文章信息

期刊：Science Advances（美国科学促进会 AAAS 综合性开源大刊）

标题：Mito-TEMPO improves survival rates in npc1-knockout zebrafish by reducing oxidative stress and enhancing mitophagy via Sod2（Mito-TEMPO 经 Sod2 减轻氧化应激、增强线粒体自噬，提高 npc1 敲除斑马鱼存活率）

影响因子：13.9（2025 年度 JCR）｜ JCR Q1 ｜ 中科院大类综合性期刊 1 区 Top

发表时间：2026 年 8 月 12 日｜ 2026;12(33):eaee0509

DOI：10.1126/sciadv.aee0509

通讯作者：曹宏（中国科学院水生生物研究所，regancao@ihb.ac.cn）

第一作者：赵文豪（中科院水生所 / 国科大，湖南农业大学）

开放获取：CC BY-NC 4.0

导读

C 型尼曼-匹克病（NPC）是一种以 NPC1 基因突变为核心的溶酶体贮积症，患儿多在 20 岁前夭折，目前尚无有效改善生存的治疗手段。本团队此前建立了 faithfully 复现人类 NPC 病理的 npc1 敲除斑马鱼模型，本研究发现模型鱼体内超氧化物歧化酶 Sod2 显著下调，伴随过度氧化应激、线粒体功能障碍和线粒体自噬（mitophagy）受阻。线粒体靶向抗氧化剂 Mito-TEMPO 处理后，NPC1-KO 斑马鱼早期存活率显著提高，肝脏/肠道胆固醇堆积与肝功能损伤明显减轻；其机制可能是 Mito-TEMPO 直接结合并稳定 SOD2，缓解氧化应激、激活 PINK1/Parkin 依赖的线粒体自噬流。SOD2 过表达可模拟、SOD2 敲低则取消 Mito-TEMPO 的疗效——提示 SOD2 是 NPC 病的潜在治疗靶点。

摘要

C 型尼曼-匹克病（NPC）是一种主要由 NPC1 基因突变引起的溶酶体贮积症。大多数患者在生命早期出现肝脾肿大和消化系统损害，随后出现进行性神经退行性变。然而，改善 NPC 病生存的有效治疗方法仍然有限。本研究利用本实验室建立的 npc1 敲除（NPC1-KO）斑马鱼模型，发现 npc1 缺失与超氧化物歧化酶 2（Sod2）表达的显著下调相关，并伴有过度的氧化应激（OS）、线粒体功能障碍和线粒体自噬缺陷。Mito-TEMPO 是一种作用于 SOD 的线粒体靶向抗氧化剂，其治疗提高了 NPC1-KO 斑马鱼的存活率，并改善了早期 NPC1-KO 斑马鱼的胆固醇堆积和肝功能损伤。其潜在机制可能涉及通过增强 SOD2 减轻 OS、促进 PINK1/Parkin 依赖的线粒体自噬流。我们的发现支持 Mito-TEMPO 作为 NPC 病的潜在治疗药物，以及 SOD2 作为 NPC 病的可能治疗靶点。

引言

C 型尼曼-匹克病（NPC）是一种罕见的溶酶体贮积症，由 NPC1（95%）或 NPC2（5%）基因突变引起，扰乱细胞内胆固醇转运。这一缺陷导致未酯化胆固醇和鞘脂在溶酶体区室中进行性堆积。NPC 患者表现出广泛的症状，包括新生儿黄疸、肝脾肿大、共济失调、震颤、癫痫发作和学习困难。婴儿期发病型以严重肝功能障碍（胆汁淤积性黄疸和肝硬化）和消化系统损害为特征，常导致 20 岁前过早死亡。

目前的治疗策略主要以控制症状为主，而非根治。已获批的糖鞘脂合成抑制剂 Zavesca（miglustat）可延缓疾病进展，但对全身性表现效果有限，部分患者还会出现上呼吸道感染、腹泻和体重减轻等不良反应。可螯合胆固醇、有效重分布溶酶体胆固醇的羟丙基-β-环糊精（β-CD）在动物模型中显示出良好疗效，但仍处于早期临床评估阶段。组蛋白去乙酰化酶抑制剂 vorinostat 可逆转 NPC1 相关的小鼠肝功能障碍，却未能改善整体疾病进展或生存。这些发现凸显了对能够改变 NPC 病早期进程的新型治疗手段的迫切需求。

在 NPC1 缺陷细胞中，线粒体胆固醇升高会诱发线粒体功能障碍并破坏电子传递链，促进过量活性氧（ROS）的产生。ROS 升高进一步增强脂质合成并可能触发细胞凋亡。在多种 NPC1 模型中——包括 NPC1 抑制剂 U18666A 处理的大鼠、Npc1 突变或敲除的 BALB/c 小鼠以及 NPC1 患者来源的成纤维细胞——均观察到 ROS 水平升高。超氧化物歧化酶（SOD）家族（SOD1、SOD2、SOD3）通过有效清除 ROS 在氧化应激防御中起关键作用。NPC1 患者 CSF 中已报告 SOD 活性和谷胱甘肽转移酶表达的改变。既往研究显示，低浓度别孕烷酮可降低 NPC1 缺陷成纤维细胞的 ROS 和脂质过氧化；促进 SOD2 表达的抗氧化调节可缓解人间充质干细胞相关椎间盘退变的病理状况。因此，增强 SOD2 表达以抑制 OS 可能是 NPC 病的一种有前景的治疗途径。

除胆固醇堆积造成的溶酶体损伤外，NPC1 缺陷细胞还存在线粒体结构和功能异常，导致自噬（包括线粒体自噬）受损。NPC1 缺陷成纤维细胞、小鼠及其他 NPC1 缺陷神经退行模型中均描述了自噬和线粒体自噬缺陷，自噬体与溶酶体融合障碍导致未降解物质堆积并加剧细胞应激。近期研究显示，雷帕霉素和 Torin 1 等诱导剂可恢复 NPC1 缺陷细胞的自噬流。因此，促进自噬（尤其是线粒体自噬）可能为 NPC 病提供另一条可行的治疗策略。

斑马鱼是研究脊髓小脑性共济失调等罕见病的有效模型，繁殖快、产仔多。鉴于 NPC1 蛋白的高度进化保守性及斑马鱼与哺乳动物同源蛋白的功能相似性，我们团队此前建立了 CRISPR/Cas9 介导的 npc1-KO 斑马鱼模型，该模型忠实复现人类 NPC 病的主要病理特征。在此模型基础上，我们发现可增强 SOD2 表达的线粒体靶向抗氧化剂 Mito-TEMPO 能显著提高 NPC1-KO 斑马鱼的存活率，并减轻其早期肝损伤和肠损伤，治疗机制可能涉及 OS 的减轻和线粒体自噬的激活。

结果

NPC1-KO 斑马鱼中 OS 升高、Sod2 表达降低

我们此前通过删除 npc1 基因 7 个碱基对建立了 NPC1-KO 斑马鱼模型，其忠实复现人类 NPC 病的主要病理特征（图 1A、B）。本研究对 1 月龄（mpf）的 NPC1-KO 与野生型（WT）斑马鱼进行了蛋白质组学分析。结果（图 1C、D）显示，多种线粒体蛋白（Timm9、Cox5Aa、Sdhb、Bpnt1 等）和溶酶体蛋白（Scarb2B 相关蛋白）在 NPC1-KO 斑马鱼中显著下调；OS 相关蛋白（Gpx9、Txnrd3、Aoc2、Pxdn 等）水平升高，自噬功能受阻（Park7、Cisd1、Tomm70a、Anxa6 等相关蛋白）。尤其值得关注的是关键 ROS 调节因子 Sod2 的减少，提示其可作为 NPC 病的治疗靶点。

图 1. 斑马鱼 NPC1-KO 的建立与蛋白质组学结果；Mito-TEMPO 分子对接结果及斑马鱼胚胎毒性测试结果。（A）npc1 基因型对 NPC1-KO 斑马鱼建立效果的鉴定。bp，碱基对。（B）斑马鱼 Npc1 的荧光显微镜观察。比例尺，100 μm。（C）火山图显示 WT 与 NPC1-KO 斑马鱼差异蛋白的聚类。FC，倍数变化。（D）热图显示 WT 与 NPC1-KO 斑马鱼差异蛋白的聚类，n = 3 次独立生物学重复。选取线粒体、溶酶体、自噬、脂质代谢、OS 和凋亡相关蛋白。（E）暴露于 Mito-TEMPO 和 β-CD 的 WT 斑马鱼胚胎发育情况。比例尺，500 μm。h，小时。（F）心跳统计分析评估 Mito-TEMPO 和 β-CD 的毒性，n = 30 次独立生物学重复。（G、H）Mito-TEMPO 与不同物种 SOD2 的分子对接结果。所有数据以均值 ± SEM 表示。超几何检验（D）、双尾 Student's t 检验（F）；n.s.，与对照组无显著差异（F）。

Mito-TEMPO 与 SOD2 的分子对接

Mito-TEMPO 是一种线粒体超氧化物清除剂，已有报道可通过调节 SOD 家族表达降低 ROS 水平。为进一步研究 Mito-TEMPO 与 SOD2 的相互作用，使用 AutoDock Vina 2.1.6 进行分子对接分析。结果显示，Mito-TEMPO 可与斑马鱼 Sod2（UniProt ID: Q6P980）和人 SOD2（PDB ID: 9BWQ）以较强结合亲和力结合（对接分数分别为 −7.2 和 −7.0 kcal/mol），这些相互作用由氢键、范德华力和 π 键介导（图 1G、H）。对接分数低于 −7.0 kcal/mol 通常表示高结合亲和力。这些结果提示 Mito-TEMPO 可能直接与 SOD2 相互作用。基于此，我们选择 Mito-TEMPO 作为 NPC 病的潜在治疗药物。

Mito-TEMPO 提高 NPC1-KO 斑马鱼存活率并降低胆固醇与 ROS 水平

体内实验中选择 β-CD 作为阳性对照药，因其已在临床试验中被证明可缓解 NPC 病的溶酶体胆固醇堆积。首先对斑马鱼胚胎进行了两种药物的急性毒性测试，结果表明 100 μM Mito-TEMPO（Mito 100）和 2.5 mM β-CD 未引起显著的发育或心脏毒性（图 1E、F 及附图 S1）。

随后，我们监测了 npc1 杂合子自交后代给药后的存活情况（图 2A）。每隔一天记录存活数据，死亡后立即进行基因分型。60 天存活分析显示，与 WT 同窝对照相比，NPC1-KO 斑马鱼在出膜后 30 天内存活率明显下降；Mito-TEMPO 或 β-CD 处理均能显著提高 NPC1-KO 斑马鱼存活率，效果相当（图 2B）。

我们进一步检测了肝酶活性与脂质/胆固醇堆积。油红 O 和 Filipin III 染色显示，与 WT 同窝对照相比，NPC1-KO 斑马鱼肝脏和肠道中有明显的脂质和胆固醇堆积（图 2C、D）。与之相符，受精后 10 天（dpf）和 1 mpf 时天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、甘油三酯和胆固醇水平均显著升高（图 2F–I）。相反，Mito 100 和 β-CD 处理均显著降低 AST、ALT、甘油三酯和胆固醇水平，支持两种药物对 NPC1-KO 斑马鱼的良好疗效（图 2C、D、F–I）。

我们还发现，NPC1-KO 斑马鱼整体 ROS 和丙二醛（MDA）水平较 WT 显著升高，而 Mito 100 处理后明显降低（图 2E、J、K）。鉴于 Mito-TEMPO 与斑马鱼 Sod2 之间观察到的强对接亲和力，我们接下来检测了 Sod2 表达。全_mount 免疫荧光和 Western 印迹分析显示，10 dpf 和 1 mpf 的 NPC1-KO 斑马鱼 Sod2 显著减少，而 Mito 100 处理在两个时间点均显著恢复 Sod2 表达（图 3A、C、E）。这些结果表明，Mito 100 通过调节 Sod2 介导的 OS 稳态在 NPC1-KO 斑马鱼中发挥抗氧化作用。

图 2. Mito-TEMPO 对 NPC1-KO 斑马鱼的治疗效果。（A）斑马鱼 Mito-TEMPO 给药流程图。（B）斑马鱼存活率统计分析。生命周期从出生记录至 60 天，包括 WT 组（n = 50）、NPC1-KO 组（n = 43）、β-CD 组（n = 41）和 Mito 100 组（n = 42）。（C）斑马鱼油红 O 染色，显示脂滴主要堆积于 NPC1-KO 斑马鱼的腹腔、肝脏和肠道。比例尺，150 和 500 μm。（D）斑马鱼胆固醇 Filipin III 染色，显示胆固醇主要堆积于 NPC1-KO 斑马鱼的腹腔和头部。比例尺，150 和 500 μm。（E）斑马鱼 ROS 染色，摄于肝脏附近腹腔。比例尺，25 μm。（F–K）试剂盒检测的 AST、ALT、甘油三酯、TC、ROS 和 MDA 水平统计结果，n = 4 次独立生物学重复。数据以均值 ± 95% 置信区间（B）或均值 ± SEM（F–K）表示。Gehan-Breslow-Wilcoxon 检验（B）与双尾 Student's t 检验（F–K）；n.s. 无显著差异；*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001，与 NPC1-KO 组比较。

Mito-TEMPO 促进 NPC1-KO 斑马鱼的线粒体自噬

线粒体自噬是自噬的一种选择性形式，在维持线粒体稳态中发挥关键作用。既往研究报告 NPC1 缺陷成纤维细胞自噬显著减少，但线粒体自噬在 NPC1 缺陷中的作用仍不清楚。透射电子显微镜显示，禁食 24 小时后，WT 同窝对照细胞中可见被双层膜囊泡包裹的正常与受损线粒体；相比之下，10 dpf 和 1 mpf 的 NPC1-KO 斑马鱼表现出线粒体肿胀和大量脂滴，提示线粒体损伤和线粒体自噬丢失。与 NPC1-KO 斑马鱼相比，Mito 100 处理逆转了这些改变（图 3D）。

接下来我们检测了代表性线粒体自噬相关蛋白——Lc3 和 Park2（编码 Parkin）——的表达。免疫荧光染色和 Western 印迹分析显示，10 dpf 和 1 mpf 的 NPC1-KO 斑马鱼 Lc3b 表达和 Lc3b 荧光斑点显著增加，而 Park2 表达显著降低。Mito 100 处理在两个时间点均有效降低 Lc3b 表达并恢复 Park2 水平（图 3B、C、F、G），提示 Mito-TEMPO 增强了 NPC1-KO 斑马鱼的线粒体自噬能力。

图 3. Mito-TEMPO 对 NPC1-KO 斑马鱼 Sod2 蛋白与线粒体自噬的影响。（A）斑马鱼 Sod2 表达的荧光显微镜观察。比例尺，150 和 500 μm。（B）共聚焦显微镜观察斑马鱼细胞（肝脏附近腹腔）Park2 与 Lc3b。比例尺，5 μm。（C）斑马鱼 Sod2、Lc3、Park2 蛋白的免疫印迹分析。（D）斑马鱼肠道附近细胞的透射电镜观察。标注 1：正常线粒体；标注 2：线粒体自噬过程；标注 3：脂滴；标注 4：肿胀线粒体。所捕获的线粒体自噬过程主要代表溶酶体与线粒体囊泡融合或线粒体囊泡包裹溶酶体的阶段。比例尺，1 和 0.5 μm。（E–G）斑马鱼 Sod2、Lc3、Park2 蛋白的免疫印迹定量结果，n = 3 次独立生物学重复。所有数据以均值 ± SEM 表示。双尾 Student's t 检验；n.s. 无显著差异；*P < 0.05；**P < 0.01，与 NPC1-KO 组比较。

Mito-TEMPO 对 U18666A 诱导的 HepG2 细胞的作用

U18666A 是一种 NPC1 蛋白抑制剂，被广泛用于诱导内体/溶酶体胆固醇堆积、模拟 NPC 病。我们用 U18666A 处理 HepG2 细胞建立了体外 NPC1 缺陷模型（NPC1 模型）（图 4A）。在功能实验之前，细胞毒性实验确认实验期间 Mito-TEMPO 在不超过 100 μM 浓度下对 HepG2 细胞无显著毒性（图 4B）。

为验证模型建立成功，我们检测了 U18666A（3 μg/ml）处理 24 小时后的胆固醇堆积与凋亡。Filipin III 染色和胆固醇检测显示模型组胆固醇大量堆积（图 4C、F）；JC-1 染色显示绿色荧光增强、红色荧光减弱，提示线粒体去极化（图 4E、H）；流式细胞术分析显示晚期凋亡细胞比例增加（图 5A、B），提示线粒体和细胞损伤。随后 Mito-TEMPO 处理以剂量依赖方式（12.5、25、50 μM）显著降低细胞内胆固醇水平、线粒体损伤（图 4C、E、F、H）和凋亡（图 5A、B），提示 Mito-TEMPO 在 NPC1 体外模型中发挥与体内相似的治疗作用。

图 4. Mito-TEMPO 对模型细胞胆固醇、ROS 与线粒体膜电位的影响。（A）Mito-TEMPO 处理 HepG2 细胞的流程图。加入 U18666A（3 μg/ml）24 小时构建体外 NPC 病模型。（B）Mito-TEMPO 给药细胞毒性测试结果。DMSO（2.5%）作为毒性阳性对照，n = 6 次独立生物学重复。（C）HepG2 细胞胆固醇 Filipin III 染色结果。比例尺，150 μm。（D）HepG2 细胞 ROS 染色结果。比例尺，150 μm。（E）HepG2 细胞线粒体膜电位 JC-1 染色结果。绿色面板为 JC-1 单体（JC-1-M），红色面板为 JC-1 聚集体（JC-1-A），n = 6 次独立生物学重复，比例尺 150 μm。（F）胆固醇试剂盒检测的 HepG2 细胞胆固醇与胆固醇酯统计结果，n = 4 次独立生物学重复。（G）ROS 试剂盒检测的 ROS 统计结果，n = 5 次独立生物学重复。（H）JC-1 试剂盒检测的 JC-1 平均荧光强度（MFI）统计结果，n = 4 次独立生物学重复。所有数据以均值 ± SEM 表示。双尾 Student's t 检验（B、F、G、H）；n.s. 无显著差异；*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001，与模型组比较。

Mito-TEMPO 减轻模型细胞 OS 并增加 SOD2 表达

SOD2 被特异性诱导以清除过量的线粒体超氧化物并减轻蛋白氧化。我们首先检测了 U18666A 诱导的 HepG2 细胞中 ROS 和 MitoSOX 水平。结果显示，与对照组相比，模型组 ROS 和 MitoSOX 水平显著升高，而 Mito-TEMPO 处理以剂量依赖方式（12.5、25、50 μM）有效降低 ROS 和 MitoSOX 的积累（图 4D、G 及附图 S1A、B）。与此一致，模型组 SOD2 表达显著降低，而 Mito-TEMPO 给药以剂量依赖方式恢复 SOD2 表达（图 5C、D）。这些发现提示 Mito-TEMPO 可能通过增强 SOD2 表达减轻 OS。

图 5. 流式细胞术分析 Mito-TEMPO 对 HepG2 细胞凋亡与 SOD2 蛋白的影响。（A）Annexin V/PI 染色检测 HepG2 细胞凋亡的流式散点图。[Annexin V]+[PI]+ 为晚期凋亡，[Annexin V]+[PI]− 为早期凋亡。（B）HepG2 细胞凋亡统计分析，n = 3 次独立生物学重复。（C）流式直方图显示 HepG2 细胞 SOD2 表达。每次检测设置不含抗体但含 FITC 染料的空白组。（D）HepG2 细胞 SOD2 表达统计结果，n = 3 次独立生物学重复。所有数据以均值 ± SEM 表示。双尾 Student's t 检验（B、D）；n.s. 无显著差异；*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001，与模型组比较。

Mito-TEMPO 通过增强 SOD2 对 U18666A 诱导的 HepG2 发挥治疗作用

为进一步探索 Mito-TEMPO 在体外 NPC1 模型中的疗效是否由 SOD2 表达增加介导，我们构建了 SOD2 敲低质粒（pLKO.1-SOD2 shRNA）和 SOD2 过表达质粒（pcDNA3.1-mCherry-SOD2 OE）（附图 S2A）。转染后，SOD2 shRNA 组 SOD2 表达明显降低，SOD2 OE 组显著升高（附图 S2B、C）。在此基础上给药（附图 S2D），通过胆固醇、ROS 和 JC-1-M 水平评估疗效。与此前发现一致，模型组胆固醇、ROS 和 JC-1-M 比值较对照组明显升高；相比之下，SOD2 OE 和 Mito 50 处理均显著降低这些指标，表明 SOD2 OE 模拟了体外 NPC1 模型中的疗效。然而，与 Mito 50 组相比，Mito 50 + SOD2 shRNA 组的胆固醇含量、ROS 水平和 JC-1-M 比值明显更高，提示 Mito-TEMPO 的原有疗效被 SOD2 shRNA 抑制（附图 S2E–J）。这些结果共同表明，Mito-TEMPO 通过增强 SOD2 表达对 U18666A 诱导的 HepG2 细胞发挥潜在治疗作用。

Mito-TEMPO 促进模型细胞的线粒体自噬流

我们使用共聚焦显微镜直接可视化了体外线粒体自噬流。首先检测 LC3B 总体表达，免疫荧光和流式分析显示模型组 LC3B 荧光斑点和表达水平显著增加，提示线粒体自噬过程可能受损；Mito-TEMPO 处理在测试浓度下降低了 LC3B 水平（图 6A 及图 7A、G）。

随后，使用 pmCherry-GFP-LC3B 串联荧光报告系统监测线粒体自噬流。融合蛋白的绿色荧光对溶酶体酸性环境高度敏感，在自噬溶酶体中迅速淬灭，仅剩红色荧光可被检测。Leica LAS X 系统的荧光分析显示，与对照组相比，模型组自噬溶酶体显著减少、自噬体显著增加，提示线粒体自噬流受阻；而 Mito-TEMPO 处理（12.5、25、50 μM）以剂量依赖方式有效逆转这一效应（图 6B、E），表明 Mito-TEMPO 可促进线粒体自噬流。

为进一步验证这一发现，我们使用 pmCherry-GFP-FIS1101–152 串联报告系统定位线粒体自噬事件。该报告系统将 mCherry-GFP 融合到线粒体外膜蛋白 FIS1 上。稳态下线粒体同时呈现红色和绿色荧光；当线粒体自噬激活时，线粒体被运送到溶酶体，GFP 信号被淬灭而 mCherry 荧光保持稳定，形成仅 mCherry 的荧光斑点（图 6D）。结果显示，与对照组相比，模型组中仅 mCherry 的斑点几乎缺失，而 Mito-TEMPO 在测试剂量下显著增加其数量（图 6C、F）。综上，这些发现表明 Mito-TEMPO 增强体外 NPC1 模型的线粒体自噬流。

图 6. Mito-TEMPO 对 HepG2 细胞线粒体自噬流的影响。（A）HepG2 细胞 LC3B 共聚焦荧光图像。比例尺，5 μm。（B）转染 pmCherry-GFP-LC3B 串联报告系统的 HepG2 细胞共聚焦荧光图像。比例尺，5 μm。（C）转染 pmCherry-GFP-FIS1101–152 串联报告系统的 HepG2 细胞共聚焦荧光图像。比例尺，5 μm。（D）pmCherry-GFP-FIS1101–152 串联报告系统分析原理示意图。（E）GFP 与 mCherry 双阳性囊泡（自噬体）和仅 mCherry 阳性囊泡（自噬溶酶体）的定量。每次实验 8 个细胞，n = 3 次独立生物学重复。（F）mCherry 斑点阳性囊泡（线粒体溶酶体）定量。每次实验 6 个细胞，n = 3 次独立生物学重复。所有数据以均值 ± SEM 表示。双尾 Student's t 检验（E、F）；n.s. 无显著差异；*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001，与模型组比较。

Mito-TEMPO 通过上调 SOD2 调节 PINK1/Parkin 介导的线粒体自噬

既往研究已证明 PINK1/Parkin 通路在线粒体自噬启动中起关键作用。因此，我们检测了 Mito-TEMPO 对 NPC1 体外模型中该通路的影响。流式细胞术显示，与对照组相比，模型组 PINK1 和 PARK2 表达降低、SQSTM1/p62 水平升高，而 Mito-TEMPO 处理（12.5、25、50 μM）提高 PINK1 和 PARK2 并降低 SQSTM1/p62 表达（图 7B、E、F、H、K、L）。我们还评估了与线粒体自噬密切相关的线粒体膜蛋白 TOMM20（外膜）和 COX-IV（内膜）。与对照组相比，两者在模型组中均显著上调，而 Mito-TEMPO 以剂量依赖方式使其下调（图 7C、D、I、J）。综上，这些结果表明 Mito-TEMPO 与 PINK1/Parkin 介导通路相关的线粒体自噬增强有关。

基于 SOD2 OE 和 SOD2 shRNA 质粒构建，我们还检测了 LC3B、PINK1 和 PARK2 表达，以进一步验证"Mito-TEMPO 促进 PINK1/Parkin 介导的线粒体自噬可能与 SOD2 增强相关"这一假说。与此前发现一致，模型组 LC3B 表达显著升高、PINK1 和 PARK2 表达降低；SOD2 OE 和 Mito 50 处理均显著降低 LC3B 表达并提高 PINK1、PARK2 表达。然而，与 Mito 50 组相比，Mito 50 + SOD2 shRNA 组 LC3B 表达明显更高、PINK1 和 PARK2 表达更低，表明 Mito-TEMPO 诱导的线粒体自噬增强被取消（附图 S3A–F）。综上，所有这些结果表明 Mito-TEMPO 通过上调 SOD2 表达增强 PINK1/Parkin 介导的线粒体自噬，这可能是其对 U18666A 诱导的 HepG2 细胞疗效的部分机制。

图 7. 流式细胞术分析 Mito-TEMPO 对 HepG2 细胞线粒体自噬通路蛋白的影响。（A–F）流式直方图显示 HepG2 细胞 LC3B、p62、TOMM20、COX-IV、PINK1 和 PARK2 的表达。每次检测设置不含抗体但含 FITC 染料的空白组。（G–L）HepG2 细胞 LC3B、SQSTM1/p62、TOMM20、COX-IV、PINK1 和 PARK2 表达的统计结果，n = 3 次独立生物学重复。所有数据以均值 ± SEM 表示。双尾 Student's t 检验（G–L）；n.s. 无显著差异；*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001，与模型组比较。

讨论

斑马鱼拥有位于 2 号染色体的单拷贝 npc1 基因（NCBI Gene ID: 553330），其氨基酸序列与人 NPC1 直系同源蛋白具有 60% 的一致性和 66% 的相似性，是 NPC 病研究的理想模式生物。在既往工作中，我们采用靶向 NPC1 外显子 2 的 CRISPR/Cas9 基因编辑建立了 NPC1-KO 斑马鱼模型。突变位点位于腔内 A 区富半胱氨酸环（氨基酸残基位置 C27），对应保守的 NPC1 特异性富半胱氨酸结构域。NPC1-KO 斑马鱼表现出类似人类 NPC 病的表型，并呈现肝病或其他消化道损伤的早期典型特征，包括黄疸、肝脾肿大、消瘦和腹腔脂质堆积。大多数 NPC1-KO 斑马鱼在 1 个月内死亡，与携带 p.C31Wfs*26 突变的患者（通常在婴儿早期夭折）的临床观察相平行。因此，改善早期生存是关键的治疗目标。由于 NPC 病罕见及哺乳动物模型的局限，β-CD 等有效的早期治疗仍处于 I 期和 II 期临床试验。基于我们已建立的 NPC1-KO 斑马鱼模型，本研究旨在探索能够增强 NPC 病早期生存的替代疗法。

NPC1 功能缺失导致脂质（包括胆固醇和鞘脂）在晚期内体/溶酶体区室堆积。异常的胆固醇储存破坏溶酶体功能并影响内质网、高尔基体和线粒体等细胞器，导致 OS 和自噬流受损。OS 导致过量的脂质和胆固醇合成（脂质过氧化）及自噬失调。此外，异常自噬诱导内质网应激、触发未折叠蛋白反应，并阻碍通过线粒体自噬、内质网自噬和过氧化物酶体自噬等过程降解受损细胞器，导致 NPC1 病中的淀粉样物质堆积和细胞损伤。与之相符，我们的 NPC1-KO 斑马鱼表现出 OS 升高、自噬流受阻和寿命缩短。越来越多证据表明，肝细胞通过大脂噬或微脂噬降解脂滴，从而缓解肝脂肪变性。因此，诱导自噬可能是 NPC 病的合理治疗途径。然而，多项研究提示单独激活自噬无法挽救 NPC1 缺陷细胞的胆固醇堆积，线粒体自噬受损与胆固醇堆积似乎是 NPC 病中两条平行的病理机制；将自噬激活剂与降胆固醇药物联合可能协同恢复细胞稳态。此外，β-CD 穿线聚轮烷已被证明可同时降低 NPC1 成纤维细胞的胆固醇堆积并增强自噬。综合这些发现和我们的斑马鱼结果，有效的 NPC 治疗可能需要同时降低 OS 和恢复自噬的多靶点药物。

SOD 家族在 OS 调节中发挥重要作用。本研究对 NPC1-KO 斑马鱼的蛋白质组学分析发现 SOD2 表达显著降低，而 SOD1 和 SOD3 保持不变。SOD2 表达降低可导致过量 ROS 积累。在 NPC1I1061T 细胞中也报告了类似的下降，N-乙酰半胱氨酸或组蛋白去乙酰化酶抑制剂通过上调 SOD2 并阻止凋亡缓解了 OS。锌离子也被证明通过 FOXO3a-SOD2 通路激活小胶质细胞线粒体自噬、促进脊髓损伤后的代谢与能量恢复。然而，此前尚无体内研究考察 SOD2 增强能否直接改善 NPC 病。我们发现，通过 SOD 促进作用发挥效应的线粒体抗氧化剂 Mito-TEMPO 可作为潜在的治疗候选药物。Mito-TEMPO 在神经退行性疾病和代谢紊乱模型中已显示出显著疗效：50–100 μM Mito-TEMPO 通过提高 SOD 活性改善阿尔茨海默病模型的神经元存活；70 μM Mito-TEMPO 通过线粒体 ROS–自噬–溶酶体通路对胰腺 β 细胞铁死亡有治疗作用。但 Mito-TEMPO 对 NPC 病的疗效此前未在体外或体内模型中报道。基于既往报道的有效剂量及我们的斑马鱼发育毒性和细胞毒性检测，本研究选择 100 μM 作为斑马鱼体内模型的治疗浓度、12.5/25/50 μM 作为体外细胞培养模型的浓度梯度。Mito-TEMPO 处理显著改善 NPC1-KO 斑马鱼早期存活、降低肝脏胆固醇和脂质堆积并减轻肝功能损伤，效果与 β-CD 相当。此外，Mito-TEMPO 降低了 NPC1 模型中的 OS 并恢复失调的自噬水平。

蛋白质组学和超微结构分析还揭示了 NPC1-KO 斑马鱼线粒体结构损伤以及 PINK1 和 Parkin（关键线粒体自噬相关蛋白）的下调，提示线粒体自噬受抑。线粒体自噬可通过 Parkin 依赖或非依赖机制进行，其中 PINK1/Parkin 通路研究最为充分。在该通路中，PINK1 积累招募并激活 Parkin，启动线粒体自噬以维持细胞稳态。既往研究显示镉诱导 PINK1/Parkin 介导的线粒体自噬以保护皮层神经元免于凋亡，牛磺酸激活同一通路以减轻 OS 和缓解椎间盘退变。然而，很少有研究将线粒体自噬调控与 NPC1 病理联系起来。我们的结果表明，Mito-TEMPO 恢复线粒体完整性、增强线粒体自噬流并上调 PINK1/Parkin 信号，与其在 NPC 病中的疗效涉及 Parkin 依赖线粒体自噬的增强和凋亡的减轻这一观点一致。

一般而言，Mito-TEMPO 是一种特别靶向 SOD2 的线粒体靶向 SOD 类似物，这可能是其能逆转 NPC 病诱导的 SOD2 下调与降解的基础。然而，我们的初步分子对接分析显示，尽管两个物种的 SOD2 直系同源蛋白存在轻微结构差异，Mito-TEMPO 与斑马鱼和人 SOD2 均具有强结合亲和力。这些发现与"Mito-TEMPO 可能通过与 SOD2 相互作用稳定蛋白，从而促成 SOD2 表达和活性的上调"的可能性一致。值得注意的是，在 NPC1 模型中敲低 SOD2 部分削弱了疗效（包括胆固醇和 ROS 水平降低以及线粒体膜电位改善），并降低了 Mito-TEMPO 触发的 PINK1/Parkin 信号，表明在缺乏足够 SOD2 结合伴侣时其疗效被部分抑制。与此一致，我们的数据表明 Mito-TEMPO 通过缓解 OS 和增强 SOD2 恢复自噬流，从而降低 NPC1 模型中的胆固醇堆积。我们观察到 SOD2 OE 同样改善体外 NPC1 模型的胆固醇稳态，这支持了体内 SOD2 靶向治疗 NPC 病的潜在可行性。

本研究仍存在若干局限。首先，NPC1-KO 位点点突变的随机性以及现有基因工程技术的限制，使我们无法可靠地建立能准确复现 NPC1-KO 斑马鱼特定功能缺失突变的稳定 NPC1-KO 细胞系。因此，我们使用晚期内体运输的有效抑制剂 U18666A 建立体外 NPC1 功能障碍模型来研究疾病机制。此外，NPC 病还以共济失调、肌肉震颤等神经退行性症状为特征，但本研究主要聚焦于改善生存和胆固醇稳态的治疗干预，而非神经系统病理，因为神经退行性症状通常晚于脂质堆积出现。相应地，我们选择了在脂质代谢中起核心作用的肝脏和肠道组织作为主要靶器官。最后，尽管 Mito-TEMPO 通过与 SOD2 对接显示出活性并在 NPC1 模型中显示出潜在疗效，它也可能通过其他分子通路或靶点发挥作用。同样，增强 SOD2 表达缓解了体外 NPC1 模型的胆固醇堆积，但本研究无法确团单独直接靶向 SOD2 是否能在体内产生相同效果。未来研究将聚焦于阐明精确的分子机制（Parkin 或 PINK1 敲除模型）并评估 NPC 病模型的神经系统发育（脊髓和脑），以进一步明确 Mito-TEMPO 的治疗潜力。此外，我们还将评估 Mito-TEMPO 与其他有前景的化合物（如 β-CD）联合治疗的优点，以及体内 SOD2 靶向干预对 NPC 病的治疗价值。

总之，利用 NPC1-KO 斑马鱼模型，我们的发现支持 Mito-TEMPO 有效改善存活率、降低胆固醇堆积并恢复 NPC1-KO 斑马鱼的肝功能。其机制可能与通过增强 Sod2 活性抑制 OS 并促进 Parkin 依赖的线粒体自噬相一致（图 8）。这些发现为 NPC 病的潜在治疗策略提供了有价值的见解，尤其是对在早期发育阶段表现出的高侵袭性基因型。

图 8. Mito-TEMPO 对早期 NPC1-KO 斑马鱼的治疗效果。NPC1-KO 斑马鱼中观察到 Sod2 水平降低和线粒体自噬异常。Mito-TEMPO 有效促进 Sod2 表达、缓解 OS 并增强线粒体自噬，从而减轻 NPC1 相关症状并改善早期存活率。

方法概要

分子对接：Mito-TEMPO 结构取自 PubChem 数据库，SOD2 蛋白结构取自 PDB 或 UniProt 数据库。去除水分子、添加极性氢、划定网格盒后，使用 AutoDock Vina 2.1.6 进行 50 次迭代的对接模拟，选取结合能最低且出现频率最高的构象作为最终输出，并用 PyMOL 3.1 和 Discovery Studio 2019 可视化。

实验动物：斑马鱼（Tübingen 品系）来自国家斑马鱼资源中心（武汉）。成鱼在 28°C、14 小时光照/10 小时黑暗循环的循环水系统中饲养；幼鱼 5 dpf 前在 90 mm 培养皿中培育，5–14 dpf 每天投喂蛋黄悬液和草履虫两次，≥14 dpf 投喂卤虫。所有动物程序经中科院水生所实验动物伦理委员会批准（IHB/LL/2024077）。

NPC1-KO 斑马鱼制备与给药：通过杂合子 npc1 携带者互交获得 NPC1-KO 斑马鱼，PCR 基因分型。药物实验将后代分为 WT 组、未处理 NPC1-KO 组和药物处理组；从出膜开始隔日浸泡给药 24 小时（QOD）持续至少 60 天，浓度为 100 μM Mito-TEMPO 或 1 mM β-CD。10 dpf 和 1 mpf 采样。发育毒性实验按 OECD 236 指南在 6 孔板中进行（每孔 10 枚 WT 胚胎，12–96 hpf 暴露于 2.5 mM β-CD 或 Mito-TEMPO 12.5/25/50/100 μM），48 和 96 hpf 在倒置显微镜下计数 30 秒心跳。

细胞实验：HepG2 细胞（ATCC HB-8065）培养于含 10% FBS 的 DMEM（10% CO₂、37°C）。用 EndoFectin HepG2 试剂转染质粒；pmCherry-GFP-LC3B 与 pmCherry-GFP-FIS1101–152 质粒由武汉大学周荣实验室惠赠。细胞以 3 μM U18666A 预处理 24 小时诱导 NPC1 模型，随后以 PBS 或 Mito-TEMPO（12.5、25、50、100 μM）处理；为诱导线粒体自噬设置 2 小时饥饿期。细胞活力用 CCK-8 试剂盒检测；线粒体膜电位用 JC-1 试剂盒检测；凋亡用 Annexin V/PI 试剂盒经流式细胞术（CytoFLEX S）检测；LC3B、SQSTM1/p62、PINK1、PARK2、TOMM20、COX-IV、SOD2 的胞内染色后经流式定量。

染色与生化检测：细胞 ROS 用 DCFH-DA 探针、斑马鱼 ROS 用 DHE 染色；MDA、甘油三酯、胆固醇用商品化试剂盒定量；细胞胆固醇外流用 Amplex Red 胆固醇检测试剂盒（有/无胆固醇酯酶区分 TC 与 FC）；油红 O 与 Filipin III 染色观察脂质与胆固醇堆积；AST、ALT 用试剂盒经酶标仪（560/590 nm）检测。

透射电镜：组织以电镜固定液 4°C 固定，切成 1 mm³ 小块，1% 锇酸后固定 2 小时，梯度丙酮脱水、环氧树脂 Epon 812 包埋聚合，超薄切片（60–80 nm）经柠檬酸铅和醋酸铀染色后用日立 HT7800 透射电镜观察成像。

免疫印迹与免疫荧光：组织以 RIPA 裂解、BCA 定量，SDS-PAGE 电泳转 PVDF 膜，一抗 SOD2（1:200）、LC3（1:200）、PARK2（1:200）、β-actin（1:1000）4°C 孵育过夜，ECL 显影，ImageJ 做灰度分析。斑马鱼组织切片经柠檬酸缓冲液抗原修复、H₂O₂ 封闭、Triton X-100 通透后与一抗（1:25）4°C 孵育过夜，Cy3/FITC 荧光二抗室温孵育 1 小时，DAPI 复染后用 Leica TCS SP8 共聚焦显微镜成像。

蛋白质组学：收集 1 mpf WT 与 NPC1-KO 斑马鱼（每组 3 个生物学重复），液氮研磨、8 M 尿素裂解，DTT 还原、碘代乙酰胺烷基化，胰蛋白酶酶解过夜，C18 柱脱盐。Vanquish Neo UHPLC 分离，Orbitrap Astral 高分辨质谱 DIA 模式采集（299 个扫描窗口、隔离宽度 2 Th、HCD 碰撞能量 25%）。DIA-NN（v1.8.1）library-free 模式处理原始数据，蛋白和前体离子 FDR 控制在 1% 以下。

统计分析：所有定量数据用 GraphPad Prism 10 分析，两组间比较用 Student's t 检验或 Gehan-Breslow-Wilcoxon 检验，结果以均值 ± SEM 表示；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，n.s. 表示 P ≥ 0.05。

补充材料（补充方法、表 S1、附图 S1–S3）与参考文献（75 条）详见原文：10.1126/sciadv.aee0509。蛋白质组学数据已存储于 DRYAD（doi:10.5061/dryad.j9kd51csp）。

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