文章信息

期刊：Kidney International（《国际肾脏》，国际肾脏病学会 ISN 官方期刊，Elsevier 出版）

最新影响因子：21.8（2025 年度 JCR）｜JCR 分区：Q1（泌尿学与肾脏学）

中科院分区（2025）：大类·医学 1 区（Top 期刊）；小类·泌尿学与肾脏学 1 区

发表信息：Kidney Int (2020) 97:1150–1163｜收稿 2019-02-09，接收 2019-11-01，在线发表 2019-12-28

DOI：10.1016/j.kint.2019.11.016

通讯作者：Olivier Devuyst（瑞士苏黎世大学生理学研究所）

开放获取：CC BY-NC-ND 4.0

导读

肾脏近端小管负责重吸收原尿中的低分子量（LMW）蛋白，其功能障碍（如 Fanconi 综合征、药物肾毒性）目前缺少高通量检测手段。苏黎世大学团队构建了转基因报告鱼 Tg(lfabp::½vdbp-mCherry)：肝脏持续生产 50 kDa 红色荧光"假想 LMW 蛋白"，经血流→肾小球滤过→近端小管重吸收→溶酶体降解。近端小管一旦"罢工"，荧光蛋白就会漏进尿液——收集鱼缸水做 ELISA 即可定量"鱼蛋白尿"。lrp2a/megalin 敲除、clcn7 敲除、顺铂与庆大霉素肾毒性模型均获验证，为药物筛选与肾毒性评估提供了全新平台。

摘要

肾脏近端小管（PT）上皮细胞通过受体介导的内吞与溶酶体加工，重吸收并代谢大部分滤过的低分子量（LMW）蛋白。近端小管的先天性与获得性功能障碍，总是表现为尿液中包括 LMW 蛋白在内的溶质异常丢失。斑马鱼前肾与人类肾单位共享若干功能节段，包括近端小管依赖 lrp2a/megalin 的内吞转运过程。虽然斑马鱼已被用作毒理学研究和药物发现的模式生物，但目前尚无可对幼体或成体近端小管功能进行大规模评估的检测方法。

本研究建立了转基因 Tg(lfabp::½vdbp-mCherry) 斑马鱼品系：在肝脏表达维生素 D 结合蛋白 N 端区与酸不敏感的红色单体荧光蛋白 mCherry 的融合蛋白（½vdbp-mCherry）。这一低分子量蛋白构件被分泌入血、经肾小球滤过、由受体介导的内吞重吸收，并在近端小管细胞的溶酶体中被加工处理。利用 lrp2a 或 clcn7 敲除幼鱼、以及暴露于已知肾毒素（庆大霉素与顺铂）的幼鱼开展的原理验证研究表明，该转基因品系可用于监测低分子量蛋白尿和溶酶体加工过程，是药物筛选与肾毒性研究的一个强大新模式生物。

转化意义（Translational Statement）：一系列先天或获得性疾病可引起近端小管功能障碍，表现为尿液中包括低分子量蛋白在内的溶质异常丢失。斑马鱼前肾与人类肾单位共享功能节段，已被用作毒理学与药物发现模型。本研究建立的转基因斑马鱼表达 50 kDa 红色荧光报告蛋白（½vdbp-mCherry），可在幼体或成体阶段对近端小管功能进行大规模评估。原理验证研究表明，该品系可用于监测低分子量蛋白尿与溶酶体加工，是药物筛选与肾毒性研究的强大新模型。

引言

肾脏近端小管（PT）通过特化的转运系统对大量滤过溶质进行重吸收与加工，在机体稳态中发挥关键作用。生理条件下，PT 上皮细胞通过顶端受体介导的内吞和溶酶体加工，重吸收滤过的低分子量蛋白（LMW，分子量最高达白蛋白的约 69 kDa），包括激素、维生素及其结合蛋白、酶、免疫球蛋白轻链，以及药物和毒素。这一通路在 PT 细胞中尤为发达，保证生理状态下人的尿液中几乎不含超滤的血浆蛋白【1】。累及 PT 细胞内溶酶体系统的先天或获得性疾病会导致 LMW 蛋白与溶质在尿中异常丢失，最终可发展为肾 Fanconi 综合征，引起肾衰竭、生长迟缓、佝偻病和肾结石等严重临床表现【2,3】。检测特异性 LMW 蛋白尿是遗传性与中毒性 PT 功能障碍最恒定、最敏感的指标【4,5】。

肾单位节段模式的高度保守性使斑马鱼成为肾脏疾病研究与药物发现的重要模式生物【6,7】。斑马鱼前肾近曲小管与人类肾单位尤为相似【8】：其近曲小管细胞具有重吸收上皮的典型特征（刷状缘、基底侧膜内褶、丰富的线粒体网络、紧密连接），表达内吞受体 megalin 与 cubilin，并具备 lrp2a/megalin 依赖的内吞转运活性【9】。针对内体-溶酶体通路的药物毒性模型或遗传疾病模型（如 Donnai-Barrow 综合征【11】、Lowe 综合征【12,13】、胱氨酸贮积症【14,15】）也支持用斑马鱼前肾研究 PT 细胞的内溶酶体系统。

总体而言，斑马鱼化学物质毒性评估依赖对幼体体貌（体型、形态）及内部器官形态的目视检查【16,17】，而 PT 功能评估则依赖注射 LMW 荧光示踪剂后的摄取显像【9,12】。这些方法或间接、或受技术限制（注射、成像）、难以定量，且可能受酸性内溶酶体囊泡内荧光淬灭的影响。注射法费力，无法对幼体或成体 PT 功能障碍进行大规模评估；而鱼尿中生物标志物的检测也很困难——标志物在水池中被稀释【18】，内源性 LMW 蛋白的滤过/加工过程亦未被表征。作者假设：表达一种可被 PT 内吞并加工的荧光 LMW 蛋白的转基因报告鱼品系，可以克服这些困难。维生素 D 结合蛋白（VDBP）由肝细胞分泌入血、经肾小球滤过、由 PT 细胞经 megalin 介导的内吞完全重吸收【19】；尿 VDBP 升高已被用于检测多种累及肾 PT 的急慢性疾病【20–24】。基于斑马鱼基因编辑与 PT 研究工具的可及性，研究者构建并表征了用于分析先天性与获得性 PT 疾病中 LMW 蛋白尿的转基因 vdbp 报告鱼品系，并结合遗传模型与已知毒素暴露，为其在大规模 PT 功能筛选中的价值提供了原理验证证据。

结果

1｜斑马鱼模型内溶酶体通路的评估

为探究斑马鱼 PT 的内溶酶体通路，研究者用 TALEN 技术构建了 lrp2a（编码 megalin）和 clcn7（编码溶酶体氯通道 ClC-7）的突变敲除品系，分别获得 lrp2adel8/del8 和 clcn7del4/del4（靶外显子小缺失导致提前终止密码子与截短蛋白，补充图 S1、S2）。纯合突变鱼出生时呈正常孟德尔比例，幼体期无发育缺陷、生育力正常、无可见异常——唯一例外是 lrp2a 纯合成鱼眼球增大（补充图 S1）。

体内内吞实验：向 56 hpf、前肾小管发绿色荧光的 Tg(cdh17::GFP) 幼鱼尾静脉注射 18.4 kDa 的 β-乳球蛋白-Cy5（标记受体介导内吞）和 10 kDa 的葡聚糖-Alexa Fluor 647（标记液相内吞）。注射 20 分钟内，lrp2a+/+ 幼鱼前肾 PT 细胞即摄取 β-乳球蛋白-Cy5，而 lrp2adel8/del8 幼鱼几乎无荧光信号（11.3±0.4 vs 0.3±0.1，P<0.001；图 1a）；10 kDa 葡聚糖的摄取在 60 分钟时同样显著缺陷（3.9±0.4 vs 0.5±0.1，P<0.001；图 1b）。透射电镜显示 lrp2a 缺陷幼鱼 PT 细胞内吞囊泡数量显著减少（40.5±4.6 vs 19.6±3.4，P<0.001；图 1c）；内体报告系 Tg(PiT1::GFP-rab5aa) 显示突变幼鱼 PT 细胞顶侧的 GFP 富集消失（18.6±3.7 vs 9.6±1.0，P<0.05；图 1d）。

溶酶体加工：在 4 dpf 的 clcn7+/+ 与 clcn7del4/del4 Tg(cdh17::GFP) 幼鱼中行体内脉冲-追踪实验。注射后 20 分钟至 1 小时，两种基因型的 β-乳球蛋白-Cy5 信号均位于 PT 细胞亚顶端极（图 1e 左、中）；注射后 4 小时，clcn7del4/del4 幼鱼 PT 细胞内积累大量荧光配体，而 clcn7+/+ 幼鱼中已完全降解（39±7 vs 876±100，P<0.01；图 1e 右）。相应地，电镜下 clcn7 缺陷幼鱼 PT 细胞出现增大的电子致密囊泡（图 1f）。这些结果表明，内溶酶体通路上遗传缺陷导致的内吞（lrp2a）或内化配体溶酶体加工（clcn7）特异性障碍，及其相应的超微结构改变，均可在幼鱼前肾 PT 细胞中检测到。

图 1　斑马鱼模型内溶酶体通路的评估。（a）表达 cdh17::GFP（绿色，前肾小管标记）的 lrp2a+/+ 与 lrp2adel8/del8 胚胎于 56 hpf 注射 β-乳球蛋白-Cy5，20 分钟后光片荧光显微镜成像：突变体前肾小管内吞缺陷及 Cy5 荧光定量（n=6 vs n=11；标尺 40 μm）。（b）注射 10 kDa Alexa Fluor 647-葡聚糖 60 分钟后成像：突变体液相内吞缺陷（n=11 vs n=9；标尺 40 μm）。（c）4 dpf PT 透射电镜：lrp2a 突变体内吞囊泡丢失及定量（黄色方框为高倍放大图；n=6 vs n=7；标尺 1 μm）。（d）表达 PiT1::GFP-rab5aa（绿色，内体标记）的 lrp2a 突变体 4 dpf PT 整体成像：PT 细胞顶侧 GFP 荧光富集丢失（n=10 vs n=12；标尺 40 μm）。（e）4 dpf 注射 β-乳球蛋白-Cy5 的 clcn7+/+ 与 clcn7del4/del4 幼鱼：注射后 20 分钟、1 小时、4 小时成像，突变体 PT 中内吞配体积累及定量（早期 n=10 vs n=7，晚期 n=6 vs n=5；标尺 40 μm）。（f）透射电镜显示 clcn7 突变体 PT 中大电子致密囊泡积累（白色星号）及囊泡直径定量（n=6 vs n=5；标尺 5 μm）。数据为均值±SEM，非参数 Mann-Whitney 检验；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。BB 刷状缘，N 细胞核，NS 无显著性。

2｜转基因 Tg(lfabp::½vdbp-mCherry) 品系的构建与表征

注射荧光 LMW 示踪剂费力且难以实现高通量检测。人 VDBP 与斑马鱼 vdbp 均含 2 个同源的 ALBUMIN 结构域 I 和 II（参与维生素 D 甾体结合；补充图 S3）。为构建新型、基因编码的内吞 LMW 报告蛋白（图 2a），研究者克隆了含斑马鱼 vdbp 蛋白完整 ALBUMIN 结构域 I 的 N 端 207 氨基酸区（"½vdbp"），并与酸不敏感荧光团 mCherry 的开放阅读框融合（图 2b；补充图 S4）。由于 fabp10a 基因启动子（编码肝型脂肪酸结合蛋白 10a，lfabp）足以驱动斑马鱼肝脏表达【26】，研究者克隆了 lfabp 启动子 3.1 kb 的 5′ 侧翼序列，在肝中驱动 ½vdbp-mCherry 表达（图 2b）。

在稳定转基因 Tg(lfabp::½vdbp-mCherry) 幼鱼中，½vdbp-mCherry 的表达经逆转录 PCR（图 2c）、western blot（图 2d）和 ELISA（图 2e）在幼鱼裂解液及分离的肝、肾组织中得到证实。活体显微镜显示 ½vdbp-mCherry 信号出现于肝脏（图 2f、g）、血管（尤其尾静脉，图 2f），以及 wt1b::GFP 转基因鱼中与肾小球相连的 PT（图 2h）。在前肾 PT 细胞内，摄取的 ½vdbp-mCherry 与溶酶体标记 ctns-EGFP 共定位——冰冻切片共聚焦分析予以确认（图 2i）。这些数据表明，Tg(lfabp::½vdbp-mCherry) 幼鱼肝脏产生的 ½vdbp-mCherry 与内源性 LMW 蛋白一样被滤过、重吸收并在 PT 细胞中加工。重组 6His 标签 ½vdbp-mCherry 的清除实验显示，注射后 30 分钟约 70% 示踪剂从血液中清除，重吸收的荧光配体在注射后 120 分钟于 PT 细胞中完全降解（补充图 S5）。值得注意的是，内源性 ½vdbp-mCherry 的重吸收模式（图 2g）与外源示踪剂 β-乳球蛋白-Cy5（图 1e）不同：在双转基因 Tg(lfabp::½vdbp-mCherry/cdh17::GFP) 幼鱼中注射 β-乳球蛋白-Cy5 证实，内源性 ½vdbp-mCherry 主要被 PT 近段摄取，而注射的 β-乳球蛋白-Cy5 被 PT 远段重吸收（补充图 S6）。

图 2　转基因 Tg(lfabp::½vdbp-mCherry) 斑马鱼报告系的构建与表征。（a）正常条件下 ½vdbp-mCherry（约 50 kDa）的命运模型：①肝中产生→②分泌入血→③肾小球滤过→④经受体介导内吞被近端小管（PT）细胞重吸收→⑤在内溶酶体中加工。E 内体；LE 晚期内体；L 溶酶体。（b）lfabp::½vdbp-mCherry 载体构建：斑马鱼 vdbp 肽 N 端 207 氨基酸融合 mCherry，由肝特异性 lfabp 启动子驱动；Tol2-L/R 为转座子左右臂。（c）野生型（WT）与转基因（TG）成鱼肝中内源性 vdbp 与转基因 ½vdbp-mCherry 的转录水平（RT-PCR；上带为内源性 vdbp，下带为 ½vdbp-mCherry）。（d）WT 与 TG 成鱼肝 mCherry 蛋白 western blot。（e）ELISA 定量：幼鱼裂解液、幼鱼尿液及肝、肾裂解液中 ½vdbp-mCherry（LD 检测下限）。（f）4 dpf 转基因幼鱼活体成像：mCherry 荧光（红）见于肝（L）、血管和 PT；卵黄囊（YS）红色为自发荧光；白色方框为高倍图；箭头示眼（E）、PT、L、SB 鳔、CV 尾静脉；标尺 500 μm。（g）lfabp::½vdbp-mCherry（红）与 cdh17::GFP（绿）共表达幼鱼 5 dpf 光片成像：mCherry 信号定位于 L 和 PT（标尺 50 μm）。（h）lfabp::½vdbp-mCherry（红）与 wt1b::GFP（绿，肾小球 G 与 PT 标记）共表达幼鱼 5 dpf 成像：½vdbp-mCherry 被连接肾小球的 PT 摄取（标尺 40 μm）。（i）固定幼鱼冰冻切片：½vdbp-mCherry 与 PiT1::ctns-EGFP（绿，溶酶体标记）在 PT 细胞共定位及荧光强度定量（白线为定量区域，黄色示共定位；标尺 10 μm）。

3｜近端小管功能障碍导致转基因报告鱼出现低分子量蛋白尿

接下来用遗传与毒性模型验证"尿中 ½vdbp-mCherry 排泄"可作为该转基因幼鱼系统 PT 功能障碍的指标（图 3a）。megalin（lrp2a）缺陷的 Tg(lfabp::½vdbp-mCherry) 幼鱼成像显示，lrp2adel8/del8 前肾中 ½vdbp-mCherry 信号较 lrp2a+/+ 显著降低（12.1±2.1 vs 3.4±0.6，P<0.001；图 3b），证实 PT 内吞缺陷；伴随 ELISA 测得尿中 ½vdbp-mCherry 升高 20 倍（2.5±0.3 vs 62.1±11.8 pg/ml，P<0.001；图 3c）。

斑马鱼幼鱼此前已被用于研究顺铂和庆大霉素的肾毒性——二者以剂量依赖方式诱导急性肾损伤【10】。用 1.5 mM 顺铂处理 Tg(lfabp::½vdbp-mCherry) 幼鱼：如预期，顺铂暴露导致 26.0% 幼鱼鳔发育缺陷（未处理对照 6.9%；图 3d）。暴露 3 天后，顺铂处理幼鱼 PT 细胞 mCherry 荧光信号显著下降（8.6±0.9 vs 5.4±0.5，P<0.01；图 3e），尿中 ½vdbp-mCherry 升高约 20 倍（2.6±0.3 vs 50.7±11.9 pg/ml，P<0.001；图 3f）。由于顺铂已知引起线粒体功能障碍【27】，整体线粒体呼吸分析显示顺铂组幼鱼氧消耗速率显著下降（数据未展示）；超微结构研究显示顺铂处理幼鱼 PT 细胞刷状缘部分丢失、线粒体基质丢失与线粒体肿胀（图 3g），与既往报道一致【28,29】。

氨基糖苷类抗生素（如庆大霉素）经 megalin 内化进入 PT 细胞，引起 PT 功能障碍与结构损伤【30,31】；大鼠模型中牛磺酸可预防庆大霉素引起的急性小管损伤【32】。将 Tg(lfabp::½vdbp-mCherry) 幼鱼暴露于庆大霉素，或按 1:4 摩尔比共注射牛磺酸：注射庆大霉素的幼鱼在注射后 2 天出现轻度（40%）与重度（19%）水肿伴体弯曲，而庆大霉素+牛磺酸组分别为 22% 和 11%（图 3h）。注射后 2 天收集的尿液分析显示，庆大霉素组尿 ½vdbp-mCherry 显著升高（480±258 vs 载体 2.7±0.4 pg/ml，P<0.001）；共注射牛磺酸显著减轻尿 ½vdbp-mCherry 排泄（105.7±71.7 pg/ml，P<0.05 vs 庆大霉素；图 3i）。超微结构分析显示庆大霉素处理幼鱼 PT 细胞中脂滴积累，牛磺酸共注射亦部分挽救（脂滴数：载体 0、庆大霉素 9.4±1.9、庆大霉素+牛磺酸 5.2±1.4，P<0.001；图 3j）。Western blot 显示，lrp2a 敲除或顺铂、庆大霉素处理均不影响 ½vdbp-mCherry 的产生水平（补充图 S7）。综上，遗传与毒性 PT 功能障碍模型均伴随转基因幼鱼尿中 ½vdbp-mCherry 显著丢失，可通过 ELISA 监测；尿 ½vdbp-mCherry 水平反映小管损伤的严重程度及保护策略的效果。

图 3　受体介导内吞衰竭导致尿中 ½vdbp-mCherry 排泄。（a）内吞缺陷条件下 ½vdbp-mCherry 命运模型：不被 PT 细胞重吸收，最终排泄入尿。（b）4 dpf 双转基因幼鱼活体光片成像：lrp2a 突变体 ½vdbp-mCherry 内吞缺陷及 PT 荧光定量（n=16 vs n=10；标尺 40 μm；L 肝）。（c）ELISA 定量尿中 ½vdbp-mCherry：lrp2a 突变体尿液中内吞配体丢失（n=12 vs n=14；LD 检测下限）。（d）2 dpf 胚胎经 1.5 mM 顺铂处理 4 小时后形态及 4 dpf 鳔发育缺陷半定量评分（3 次独立实验；标尺 1 mm）。（e）顺铂暴露的双转基因幼鱼 5 dpf 活体成像：½vdbp-mCherry 内吞缺陷及 mCherry 荧光定量（n=32 vs n=47；标尺 40 μm）。（f）ELISA：顺铂处理转基因幼鱼尿液中配体丢失（n=14 vs n=31）。（g）透射电镜：顺铂处理幼鱼 PT 细胞刷状缘（BB）丢失与线粒体肿胀（箭头示无 BB 的上皮细胞，星号示线粒体肿胀；n=7 vs n=9；标尺左 5 μm、右 2 μm）。（h）2 dpf 转基因胚胎静脉注射 6 mg/ml 庆大霉素、或庆大霉素+6.3 mg/ml 牛磺酸、或 0.9% NaCl 载体后的形态及 4 dpf 表型半定量评分（n=53 vs n=46；标尺 1 mm）。（i）ELISA：载体、庆大霉素、庆大霉素+牛磺酸各组尿 ½vdbp-mCherry（n=9/15/16）。（j）透射电镜：各组幼鱼 PT 中脂滴及定量（n=5/8/9；标尺 5 μm）。柱状图为均值±SEM；Mann-Whitney 检验（b–g、j 左）；单因素 ANOVA+Kruskal-Wallis（h–j）；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

4｜溶酶体贮积病的转基因斑马鱼报告模型

LMW 蛋白被 PT 细胞受体介导内吞后，依次经早期与晚期内体，最终到达溶酶体，在酸性环境中被酶解。由于 mCherry 在酸性环境中仍保持荧光，½vdbp-mCherry 有望用于监测 PT 细胞的溶酶体功能障碍（图 4a）。鉴于 clcn7del4/del4 幼鱼是溶酶体贮积病模型（见上文图 1e–g），研究者首先分析了 clcn7 转基因 Tg(lfabp::½vdbp-mCherry) 幼鱼中 ½vdbp-mCherry 的加工：与 clcn7+/+ 相比，clcn7del4/del4 纯合突变幼鱼 PT 细胞中 mCherry 积累，荧光强度显著升高（22±4.0 vs 75.9±6.1，P<0.001）且 mCherry 阳性囊泡增大（10.8±1.3 vs 29.5±2.0 μm²，P<0.001；图 4b）。在纯合突变幼鱼中重新引入斑马鱼 clcn7 mRNA 可部分挽救荧光强度（47.2±4.0，P<0.01）与囊泡大小（19.2±2.5 μm²，P<0.05），证明肾脏表型特异地与 clcn7 基因缺失相关。clcn7del4/del4 幼鱼 PT 细胞晚期内体/溶酶体中荧光配体的积累，经关联光学-电子显微镜（CLEM）确认：½vdbp-mCherry 阳性的内溶酶体区室与 clcn7 突变体中的电子致密囊泡重叠（图 4c）。随后，将 Tg(lfabp::½vdbp-mCherry) 幼鱼暴露于质子泵抑制剂巴弗洛霉素 A1（BfnA1，损害溶酶体酸化）：BfnA1（20 nM，16 小时）处理后，PT 细胞荧光强度（18.0±3.1 vs 36.9±2.9，P<0.01）与总荧光面积（158±21 vs 333±37 μm²，P<0.01）均显著升高（图 4d）。Western blot 显示 clcn7 敲除或 BfnA1 处理均不影响 ½vdbp-mCherry 产生水平（补充图 S7D、E）。这些结果表明，Tg(lfabp::½vdbp-mCherry) 幼鱼系统同样可用于监测先天性（clcn7 敲除）或获得性（BfnA1）溶酶体功能障碍时 PT 细胞中 ½vdbp-mCherry 的积累。

图 4　溶酶体功能障碍导致 ½vdbp-mCherry 加工缺陷。（a）遗传性（clcn7 敲除）或药理性（BfnA1 处理）溶酶体功能障碍时 ½vdbp-mCherry 命运模型。（b）5 dpf 转基因 clcn7+/+ 与 clcn7del4/del4 幼鱼（或注射野生型 clcn7 mRNA 的 clcn7del4/del4）多光子显微镜成像：突变体 PT 中 ½vdbp-mCherry 积累，重新引入 clcn7 mRNA 可部分挽救（mCherry 荧光强度与囊泡大小定量；每组 n=8；标尺 30 μm/10 μm）。（c）5 dpf clcn7del4/del4 幼鱼 PT 的关联光学-电子显微镜（CLEM）：超薄切片先经宽场荧光显微镜成像并用超分辨径向涨落分析（ImageJ）处理，再行低电压扫描电镜超微结构分析；细胞核以 DAPI（蓝）复染（标尺 2 μm）。（d）lfabp::½vdbp-mCherry 幼鱼经 BfnA1（20 nM，16 小时）处理后 5 dpf 成像：BfnA1 处理鱼中 ½vdbp-mCherry 积累（荧光强度与总 mCherry 阳性面积定量；每组 n=11；标尺 30 μm/10 μm）。数据为均值±SEM；单因素 ANOVA+Bonferroni（b）；Mann-Whitney（d）；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。ADP 二磷酸腺苷；ATP 三磷酸腺苷；DMSO 二甲基亚砜；EM 电镜；IF 免疫荧光；F 用于 IF/EM 图像对齐的定位微珠；L 溶酶体；LE 晚期内体；N 细胞核。

讨论

为拓展斑马鱼作为肾脏疾病模式生物的用途，本研究建立了在肝脏表达低分子量 ½vdbp-mCherry 蛋白的转基因 Tg(lfabp::½vdbp-mCherry) 斑马鱼品系。与 GFP 标记的全长 vdbp 不同，内源性表达的 ½vdbp-mCherry 被分泌入血、经肾小球滤过、经受体介导内吞被 PT 细胞重吸收，并在内溶酶体中加工。由于荧光团 mCherry 对 pH 不敏感，可用于追踪酸性内溶酶体区室中的荧光配体。遗传（lrp2a 与 clcn7 敲除）与药理（庆大霉素与顺铂暴露）模型的研究表明，该转基因品系可用于监测 PT 细胞的 LMW 蛋白尿与溶酶体加工，是药物筛选与肾毒性研究的强大新工具。

研究者首先表征了内吞受体 megalin（lrp2a）与溶酶体氯通道 ClC-7（clcn7）斑马鱼敲除品系的肾脏表型。两个敲除品系前肾的形态与功能异常与敲除小鼠相似，支持其用于内溶酶体通路分析。lrp2a 缺陷转基因幼鱼成像显示 PT 对 ½vdbp-mCherry 的摄取大幅下降、导致其经尿排泄——这与 megalin 敲除小鼠【33】及 Donnai-Barrow 综合征患者【34】中的缺陷相似。lrp2adel8/del8 突变体中受体介导内吞与液相内吞均受损：既往研究已表明，当受体介导内吞被首先破坏时，液相内吞经典标志物葡聚糖的重吸收也会受损【9,11】——这可能由于 lrp2a 缺陷幼鱼形成的内吞囊泡减少，大部分葡聚糖正是经此类囊泡重吸收（不结合 megalin 受体而停留于管腔液中）。值得注意的是，lrp2adel8/del8 突变体出现眼球增大，与 N-乙基-N-亚硝脲诱导的 lrp2a 突变品系 bugeye 相同【35】。lrp2a 敲除斑马鱼幼体期无发育缺陷、成体死亡率不升高；而 megalin 缺陷新生小鼠死于围产期呼吸并发症（肺膨胀与肺泡扩张受损）【36】——斑马鱼以鳃呼吸、无肺，故不受 megalin 缺陷相关呼吸异常影响。

Cl⁻/H⁺ 反向转运体 ClC-7 是溶酶体中主要的氯离子通透通路，对溶酶体降解活性至关重要【37】；ClC-7 缺陷在小鼠和人中导致溶酶体贮积病、骨硬化症、神经退行性变和视网膜变性【38–40】。Clcn7 缺陷小鼠呈严重畸形与生长迟缓，通常在 7 周前死亡【39】；而 clcn7 敲除斑马鱼存活不受影响。clcn7 敲除斑马鱼无骨表型，可能是骨形成-吸收的物种差异和/或 ClC-7 在肾外组织作用不同所致。例如，小鼠中 ClC-7 需其 β 亚基 Ostm1 支持溶酶体功能与骨吸收【41】，两蛋白的稳定性均依赖与伙伴的共表达【42】。虽然斑马鱼 ClC-7 蛋白序列与小鼠相似度较高（76% 一致），但斑马鱼 Ostm1 与小鼠 Ostm1 仅有 33% 一致——蛋白序列差异可能导致功能差异及 ClC-7 缺失在不同物种中的不同表现。

尿中出现 LMW 蛋白是先天性与获得性 PT 功能障碍的恒定标志【2】。基于 LMW 蛋白尿检测的价值，研究者开发了以酸不敏感荧光团 mCherry 融合的截短斑马鱼 vdbp 肽的转基因报告系 Tg(lfabp::½vdbp-mCherry)：其在肝中合成 ½vdbp-mCherry，分泌入血、经肾小球自由滤过、受体介导内吞重吸收并被 PT 细胞溶酶体加工；重吸收与溶酶体加工可经 ELISA 或活体荧光成像监测。据作者所知，这是首个斑马鱼 LMW 蛋白尿转基因报告系。此前报道的 Tg(lfabp::vdbp-GFP) 品系中 79.6 kDa 的 vdbp-GFP 在肝中合成并分泌入血【43】，但全长 vdbp 融合蛋白无法透过斑马鱼肾小球滤过屏障，只能用作肾小球通透性示踪剂，不适合分析 PT 细胞功能。有趣的是，内源性产生的 ½vdbp-mCherry 被 PT 近段摄取，而外源示踪剂 β-乳球蛋白-Cy5 主要被更远端部分重吸收——这可能是示踪剂化学性质差异【44】所致，或因生理条件下内源蛋白使 PT 近段重吸收能力饱和、外源示踪剂只能由 PT 远段摄取。

本研究的一个重要方面是：遗传（lrp2a 缺失）或毒性（顺铂或庆大霉素）损伤引起的 ½vdbp-mCherry 尿排泄（即 LMW 蛋白尿）可通过 ELISA 定量鱼池水中的 mCherry 可靠评估。尿 ½vdbp-mCherry 在尚未（或未）出现水肿的顺铂处理幼鱼中即可检出，表明这是监测小管功能障碍的敏感方法。庆大霉素处理是啮齿类和斑马鱼幼鱼中成熟的急性肾衰模型【10,32】；本研究数据显示庆大霉素确实经尿 ½vdbp-mCherry 升高诱导 LMW 蛋白尿，而共给予牛磺酸可部分挽救 LMW 蛋白尿与脂滴积累——该报告系中尿 ½vdbp-mCherry 水平反映小管损伤严重程度与保护策略效果。据认为牛磺酸通过多种机制限制脂质过氧化与膜损伤、提高整体线粒体功能【45】，其挽救机制有待进一步研究。在 E3 幼鱼培养液中检测尿 ½vdbp-mCherry 简单、无创，适用于受体介导内吞的监测。

除监测 LMW 蛋白尿外，研究者还评估了该转基因品系分析溶酶体贮积病的潜力——此类疾病以溶酶体内分子积累为特征【46】。溶酶体是通过水解酶、酸性机制与膜蛋白/转运体协同作用分解并回收多种底物的分解代谢中心；ClC-7 或胱氨酸蛋白缺陷小鼠的肾小管上皮细胞中常见未消化物质积累【40,47】。重要的是，mCherry 一旦到达酸性溶酶体区室即可成像追踪——如其与溶酶体标记 ctns-EGFP 在 PT 上皮细胞中的共定位所示。在 Tg(lfabp::½vdbp-mCherry) 斑马鱼中，BfnA1 处理或 clcn7 缺失对溶酶体功能的抑制诱导 ½vdbp-mCherry 在前肾 PT 细胞中积累——证明生理条件下 ½vdbp-mCherry 被 PT 细胞重吸收后即被降解（如同天然 VDBP【19】），并证实了溶酶体酸化与氯离子稳态对内吞配体溶酶体加工的重要性。将 Tg(lfabp::½vdbp-mCherry) 报告系与肾小球疾病模型结合，将有助于分析蛋白超载对 PT 功能的影响。本研究还首次将关联光学-电子显微镜（CLEM）方法用于斑马鱼前肾超微结构的扫描电镜成像及与超分辨光学显微镜的关联——该方法此前已用于小鼠脑组织突触和斑马鱼视网膜线粒体嵴的分析【48】。研究数据表明，CLEM 结合超分辨径向涨落分析【49】是监测斑马鱼前肾 PT 细胞溶酶体（以及延伸至自噬囊泡）结构与形态的可靠精确方法。

总之，转基因 Tg(lfabp::½vdbp-mCherry) 斑马鱼报告系的构建与原理验证表征，为研究先天性与获得性 PT 功能障碍的诸多方面开辟了新视角，并进一步支持斑马鱼用于药物筛选与肾毒性研究。

材料与方法（概要）

斑马鱼饲养与化学处理：斑马鱼按 14/10 小时光暗周期、28 °C 饲养；胚胎取自苏黎世大学鱼房自然产卵，培养于含 0.01% 亚甲蓝的 E3 培养液。顺铂处理：2 dpf 胚胎于含 1.5 mM 顺铂的 E3 中处理 4 小时后转入新鲜 E3；体视显微镜下手工计数鳔发育缺陷幼鱼数。庆大霉素处理：2 dpf 胚胎麻醉后经总主静脉注射 1 nL 6 mg/ml 庆大霉素/0.9% NaCl，或共注射 6.3 mg/ml 牛磺酸；4 dpf 形态学分为 I 期（无变化）、II 期（轻度水肿）、III 期（重度水肿）。治疗后 2 天（庆大霉素）或 3 天（顺铂）逐尾收集 E3 中过夜排泄的尿液；活体成像前用 0.003% PTU 处理胚胎。BfnA1 溶于 DMSO，20 nM 处理 16 小时。动物实验经苏黎世州兽医局批准。

TALEN 构建 lrp2a 与 clcn7 敲除鱼：按 Golden Gate TALEN 组装方案构建，TALEN 靶点分别为 lrp2a 第 75 外显子与 clcn7 第 7 外显子（间隔 15 nt，含 AciI/PstI 酶切位点用于突变筛选）；约 1 nL TALEN mRNA（400 ng/ml）注射单细胞胚胎，F0 与野生型外交叉、F1 筛选杂合携带者、F2 互交获纯合突变体。mRNA 挽救实验：斑马鱼肾总 RNA 逆转录获得 clcn7 cDNA，克隆入 pDrive TOPO 载体，体外转录并加 poly(A) 后按 1 nL（600 ng/ml）注射转基因 clcn7 敲除胚胎，5 dpf 分析表型。

组织特异性表达报告蛋白的转基因品系构建：PCR 扩增 fabp10a（lfabp）与 slc20a1a（PiT1）启动子并经 Gateway 克隆；斑马鱼 ctns、rab5aa cDNA 分别与 EGFP 融合，vdbp N 端 207 aa 编码序列与 mCherry 融合；经中入门克隆与 LR 反应构建 lfabp::½vdbp-mCherry、PiT1::GFP-rab5aa、PiT1::EGFP-RAB7A、PiT1::ctns-EGFP 等载体，与 Tol2 转座酶 mRNA 共注射单细胞胚胎建立稳定品系；双转基因鱼由 Tg(lfabp::½vdbp-mCherry) 与 Tg(cdh17::GFP)、Tg(wt1b::GFP) 或 Tg(PiT1::ctns-EGFP) 杂交获得。

内吞活性检测：牛 β-乳球蛋白经 Cy5 标记试剂盒标记纯化（终浓度 5 mg/ml）；Tg(cdh17::GFP) 幼鱼麻醉后经总主静脉注射 β-乳球蛋白-Cy5 或 10 kDa 葡聚糖-Alexa Fluor 647，孵育 20 分钟、1 或 4 小时后 2% 多聚甲醛/PBS（含 0.1% Tween-20）过夜固定。

荧光显微镜：Zeiss Lightsheet Z.1 光片荧光显微镜（20/1.0 NA 水浸物镜）活体或固定成像，Imaris 生成最大强度投影，ImageJ 定量荧光强度（每尾定量整条前肾小管，参数一致）；Leica TCS SP8 多光子显微镜（1100 nm 激发 mCherry；925/1041 nm 双色成像 EGFP+mCherry）采集高分辨图像，Huygens 去卷积、ilastik 分割、ImageJ 定量囊泡大小与总面积；共定位分析采用 10 μm 冰冻切片与 Leica SP8 共聚焦（40 倍油镜）。

透射电镜：幼鱼以 2.5% 戊二醛+1.6% 多聚甲醛二甲胂酸钠缓冲液固定过夜，1% 锇酸后固定、醋酸铀染色，梯度乙醇脱水、Epon812 包埋；350 nm 半薄切片甲苯胺蓝染色，60 nm 超薄切片以 Philips CM100 电镜 80 kV 观察；手工计数囊泡，囊泡直径取 x/y 轴膜间距离均值。

关联光学-电子显微镜（CLEM）：幼鱼以 0.05% 戊二醛+4% 甲醛固定，12% 明胶包埋，2.3 M 蔗糖浸润冷冻后行 Tokuyasu 冷冻超薄切片（110 nm）收集于硅片，加入 170 nm 荧光微珠作定位标记；DAPI 染色后以宽场荧光显微镜（Leica SR GSD 3D，160 倍/1.43 NA 油镜，每通道采集 1000 帧）行超分辨径向涨落分析（Fiji 插件），再经 0.1% 戊二醛后固定、甲基纤维素包埋，1.5 keV 扫描电镜（Zeiss Auriga 40）成像，TrakEM2 对齐光镜/电镜图像。

RT-PCR、Western blot 与尿液 ELISA：TRIzol 提取成鱼肝总 RNA（DNase I 去除基因组 DNA），Phusion 高保真酶以特异性引物检测 vdbp（1459 bp）与 ½vdbp-mCherry（1030 bp）cDNA。幼鱼或肝组织 RIPA 匀浆，BCA 定量，SDS-PAGE 转膜后以抗 mCherry、抗 β-actin 或抗 GAPDH 一抗孵育，化学发光显影。尿液收集：幼鱼 96 孔板单尾/100 μL E3，28 °C 16 小时后收集；肝、肾组织用细胞提取液裂解，按 mCherry ELISA 试剂盒（Abcam）说明在 450 nm 读数定量。

统计分析：Prism 5 软件；D'Agostino-Pearson 正态性检验；两组比较用非配对双侧 t 检验或 Mann-Whitney 检验，多组比较用单因素 ANOVA+Bonferroni 或 Kruskal-Wallis 事后检验；整体成像在基因分型前盲法进行，无样本剔除，P<0.05 为显著。

补充说明：本文系文献翻译整理，原文以开放获取（CC BY-NC-ND 4.0）形式发表于 Kidney International (2020) 97:1150–1163，DOI: 10.1016/j.kint.2019.11.016。文中图片版权归原论文作者及国际肾脏病学会所有。补充材料（图 S1–S7）、致谢、基金与参考文献详见原文，此处从略。

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