题目：Disruption of PIKFYVE causes congenital cataract in human and zebrafish

原文链接：https://doi.org/10.7554/eLife.71256

期刊：eLife

摘要

先天性白内障是一种主要发生在生命最初十年的眼部疾病，也是导致儿童失明的主要原因之一。然而，先天性白内障发病的分子机制尚未完全明确。本研究通过对一个患有先天性白内障的中国家系进行全外显子组测序，在PIKFYVE基因中发现了一个潜在的病理性变异（p.G1943E），该变异位于PIKFYVE蛋白的PIP激酶结构域。研究证实，在斑马鱼中杂合/纯合破坏PIKFYVE激酶结构域，而非过表达PIKFYVE 1943 E，可模拟人类患者的白内障表型，这表明该病是由单倍剂量不足而非PIKFYVE活性的显性负性抑制所导致。对pikfyve斑马鱼突变体的表型分析显示，Pikfyve的缺失会导致晶状体细胞出现异常空泡化（Rab7+Lc3+双阳性两性小体的积累），而使用V-ATP酶抑制剂巴弗洛霉素A1（Baf-A1）处理可显著缓解这一现象。综上，本研究鉴定出PIKFYVE是先天性白内障的一个新致病基因，并明确了Baf-A1在治疗PIKFYVE缺乏所致先天性白内障中的潜在应用价值。

编辑评估

这篇手稿对眼发育与病理学领域以及眼遗传病学的研究者具有参考价值。研究团队以斑马鱼为模型，在人类磷酸肌醇激酶基因PIKFYVE的激酶结构域中发现了一种新的常染色体显性突变，并评估了该突变对先天性白内障（晶状体混浊）的影响。研究证实，PIKFYVE激酶结构域的杂合或纯合敲除会导致白内障病变，而PIKFYVE G1943E的过表达则不会，这表明其致病机制为单倍剂量不足，而非对PIKFYVE活性的显性负性抑制。作者提供了有力证据，证明PIKFYVE激酶结构域的突变可能引发先天性白内障。总体而言，文中采用的体外与体内遗传学研究方法体系，可推广应用于其他人类遗传性疾病的研究。

引言

先天性白内障是指在出生时或生命最初十年内发生的晶状体部分或完全混浊。它是一种常见的眼部异常，会导致婴儿期视力损害和失明（科哈尔等人，2017年），在全球范围内占儿童失明病例的5%至20%。（Sheeladevi 等人，2016）。根据晶状体混浊的位置和形态，先天性白内障可分为七种临床类型：核性白内障、极性白内障、板层白内障、核合并皮质性白内障、皮质性白内障、缝线状白内障和全白内障（Zhai 等人，2017）。不同类型的白内障会导致患者出现不同程度的视力损伤。多种因素与白内障密切相关，包括影响晶状体代谢的基因变异（Li 等人，2020），其中常染色体显性遗传先天性白内障是最常见的遗传方式（Berry 等人，2020a）。截至目前，先天性白内障的发生已与至少50个参与晶状体结构和发育的基因变异相关（Berry 等人，2020b；Shiels 和 Hejtmancik，2017），这些基因包括晶状体蛋白基因（CRYAA、CRYAB、CRYBB1、CRYBB2、CRYBB3、CRYBA1/A3、CRYBA2、CRYBA4、CRYGC、CRYGD 和 CRYGS）（Bhat，2003；Zhuang 等人，2019）、膜蛋白基因（GJA3、GJA8、MIP 和 LIM2）（Berry 等人，2000；Beyer 等人，2013；Pei 等人，2020）、生长和转录因子基因（PITX3、MAF 和 HSF4）（Anand 等人，2018）、串珠状纤维结构蛋白基因（BFSP1 和 BFSP2）（Song 等人，2009）以及其他基因（CHMP4B 和 EPHA2）（Dave 等人，2016；Shiels 等人，2007）。尽管这些研究成果为我们理解先天性白内障的遗传病因学做出了巨大贡献，但新的致病基因及其潜在的分子机制仍有待进一步探索（Berry 等人，2020a）。

本研究从一个中国白内障家系中，在PIKFYVE（含FYVE型锌指结构的磷酸肌醇激酶）基因的磷脂酰肌醇磷酸激酶（PIPK）结构域中鉴定出一个错义遗传变异（p.G1943E）。人类PIKFYVE基因编码一种含2098个氨基酸的大蛋白，该蛋白包含六个进化保守结构域（Kawasaki等人，2012），分别为锌指磷酸肌醇激酶（FYVE）结构域、丛蛋白同源结构域、β-片翼状螺旋DNA/RNA结合基序、胞质伴侣蛋白CCTγ顶端结构域样基序、血影蛋白重复序列（SPEC）以及C端片段PIPK结构域（Li等人，2005；Shisheva，2008）。N端FYVE结构域可与膜上的PtdIns3P结合，而C端为激酶结构域，具有催化生成PtdIns(3,5)P2的功能（Shisheva等人，1999）。目前尚未有PIKFYVE在晶状体发育中的体内功能及其与先天性白内障关联的相关研究报道。与此前报道的影响伴侣蛋白样结构域、引发斑点状角膜营养不良（CFD）的PIKFYVE变异不同（该病以角膜基质中散布微小白色斑点为特征；Gee等人，2015；Kawasaki等人，2012；Li等人，2005），本研究首次证实PIKFYVE激酶结构域中的p.G1943E变异会导致人类患者患先天性白内障。通过斑马鱼模型实验，我们发现Pikfyve的PIPK结构域破坏会引发早发性白内障缺陷（晶状体中Rab7+Lc3+双阳性自噬体异常聚集），而用V-ATP酶抑制剂巴弗洛霉素A1（Baf-A1）处理PIKFYVE缺陷胚胎，可显著缓解斑马鱼突变体晶状体的空泡化缺陷。

结果

先天性白内障家系及临床特征

我们招募了一个患有先天性白内障的大型朝鲜族家族，该家族共31名成员，跨越四代人，其中12人患病（图1A）。除一名嫁入的汉族成员（III-8）外，其余家族成员均为朝鲜族。该家族中无近亲结婚情况。家系中每一代均出现双侧白内障，患病的父母将疾病遗传给了男性和女性后代，提示其为常染色体显性遗传模式。这些患者未发现其他眼部和全身异常。除两名已故成员外，我们收集了所有患者的临床资料（表1）。10名在世患者中有7人在10岁前被确诊为白内障，最小确诊年龄为2岁。这些患者的最佳矫正视力（BCVA）在20/125至20/20之间。先证者（III-9）自幼双眼表现为核粉状白内障（图1B），伴视力下降（右眼：20/40，左眼：20/66）。先证者的母亲（II-4）同样双眼患有核粉状白内障，而父亲（II-3）双眼无白内障。先证者的儿子（IV-5）患有Y字缝合线白内障。在该家族的其他患病成员中，II-8、III-5、III-6和IV-3表现为双眼核粉状混浊，而III-1及其儿子（IV-1）双眼出现周边皮质点状混浊。该家族所有患者的眼底照相和光学相干断层扫描（OCT）检查均未发现异常。

图1. 白内障家系的系谱结构及眼部表现。(A) 先天性白内障家系的系谱图。方块代表男性，圆圈代表女性；带斜线的符号表示已故个体。实心符号表示患病个体，空心符号表示未患病个体。所有患病家系成员均患有双侧先天性白内障。箭头指示先证者。标有星号（∗）的个体通过全外显子测序进行分析。每个符号下方标注了PIKFYVE变异体（p.G1943E）的基因型（+，野生型等位基因；−，p.G1943E变异等位基因）。(B) 裂隙灯照片显示未患病个体（IV-6）透明的晶状体以及先证者（III-9）左眼的核粉状白内障。

在该白内障家系中PIKFYVE基因致病性遗传变异的鉴定

为了明确该家系中导致先天性白内障的致病变异，我们对四名选定的家系成员进行了全外显子组测序（WES）分析，其中包括三名患病成员（II-1、III-9和IV-5）和一名未患病成员（II-5；图1A）。每个个体共检测到101,852至102,401个序列变异体。在基因组聚合数据库（gnomAD；https://gnomad.broadinstitute.org/）中，这些非同义变异或剪接位点变异的次要等位基因频率均低于1%，且在所有三名患病成员中均存在，而从未受影响的成员中排除的序列被过滤并保留。随后我们聚焦于已知白内障基因中的变异体，但未在该家系中发现任何致病突变。基于致病性的计算机预测进一步筛选，将候选基因缩小至三个（PIKFYVE、NPHS1 和 FPR1；表2）。接着我们通过桑格测序对整个家系中的这些候选变异体进行验证和评估。其中，仅 PIKFYVE 变异体在该家系中与疾病完全共分离（图1A）。如图2A所示，与健康对照相比，白内障患者的 PIKFYVE 基因在第39外显子存在一个 G 到 A 的杂合替换，这导致 PIPK 结构域第1943位高度保守的氨基酸甘氨酸（G）被谷氨酸（E）取代（图2B、C）。为探究 PIKFYVE 在白内障发生发展中的潜在作用，我们首先通过定量逆转录聚合酶链式反应证实了其在人前囊晶状体中的表达（图2-补充图1A、B）。随后为解析 p.G1943E 变异体如何改变 PIKFYVE 的功能，我们对转染 pCS2(+)-CMV-PIKFYVEWT 和 pCS2(+)-CMV-PIKFYVEG1943E 的 HEK293T 细胞在转染后34和44小时进行蛋白质印迹分析，测定 PIKFYVE 和 PIKFYVE 1943 E} 的蛋白稳定性。如图2D所示，PIKFYVE 1943E 的表达水平与 PIKFYVEWT 相当，表明 p.G1943E 变异体对 PIKFYVE 的蛋白稳定性几乎无影响。近期，研究人员通过冷冻电镜解析了 PIKFYVE 的中低分辨率结构（PDB 编号：7K2V）（Lees 等人，2020）。以该结构为模板，我们预测了 p.G1943E 变异体形式的 PIKFYVE PIPK 结构域。如图2E、F所示，p.G1943E 位于连接 PIPK 结构域 N 叶（金色）和 C 叶（青色）的连接环中。该环（红色）充当 N 叶与 C 叶之间的铰链（图2F），并形成高度受限的构象。然而，p.G1943E 变异体向该环引入了一个带负电荷的残基。这一负电荷残基不仅改变了 PIPK 结构域的表面静电势（图2G），还在该环与 N 叶（D1872 和 D1871）之间产生电荷排斥（图2F），从而可能影响 PIKFYVE 的激酶活性。

 表1. 白内障家系中存活患者者的临床特征BCVA：最佳矫正视力。OD：右眼。OS：左眼。OU：双眼。Y：是。N：否。F：女性。M：男性。LP：光感。FC：数指。—：未知。NA：不适用。

表2. 该白内障家系全外显子测序鉴定出的候选变异MAF：次要等位基因频率。gnomAD：基因组聚合数据库。PolyPhen：多态性表型分析。GERP：进化保守性证据。CADD：联合注释依赖损耗评分。

为进一步明确PIKFYVE基因变异与白内障的相关性，本研究对另一个先天性白内障家系、10例散发性先天性白内障病例以及200例年龄相关性或并发性白内障患者进行了筛查。本实验中，从7例年龄相关性或并发性白内障患者中鉴定出6个受累位点。其中，外显子36的c.5399A>C（p.Q1800P）变异和外显子37的c. 5594 C>T p.A1865V变异均位于PIP激酶结构域内（图2-图补充2，图2—图补充2—源数据1）。这些结果进一步提示，PIKFYVE基因的遗传变异可能是白内障发生的致病因素/危险因素。

PIKFYVE 基因 PIPK 结构域的破坏会导致斑马鱼早发性白内障

    生物信息学分析表明，p.G1943E 变异会在环区引入一个带负电荷的残基，这可能会影响 PIKFYVE 的激酶活性。为了直接证明在人类患者中 p.G1943E 变异的杂合性导致的是 PIKFYVE 活性的单倍剂量不足，而非显性负抑制，我们利用 CRISPR/Cas9 定向基因编辑技术构建了 pikfyve 缺陷型斑马鱼突变体（Shankaran 等人，2018）。为了最大程度模拟人类患者中的 p.G1943E 变异，我们在外显子 40 中设计了靶向 C 端 PIPK 结构域的单导向 RNA（sgRNA），并筛选出 pikfyveΔ8 等位基因，该等位基因在 pikfyve 的 cDNA 中存在 8 个碱基对的缺失和 112 个碱基对的插入。如图 3A 所示，pikfyveΔ8 等位基因中的这种插入/缺失突变在插入位点下游立即引入了一个提前终止密码子，从而推测会产生一种截短的Pikfyve蛋白，该蛋白缺乏激酶活性。表型分析显示，pikfyveΔ8纯合突变体在受精后5天（dpf）前发育正常，但随后出现严重的发育缺陷，所有个体均在受精后9天死亡（图3-图补充1A、B）。体视显微镜下观察发现，与野生型同胞（sib）相比，pikfyveΔ8突变体的晶状体在受精后5天时透明度更低（图3B）。为了详细表征该表型，我们在不同阶段使用差示干涉对比（DIC）显微镜追踪了所有基因型晶状体的发育情况。研究结果显示，泡状空泡首先出现在3天龄（dpf）时观察pikfyveΔ8纯合突变体的晶状体发育情况（图3C和D）。值得注意的是，到5天龄时，空泡的数量和大小均急剧增加，几乎占据了突变体的整个晶状体。值得一提的是，与野生型（WT）对照组相比，pikfyveΔ8杂合突变体的晶状体中空泡数量也显著增多（图3C和D），这表明晶状体的正常发育高度依赖Pikfyve的活性，而Pikfyve的杂合性破坏足以引发白内障表型。此外，通过抑制剂YM201636对PIKFYVE活性进行药理学抑制，也会使人晶状体上皮细胞HLEB3出现异常空泡化（图3E和F），这表明PIKFYVE在调控白内障形成中的功能在不同物种间高度保守，我们的斑马鱼白内障模型有望成为进一步开展临床前研究的优质模型系统。

图2.脊椎动物中PIKFYVE同源基因的序列。黑色三角标注1943位保守的甘氨酸。(D) 对PIKFYVE和图2的蛋白质免疫印迹分析。从先天性白内障家系中鉴定出的PIKFYVE变异体。(A) 桑格测序色谱图展示健康对照者和白内障患者的cDNA序列。患者中杂合的c.5828G>A错义变异体由红色箭头标注。(B) 人类PIKFYVE结构域的示意图。PIPK结构域中的p.G1943E变异体由红色箭头标注。(C) 蛋白质序列比对，颜色由红到蓝，下方展示静电势标度。详情参见图2-源数据1。连接子分别以金色、青色和红色显示。p.G1943E变异体的位置用黄色星号标注。(G) PIKFYVE的PIPK结构域野生型(WT)与p.G1943E变异体的表面静电势对比。静电势以热图形式呈现。蛋白质水平通过GAPDH表达进行标准化。实验重复三次。(E) 利用PHYPRE2服务器(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/)构建的PIKFYVE PIPK结构域p.G1943E变异体形式的预测结构模型。N叶、C叶和铰链连接子分别以金色、青色和红色显示。E1943侧链也以棒状模型展示。(F) 展示PIKFYVE PIPK结构域组织的示意图。N叶、C叶和铰链PIKFYVEG1943E在瞬时转染pCS2(+)-CMV-PIKFYVEWT或pCS2(+)-CMV-PIKFYVEG1943E的HEK293T细胞中的表达。分别以金色、青色和红色显示。变异体残基E1943以棒状模型展示并以绿色标注。

本文的在线版本包含图2的以下源数据和图补充资料： 源数据1. 图2D中条带强度的原始数据。 源数据2. 图2D中完整未编辑的印迹原始数据。 图补充资料1. PIKFYVE在人类晶状体囊中的表达。 图补充资料2. 展示PIKFYVE变异体分布的示意图。 图补充资料2—源数据1. 图2—图补充资料2中7名携带PIKFYVE变异体患者临床表现的原始数据。

图3. 斑马鱼中Pikfyve的PIPK结构域破坏导致早发性白内障。(A) 示意图展示构建的pikfyveΔ8突变等位基因。下划线碱基对为sgRNA靶向序列。缺失的碱基对以深蓝色标注，插入的碱基对以红色标注。突变形式中引入的终止密码子显示在灰色框内。(B) 5 dpf时野生型同胞和pikfyveΔ8突变体晶状体的代表性图像。(C) 3 dpf和5 dpf时pikfyve+/+、pikfyve+/Δ8和pikfyveΔ8/Δ8胚胎晶状体的相差干涉（DIC）代表性图像。(B)和(C)中的比例尺为10 μm。(D) 3 dpf（pikfyve*对应n=7；pikfyve对应n=7；pikfyve 和5 dpf（pikfyve*对应n=7)；pikfyve a8对应n=11；pikfyveΔ8/Δ8对应n=6 时pikfyve+/+、pikfyve+/Δ8和pikfyveΔ8/Δ8胚胎晶状体空泡数量的定量分析。(E) HLEB3细胞用DMSO或PIKFYVE抑制剂YM201636处理4小时后的代表性图像。比例尺为25 μm。(F) (E)中空泡数量的定量分析。****，p<0.0001，Student’s t检验。所有实验均重复三次。详细信息参见图3-源数据1。本文在线版本包含图3的以下源数据和图补充材料：源数据1. 图3D和F中定量分析的原始数据。图补充1. pikfyve缺陷型斑马鱼突变体的特征分析。图补充1-源数据1. 图3-图补充1B定量分析的原始数据。图补充2. PIKFYVE 1943E的异位过表达未能在斑马鱼中诱导白内障缺陷。图补充3. PIKFYVE的G1943E变异形式在拯救pikfyve缺陷型斑马鱼突变体的空泡缺陷方面效率较低。图补充3-源数据1. 图3-图补充3B、C定量分析的原始数据。

除了对Pikfyve进行功能丧失研究外，我们还利用泛在表达的泛素（ubi）启动子构建了转基因品系，即Tg(ubi:PIKFYVEWT)和Tg(ubi:PIKFYVE G 1943 E )，分别在斑马鱼中过表达PIKFYVE和PIKFYVE 1943 E（图3-补充图2A）。与预期一致，这两种斑马鱼品系在早期阶段均表现出晶状体正常发育（图3-补充图2B），这表明人类患者患白内障确实是由单倍剂量不足导致的，而非p.G1943E变异对PIKFYVE活性的显性负抑制作用。此外，在pikfyveΔ8;Tg(ubi:PIKFYVEWT)和pikfyveΔ8 Tg(ubi:PIKFYVE 1943 E 斑马鱼中，空泡化表型均得到了部分挽救（图3-补充图3A）。然而，尽管所有pikfyveΔ8;Tg(ubi:PIKFYVEWT)胚胎的空泡数量均减少至15个以下n=6 / 6，仍有约三分之一的pikfyve; Tg(ubi:PIKFYVE G 1943 E突变体保留了15个以上的空泡 n=5/17（图3-补充图3A）。整体原位杂交（WISH）结果显示，Tgubi:PIKFYVE 1943 E 中PIKFYVE的表达量至少与 PIKFYVE 相当，甚至更高（图3-补充图3B）。这些结果表明，PIKFYVE 1943 E 的挽救效果不如PIKFYVEWT。

PikfyveΔ8 突变体白内障表型的详细表征

为明确pikfyveΔ8突变体白内障表型的细节，我们将pikfyveΔ8突变体与报告基因转基因品系Tg(cryaa:DsRed)（Nguyen-Chi等人，2014）进行杂交，该品系中DsRed的表达由晶状体纤维主要组成成分晶体蛋白基因cryaa的启动子调控（Runkle等人，2002）。有趣的是，与野生型同胞晶状体中DsRed信号均匀分布的情况相比，pikfyveΔ8突变体中的空泡几乎占据了晶状体表面，且所有空泡均呈DsRed阴性（图4A），表明这些空泡不含晶状体纤维。同时，苏木精-伊红（HE）染色结合ZL-1抗体和DAPI复染结果显示，尽管Pikfyve的缺失似乎对晶状体的去核过程无明显影响，但pikfyveΔ8突变体中的晶状体纤维排列较野生型同胞更为紊乱（图4B、C）。为进一步高分辨率表征空泡和晶状体结构，我们利用透射电子显微镜（TEM）观察了野生型同胞和pikfyveΔ8突变体晶状体的超微结构。在3天龄（dpf）和5天龄（dpf）的突变体晶状体中可观察到大型空泡，而野生型同胞晶状体中仅见少量微小空泡（图4D）。野生型同胞的晶状体纤维细胞轻度水肿，细胞核呈椭圆形，染色质均匀。晶状体纤维（白色箭头）排列整齐紧密。此外，野生型同胞的线粒体（黑色三角）轻度肿胀，无空泡形成。相比之下，pikfyveΔ8突变体的晶状体纤维细胞明显水肿，细胞核形态不规则，晶状体纤维排列松散且变形，同时出现脂滴。与野生型同胞相比，pikfyveΔ8突变体的线粒体（黑色三角）显著肿胀、体积增大，线粒体嵴减少，且多数线粒体出现异常空泡化。此外，pikfyveΔ8突变体中的自噬溶酶体也出现肿胀和空泡化现象。

图4. pikfyveΔ8突变体白内障表型的详细表征。(A) Tg(cryaa:DsRed)转基因背景下5 dpf野生型同胞和pikfyveΔ8突变体晶状体的共聚焦成像。(B) 5 dpf野生型同胞和pikfyveΔ8突变体斑马鱼晶状体经冷冻切片后的苏木精-伊红（HE）染色。(C) 5 dpf野生型同胞和pikfyveΔ8突变体斑马鱼晶状体的ZL-1抗体和DAPI染色。(D) 3 dpf和5 dpf时野生型同胞和pikfyveΔ8突变体晶状体的透射电子显微镜（TEM）图像。ASS：自噬溶酶体；LD：脂滴；N：细胞核。所有结果均在三个不同个体中得到验证。所有比例尺均代表10微米。

PikfyveΔ8 突变体中的液泡为异噬体

为明确 pikfyveΔ8 突变体晶状体中空泡的性质，我们进行了延时成像以监测其在斑马鱼发育过程中的行为。结果显示，pikfyveΔ8 突变体中的空泡具有高度动态性，且频繁观察到小空泡相互融合形成大空泡（图5A，白色箭头）。这一特征，结合此前关于 PIKFYVE 是内膜稳态关键调控因子的研究结果（长谷川等，2017），促使我们进一步探究 pikfyveΔ8 突变体中的空泡是否实际上为内吞囊泡。为验证这一问题，我们制备了编码 GFP 与内吞囊泡标志物（即小 GTP 酶 Rab5c、Rab7 和 Rab11a）的融合 mRNA（朗格迈尔等，2018），并将其注射到斑马鱼胚胎中，以特异性标记 pikfyveΔ8 突变体中的早期、晚期和循环内体。结果表明，在 pikfyveΔ8 突变体中，几乎所有空泡均呈晚期内体标志物 Rab7-GFP 阳性（图5C，白色箭头）。相比之下，早期内体标志物 Rab5c-GFP 和循环标志物 Rab11a-GFP 并未与空泡共定位（图5B-D）。由于自噬同样与细胞器膜系统密切相关，且已有研究表明其受 PIKFYVE 调控（维奇纳扎等，2015），因此我们进一步检测了自噬体的状态。

图5. 比例尺代表10微米。 pikfyveΔ8突变体液泡的特征分析。(A) 延时成像显示4天份（dpf）pikfyveΔ8突变体晶状体中液泡形成的动态变化。白色箭头指示两个小液泡的融合过程。(B) 代表性图像显示注射gfp-rab5c信使核糖核酸（mRNA）的3.5天份（dpf）野生型同胞和pikfyveΔ8突变体的晶状体。(C) 代表性图像显示注射gfp-rab7信使核糖核酸（mRNA）的3.5天份（dpf）野生型同胞和pikfyveΔ8突变体的晶状体。(D) 代表性图像显示注射gfp-rab11a信使核糖核酸（mRNA）的3.5天份（dpf）野生型同胞和pikfyveΔ8突变体的晶状体。(E) 代表性图像显示注射mcherry-lc3b信使核糖核酸（mRNA）的3.5天份（dpf）野生型同胞和pikfyveΔ8突变体的晶状体。所有实验均重复三次。所有本文的在线版本包含图5的以下图版补充：图补充1：pikfyveΔ8 突变斑马鱼小胶质细胞和晶状体中溶酶体的特征分析通过注射lc3b- mcherry融合mRNA，在pikfyveΔ8突变体中进行了相关实验。如图5所示，pikfyveΔ8突变体中一部分液泡也自噬体标志物Lc3b呈阳性。综合来看，这些数据表明pikfyveΔ8突变体中的液泡是由自噬体与晚期内体融合形成的类自噬内泡体。

巴弗洛霉素A1可部分挽救PikfyveΔ8突变斑马鱼晶状体中的空泡缺陷

BafA1是VATPase的特异性抑制剂。先前的研究表明，BafA1可挽救PIKFYVE缺陷在COS7细胞中诱导的液泡表型（康普顿等人，2016年）。因此我们研究了Baf-A1是否也能减轻pikfyveΔ8突变体斑马鱼晶状体中的空泡形成缺陷。结果发现，经Baf-A1处理的pikfyveΔ8突变体晶状体中的空泡数量显著低于经二甲基亚砜（DMSO）处理的对照组（图6A和B）。为进一步验证Baf-A1可直接缓解白内障缺陷，而非仅延缓该表型，我们对同一批突变体斑马鱼在Baf-A1处理前后的晶状体进行了成像观察。如图6C和D所示，所有突变体胚胎在经DMSO处理或未处理后，空泡数量均略有增加，而所有pikfyveΔ8突变体的空泡数量则显著减少。此外，先前的研究表明，瞬时受体电位粘脂素1（TRPML1）的过表达能够部分挽救PIKfyve缺陷型巨噬细胞中的空泡表型（Krishna等人，2016）。但在本研究体系中，通过mRNA注射异位表达Trpml1无法挽救pikfyveΔ8突变体中的空泡形成表型（图6-图补充1）。因此，V-ATP酶而非Trpml1可能是Pikfyve 缺陷型突变体晶状体中大液泡的形成或维持，而 Baf-A1 对 V-ATPase 的抑制可直接缓解白内障表型。

图6. Baf-A1 部分挽救了 pikfyveΔ8 突变斑马鱼晶状体中的空泡缺陷。(A) 用 DMSO 或 Baf-A1 处理4.5小时的4天龄（dpf）pikfyveΔ8 突变体晶状体的代表性共聚焦图像。(B) 用 DMSO 或 Baf-A1 处理的4天龄（dpf）野生型同胞胚胎和 pikfyve 突变体胚胎晶状体内空泡数量的定量分析（野生型组为 =10；突变体组为 n=7。(C) 未处理或经 DMSO 或 Baf-A1 处理4.5小时的4天龄（dpf）pikfyve 突变体晶状体的共聚焦图像。(D) (C) 中空泡数量的定量分析（每组 n=6，编号 n=6。所有实验均重复三次。所有比例尺均代表20微米。*p<0.05：** p<0.01；*** 0<0.001：**** p<0.0001，Student's t 检验。详细信息参见图6-源数据1。

本文的在线版本包含图6的以下原始数据和图补充材料： 原始数据1：图6B和D中定量分析的原始数据。 图补充材料1：过表达trpml1无法挽救pikfyve Δ8突变体的晶状体缺陷。 图补充材料1—原始数据1：图6—图补充材料1B中定量分析的原始数据。

讨论

  本研究在一个中国朝鲜族家系中鉴定出PIKFYVE基因的一个错义变异（p.G1943E），该变异是导致先天性白内障的原因（图1和图2）。此变异在普通人群中极为罕见。在gnomAD数据库中，仅有4名个体（包括3名东亚人和1名拉丁裔/混血美国人）携带p.G1943E变异，其等位基因频率极低，仅为0.00002（表2）。与既往研究结果一致（Berry等人，2020b），该白内障家系患者的晶状体混浊程度和形态在表型上存在异质性（表1）。该家系中多数患者在儿童期即出现白内障和视力下降，部分病例的确诊时间则较晚。同时，大多数患者表现为核粉状白内障，其余患者则为核Y字缝白内障或周边皮质点状白内障（表1）。临床表现的这种异质性可能归因于晶状体发育过程中遗传因素与环境因素的相互作用（Berry等人，2020b）。

有研究报道PIKFYVE基因的变异与先天性纤维蛋白原缺乏症（CFD）相关（Gee等人，2015；Kawasaki等人，2012；Kotoulas等人，2011；Li等人，2005）。然而，除了两名CFD患者分别在66岁和58岁时出现白内障形成外，这些研究中发现的PIKFYVE基因变异均未导致先天性白内障（Kotoulas等人，2011）。有趣的是，本研究中先天性白内障患者也未出现任何角膜缺陷。值得注意的是，PIKFYVE基因中所有与CFD相关的突变，无论纯合还是杂合，均分布在两个区域（即氨基酸667-843和1490-1538），分别对应胞质伴侣CCTγ顶端结构域样基序和SPEC结构域。相比之下，本研究中鉴定出的p.G1943E变异位于C端PIPK结构域。基于这些发现，我们推测PIKFYVE基因的不同结构域可能通过结合不同的伴侣蛋白发挥不同的功能。这一假设得到了其他证据的进一步支持。首先，预测的蛋白质结构显示，p.G1943E变异并未对PIKFYVE蛋白质结构造成整体破坏，而是通过改变PIPK结构域的表面静电势，在环区与N叶之间产生电荷排斥，仅轻微改变了PIPK结构域的三维构象（图2F和G）。因此，有理由认为PIPK结构域的这一突变可能特异性改变其激酶活性，或改变与其他蛋白的结合界面，同时保持N端胞质伴侣CCTγ顶端结构域样基序和SPEC结构域的功能完整。其次，在我们的pikfyveΔ8斑马鱼突变体中，PikfyveΔ8蛋白的C端PIPK结构域被截短，而N端的胞质伴侣CCTγ顶端结构域样基序和SPEC结构域未受影响。相应地，我们也未在斑马鱼突变体中观察到任何角膜缺陷。

已有研究表明，在COS-7细胞中抑制PIKFYVE可通过促进早期内体和晚期内体的扩大诱导大空泡形成（Ikonomov等人，2006；Rutherford等人，2006）。进一步研究发现，Ca 2+ 释放通道、定位于内溶酶体的粘脂病TRPML1可在PIKFYVE下游发挥作用，触发膜融合/分裂过程（Dong等人，2010）或促进溶酶体/吞噬体成熟（Dayam等人，2015；Kim等人，2014）。有趣的是，尽管TRPML1的过表达可部分缓解PIKFYVE缺陷型巨噬细胞的空泡表型（Krishna等人，2016），但在pikfyveΔ8斑马鱼突变体的晶状体中未观察到这种挽救效应（图6-图补充1），这表明PIKFYVE的作用可能具有情境依赖性。与这一观点一致，我们还发现pikfyveΔ8突变体小胶质细胞（脑内常驻巨噬细胞）和晶状体细胞中的空泡在溶酶体标志物染色下呈现不同的染色模式（图5-图补充1）。另一方面，Baf-A1药物也可抑制PIKFYVE缺陷型COS-7细胞和巨噬细胞的空泡形成（Compton等人，2016；Isobe等人，2019）。本研究中，我们发现Baf-A1可部分挽救pikfyveΔ8斑马鱼突变体晶状体的空泡缺陷（图6A-D）。Baf-A1是一种大环内酯类抗生素，可抑制定位于细胞器膜上的ATP依赖性质子泵V-ATPase。V-ATPase介导的细胞酸化过程可能影响多种基础生物学过程，包括膜运输（尤其是内体成熟以及自噬体与溶酶体的融合；Hammond等人，1998；Yamamoto等人，1998）、蛋白质降解和自噬（Bowman等人，1988；Yamamoto等人，1998；Yoshimori等人，1991）。有趣的是，酵母中的多项研究也发现了V-ATPase的突变，这些突变不影响质子泵功能，但确实会导致液泡融合缺陷（斯特拉瑟等人，2011年）。此外，另一项针对果蝇的研究表明，Baf-A1对囊泡融合的抑制作用不依赖于V-ATP酶，而是取决于Ca 2+)肌质网/内质网Ca 2+-ATP酶（SERCA泵），即Baf-A1的次要靶点（莫韦赞等人，2015年）。因此，Baf-A1的作用靶点及其潜在机制仍需进一步研究。这些机制最终将为该药物在治疗PIKFYVE缺乏症所致先天性白内障中的潜在临床应用提供依据。

材料与方法 

家系与患者

本研究从中国广东省深圳眼科医院眼科门诊招募了一个四代同堂的家系，共包含31名家庭成员（图1A）。所有在世的家庭成员均接受了全面的眼科检查。该家系中有12人被诊断为先天性白内障（图1B，表1），其余19人未患病。先天性白内障的诊断依据为：出生时或生命最初十年内发现晶状体混浊；无其他已知病因（如外伤、医源性因素或炎症性疾病）（Berry等人，2020a）。同时，本研究还招募了另一个先天性白内障家系、10例先天性白内障散发病例以及200例年龄相关性白内障或并发性白内障患者。本研究的伦理方案经深圳眼科医院独立伦理委员会批准，符合《赫尔辛基宣言》（1975年）的原则。在获取人体组织样本前，所有研究参与者均签署了书面知情同意书及出版同意书。研究前，研究人员通过移除姓名、身份证号等可识别个人信息对样本进行去标识化处理。

PIKFYVE 基因变异的鉴定

本研究采用全外显子组测序（WES）和桑格测序技术，在先天性白内障家系中鉴定出p.G1943E遗传变异。简要来说，研究人员从白内障患者的血液或毛发样本中提取了DNA。使用SureSelect人类全外显子组V6捕获试剂盒（美国加利福尼亚州圣克拉拉市安捷伦科技公司）进行外显子组捕获。对一个中国朝鲜族家系的四名选定成员（II-1、II-5、III-9和IV-5）进行了全外显子组测序。样本在HiSeq 4000新一代测序系统（美国加利福尼亚州圣地亚哥市因美纳公司）上进行测序。利用Burrows-Wheeler比对工具（BWA）将测序读段比对到人类参考基因组（hg19）（Li和Durbin，2009）。使用基因组分析工具包（GATK），按照种系DNA中单核苷酸多态性（SNP）和插入缺失（Indel）检测的最佳实践流程进行变异检测（McKenna等人，2010）。利用变异注释工具（ANNOVAR）对变异进行注释（Wang等人，2010），随后依据以下标准进行筛选：外显子区域或剪接位点区域的非同义单核苷酸多态性或插入缺失；基因组聚合数据库（gnomAD）中的新型或低频等位基因frequency <1%；PolyPhen预测结果score >0.2；基因组进化速率谱（GERP）评分score >2.5；以及联合注释依赖损耗评分 CADD) > 10。通过聚合酶链式反应（PCR）和桑格测序验证全外显子组测序检测到的突变，并对家系中其他成员进行突变筛查。PCR和桑格测序所用的引物序列测序所用引物为： 正向引物：5′-TTTTGACCCTTCTCTTGATTAGAGG-3′； 反向引物：5′-AAATATGGCCTAGTAAACCAAAGTTAAA-3′。

针对另一个先天性白内障家系以及10例散发性先天性白内障病例，采用眼科基因组合检测（白内障已知致病基因及PIKFYVE基因检测）；而针对200例年龄相关性白内障或复杂性白内障患者，采用PIKFYVE外显子快速靶向测序，以筛选PIKFYVE基因中其他潜在致病变异体。变异体基于以下标准进行筛选：从耐受到不耐受的排序评分（SIFT）≤0.05；基于神经网络的遗传变异有害性注释评分（DANN）>0.93；score >0.93；变异效应评分工具（VEST）评分范围为0至1，评分越高，突变越可能引起功能改变；ClinPred score >0.5；以及MutationTaster score >0.5

细胞培养

HLEB3细胞（ATCC CRL-11421）购自ATCC。HEK293T细胞来自深圳北大-香港大学医学院联合医学中心的细胞库，该细胞库最初由香港科技大学的同事从ATCC订购。细胞培养按照说明书进行（Andley等人，1994）。通过DAPI染色检测细胞核完整性，以预防支原体污染。

YM201636 处理

将 HLEB3 细胞接种至六孔板中培养4天。随后用工作浓度为800纳摩尔的 YM201636（中国 Selleck 公司）处理细胞4小时，之后进行成像。仅用二甲基亚砜（DMSO）处理的细胞作为对照组。

实时定量聚合酶链式反应

三名白内障患者的晶状体前囊膜均在手术过程中获取。使用 FastPure 细胞/组织总 RNA 提取试剂盒（货号 RC112-01，中国 Vazyme 公司）提取总 RNA，并通过 SuperScript III 第一链合成系统（货号 18080051，美国赛默飞世尔科技公司）进行逆转录。在 CFX96 实时荧光定量 PCR 检测系统中，采用 iTaq 通用 SYBR Green 预混液（货号 1725124，美国伯乐公司）进行实时荧光定量 PCR 检测。

蛋白质检测（蛋白质印迹法）

使用脂质体转染试剂RNAiMAX（货号13778030，赛默飞世尔科技公司，美国）按照制造商的说明书对HEK293T细胞进行转染。细胞转染2微克pCS2(+)-CMV-PIKFYVEWT或pCS2(+)-CMV-PIKFYVEG1943E，分别在34小时和44小时收获细胞用于蛋白质印迹分析。以持家基因GAPDH的表达作为上样对照。使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达，https://imagej.nih.gov/ij 测定条带强度并定量PIKFYVE蛋白的表达水平。本研究使用了抗PIKFYVE单克隆抗体（货号ab137907，英国剑桥Abcam公司）、抗GAPDH单克隆抗体（货号ab9485，Abcam公司）作为一抗，以及山羊抗兔二抗（货号ab205718，Abcam公司）作为二抗。

斑马鱼饲养

斑马鱼按照标准方案进行饲养和维持（Westerfield，1993）。本研究使用了野生型AB品系、pikfyveΔ8突变体以及转基因品系，包括Tg(cryaa:DsRed;il-1b:GFP-F)（Nguyen-Chi 等人，2014）、Tg(ubi:PIKFYVEWT)和Tg(ubi:PIKFYVE G 1943 E。

斑马鱼Pikfyve突变体的构建

研究人员借助在线工具Crisprscan（Vejnar等人，2016年）设计了单导向RNA（sgRNA）。该sgRNA通过MEGAshortscript T7转录试剂盒（货号AM1354，美国安比昂公司，得克萨斯州奥斯汀市）进行体外转录合成，并利用MEGAclear试剂盒（货号AM1908，美国安比昂公司）完成纯化。随后，将sgRNA与Cas9蛋白（嗜热链球菌来源的EnGen Cas9核定位信号蛋白，货号M0646M，美国纽英伦生物实验室，马萨诸塞州伊普斯维奇市）共同注射到单细胞阶段的斑马鱼胚胎中，其中sgRNA的终浓度为100纳克/微升，Cas9蛋白的终浓度为800纳克/微升。研究人员通过T7核酸内切酶1（T7E1）酶切反应和桑格测序筛选出稳定的突变品系。

转基因斑马鱼品系的构建

野生型（WT）和G1943E突变型人PIKFYVE的编码序列被置于泛素启动子（ubi）下游（Mosimann等人，2011），并将其克隆至含有的改造型PBSK载体中Tol2转座子元件的两个臂（川上等人，2000年）。随后将质粒和转座子mRNA显微注射到单细胞阶段的胚胎中。注射后的胚胎培育至成体，通过聚合酶链式反应（PCR）和整体原位杂交（WISH）技术（张和刘，2013年）对F1代胚胎进行种系传递筛选。

组织学

斑马鱼胚胎在5天龄（dpf）时用4%多聚甲醛固定，随后在30%蔗糖中脱水。将完整胚胎包埋在最佳切割温度复合物中，并在-80℃下冷冻。从头部开始，在横向上以10微米的间隔进行冷冻切片。HE染色和抗体染色均按照标准方案进行。本研究使用了ZL-1抗体（ab185979，Abcam公司）。晶状体的透射电子显微镜（TEM）分析由武汉服务博奥科技有限公司完成。

斑马鱼晶状体成像

图像在蔡司LSM980共聚焦激光扫描显微镜（德国卡尔蔡司显微镜公司，纽约）下拍摄。本研究使用63倍物镜（平场复消色差63×/1.40油浸DIC M27）。对于延时成像实验，将4天龄斑马鱼置于含0.02%三卡因的1.0%低熔点琼脂糖中固定。使用蔡司Celldiscoverer 7显微镜（德国卡尔蔡司显微镜公司）直接对晶状体进行成像，采用50倍水浸物镜（平场复消色差50×/1.2），每3分钟拍摄一次图像。图像通过ImageJ软件（美国国立卫生研究院）进行分析。

斑马鱼晶状体中内体与自噬体的检测

将 rab5c、rab7 或 rab11a 的编码序列与 GFP 序列融合，克隆至 pCS2+ 载体中。使用 mMESSAGE mMACHINE SP6 试剂盒（货号 AM1908，Ambion 公司）体外合成 mRNA。向单细胞阶段的斑马鱼胚胎中注射约 1–2 纳升、浓度为 100 纳克/微升的 mRNA。在受精后 3.5 天，将胚胎固定于 1% 低熔点琼脂糖中，在共聚焦显微镜下进行成像观察。

巴弗洛霉素A1处理

将Baf-A1粉末（HY-100558，美国新泽西州MedChemExpress公司）溶解在二甲基亚砜（DMSO）中配制成1毫摩尔/升的储备液，使用前在卵水中稀释至1微摩尔/升。斑马鱼胚胎在28.5摄氏度下用1‰的二甲基亚砜溶液或1微摩尔/升的Baf-A1溶液处理4.5小时，随后用卵水冲洗，再进行共聚焦成像。

统计分析

两组间比较采用双尾Student氏t检验。数据以均值±标准差表示。统计学显著性标注为n.s.、p>0.05、*p<0.05、***p<0.001以及****p<0.0001。