要作用。因此，合成并筛选新型基于查尔酮的化合物，有望成为发现新型促血管生成药物的有效途径。

本研究采用了多种成熟的实验方法来研究血管生成，例如人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖实验、角膜微囊实验、斑马鱼模型以及鸡胚尿囊膜（CAM）实验。在本研究中，我们采用系统的方法设计并合成了六种新型查尔酮衍生物，并通过两种互补的体内模型对其活性进行了评估与验证，即斑马鱼模型和鸡胚尿囊膜实验。斑马鱼模型的优势在于其胚胎透明、体外受精且发育迅速，因此特别适用于血管发育的形态学分析（如肠下静脉SIV和尾静脉丛CVP）。鸡胚尿囊膜实验则可对血管生成进行验证在类哺乳动物的胚外环境中。此外，我们利用密度泛函理论（DFT）和分子静电势（MESP）图谱对活性化合物进行了深入的计算化学表征，旨在建立构效关系（SAR），并从分子层面解释其优异的生物活性。本研究的最终目标是发现一种具有潜在临床应用价值的新型促血管生成小分子药物，并阐明其潜在的分子和电子结构基础。

结果

化学

在本研究中，我们采用与先前报道[37]相似的方法合成了六种查尔酮类化合物（1a–1f）。O-异丙基苯乙酮或其醛衍生物的合成步骤较为简便。首先，将苯乙酮或相应醛与溴代异丙烷及碳酸钾在N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中反应，获得了理想的反应结果。随后，所得苯乙酮与对应的苯甲醛在5摩尔/升氢氧化钾（KOH）存在下发生反应，生成产物1a–1f，分离产率在76%至90%之间（图7）。对(^{1} H)-核磁共振（NMR）谱图的分析证实，这些查尔酮类化合物均为反式构型，其(J_{H alpha, H beta})耦合常数介于15至16赫兹之间。化合物1a–1f的核磁共振谱图已在补充数据中给出（图S1–S6）。

查尔酮类化合物在斑马鱼胚胎中的存活率分析

本研究中，斑马鱼胚胎在受精后48至72小时（hpf）暴露于不同浓度（0–15 mg/L）的查尔酮类化合物中（图1A），并记录其存活率。结果显示，暴露于1–15 mg/L的1a和1f的胚胎存活率极低（0%–0.33%±0.58，三次重复实验，编号(n=100)）（图1B、E）。相比之下，1b、1d和1e在1–15 mg/L暴露组中的存活率显著更高，范围在83%±4.36至99.33%±1.15之间（编号((n=100))）（图1C、E、F）。同样，“无处理”和“空白”对照组的胚胎存活率接近100%（99%±1–100%，编号(n=100)）（图1B–G）。值得注意的是，暴露于低浓度（1、3和5 mg/L）1c的胚胎存活率较高（96.33%±2.89–99.33%±1.15，编号(n=100)）。然而，在1c的高浓度（10和15 mg/L）处理组中未观察到存活胚胎（图1D）。这些发现表明，5 mg/L的查尔酮类化合物（1a和1f除外）是斑马鱼模型后续实验的最佳浓度。

图1 | 查尔酮类化合物的暴露方法及存活率分析。收集受精后48小时（hpf）发育的斑马鱼胚胎，每个实验组随机分为100枚胚胎，将其浸泡在水中（无处理）、0.1%二甲基亚砜（空白对照）或1、3、5、10、15毫克/升的待测化合物（化合物1a–1f）中24小时。至受精后72小时，统计存活胚胎数量并计算存活率。(A) 暴露时间为受精后48至72小时。(B–G) 各查尔酮类化合物的存活率分析。

查尔酮类化合物对SIV增殖的影响

在斑马鱼胚胎中，SIV 在发育早期形成一个简单的血管网络，并在受精后48至72小时之间发生显著的分支和生长。为了研究……的影响为研究查尔酮类化合物对血管发育的影响，我们通过碱性磷酸酶染色（AP-staining）观察了1b–1e组（5毫克/升）处理后背侧血管（SIV）分支点的形成情况（图3A–F）。1c处理组的SIV分支点数量显著增多，平均达2.28±0.19个（((n=68))），而“无处理”组为0.89±0.13个（((n=58))），“空白对照组”为0.79±0.17个（((n=35))）（图3G）。t检验的统计分析证实，“1c组”与“无处理组”（((p<0.001))，P<0.001）或“空白对照组”（((p<0.001))，P<0.001）之间存在显著差异。

我们进一步研究了不同浓度的1c（1、3和5毫克/升）对猴免疫缺陷病毒（SIV）过度增殖的影响（图2A），白色箭头指示过度增殖现象。“无处理组”“模拟处理组”和处理组中猴免疫缺陷病毒过度增殖的平均计数分别如下：0.22±0.08（((n=58))）、0.12±0.04（((n=58))）、0.54±0.12（((n=65))）、1.59±0.20（((n=68))）和1.03±0.24（((n=29))）。单因素方差分析显示存在显著差异（F值：0.0028）。(<0.0001)，以及1、3和5毫克/升浓度组相较于对照组的数值为0.0094）。事后图基-克莱默 Honestly Significant Difference（HSD）检验结果显示，所有处理组（1、3和5毫克/升）的猴免疫缺陷病毒（SIV）增殖计数均显著高于对照组（“无处理”组和“模拟处理”组）（图2）。

图2 | 化合物1c暴露胚胎中SIV增殖的记录。(A–C) 用1、3和5 mg/L的化合物1c处理48至72小时胚胎形成期（hpf）的AB品系胚胎的碱性磷酸酶（AP）染色代表性图像。72小时胚胎形成期（hpf）的胚胎进行碱性磷酸酶染色。白色箭头标记SIV增殖的位置。数据采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和图基-克莱默真实显著差异（HSD）检验进行统计分析。

图3 | 查尔酮类化合物对斑马鱼节段间血管分支点的影响记录。(A–F) 仅用水处理（无处理）、0.1%二甲基亚砜（空白对照）或含查尔酮类化合物（化合物1b、1c、1d和1e）的水处理的碱性磷酸酶染色胚胎（AB品系）的代表性图像。(G) 数据使用Excel T检验进行统计学分析（((^{+++} p<0.001))

1c 对尾静脉丛重塑的影响

斑马鱼尾静脉丛（CVP）由毛细血管网络构成，毛细血管间间隙通常被用作血管生成过程中血管正常重塑的指标。我们通过计数这些毛细血管间间隙，评估了1c对CVP重塑的影响。“空白对照组”和1c处理组的毛细血管间间隙平均数量分别为11.62±0.61和16.3±1.9（图4）。这些研究结果表明，1c处理通过增加毛细血管间间隙的数量，促进了CVP的重塑。

图4 | 化合物1c暴露增加了CVP中毛细血管间间隙的数量。(A-C) 暴露时间为受精后12至36小时。代表性图片显示了受精后36小时Tg(fi1:egfp)阴性对照组和化合物1c处理胚胎的CVP。(D) 各组毛细血管间间隙数量的统计图。X轴和Y轴分别代表毛细血管间间隙的平均数量和各实验组。((^{++} p<0.01))

化合物1c改变血管生成相关基因的表达

为探究1c促血管生成效应的分子机制，我们通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测了三个关键血管生成相关基因的表达：钙粘蛋白5（cdh5）、神经纤毛蛋白1a（nrp1a）以及fms相关受体酪氨酸激酶1（flt1）。图6显示，与空白对照组相比，1c处理组中cdh5和nrp1a的表达水平显著升高（分别为2.04±0.42和3.20±1.76，(N=3)）。相反，1c处理组中(flt1)的表达显著降低（0.65±0.19，(N=3)）（图6）。这些结果表明，1c通过影响参与细胞间黏附（cdh5）、共受体信号传导（nrp1a）以及血管内皮生长因子（VEGF）受体信号传导（((flt1))）的关键因子来调控血管生成，证实了其促血管生成活性。

图6 | 化合物1c暴露影响血管生成相关基因cdh5、nrp1a以及(flt1)的表达。采用相对定量CT法（CT：实时聚合酶链式反应循环数；相对于对照组(group =2^{-Delta Delta C T})的相对倍数；GMD处理组与相应的模拟组存在显著差异）。

1c 诱导鸡胚血管生成

为了进一步验证1c的促血管生成作用，我们采用了鸡胚模型结合CAM实验法，这是一种成熟的一种评估血管生长的方法。结果表明，与空白对照组胚胎相比，经 1c 处理的区域在圈定区域内形成了更致密、更广泛的血管网络。值得注意的是，额外的血管分支从主血管延伸而出（图5C，35.25±3.72 对比 44.58±3.32，(n=12)；图 空白组对比 1c 处理组）。这些发现证实 1c 能在鸡胚模型中促进血管生成，进一步证明了其促血管生成的潜力。

图5 | 化合物1c暴露的鸡胚的CAM分析。将受精后12天（38HH）的鸡胚放置在（A）浸有DMSO的滤膜或（B）经100mg/L化合物1c处理的滤膜上。观察每个胚体内部的区域以记录血管生长模式。（C）各组分支点数量的统计图。分支点数量通过AngioTool[36]计数并进行分析

化合物的化学反应性

从几何优化结果可以看出，分子结构接近平面，且相对于共轭的 (C=C) 双键采取反式构型。沿 C11–C10–C8–C7 和 C5–C7–C8–C10 测得的二面角显示，前者偏离平面约 (7^{circ })，这是由最大非平面性导致的，而后者仅偏离约 2°，呈接近平面的构型（图 8）。

C1、C2、C14和C15位末端苯环上的给电子取代基-OH、(-OCH_{3})以及-(O(CH_{3})_{2})会对所赋予的反应活性产生影响。这些取代基表现出一个约为 (-O(CH_{3})_{2}>-) 至 (OH>-OCH_{3}) 量级的负诱导（I）效应，这在查尔酮官能化化合物的结构反应性中起着关键作用。为了明确其反应性，我们在分子结构上绘制了分子静电势（MESPs）（图9a）。以红色和蓝色分别表示的正电势（((V_{s, max }))）和负电势（((V_{s, min }))），分别突出了空间中的亲电和亲核区域，是决定反应性的重要描述符。(V_{s, max }) 区域主要存在于苯环间位和对位的给电子取代基 (-OCH_{3}) 和 (-O(CH_{3})_{2}) 上。(V_{s, min }) 区域位于羰基氧和 -OH 取代的化合物 1b 及 1c 上。取代基 (-OCH_{3}) 和 (-O(CH_{3})_{2}) 的两个氧原子中心处，可观察到 (V_{s, min }) 最大值，约为 -41.4 至 -42.5 千卡/摩尔，而羰基氧原子的 (V_{s, min }) 约为 -38.4 至 -41.1 千卡/摩尔。相比之下，(V_{s, max }) 数值在分子表面分布均匀。1c 所观测到的最高平均 (V_{s, max })（约 18.18 千卡/摩尔）表明其吸引亲核试剂的倾向更强，而 1d 的 (V_{s, max }) 最低（约 11.89 千卡/摩尔）。此外，1c 具有最弱的亲核位点（((V_{s, min }=ca .-11.96 kcal / mol))），1f 则具有最强的亲核位点（((V_{s, min }=-19.48 kcal / mol))）。此外，净平均电势 (V_{avg }=sum(V_{s, max }+V_{s, min })) 显示，1b（4.17 千卡/摩尔）和 1c（6.31 千卡/摩尔）具有强亲电位点。1a（-1.73 千卡/摩尔）、1d（-5.44 千卡/摩尔）、1e（-1.08 千卡/摩尔）和 1f（-5.88 千卡/摩尔）表现出亲核特征，其中 1f 表现出最强的亲核特征（图9）。因此，分子静电势分析表明1c和1f易具有最高反应性，因为与各自同类物质相比，它们的(V_{s, max })和(V_{s, min })数值在性质上分别最强。

图7 | 本研究中使用的查尔酮类化合物的结构。每种化合物下方列出了其化学分子式、精确质量和分子量。共合成了六种化合物（化合物1a–1f）。

前线分子轨道分析

FMO分析为所研究查尔酮衍生物的电子结构和化学反应活性提供了关键见解。这些分子中的最高占据分子轨道（HOMO）在包含芳香环和(alpha, beta) - 不饱和羰基部分的共轭π体系上离域，表明其具有强烈的π特征，且具备电子给体潜力。相比之下，最低未占据分子轨道（LUMO）主要定域在羰基氧原子上，表明该区域是易受亲核试剂进攻的主要亲电位点（图10）。计算得到的(Delta E_{g})值在134.77千卡/摩尔（1b，最低）至136.63千卡/摩尔（1c，最高）之间，均显著低于未取代查尔酮的数值（147.46千卡/摩尔），说明这些衍生物具有更高的反应活性，同时分子稳定性处于中高水平。当-OH、(-OCH_{3})和(-O(CH_{3})_{2})等给电子取代基位于间位和对位时，会产生+M（共振给电子）效应，但由于氧原子的电负性，同时也会产生诱导吸电子（-I）效应。共振效应在间位时减弱，使得(-I)效应占据主导，整体使这些基团表现出弱致钝作用。因此，基于电子效应的反应活性顺序遵循(-OH>-OCH_{3}>-O(CH_{3})_{2})。这一趋势解释了为何含有更多-(O(CH_{3})_{2})基团的化合物1d和1f，其(Delta E_{g})值更高，反应活性却更低。尽管1c的(Delta E_{g})值最高，但其电子化学势（μ=97.31千卡/摩尔）为该系列中最高，表明其更易给出电子，亲核性更强。此外，亲电指数（1a–1c的((omega ≈34.59 kcal / mol)）高于未取代查尔酮，意味着其接受电子的能力更强，是更优的亲电试剂。化合物1c还表现出最高的电子转移参数（((Delta N))），进一步证实了其双反应性特征（表1）。综合来看，这些研究结果表明，尽管1c的能隙略高，但其亲核性和亲电性的平衡最为理想，使其成为与蛋白质等亲电生物分子靶标形成复合物的潜在候选物。

讨论

本研究中，我们鉴定出一种合成查尔酮衍生物——(E)-1-(3,4-二甲氧基苯基)-3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙-2-烯-1-酮（化合物1c），作为一种新型促血管生成剂，在斑马鱼和鸡胚模型中均验证了其活性。查尔酮因其抗炎、抗氧化和抗癌特性已被广泛研究，但其在促进血管生成方面的潜力却未得到充分探索。我们的研究结果证实，化合物1c能有效诱导早期发育阶段的血管生成，从而拓展了该类化合物的治疗应用范围。

血管生成在组织再生等生理过程以及癌症、慢性炎症等病理状态中均发挥着核心作用。如前文所述，过度的血管生成与肿瘤生长和炎症性疾病相关，而血管生成不足与缺血性疾病相关。因此，如前文所述，血管生成的调控已成为一项关键治疗策略，这也凸显了开发1c这类小分子药物的价值。

在斑马鱼胚胎中，1c 处理可促进节间血管生成，而鸡胚尿囊膜（CAM）实验显示血管分支也有所增加。这些表型变化伴随血管生成相关基因（包括 cdh5 和 nrp1a）的上调，以及 (flt1) 的下调。由于 (flt1) 编码一种诱骗型血管内皮生长因子（VEGF）受体，其抑制作用可能会增加Kdrl（VEGFR2）可利用的VEGF-A，从而放大促血管生成信号传导[25]。

我们的分析得出的一个关键结构见解在于查尔酮骨架B环上羟基和甲氧基的取代模式。化合物1c与其位置异构体1b的区别仅在于这两个基团的取向，但其促血管生成活性却显著更高。这两个官能团在生理pH值（6.8–7.4）下均具有化学稳定性，这一特性在斑马鱼胚胎和鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）实验中均得到了验证。因此，二者在生物学活性上的差异这种活性不太可能是由稳定性导致的，而是由空间构型引起的。这一发现凸显了一种精确的结构-活性关系，即取代基位置即使发生细微变化显著影响生物学功能。此类知识为基于查尔酮的血管生成剂的合理设计与优化提供了宝贵的切入点。

尽管这些研究结果颇具前景，但仍存在一定局限性。本研究未纳入蛋白水平的验证（如血管内皮生长因子受体2磷酸化或下游信号传导），也未使用哺乳动物模型来评估全身疗效或安全性。此外，1c的药代动力学和毒理学特征尚未阐明。解决这些问题对于将1c转化为潜在的治疗应用至关重要。

总之，本研究报道了一种具有强效促血管生成活性的新型查尔酮衍生物，并在两种互补的体内模型中得到了验证。计算分析（分子静电势和前线分子轨道理论）得出的趋势与实验观察到的体内活性一致，其中化合物1c表现出更优异的抗血管生成效果。具体而言，化合物1c的分子静电势表面呈现出最显著的正静电势区域（((V_{s, max }))），表明其与结合界面处亲核残基相互作用的倾向增强。前线分子轨道理论衍生的描述符（((u))）以及电子转移能力（((Delta N))）进一步证实了这一观察结果，表明其电子反应性有所提升。重要的是，体内实验结果证实了化合物1c的生物功效，而计算得出的电子描述符为其活性增强提供了机理解释。因此，我们认为亲电性及相关参数是更广泛的构效关系中的辅助影响因素，而非生物功能的唯一决定因素。相比之下，1f表现出更强的亲核性但整体反应性较低，这与其体内活性中等的结果相符。因此，1c可作为进一步生物评价的有潜力候选物。本研究整合了形态学检测、基因表达谱分析和结构分析，为不断发展的血管生成小分子调节剂领域提供了助力，并为未来开发1c类似物作为血管功能不全候选治疗药物奠定了基础。

材料与方法

新型查尔酮类似物的合成

(^{1} H)（300兆赫兹）和(^{13} C)（75兆赫兹）的核磁共振光谱在瓦里安Mercury-300核磁共振波谱仪（美国加利福尼亚州圣克拉拉市安捷伦公司）上记录。以四甲基硅烷（TMS）为内标，其相对于四甲基硅烷的低场化学位移以δ值（百万分比，ppm）表示，这归因于原子核周围电子环境的变化。质谱在VG Analytical Model 70–250 s质谱仪（美国加利福尼亚州帕洛阿尔托市瓦里安公司）上测定。所有试剂均按商业采购的原样使用。

（e）-1-（3,4-二甲氧基苯基）-3-（3-isopropoxy-4-methoxyphenyl）prop-2-en-one（1a）(^{1} H)NMR((CDCl_{3}))δ7.77（1H， d，(J=15.6 ~Hz)），7.65（1H，dd，.(J=8.4)，2.1 Hz），7.62（1H，dd，(J=8.1)，1.8 Hz），7.43（1H，d，(J=15.6 ~Hz)），7.17（1H，d，(J=1.8 ~Hz)），6.93（1H，d，(J=8.4 ~Hz)），6.91（1H，d，(J=8.4 ~Hz)），4.68（1H，septa，(J=6.0 ~Hz)），3.96（6H，s），3.95（3H，s），3.94（3H，s），1.43（6H，d，(J=6.0 ~Hz)）；(^{13} C)-NMR((CDCl_{3}))：δ188.6,151.6,151.2,150.0,149.2,143.9,131.2,128.0,122.8,122.7,119.7,112.8,111.4,111,110.1,71.

(E)-1-(3,4-二甲氧基苯基)-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)丙-2-烯-1-酮 (1b) (^{1} H) -核磁共振 ((CDCl_{3})) δ 7.75 (1H, 双峰, (J=15.6) 赫兹), 7.68 (1H, 双峰, (J=7.8 ~Hz) ),7.44 (1H, 双峰, (J=15.6 ~Hz) ), 7.26 (1H, 单峰), 7.24 (1H, 双峰, (J=8.4 ~Hz) = 8.4 赫兹), 7.13 (1H, 单峰), 6.97–6.93 (2H, 多重峰), 5.71 (1H, 单峰), 3.99 (3H, 单峰), 3.98 (3H, 单峰), 3.96 (3H, 单峰); (^{13} C) -核磁共振 ((CDCl3)) ): δ 188.6, 153.1, 149.2, 148.7, 145.9, 143.9, 131.5, 128.7, 122.9, 122.7, 119.8, 112.9, 110.7, 110.6, 109.9, 76.7, 56.1, 56.0; 高分辨质谱 计算值 (C_{18} H_{18} O_{5}) : 314.1154。实测值: 314.1160 [26]。

（e）-1-（3,4-二甲氧基苯基）-3-（3-hydroxy-4-methoxyphenyl）prop-2-en-one（1c）(^{1} H)NMR((CDCl_{3}))δ7.75（1H， d，(J=15.5)Hz）、7.69（1H，dd，(J=8.4)，2.0 Hz）、7.64（1H，d，(J=1.96 ~Hz)）、7.44（1H，d，(J=15.5 ~Hz)）、7.32（1H，d，(J=2.1 ~Hz)）、7.15（1H，dd，(J=8.4)2.0 Hz）、6.95（1H，d，(J=8.4 ~Hz)）、6.89（1H，d，(J=8.3 ~Hz)）、5.71（1H，s）、3.99（3H，s）、3.98（3H，s）、3.96（3H，s）；(^{13} C)-NMR((CDCl_{3}))：δ188.6、153.1、149.2、148.7、145.9、143.9、131.5、128.7、122.7、119.8、112.9、110.7、110.6、109.9、76.7、56.1、（e）-1-（3，4-diisopropoxyphenyl）-3-（4-isopropoxy-3-methoxyphenyl）prop-2-en-1-one（1d）(^{1} H)-NMR((CDCl_{3}))δ7.74（1H， d，(J=15.6 ~Hz)）、7.65（1H，d，(J=8.4 ~Hz)）、7.64（1H，s）、7.38（1H，d，(J=15.6 ~Hz)）、7.20（1H，d，(J=8.4 ~Hz)）、7.16（1H，s）、6.95（1H，d，(J=8.4 ~Hz)）、6.90（1H，d，(J=8.4 ~Hz)）、4.62（2H，septa，(J=6.0 ~Hz)）、4.45（1H，septa，(J=6.0 ~Hz)）、3.92（3H，s）、1.40（3H，d，(J=6.0 ~Hz)）、1.39（3H，d，(J=6.0 ~Hz)）、1.36（3H，d，(J=6.0 ~Hz)）；(^{13} C)-NMR((CDCl_{3}))：δ188.9、153.6、150.2、149.7、148.5、144.1、131.6、128.0、123.4、122.7、119.7、118.1、11522.2、22.1、22.0；高分辨质谱计算值（分子式为 (C_{25} H_{32} O_{5})）：412.2250。实测值：412.2252 [27]。

（e）-1-（3,4-二甲氧基苯基）-3-（4-isopropoxy-3-methoxyphenyl）prop-2-en-one（1e）(^{1} H)-NMR((CDCl_{3}))：6 7.76（1H， d，(J=15.6)Hz）、7.68（1H，dd，(J=8.7)1.2 Hz）、7.62（1H，d，(J=1.8 ~Hz)）、7.41（1H，d，(J=15.6 ~Hz)）、7.22（1H，d，(J=8.7 ~Hz)）、6.94（1H，d，(J equiv)8.4 Hz）、6.91（1H，d，(J=8.4 ~Hz)）、4.62（1H，septa，(J=6.0 ~Hz)）、3.97（6H，s）、3.93（3H，s）、1.41（6H，d，(J=6.0 ~Hz)）；(^{13} C)：δ188.7、150.3、149.8、149.2、144.2、131.6、128.0、123.5、122.8、122.7、119.6、114.6、111.1、110.9、109.9、71.3、56.1、22.

（e）-1,3-之二（4-isopropoxy-3-methoxyphenyl）prop-2-en-1-one（1f）(^{1} H)-NMR((CDCl_{3}))δ7.76（1H， d，(J=15.6 ~Hz)）、7.67-7.62（2H，m）、7.41（1H，d，(J=15.6 ~Hz)）、7.22（1H，dd，(J=2.1)，8.1 Hz）、7.17（1H，d，(J=2.1 ~Hz)）、6.94（1H，d，(J=8.1 ~Hz)）、6.91（1H，d，(J=8.1 ~Hz)）、4.64（1H，septa，(J=6.0 ~Hz)）、4.62（1H，septa，(J=6.3 ~Hz)）、3.95（3H，s）、6.93（3H，s）、1.43（6H，d，(J=6.0 ~Hz)）、1.41（6H，d，(J=6.3 ~Hz)）；(^{13} C)：δ188.7、150.3、149.8、149.2、144.2、131.6、128.0、123.5、122.8、122.7、119.6、111.1、110.9、109.9、71.7、71.3

计算细节

采用密度泛函理论（DFT），在 M06-2X/6-311+G(d,p) 理论水平下对查尔酮及查尔酮官能化化合物 1a–f 进行结构优化[29]。对优化后结构进行后续的简谐振动分析，确保结构中仅存在实频，表明该结构为势能面（PES）上的极小点。采用 Grimme 色散校正 D3 系数来考虑长程分子内相互作用[30]。明尼苏达 M06-2X 泛函为全局杂化泛函，含 54% 的哈特里-福克交换能，其在主族元素热化学、动力学及非共价相互作用研究中的应用已有充分文献报道。所有 DFT 计算均通过 Gaussian G16 Rev. C.01 程序包完成[31]。

当发生化学反应时，最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占据分子轨道（LUMO）是起主要作用的电子轨道。HOMO 体现电子给予能力，而 LUMO 则参与电子的接受。因此，探究前线分子轨道（FMO）分析，即 LUMO-HOMO 之间的能隙，是理解分子内电荷转移的重要指标，因为该能隙可用于衡量分子的导电性。能隙较低的分子被视为具有高化学反应性和低动力学稳定性的易极化分子，这类分子通常被称为软分子[32]。而能隙较大的分子则被归为硬分子。根据库普曼定理，最高占据分子轨道能量（((E_{HOMO}))）与电离势（I）相关，最低未占据分子轨道能量（(( E_{LUMO }))）则为电子亲和能（A）[33]。最高占据分子轨道与最低未占据分子轨道之间的能隙（((Delta E_{gap }))）反映了分子体系对氧化还原反应的抵抗能力以及较低的化学反应活性。除了(Delta E_{gap })之外，还通过以下公式计算得到包括化学势（((u))）、化学硬度（((ๆ))）、亲电指数（((a))）、软度（((б))）以及转移电子数（((Delta N))）在内的量子化学描述符[34]：

利用波函数分析表面分析套件（WFA-SAS）对优化结构得到的三维（3D）分子静电表面势（MESP）(V(r)) 数据的实空间可视化，被用于解释和预测分子体系的化学反应性。通过对静电势梯度（((nabla V(r)))）以及临界点（CPs）处的海森矩阵元素进行严格的MESP拓扑映射，实现了定量分析，其中(nabla V(r)=0)。在MESP拓扑结构中，成键区域（即分子间/分子内区域）呈现出（3, −1）键临界点（BCPs）的特征，而高电子密度区域（如孤对和π离域区域）则表现为具有负电势的（3, +3）临界点(V_{min })。对(V_{min })的分析为表征分子体系中的高电子密度区域提供了有力且有价值的描述符，因为它对应于该点波函数的局域化信息，该信息受库仑定律下原子核与电子分布的影响。对(V_{min })的分析成功解释了化学反应性并量化了取代基效应。小分子配体孤对区域的(V_{min })已被用作可靠的电子参数，用于评估对互补受体环境的σ给电子能力。

实验动物

野生型AB品系斑马鱼以及绿色荧光血管转基因鱼Tg(fli1:egfp)按照先前报道的方法进行饲养。鸡胚购自当地农场（台湾宜兰礁溪楚林公司）。所有动物研究及实验流程均经淡江大学生物安全委员会批准（批准号：AZ-BS-111001）。

药物暴露与存活率分析

收集野生型斑马鱼胚胎，每100个胚胎分为一组。每组用六种不同化合物（1a–1f）中的一种处理，浓度分别为1、3、5、10或15毫克/升。“无处理”组在水中培养，“模拟”组在0.1%二甲基亚砜（DMSO）中培养。暴露期为受精后48小时（hpf）至72小时。在72小时时通过计数存活胚胎评估存活率，数据采用Excel软件进行分析。所有实验均实验重复进行三次，结果以平均值±标准差（SD）表示。

碱性磷酸酶染色

按照先前建立的方案，进行碱性磷酸酶染色以可视化血管中的内皮细胞。简要步骤如下：胚胎在受精后72小时用4%多聚甲醛固定，并用含10%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤。使用氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸底物检测碱性磷酸酶活性，并记录血管生长模式。数据采用Excel软件分析，以平均值±标准差表示，实验均进行三次重复。

荧光血管生长模式记录

采用在血管中表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因斑马鱼品系Tg(fli1:egfp)来研究血管生长。将胚胎分为若干组（每组25枚），从受精后12小时至36小时（hpf）分别用0.1%二甲基亚砜（DMSO，对照组）或5毫克/升的1c处理。在受精后36小时，计数心血管静脉丛（CVP）中的毛细血管间隙数量。数据通过Excel软件分析，并以平均值±标准差（SD）形式呈现，所有实验均重复三次。

实时聚合酶链式反应（RT-PCR）

RNA提取、cDNA合成和RT-PCR的操作均按之前报道的方法进行[11]。用于检测β-肌动蛋白（内参）、ft1、cdh5和nrp1a表达的引物序列合成如下：

鸡胚尿囊膜实验

受精后9天（35期HH）的鸡胚用于绒毛尿囊膜（CAM）实验。小心去除蛋壳以暴露绒毛尿囊膜。将圆形滤纸片（半径2.55毫米）浸泡在二甲基亚砜（DMSO，空白对照）或100毫克/升的1c溶液中10分钟，然后放置在膜上。用3M胶带密封鸡胚，并在37℃条件下培养。受精后12天（38期HH），使用iPhone 7拍摄照片。观察每个鸡胚内一个大圆区域内的血管生长模式，并通过AngioTool软件计数分支点数量。

统计分析

所有统计分析均使用 R 软件包 Rcmdr（R 版本 4.3.2）和 Microsoft Excel 完成。采用单因素方差分析（ANOVA）评估各组间的差异处理组。当整体方差分析（ANOVA）结果显著时，采用Tukey-Kramer真实显著差异（HSD）检验进行两两比较。图1和图2结果的生存率分析、方差分析及Tukey-Kramer HSD检验均通过Rcmdr包实现。对于图3、图4和图5中的分支点和成本-数量-利润（CVP）分析，结果以平均值±标准差（mean±SD）呈现，双样本t检验使用Microsoft Excel完成。p值小于0.05被认为具有统计学显著性。对于多重比较，通过Tukey-Kramer校正将家族式错误率控制在0.05。此外，图1、图2、图3、图4和图5中分析的样本量（n）指生物学重复次数，图6中分析的样本量（N）指技术重复次数。