文章信息

期刊：Theranostics（Ivyspring 出版，转化医学与精准医疗领域期刊）

标题：Lactate metabolism coordinates macrophage response and regeneration in zebrafish（乳酸代谢协调斑马鱼巨噬细胞应答与再生）

影响因子：14.9（2025 年度 JCR，官网数据）｜ JCR Q1 ｜ 中科院大类医学 1 区 Top

发表时间：2022 年 5 月 13 日｜ 2022;12(8):3995–4009

DOI：10.7150/thno.65235

通讯作者：Farida Djouad（法国蒙彼利埃大学 IRMB，INSERM U1183，farida.djouad@inserm.fr）

共同第一作者：Candice Bohaud、Jholy De La Cruz（通讯贡献作者：Yoan Arribat）

开放获取：CC BY 4.0

导读

巨噬细胞在组织发育、稳态与再生中扮演多功能角色，应对损伤时会发生大规模代谢重塑，但这一过程的体内调控机制从未被解析。本研究以 3 dpf 斑马鱼幼鱼尾鳍切除为再生模型，通过单细胞 RNA 测序发现再生组织中巨噬细胞糖酵解与乳酸代谢通路显著上调（ldha 几乎专一表达于髓系细胞）。药理学抑制（2DG、DCA、GAL、OXA）证实乳酸通路对巨噬细胞招募、TNFα⁺ 促炎极化和尾鳍再生不可或缺，且仅再生早期（0–24 hpA）干预有效；CRISPR 敲低乳酸转运体 MCT1（而非 MCT4）破坏巨噬细胞激活，提示胞外乳酸摄取是关键。外源添加乳酸不仅能挽回抑制造成的再生缺陷，还能超越基础水平加速尾鳍再生；转录组分析显示乳酸全面重塑巨噬细胞基因表达——上调 tnfrsf1b、csf3a 等促炎/促生存基因，增强吞噬、基质降解与细胞运动并抑制凋亡。该研究首次在体内揭示了乳酸作为"代谢信使"协调炎症与再生的作用。

摘要

依据（Rationale）：巨噬细胞是在组织发育、稳态和再生中起关键作用的多功能细胞。事实上，在组织损伤及随之而来的再生过程中，巨噬细胞会经受挑战并发生大规模的代谢适应和改变。然而，巨噬细胞微环境对这种代谢重编程的控制从未在体内被解析。

方法：本研究以斑马鱼尾鳍切除作为稳健的再生模型。我们通过单细胞 RNA 测序和全组织转录组分析探索了组织截断后基因表达的特异性变化。在鉴定关键改变的基础上，我们通过联合使用该通路的化学与遗传抑制剂，确认了乳酸通路在巨噬细胞应答和鳍再生中的作用。

结果：单细胞 RNA 测序揭示鳍再生时巨噬细胞中多个糖酵解和乳酸代谢相关基因上调。利用 LDH 酶的化学抑制剂，我们确认乳酸在巨噬细胞招募和极化中的作用——促进促炎表型并增强鳍再生。单羧酸转运体的遗传调节揭示了乳酸水平的复杂调控，兼有胞内和胞外两种来源。总体而言，不同来源的乳酸在再生最初 24 小时内导致巨噬细胞激活，TNFα 等炎症因子表达升高。转录组分析证实乳酸引起巨噬细胞基因表达的全局性改变。

结论：总之，我们的发现凸显了乳酸在巨噬细胞向促炎表型分化起始阶段的关键作用。乳酸及其下游效应介导的巨噬细胞表型深刻改变，在协调炎症应答与组织再生中发挥关键作用。

引言

在脊椎动物中，一些物种能够在心脏、下颌、肢体和/或鳍遭受广泛损伤后完全再生其组织。这一在截断或组织损伤后实现复杂结构功能性恢复的过程称为表观形再生（epimorphic regeneration）。该机制始于一种称为芽基（blastema）的瞬时结构的形成——主要由高度增殖的间充质细胞构成的异质性细胞团块，最终分化为多种不同细胞类型并产生与原始截断结构完全相同的复本。巨噬细胞在表观形再生中的作用已被我们和其他团队广泛研究。最初因其吞噬能力被描述的巨噬细胞，已被揭示在炎症及其消退中具有关键作用。在斑马鱼等再生物种中，巨噬细胞在控制截断后附肢再生中至关重要。在再生过程不同时间点的遗传或药理学巨噬细胞清除实验证实，早期招募巨噬细胞的缺失会抑制这一过程。为完成其功能，巨噬细胞会动态应答微环境变化，并通过不同的激活阶段进行适应。我们近期阐明了这种可塑性，并证实在斑马鱼幼鱼尾鳍再生过程中不同巨噬细胞亚群的依次聚集。表达 TNFα 的巨噬细胞在协调鳍再生中尤为重要。

应答微环境变化时，巨噬细胞会经历保证其在稳态和炎症中角色的新陈代谢重编程。体外研究表明，促炎巨噬细胞（M1 样）优先使用糖酵解代谢，而抗炎巨噬细胞（M2 样）则更多依赖氧化磷酸化。巨噬细胞亚群的代谢表型最近也在斑马鱼炎症应答中被在体表征。然而，再生过程中巨噬细胞代谢重编程的时间进程及其功能仍属未知。虽然近期一项研究显示尾鳍再生过程依赖全局性代谢重编程，但芽基巨噬细胞的代谢改变及其在再生中的作用尚未被研究。

在本研究中，我们利用 3 dpf 斑马鱼幼鱼的尾鳍再生模式进行单细胞 RNA 测序（scRNA-seq），鉴定再生组织中各类细胞的改变。有趣的是，我们揭示了巨噬细胞表达谱的关键改变，尤其是与糖酵解和乳酸代谢相关的基因。继而，联合化学与遗传抑制关键调节因子，我们确认了糖酵解和乳酸产生对（i）损伤部位巨噬细胞招募/聚集、（ii）巨噬细胞激活/极化、（iii）芽基形成和斑马鱼鳍再生的影响。最终，我们证明乳酸通路影响巨噬细胞的全局表达谱。总之，我们的发现为再生过程中巨噬细胞的代谢调控提供了新见解。

材料与方法（概要）

斑马鱼品系与再生实验：使用野生型及转基因鱼 Tg(mpeg1:mCherry-F)（可视化巨噬细胞）和 Tg(mpeg1:mCherry-F;tnfa:eGFP-F)（可视化巨噬细胞中 tnfa 表达）。对 72 hpf 幼鱼以 0.016% Tricaine 麻醉后用手术刀在脊索后端界限处截断尾鳍。再生以截断后小时数（hpA）计量。

药理学调节：糖酵解抑制剂 2-脱氧葡萄糖（2DG，50 μM）、丙酮酸脱氢酶激酶抑制剂二氯乙酸钠（DCA，500 μM，促进丙酮酸进入三羧酸循环、间接阻断乳酸产生）、LDH 直接抑制剂嘌呤黄酮（GAL，500 nM，同时阻断 LDHA 与 LDHB）、另一种 LDH 抑制剂草酸钠（OXA，10 mM）以及外源 L-乳酸钠（100 μM）分别通过浸泡（直接加入鱼水）或截断前 1 小时尾静脉注射给药，并设置 0–24 hpA、24–72 hpA 或全程等不同时间窗口。

遗传调节：按 Kroll 等描述的 CRISPR/Cas F0 敲除策略，针对 MCT1 与 MCT4 各设计 3 条 gRNA，与 True Cut Cas9 蛋白混合后注射单细胞期受精卵（每枚 1 nl），乱序 gRNA 作对照，crispant 胚胎未见致死。

成像与定量：荧光体视显微镜（Leica DMI6000CS）测量再生鳍长度（截断面至鳍尖中位面距离）与面积（脊索至鳍尖间鳍褶面积，Fiji 软件多边形工具）；共聚焦显微镜（TCS SP5/SP8 MP）观察 6 hpA 鳍尖巨噬细胞迁移行为及 6/24 hpA 巨噬细胞招募与激活（直接在图像上计数）；H3P（抗磷酸化组蛋白 3）免疫染色定量芽基细胞增殖。

scRNA-seq 分析：数据取自 GEO（GSE158851），使用 Seurat 4.0.3 进行质控（过滤基因数 <200 或 >4000 的细胞、DoubletFinder 去双胞、线粒体基因占比 >10% 的细胞）、归一化、PCA 降维（16 个主成分）、UMAP 可视化与 Louvain 聚类（resolution = 1）。髓系亚聚类以 mpeg1/mfap4（巨噬细胞）与 lyz/mpx（中性粒细胞）标记拆分；差异表达用 FindMarkers（DESeq2 方法），以 q < 0.05（聚类标记）或 p < 0.01（cut vs uncut）为显著；代谢通路富集使用 Ingenuity Pathway Analysis（IPA，Z > 2 视为显著激活、Z < −2 视为显著抑制）。

微阵列分析：FACS 分选 24 hpA 有/无 100 μM L-乳酸处理的巨噬细胞（每重复 150 条尾鳍，3 个生物学重复），RNeasy Mini Kit 提取 RNA，Affymetrix 斑马鱼 1.0 ST 芯片杂交，RMA 归一化，limma 构建线性模型做差异表达（P < 0.05），按倍数变化取上下调各 25 位基因绘制热图，DAVID 平台做 GO 富集。统计与作图使用 GraphPad Prism 6.0。

结果

鉴定再生过程中巨噬细胞激活的关键代谢通路

3 dpf 幼鱼尾鳍褶截断会触发一个稳健的再生过程，3 天内即可恢复原始组织。这一过程称为表观形再生，依赖于截断后 24 小时（hpA）芽基的形成。为以细胞特异性的方式鉴定转录谱的改变，我们使用 scRNA-seq 与 Chromium 系统（10X Genomics 平台）比较了完整（未损伤）与 24 hpA 再生尾鳍。

基于 Louvain 无监督聚类算法的整合数据集细胞聚类鉴定出 10 个细胞群（图 1A）。其中，髓系与间充质细胞群在截断后细胞数量发生了显著改变——损伤诱导的巨噬细胞招募及截断后间充质组织的移除（直至更晚阶段才恢复）或可解释这些观察（附图 S1A）。髓系特征标记基因 spi1b、coro1a 和 lcp1 在髓系群中高表达。在该群内，我们利用髓系特异性过氧化物酶 mpx 和溶菌酶 lyz 标记进行亚聚类，排除少数尚未通过反向迁移离开鳍的中性粒细胞，聚焦于仅表达 mpeg1 和 mfap4 的巨噬细胞（图 1B，附图 S1B）。随后我们对巨噬细胞群体进行差异基因表达分析，比较未损伤与损伤样本的细胞代谢相关表达数据（图 1C、D）。基于差异表达基因列表的 IPA 经典通路分析显示乳酸通路相关基因富集，且特异性出现在巨噬细胞中——33% 的触发乳酸产生的分子组件在截断组织与完整鳍之间差异表达，提示乳酸发酵通路在再生巨噬细胞中的关键作用（图 1C）。与之相符，被描述为应对强糖酵解活性、促进乳酸产生的甲基乙二醛降解通路，也是再生巨噬细胞中最富集的通路之一。

我们聚焦于截断后巨噬细胞群中从文献和数据库精心挑选的糖酵解基因的差异表达。我们鉴定出 4 个靶标：乙二醛酶系统主酶乙二醛酶 1（glo1）、关键糖酵解酶 3-磷酸甘油醛脱氢酶（gapdh）、LDH 复合体中参与丙酮酸与乳酸相互转化的 LDH B 亚基（ldhb）——它们位列 p 值最小的前 5 个差异表达基因；此外，具有强乳酸产生活性的 LDH A 亚基（ldha）与上述酶一同位列再生条件下倍数变化最大的前 15 个基因。值得注意的是，醇脱氢酶 5（adh5）和醛脱氢酶 6（aldh6a1）是列表中少数下调基因，提示丙酮酸的酒精发酵受到抑制（图 1D）。

小提琴图可视化证实了这些酶在尾鳍再生过程中的差异表达水平（图 1E）。在探索各细胞群中乳酸基因时，我们发现乳酸相关酶在髓系群中富集，尤其是几乎专一表达于髓系群的 ldha 亚基（图 1F）。我们还比较了 24 hpA 仍存在于芽基中的中性粒细胞中这些酶的表达谱，未观察到截断与完整组织之间的表达差异，凸显这是一种巨噬细胞特异的机制（数据未展示）。使用 IPA，我们生成了再生鳍相对完整鳍特异性上调和下调基因的网络，鉴定出指向乳酸通路的一组糖酵解与氧化磷酸化（OXPHOS）代谢分子。值得注意的是，网络中连接度最高的基因是 ldha、ldhb、丙酮酸激酶 M（pkm）和数个细胞色素（附图 S1C）。这些结果凸显了尾鳍再生过程中体内代谢过程的复杂性，并表明尽管乳酸与糖酵解十分重要，作为发育过程主要代谢通路的 OXPHOS 仍在活跃使用——OXPHOS 在损伤与未损伤条件下的多个细胞群中广泛活跃。这些发现促使我们解析糖酵解和乳酸代谢对再生的影响。

图 1. 从单细胞 RNA 测序数据鉴定再生尾鳍巨噬细胞中被调节的关键通路。（A）24 hpA 尾鳍（cut）与未损伤对照（uncut）整合数据的聚类。AER：顶外胚层嵴；EBL：上皮基底层；NCC/NCdC：神经嵴细胞/神经嵴来源细胞。（B）基于 mpeg1.1 表达的巨噬细胞亚群特征图及其在 cut 与 uncut 条件下分布的降维图。（C）IPA 代谢网络的经典通路分析——巨噬细胞亚群内比值（检测到的基因数/通路基因总数）。（D）主要糖酵解相关基因 cut/uncut 表达比值热图。（E）cut 与 uncut 条件下差异表达最显著的糖酵解与乳酸相关基因小提琴图。（F）差异表达最显著的基因在各尾鳍细胞群中 cut/uncut 表达倍数变化热图。

糖酵解与乳酸代谢是尾鳍再生过程中巨噬细胞招募与极化所必需

在 72 hpf 斑马鱼幼鱼中，可通过转基因鱼 Tg(mpeg1:mCherry-F/tnfa:eGFP-F) 在再生过程中四维监测巨噬细胞亚群。整个巨噬细胞群体表达法尼基化 mCherry（mCherry-F），而激活细胞可通过促炎标记 TNFα-GFP 的表达加以区分。尾鳍截断后，巨噬细胞在数分钟内被招募至损伤部位，6 hpA 形成一道"细胞屏障"，约 18 hpA 离开截断部位进入血流或巡逻于再生组织直至 72 hpA（图 2A）。为研究糖酵解与乳酸代谢对再生组织中巨噬细胞招募与行为的作用，我们聚焦 6 hpA 鳍尖巨噬细胞的聚集，通过计数损伤部位 mpeg⁺ 细胞总数进行衡量（图 2B、C）。我们将不同的代谢抑制药物直接加入鱼水：2DG（抑制糖酵解第一步）、DCA（促进丙酮酸进入三羧酸循环、间接阻断乳酸产生）和 GAL（直接阻断乳酸代谢、抑制 LDHA 与 LDHB 同工酶）（附图 S2A）。6 hpA 的共聚焦分析显示，与对照和 2DG 条件相比，DCA 和 GAL 存在时巨噬细胞屏障形成显著受损（附图 S2B–D）。这一效应与同一时间点（6 hpA）整鳍巨噬细胞总数下降相关（图 2B 及附图 S2B）。24 hpA 时，2DG 和 DCA 处理幼鱼整鳍巨噬细胞总数也显著减少，GAL 则不然（图 2C 及附图 S2C）。

表达 tnfa 的促炎巨噬细胞在再生最初 24 小时内聚集于再生鳍，并在 24–72 hpA 之间向非炎性表型转换或离开损伤部位（图 2A）。为研究糖酵解与乳酸代谢对巨噬细胞激活的作用，我们在含代谢药物的鱼水中培养 Tg(mpeg1:mCherry-F/tnfa:eGFP-F) 幼鱼。活体共聚焦成像显示，只有 GAL 显著降低 6 hpA 和 24 hpA 表达 tnfa 的巨噬细胞数量（图 2D、E、2H）。以表达 tnfa 的巨噬细胞相对数量（mpeg1⁺tnfa⁺:mpeg1⁺ 比值）进行的定量支持这一结果——GAL 存在时 24 hpA（而非 6 hpA）比值下降（图 2F–H）。

总之，这些结果表明糖酵解与乳酸代谢的抑制都会损害斑马鱼幼鱼再生鳍内巨噬细胞的招募与迁移行为，而只有直接抑制乳酸代谢才会压制巨噬细胞向促炎表型的极化。

图 2. 糖酵解与乳酸抑制剂改变巨噬细胞的招募与极化。（A）截断后巨噬细胞招募、迁移与极化的实验设计。（B）截断后浸泡于斑马鱼水（CT）、2DG（50 μM）、DCA（500 μM）或 GAL（500 nM），6 hpA 整鳍 mpeg⁺ 巨噬细胞数量定量（均值 ± SEM，n > 30，普通单因素 ANOVA，Dunnett 多重比较，与对照比较，**p ≤ 0.01，****p ≤ 0.0001）。（C）同上，24 hpA 整鳍 mpeg⁺ 巨噬细胞数量定量（均值 ± SEM，n < 30，Kruskal-Wallis 检验，Dunn 多重比较，*p ≤ 0.05，***p ≤ 0.001）。（D）6 hpA 整鳍 mpeg⁺tnfa⁺ 巨噬细胞数量定量（均值 ± SEM，n > 30，单因素 ANOVA，Dunnett 多重比较，****p ≤ 0.0001）。（E）24 hpA 整鳍 mpeg⁺tnfa⁺ 巨噬细胞数量定量（均值 ± SEM，n > 30，单因素 ANOVA，Dunnett 多重比较，***p ≤ 0.001）。（F）6 hpA 整鳍 mpeg⁺tnfa⁺ 巨噬细胞相对数量（mpeg⁺tnfa⁺/mpeg⁺ 总数倍数变化）定量（与对照比较无显著差异）。（G）24 hpA mpeg⁺tnfa⁺ 巨噬细胞相对数量定量（*p ≤ 0.05）。（H）共聚焦图像 Z 投影，展示截断后浸泡于 CT、2DG、DCA 或 GAL 的幼鱼在 6 与 24 hpA 的巨噬细胞招募与激活（比例尺 = 60 μm）。

糖酵解与乳酸代谢抑制损害再生效率

我们和其他团队已证实巨噬细胞在芽基形成与再生过程中的关键作用，部分通过分泌促炎介质 TNF-α 和 IL-1β 实现。结合巨噬细胞清除、morpholino 敲低和连体共生实验，我们已证明 TNFα/TNFR1 信号通路对芽基细胞增殖和鳍再生必不可少。为评估糖酵解与乳酸代谢对再生的作用，我们采用斑马鱼幼鱼尾鳍横断模型，监测芽基形成与鳍再生长。3 dpf 幼鱼鳍截断后，6 hpA 形成伤口上皮——芽基建立的关键步骤；24 hpA 出现高度增殖的芽基结构，产生与原始鳍相同的新鳍；72 hpA 时由排列整齐的伸长间充质细胞构成（附图 S3A）。因此，我们首先研究了 2DG、DCA 和 GAL 对尾鳍发育的影响，未发现 6 dpf 时对照组与 2DG、GAL 处理组尾鳍发育的差异。值得注意的是，DCA 处理幼鱼的尾鳍比对照组更长（图 3A）。这可能是由于 DCA 迫使 OXPHOS 达到最大——尽管细胞快速增殖的早期发育阶段使用有氧糖酵解，但斑马鱼幼鱼发育过程中氧化磷酸化的比重会逐渐增加。

随后，我们评估了糖酵解与乳酸对截断后 3 dpf 幼鱼尾鳍再生长的影响——幼鱼分别饲养于常规鱼水或含药物的水中。我们在 72 hpA 测量再生长度及脊索与鳍尖之间再生鳍面积（图 3B），观察到暴露于 2DG、DCA 和 GAL 的斑马鱼在 72 hpA 鳍长与鳍面积显著下降（图 3C）。为更特异性地靶向循环免疫细胞（尤其巨噬细胞），我们还将这些药物注射入斑马鱼尾静脉，观察到类似的对尾鳍再生的抑制效应——鳍再生长度与面积显著减少（附图 S3B）。为确认 GAL 对巨噬细胞应答（图 2）和鳍再生（图 3）的影响，我们评估了另一种 LDH 抑制剂草酸钠（OXA）的效果。我们发现，OXA 无论是加入鱼水还是注入尾静脉，都显著抑制鳍再生（附图 S3C）。随后，我们在 24 hpA 用 H3P 免疫荧光评估 2DG、DCA、GAL 和 OXA 对芽基细胞增殖的影响，显示与对照相比芽基细胞增殖显著减少（附图 S3D）。

总之，这些结果表明，在鳍再生长全程（0–72 hpA）对糖酵解和乳酸代谢进行全身性（鱼水浸泡）或系统性（尾静脉注射）抑制，均会显著损害斑马鱼幼鱼的再生潜能。

最后，我们评估了再生过程不同时间点乳酸抑制的效果。为此，幼鱼在含或不含 2DG、DCA 或 GAL 的鱼水中孵育——或是在再生过程最初的 24 小时（对应芽基促炎与增殖阶段），或是在后期 24–72 hpA（对应芽基非炎性分化阶段）（图 3D）。我们发现，在再生早期添加 2DG、DCA 和 GAL 显著损害 72 hpA 尾鳍的再生生长（图 3E），而在后期添加对鳍再生无显著影响（图 3F）。这些结果揭示了乳酸通路在尾鳍再生中的关键作用，尤其是在芽基形成的早期阶段。

图 3. 糖酵解与乳酸抑制剂影响截断后的尾鳍再生。（A）未截断幼鱼在 144 hpf 浸泡于斑马鱼水（CT）、2DG（50 μM）、DCA（500 μM）或 GAL（500 nM）的鳍生长长度（均值 ± SEM，n < 30，Kruskal-Wallis 检验，Dunn 多重比较，*p ≤ 0.05）。（B）实验设计：（a）0–72 hpA 浸泡给药，或（b）截断前 1 小时（1 hbp）尾静脉注射给药，截断尾鳍并测量再生生长。（C）72 hpA 尾鳍再生代表性图像（比例尺 = 100 μm）及对应柱状图——截断后 0–72 hpA 浸泡于 CT、2DG（50 μM）、DCA（500 μM）或 GAL（500 nM）的 72 hpA 鳍长与鳍面积（均值 ± SEM，n > 30，单因素 ANOVA，Dunnett 多重比较，*p ≤ 0.05，***p ≤ 0.001，****p ≤ 0.0001）。（D）给药时间窗口设计及对鳍再生的影响。（E）截断后 0–24 hpA 浸泡给药的 72 hpA 鳍长（均值 ± SEM，n < 30，Kruskal-Wallis 检验，Dunn 多重比较，*p ≤ 0.05，**p ≤ 0.01）。（F）截断后 24–72 hpA 浸泡给药的 72 hpA 鳍长（均值 ± SEM，n < 30，Kruskal-Wallis 检验，Dunn 多重比较，无显著差异）。

胞外乳酸加速斑马鱼幼鱼尾鳍再生

为通过遗传学手段确认乳酸的影响，我们在斑马鱼巨噬细胞中敲低了主要单羧酸转运体 MCT1 和 MCT4（附图 S4A、B）。MCT1 是乳酸摄取的重要组分，MCT4 则负责其分泌。CRISPR 敲除 MCT4 不影响截断后 24 hpA 诱导的巨噬细胞激活（附图 S4C、D）；相反，MCT1 的缺失破坏了截断部位 TNFα 表达巨噬细胞的存在（附图 S4C）。这些结果证实乳酸对巨噬细胞激活的重要性，并突出从胞外区室摄取该底物的必要性。MCT4 crispant 中无效应的结果提示，分泌乳酸的细胞依赖其他转运体输出乳酸并在再生时激活巨噬细胞。这些结果呼吁进一步研究以鉴定巨噬细胞的细胞伙伴和乳酸分泌途径。

为检验这种胞外乳酸在再生级联中的作用，我们给截断幼鱼提供外源乳酸——直接加入鱼水。我们研究了外源乳酸存在下幼鱼鳍再生的潜能。首先，我们证明乳酸暴露对 6 dpf 幼鱼尾鳍正常发育没有影响（图 4A）。接着，我们评估乳酸补充能否抵消内源性乳酸产生的抑制。我们发现，虽然 GAL 对 LDH 的抑制减少了鳍再生（图 3C），同时添加外源乳酸可恢复再生能力（图 4B–D）。有趣的是，外源乳酸供给超越了基础再生水平，与对照相比增强了鳍再生（图 4C、D）。这一结果证实了胞外乳酸来源对促进再生的重要性。有趣的是，我们确认乳酸给药后 6 hpA 芽基中 H3P 阳性细胞显著增加，证实这些条件下芽基细胞增殖的增加（附图 S5E）。

为确认外源乳酸对炎症的直接作用，我们评估了 100 μM 乳酸单独或与 500 μM GAL 共同存在时的巨噬细胞激活，并确定乳酸对 GAL 所致表型的影响（图 2B–G）。共聚焦分析显示，与未处理幼鱼相比，乳酸单独或乳酸+GAL 处理的再生幼鱼在 6 hpA 表达 tnfa 的巨噬细胞数量显著增加（附图 S5A）。这些结果提示巨噬细胞的早期激活主要由外源乳酸驱动。两种处理在 24 hpA 均未观察到效应（附图 S5B）。6 hpA 表达 tnfa 巨噬细胞相对数量（mpeg1⁺tnfa⁺ 与 mpeg1⁺ 总数比值）的定量显示，乳酸单独或乳酸+GAL 处理幼鱼较未处理幼鱼呈上升趋势，而 24 hpA 无效应（附图 S5C、D）。

总之，这些结果证实外源乳酸可短暂增加巨噬细胞炎症、加速再生过程并克服代谢抑制造成的再生障碍。内源性产生与胞外输入的乳酸在再生时汇聚于巨噬细胞激活。

图 4. 外源乳酸加速截断后的尾鳍再生。（A）未截断幼鱼在 144 hpf 浸泡于斑马鱼水（CT）或乳酸中的鳍生长长度（均值 ± SEM，n < 30，Mann Whitney 检验，双尾，无显著差异）。（B）72 hpA 尾鳍再生代表性图像（比例尺 = 100 μm）及对应柱状图（C）——截断后浸泡于斑马鱼水（CT）、乳酸（100 μM）或 GAL（500 nM）与乳酸（100 μM）同时添加的鳍长（均值 ± SEM，n < 30，Mann Whitney 检验，双尾，***p ≤ 0.001）。（D）截断后浸泡于 CT、乳酸（100 μM）或 GAL（500 nM）+乳酸（100 μM）的 72 hpA 鳍面积（均值 ± SEM，n < 30，Mann Whitney 检验，双尾，****p ≤ 0.0001）。

乳酸引起再生尾鳍巨噬细胞炎症谱的全局性改变

为绘制乳酸诱导改变的图谱，我们分选了截断后有无乳酸处理下的巨噬细胞并进行了全 mRNA 分析。由于产生 TNFα 的巨噬细胞峰值出现在截断后 6 hpA，我们将微阵列分析聚焦于 24 hpA 以鉴定受 TNFα 下游调控的信号通路。为此，我们从 24 hpA 再生尾鳍中 FACS 分选巨噬细胞——分别置于含或不含 100 μM L-乳酸的溶液中——将其 mRNA 与 Affymetrix 1.0 st 芯片杂交，生成各条件的表达谱。随后进行差异表达分析以生成乳酸对巨噬细胞作用的转录组特征。我们获得 454 个差异表达基因（P < 0.05），其中 190 个上调、264 个下调；104 个上调和 48 个下调基因倍数变化大于 2（图 5A、B；补充表 1）。随后在 DAVID 平台对差异表达基因进行基因本体（GO）富集分析（补充表 2）。我们发现 COPI 依赖的高尔基体-内质网逆行运输（kifc1、sec22bb、kif5ab）、Ephrin 信号（myl12.2、efnb2a、nck2a）和基质金属蛋白酶激活（cela1.1、prss1、si:dkey-239J18.3）等通路呈现弱富集（P < 0.1）。

重要的是，肿瘤坏死因子受体超家族成员 1B（tnfrsf1b）在 p 值上超越所有上调基因，且倍数变化也位居前列。tnfrsf1b 是 TNFR2 的直系同源基因（与 TNFR1 相对），几乎专一表达于免疫细胞，可刺激 NFκB 信号且不具备诱导细胞死亡的内在活性。我们假设 tnfrsf1b 可能作为正反馈环路，增强存活与促炎表型。

图 5. 乳酸对再生尾鳍巨噬细胞的转录组效应。（A）火山图显示乳酸处理后巨噬细胞差异表达基因（红点）。（B）热图显示截断尾鳍巨噬细胞在乳酸处理（Lact）与否（Ctrl）条件下按平均表达倍数变化排序的前 25 个显著上调与下调基因；每个条件 3 个生物学重复。

讨论

本研究首次证明乳酸在再生过程中影响巨噬细胞行为、招募和极化。组织截断后乳酸通路的增强协调了巨噬细胞的代谢变化与炎症应答。基因表达的调节使巨噬细胞特性得以适应芽基形成的挑战。

乳酸在炎症中的作用长期令人困惑。虽然本研究强调了其对巨噬细胞招募和极化的激活功能，许多研究（尤其在肿瘤背景下）指出乳酸的抗炎作用。这一表面上的矛盾依赖于再生过程中炎症时间进程的复杂性。外源乳酸补充仅在截断后 24 小时内给药时增加表达 TNFα 的促炎巨噬细胞频率。这提示乳酸摄取在芽基增殖阶段——细胞依赖极高能量需求之时——起决定性作用。在再生过程的最后 48 小时里，乳酸可能对斑马鱼巨噬细胞产生不同影响：在此分化阶段，乳酸反而可能促进向非炎性巨噬细胞表型的转换。

虽然本研究阐明了乳酸在协调炎症与再生中的重要性，但它也提出了一个新的问题：截断后这种代谢物从何而来？全局性乳酸给药和化学抑制剂阐明了乳酸通路对巨噬细胞重编程的作用，但未能区分胞内或胞外糖酵解与乳酸产生的影响。scRNA-seq 证实巨噬细胞经历调节糖酵解和乳酸代谢的胞内适应，这些改变要求细胞自主性的代谢重编程。然而，我们证明 MCT1 缺失介导的乳酸摄取破坏会阻止 24 hpA 的巨噬细胞应答，提示外源供给的重要性。同样，这一矛盾可由再生过程中相继阶段的存在来解释——启动和维持巨噬细胞代谢重编程的乳酸来源可能随时间变化。这一问题呼吁进一步研究，以考察其他芽基细胞及其与巨噬细胞的代谢对话。

乳酸对巨噬细胞的激活意味着基因表达的广泛改变。这种转录转变可能由乳酸对染色质乙酰化的直接作用驱动。事实上，组蛋白乙酰化的微妙平衡最近被确定为再生背景下乳酸效应的重要介导者。作为组蛋白乙酰转移酶 p300 的共激活因子，HIF1a 可能在巨噬细胞命运中起决定性作用。HIF1a 已知可被乳酸激活，并在伤口愈合过程中调节巨噬细胞运动或诱导 TNFα 表达。HIF1a 与组蛋白乙酰转移酶调节的组合可能是乳酸改变巨噬细胞转录谱、协调再生过程中代谢变化与炎症应答的重要效应者。

转录改变的图谱凸显了乳酸诱导重编程的主要靶标。其中，Tnfrsf1b 显现乳酸调节的主要靶点。Tnfrs1b 作为 Tnfa 信号的主要受体之一，缺乏死亡结构域（TRADD 和 FADD），从而避免直接激活细胞死亡，转而诱导抑制性凋亡蛋白 1 和 2（cIAPs）、NF-κB 通路和 PI3K-Akt 通路的表达，促进细胞存活。其过表达可能转化为促炎表型的维持，同时避免凋亡。与此一致，人 M1/M2 巨噬细胞的 RNA 测谱显示 Tnfrs1fb 直系同源基因（TNFR2）按 p 值和倍数变化位列 M1 标记，该表达进一步在斑马鱼幼鱼中作为巨噬细胞群体核心转录网络的一部分得到验证。乳酸效应子的探索还发现肿瘤坏死因子受体超家族成员 6（fas）——另一 TNF 受体，虽经典地与凋亡相关，但在哺乳动物巨噬细胞体外被描述为通过 ERK/JNK 依赖的 NfκB 激活诱导促炎介质和细胞因子。与此一致，我们发现集落刺激因子 3a（csf3a）——一种参与 M1 巨噬细胞极化的趋化因子——上调。另一方面，我们发现 TNF 受体超家族成员 11（tnfrs11b，参与破骨细胞凋亡的 TNF 受体）和 C-X-X 基序趋化因子受体 4（Cxcr4，抗炎 M2 样巨噬细胞的重要激活因子）位列下调基因，再次提示促炎程序的维持以及巨噬细胞存活的促进。

在上调基因中，我们发现 zgc:174153（组织蛋白酶 L2 家族成员）和组织蛋白酶 l（ctsl）——积极参与溶酶体蛋白降解的基因。此外，吞噬体形成介导者桥接整合子 2b（bin2b），以及补体级联的关键组分、可诱导邻近细胞凋亡的 C3a 过敏毒素趋化受体 1（c3ar1），在乳酸处理下呈现上调，提示巨噬细胞吞噬能力的改善。有趣的是，广泛参与细胞突起形成的运动蛋白如驱动蛋白样蛋白 c1（kifc1）、驱动蛋白样蛋白 5ba（kif5ba）和驱动蛋白家族成员 20Bb（kif20bb）上调，而黏附基因如整合素 β4（itgb4）、内皮细胞黏附分子 a（esama）、整合素 β 样 1（itgbl1）、delta 样蛋白（jag2b）和原钙黏蛋白 2 α b 10（pcdh2ab10）在乳酸存在时下降，这可能转化为巨噬细胞运动性的增强。

总体而言，这一转录谱表明乳酸处理改善巨噬细胞功能——如胞内运输、吞噬、基质降解和细胞运动——同时保持炎症表型并避免凋亡。这些改变可带来更好的巨噬细胞性能，从而帮助斑马鱼尾鳍再生过程中的组织清除与重塑等多个过程。

补充材料见原文：附图（https://www.thno.org/v12p3995s1.pdf）、补充表 1（v12p3995s2.xlsx）、补充表 2（v12p3995s3.xlsx）。scRNA-seq 数据存储于 GEO（GSE158851）。参考文献（60 条）详见原文。基金资助：Inserm、蒙彼利埃大学、FOREUM 基金会与法国国家研究署（ANR-18-CE18-0010-02 "PPAROA"项目）。

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苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。