题目：odd skipped-related 2 as a novel mark for labeling the proximal convoluted tubule within the zebrafish kidney

原文链接:https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2024.e27582

期刊：Heliyon

摘要

肾脏的近端曲细管（PCT）是肾脏中负责重吸收、分泌以及维持肾小管内电解质和水平衡的关键功能区段。然而，目前缺乏用于研究近端曲细管形态发生的明确内源性转基因品系。通过分析成年斑马鱼肾脏的单细胞转录组数据，我们在近端曲细管中检测到了奇数Skipped相关2（osr2，其编码一种奇数Skipped锌指转录因子）的表达。为探究osr2在近端曲细管形态发生中的作用，我们构建了转基因斑马鱼品系Tg(osr2:EGFP)，该品系可表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）。EGFP的表达模式与内源性Osr2的表达模式高度一致，能够忠实再现其天然表达谱。在肾脏发育过程中，我们可借助EGFP追踪近端曲细管的发育过程，这一特性在成年斑马鱼体内也同样适用。此外，由osr2:EGFP标记的斑马鱼近端曲细管片段长度较短且重叠现象少见，便于对肾单位进行计数。Tg(osr2:EGFP)转基因品系的构建同时伴随osr2活性的敲除。值得注意的是，研究结果表明osr2失活对Tg(osr2:EGFP)斑马鱼肾单位的发育和再生无显著影响。总体而言，该转基因斑马鱼品系的建立为近端曲细管的遗传学和化学分析提供了极具价值的研究工具。

引言

近端小管（PT）是肾单位的关键组成部分，负责对肾小球滤过液进行大部分的重吸收与处理。它包含两个不同的节段：近曲小管（PCT）和近端直小管（PST）。在哺乳动物中，近曲小管以其卷曲的结构为特征，而近端直小管则呈直形，无卷曲结构。功能上，两个节段具有相似的作用，包括重吸收水、葡萄糖、氨基酸和离子，以及排泄代谢废物。不过，这些功能主要由近曲小管完成，近端直小管的贡献相对有限。受损的近曲小管细胞在急性肾损伤（AKI）、慢性肾病和糖尿病肾病的发病机制中发挥关键作用。鉴于斑马鱼与哺乳动物近曲小管的基因高度保守，斑马鱼模型在近曲小管发育及疾病研究中具有重要价值。

组织特异性转基因技术已成为研究组织发育的宝贵工具。在斑马鱼中，已构建出多种携带荧光蛋白的转基因品系，用于可视化肾脏器官形态发生。例如，转基因品系Tg(cdh17:DsRed)（品系编号：ZDB-FIG-230223-3）可标记肾小管。Tg(dβh:GFP)斑马鱼品系利用多巴胺-β-羟化酶（dph）启动子驱动绿色荧光蛋白（GFP）表达，从而标记近端小管（PT）的发育。另一种转基因品系Tg(ret1:GFP)在ret基因座的驱动下表达GFP，可标记最远端的前肾管[。表达GFP的ET33-D10斑马鱼品系可标记近端小管。此外，Tg(gtshβ:GFP)斑马鱼品系在石斑鱼 gtshβ 启动子详细说明了转基因斑马鱼品系中垂体催乳素细胞（PCT）的发育过程。尽管取得了这些进展，但用于可视化垂体催乳素细胞发育和形态发生的特异性内源性转基因品系仍然缺乏。

编码锌指蛋白的osr2基因在小鼠等高等脊椎动物中被检测到。对小鼠osr2突变株的研究表明，该基因在内胚层、腭、骨骼、牙齿以及四肢滑膜关节的正常模式形成中发挥着关键作用。值得注意的是，osr2已被证实是腭发育的关键调控因子，也是与人类腭裂形成相关的潜在候选基因。此外，osr2在肾脏中表达，且在非洲爪蟾和斑马鱼的基因组中也发现了该基因的存在，其在这两种生物中似乎对肾脏的形成有一定作用。以往的研究证实，osr2是斑马鱼原肾发育所必需的，这一点可通过osr2在原肾中的表达以及osr2敲低胚胎出现心包水肿得到证明。然而，也有研究得出了相反的结论，即osr2敲低胚胎的肾脏发育并未出现异常。因此，还需要更多的证据来明确osr2的具体作用。

本研究利用CRISPR/Cas9敲入技术成功构建了Tg(osr2:EGFP)转基因斑马鱼品系。研究结果表明，osr2可作为近端曲小管（PCT）的可靠标记物。Tg(osr2:EGFP)肾脏中的EGFP表达能够实现对近端曲小管的标记。值得注意的是，肾单位的结构复杂性为其计数带来了挑战。传统上，原位杂交技术被用于肾单位计数，但该方法耗时且操作复杂。相比之下，osr2:EGFP标记的片段长度较短且重叠现象少见，为高效计数肾单位提供了实用优势。此外，研究发现，Tg(osr2:EGFP)转基因鱼中osr2基因的失活并未对肾脏的发育和再生产生不利影响，其结果与对照组相当。总体而言，本研究凸显了Tg(osr2:EGFP)斑马鱼品系作为创新资源的应用价值，可用于遗传或化学背景下近端曲小管的发育、再生及相关研究。

结果

osr2 在斑马鱼近端肾小管上皮细胞中的表达

为探究 osr2 在斑马鱼肾脏中的表达模式，我们对已发表的单细胞数据进行了重新分析RNA测序（scRNA-seq）数据（GSE100910）。对scRNA-seq数据的分析显示，osr2在近端小管上皮细胞（PTECs）中表达（图1A和B）。由于近端小管（PT）由近曲小管（PCT）和近直小管（PST）组成，我们旨在进一步验证osr2在斑马鱼肾脏近端小管中的表达模式。为此，基于在近曲小管（PCT）中特异性高表达的标记基因slc20a1a以及在近直小管（PST）中特异性高表达的标记基因slc13a1和slc13a3，我们使用Seurat（4.2.0版）将近端小管上皮细胞群分为近直小管细胞（PSTCs）和近曲小管细胞（PCTCs）亚群（图1C）。值得注意的是，分析表明osr2的表达定位于斑马鱼肾脏的近曲小管（图1F）。此外，热图展示了多个近曲小管标记基因的表达情况，包括osr2、slc20a1a、slc6a19b、epdl2、slc7a7、slc34a1a等（图1D）。既往研究已证实slc20a1a是近曲小管的标记基因，我们的研究结果与这一发现一致，表明slc20a1a和osr2均在近曲小管中表达（图1D-F）。综上，这些研究结果表明，osr2可作为一种有价值的新型标记基因，用于近曲小管的特征鉴定和相关研究。

图1. osr2在斑马鱼肾脏中的表达模式。A-B：单细胞RNA测序分析显示osr2在近端小管上皮细胞中表达。tSNE图展示了斑马鱼肾脏细胞簇及osr2的表达情况。造血干细胞；肾祖细胞；肾多纤毛细胞；巨噬细胞髓系；肾黏蛋白；血管内皮细胞；远端小管上皮细胞；近端小管上皮细胞。C：远端小管上皮细胞簇被分为近端直小管细胞和近端曲小管细胞亚群。D：热图展示了C中近端曲小管细胞或近端直小管细胞内部分基因的相对对数表达量。E-F：各亚群中slc20a1a和osr2的表达分析。近端曲小管上皮细胞；近端直小管上皮细胞。

斑马鱼中osr2:EGFP标记近端曲小管

为进一步确定osr2能否作为PCT标记物，我们设计了靶向斑马鱼osr2第二个内含子的短向导RNA（sgRNA）。随后将该sgRNA与zCas9 mRNA共注射至单细胞期斑马鱼胚胎中，切割效率约为16%。接下来，我们构建了供体质粒osr2-P2A-GFF，该质粒由四部分组成：左臂、P2A-GFF编码序列、右臂以及crayy-EGFP（图2A）。该方法实现了整个供体质粒片段的敲入（基因组定位：GRCz11；16号染色体：54404070–54404071；基因ID：ENSDARG00000038006），从而获得TgKI(osr2:GFF)斑马鱼（图2B；图S1），相关细节已提交至斑马鱼数据库ZFIN（品系ID：ZDB-ALT-231019-1）。对F1代子代的PCR和测序分析验证了其各自F0代亲本的基因组整合可遗传，我们选用携带(osr 2^{-12})（内含子中12 bp缺失）的TgKI(osr2:GFF)斑马鱼用于后续的饲养和实验（图2C；图S2）。随后，我们通过RT-PCR检测了TgKI(osr2:GFF)纯合子和野生型（WT）斑马鱼中osr2的转录情况（图2D、E），未在TgKI(osr2:GFF)纯合子中检测到完整的osr2转录本。因此，TgKI(osr2:GFF)纯合子中osr2的完整阅读框被破坏。鉴于GFF可通过其识别序列（上游激活序列，UAS）激活转录，位于UAS下游的基因可在表达GFF的细胞中表达[24]。Tg(UAS:EGFP)转基因报告鱼在UAS下游携带EGFP基因，可在GFF阳性的细胞和组织中特异性表达EGFP。我们将TgKI(osr2:GFF)与Tg(UAS:EGFP)杂交，获得TgKI(osr2:GFF) × Tg(UAS:EGFP)，简称为Tg(osr2:EGFP)，并在胚胎的前肾区域观察到EGFP的表达（图2F、G）。根据其表达模式和形态特征，我们推测表达EGFP的定位于近端曲小管（PCT）内。为进一步验证这一点，我们采用近端曲小管经典标记物slc20a1a的整体原位杂交（WISH）作为参照，验证osr2:EGFP的表达区域为近端曲小管。结果显示slc20a1a与osr2:EGFP在同一位置表达，表明osr2:EGFP可标记近端曲小管（图2H–K），这与单细胞数据分析的结果一致。

图2.内含子靶向介导的供体质粒在斑马鱼osr2基因座上的敲门。A：使用CRISPR/Cas9系统在斑马鱼osr2基因座上生成GFF敲门的内含子靶向介导策略的示意图。sgRNA靶的序列以红色显示，原间隔相邻基序（PAM）序列以绿色描绘。供体质粒的右臂和左臂序列由棕色线条表示。左臂为840 bp，右臂为840 bp。在供体质粒与zCas9 mRNA和sgRNA共注射后，整个供体质粒fregment被整合到osr2基因座中。斑马鱼osr2有4个外显子，E2、E3和E4分别代表第2、3和4个外显子。B：来自3#创始人的F1后代的3'和5'连接的PCR分析。F1、R1、F2和R2引物显示在四个供体质粒敲门F0创始人的F1后代的A. C：5'连接序列中。indel突变以红色突出显示。D：osr2在TgKI（osr2：GFF）和WT斑马鱼中的转录示意图。E：RT-PCR用于验证osr2和GFF在TgKI（osr2：GFF）和WT斑马鱼中的转录（每组(n=3)生物复制）。F：获得TgKI（osr2：GFF）纯合子、TgKI（osr2：GFF）杂合子和Tg（osr2：EGFP）转基因鱼的示意图。G：24 hpf时Tg（osr2：EGFP）胚胎的体内共聚焦图像（背视图）显示EGFP在前肾中的表达，如红色箭头所示。标尺条，500μm。H-K：的表达模式H：24 hpf胚胎中slc20a1a表达模式的WISH分析（侧视图）。I：osr2的体内共聚焦图像（侧视图）：24 hpf的EGFP胚胎。后肠（白色箭头）。J：24 hpf胚胎中slc20a1a表达模式的WISH分析（背视图）。K：24 hpf的Tg（osr2：EGFP）胚胎的体内共聚焦图像（背视图）。hom，纯合子；het，杂合子；pA，聚（A）。H至K中的比例尺，500μm。（关于本图例中对颜色的引用的解释，读者参考本文的网络版。）

Tg(osr2:EGFP)斑马鱼胚胎发生过程中EGFP的动态表达模式

此前已有研究记录了osr2在斑马鱼胚胎发育过程中的多种组织中的表达，包括原肾、胸鳍芽和肠道。为了评估Tg(osr2:EGFP)能否真实反映内源性osr2的表达，我们通过立体荧光显微镜对osr2:EGFP的表达模式进行了动态分析。通过观察，我们确定osr2:EGFP在原肾管近曲小管（PCT）中表达（图3A）。随着胚胎发育的进行，被osr2:EGFP标记的原肾管近曲小管出现了逐渐聚集并向前卷曲的现象（图3B-D）。此外，在48小时至120小时胚胎发育阶段（hpf），胸鳍、第一咽弓和神经细胞中也检测到了osr2:EGFP的表达（图3A-D）。先前的研究表明，osr2最早在24小时胚胎发育阶段于后肠上皮细胞中表达，并在48小时胚胎发育阶段于后肠和肠间充质中表达。为了进一步验证osr2:EGFP在肠道中表达，我们将Tg(osr2:EGFP)与特异性标记前肾近曲和远曲小管的Tg(cdh17:DsRed)进行杂交。结果显示，在48小时和72小时胚胎发育阶段，后肠中表达osr2:EGFP的细胞位于肾小管下方（图3E和F）。随着胚胎发育，后肠形态发生表现出逐渐聚集的特征（图3G和H）。综上，这些研究结果表明Tg(osr2:EGFP)转基因鱼能够准确反映内源性osr2的表达模式。

图3. Tg(osr2:EGFP)转基因品系整个胚胎发生过程中动态EGFP表达模式。A-D：分别展示了Tg(osr2:EGFP)胚胎在48小时pf、72小时pf、96小时pf和120小时pf时的原肾管背侧视图。在这些阶段，EGFP在原肾管区域（红色箭头指示）以及胸鳍（白色箭头指示）中表达。E-F：展示了不同发育阶段Tg(osr2:EGFP;cdh17:DsRed)胚胎的侧视图。可观察到后肠（白色箭头）和肠腔（*）。het，杂合子。A至H的比例尺为500微米。（关于本图图例中颜色参考的解释，请参阅本文的网络版本。）

Tg(osr2:EGFP) 标记原肾管近端曲小管的形态发生

为进一步明确 Tg(osr2:EGFP) 可标记近端曲小管（PCT）的形态发生过程，我们采用共聚焦显微镜观察了EGFP在PCT中的表达模式。观察结果显示，发育中肾脏内的EGFP荧光信号最初在约20小时胚胎期（hpf）于背侧上方被检测到。至24小时胚胎期，EGFP荧光延伸至卵黄囊上方，呈现出双侧管状结构（图4A）。为给osr2标记PCT形态发生提供更多证据，我们将Tg(osr2:EGFP)与Tg(cdh17: DsRed)进行杂交。随后，我们追踪了24至120小时胚胎期胚胎中osr2:EGFP和cdh17:DsRed的表达模式（图4A–E）。研究结果表明，在整个胚胎发育过程中，EGFP与DsRed在PCT中均存在共表达，且该表达状态持续至成体阶段。表达slc20a1a的PCT从线性管状结构转变为卷曲结构的时间进程此前已有研究表征。我们通过osr2:EGFP标记观察到的PCT形态发生时间进程与上述研究结果一致。因此，结合单细胞分析、原位杂交及转基因斑马鱼的实验结果，我们认为osr2是PCT的一个新型标记基因。

图4. 在Tg(osr2:EGFP)胚胎中，原肾管（PCT）的形态发生由EGFP标记。A-E：展示了在指定阶段同时被EGFP和DsRed标记的PCT细胞的背侧视图，对应((n=6))。可观察到osr2:EGFP在胸鳍中的表达（红色箭头）。A至E的比例尺为200微米。（若要解读本图图例中的颜色参考，请读者查阅本文的网络版本。）

osr2突变体不影响斑马鱼近端曲小管的发育

以往关于osr2在斑马鱼肾脏发育中作用的研究得出了相互矛盾的结果。因此，收集更多证据以明确osr2的影响至关重要。在我们的敲入策略中，整个供体质粒被整合到斑马鱼基因组中（图2A、B及补充图S1），导致TgKI（osr2:GFF）纯合子中osr2的完整阅读框被破坏（图2D、E）。因此，TgKI（osr2:GFF）纯合子为突变体，而上述发育研究采用的是TgKI（osr2:GFF）杂合子，其对胚胎发育未表现出任何可识别的影响。为探究osr2突变体是否会影响胚胎发生，我们使用体视显微镜观察了Tg（osr2:EGFP;cdh17:DsRed）斑马鱼胚胎的生长情况。结果显示，osr2失活的Tg（osr2:EGFP;cdh17:DsRed）斑马鱼胚胎中，近曲小管（PCT）和肾小管的形态与发育情况与对照组无明显差异（图5A-J）。此外，TgKI（osr2:GFF）纯合子斑马鱼的其他组织（第一咽弓、胸鳍和神经元细胞）也未发现明显缺陷。我们认为osr2失活对肾单位的发育无影响，这可能与osr2旁系同源基因的互补作用有关。同时，我们还检测到通过qRT-PCR检测了osr2旁系同源基因osr1在胚胎期和成年期TgKI（osr2:GFF）纯合子及野生型斑马鱼肾脏中的转录水平，但未发现osr1 mRNA存在明显上调（图5K）。综上，我们认为osr2失活似乎对斑马鱼肾脏发育没有显著影响。

图5. TgKI(osr2:GFF)纯合子和TgKI(osr2:GFF)杂合子的胚胎形态。A-J：利用Tg(osr2:EGFP;cdh17:DsRed)背景展示TgKI(osr2:GFF)杂合子（A-E）和TgKI(osr2:GFF)纯合子（F-J）的胚胎发育形态，显示了指定阶段近曲小管（PCT）和肾小管的发育情况 ((n=6))。K：对胚胎期和成年期TgKI(osr2:GFF)纯合子及野生型（WT）斑马鱼肾脏中osr1的qRT-PCR分析（每组进行(n=3)次生物学重复）。纯，纯合子；杂，杂合子。A至J的比例尺为500皮米。K中的数据采用双侧t检验分析，以平均值±标准差表示。

osr2:EGFP 成年斑马鱼为检测肾单位再生提供了有价值的工具

鱼类肾脏在损伤后具有全新再生肾单位的显著能力，这一过程被称为肾脏再生。在损伤刺激下，肾祖细胞（RPCs）会经历聚集过程，随后快速增殖并进一步分化为新的肾单位，为新肾单位的再生数量统计提供了基础。尽管肾单位再生具有重要意义，但由于肾单位结构本身的复杂性，目前仍缺乏便捷有效的肾单位再生数量统计方法。本研究结果显示，osr2:EGFP在整个胚胎发育过程中均在近端曲小管（PCT）中表达（图4），并持续至成年阶段（图6B、C）。鉴于每个肾单位仅包含一段近端曲小管，对近端曲小管片段再生情况的评估可近似反映肾单位的再生速率。在Tg(osr2:EGFP)转基因鱼中观察到的标记片段短小且极少重叠，因此该模型为检测肾单位再生速率提供了有效工具。由此可见，Tg(osr2:EGFP)斑马鱼的应用极大地推动了肾单位再生数量的统计工作。

随后，本研究旨在探究osr2基因失活对Tg(osr2:EGFP)斑马鱼肾单位再生的潜在影响。为实现这一目标，我们依据构建急性肾损伤（AKI）模型的示意图（图6A），通过向成年斑马鱼腹腔注射经典肾毒性药物庆大霉素（Gent；2.7 μg/μL，每尾鱼20 μL），诱导其发生急性肾损伤。研究结果表明，与未损伤的肾脏相比，TgKI(osr2:GFF)纯合子和杂合子在损伤后4天、6天和8天的肾单位再生速率相近，分别约为18%、50%和80%（图6D-L）。综上，本研究认为与对照组相比，osr2基因的失活可能不会影响Tg(osr2:EGFP)斑马鱼的肾单位再生过程。

图6. 肾损伤后Tg(osr2:EGFP)成年斑马鱼中(EGFP)细胞的再生。A：成年斑马鱼腹腔注射庆大霉素构建急性肾损伤（AKI）模型的示意图。B：显示osr2:EGFP和cdh17:DsRed共标记的成年斑马鱼近端曲小管（PCT）细胞的共聚焦图像，对应((n=6))。A中比例尺为100微米。C：B中框选区域的高倍放大图像。比例尺为200微米。D-G：在损伤后指定时间点，利用osr2:EGFP背景展示TgKI(osr2:GFF)纯合子中近端曲小管的状态，对应((n=6))。比例尺为100微米。H-K：在损伤后指定时间点，利用osr2:EGFP背景展示TgKI(osr2:GFF)杂合子中近端曲小管的状态，对应((n=6))。比例尺为100皮米。L：损伤后，使用ImageJ统计TgKI(osr2:GFF)纯合子和杂合子的肾脏再生率（每组(n=5)次生物学重复）。hom代表纯合子；het代表杂合子。A至J中比例尺为500微米。

讨论

转基因技术具有诸多优势，例如便于整合含荧光蛋白和目的基因的片段，从而实现实验动物的早期筛选。本研究利用CRISPR/Cas9敲入技术构建了Tg(osr2:EGFP)斑马鱼。研究发现增强型绿色荧光蛋白（EGFP）在肾脏、胸鳍和肠道中表达，其模式与内源性osr2的表达谱一致。因此，Tg(osr2:EGFP)能够真实反映osr2在体内的表达情况。通过追踪EGFP的表达，我们可以研究近端曲小管（PCT）的发育。综上，Tg(osr2:EGFP)转基因斑马鱼品系的建立为后续研究斑马鱼近端曲小管发育奠定了重要基础。

肾脏近曲小管（PCT）在肾小管内电解质和水平衡的分泌、重吸收及维持过程中发挥关键作用。然而，目前仍缺乏标记PCT发育的转基因鱼品系。两种由肾脏特异性启动子（cdh17和enpep）驱动的荧光标记转基因品系Tg(pt305(cdh17:EGFP))和Tg(enpep:GFP)能够标记近端小管（PT），但这些转基因品系也会在其他肾小管细胞中发出荧光。由石斑鱼gtshβ启动子驱动的转基因斑马鱼品系Tg(gtshβ:GFP)会在垂体和肾脏中表达绿色荧光蛋白（GFP），并可标记PCT和近端直小管（PST）节段的发育细节。但目前仍缺乏能清晰标记PCT的内源性斑马鱼品系。本研究通过重新分析先前发表的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据（GSE100910），发现osr2是标记PCT的新型标志物（图1）。已有研究表明osr2参与肾脏发育，且osr2在肾脏中的表达时间早于slc20a1a，这使其能够更好地追踪PCT的形态发生过程。因此，构建Tg(osr2:EGFP)转基因斑马鱼品系为追踪PCT的形态发生提供了极具价值的工具。

肾单位是结构高度复杂的组织，且彼此紧密相邻，这使得肾单位计数工作颇具挑战性。此前已有人采用原位杂交等方法开展肾单位计数研究，但这些方法操作复杂且耗时。另一种方法是使用40千道尔顿的荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖，这种物质可被导管细胞摄取，进而实现肾单位计数。不过，该方法标记的片段过长，给肾单位计数带来了困难。相比之下，Tg(osr2:EGFP)转基因鱼能够标记近端曲小管片段，其标记的片段更短且重叠度更低，因此非常适用于肾单位计数。

为构建TgKI(osr2:GFF)斑马鱼品系，研究人员借助CRISPR/Cas9技术将供体质粒插入斑马鱼基因组（基因组定位：GRCz11；16号染色体：54404070–54404071；基因ID：ENSDARG00000038006）（图2A-E）。随后将该品系与Tg(UAS:EGFP)斑马鱼杂交，获得Tg(osr2:EGFP)品系（图2F、G）。值得注意的是，osr2完整阅读框的破坏导致了osr2基因失活。尽管如此，本研究发现osr2基因失活的TgKI(osr2:GFF)斑马鱼胚胎发育过程中未出现明显异常（图5）。为探究osr2基因失活对肾单位再生的影响，研究人员通过腹腔注射庆大霉素诱导成年斑马鱼发生急性肾损伤（AKI），并对肾单位再生情况进行评估。结果显示，osr2基因失活并未影响成年斑马鱼的肾单位再生（图6）。基于上述研究结果，我们得出结论：osr2基因失活可能对斑马鱼近曲小管（PCT）的发育和再生无显著影响。

在此，TgKI(osr2:GFF)纯合子和杂合子均能正常生长至成年并正常繁殖。osr2基因失活的斑马鱼未观察到明显缺陷；然而，吗啉代实验的数据却得出了相互矛盾的结果，部分研究表明存在缺陷，而另一些研究则未发现此类异常。因此，我们需要排除吗啉代的副作用。此外，当基因突变导致功能完全丧失时，会触发遗传补偿反应，促使机体增加其他基因的表达以替代其功能，保障正常的发育和存活。研究发现，斑马鱼、小鼠或拟南芥等多种生物中，基因敲除突变所触发的遗传补偿反应是促成遗传稳健性的一种机制。为了确定osr2功能丧失是否因遗传补偿效应而未影响斑马鱼的生长，我们检测了osr2旁系同源基因osr1的转录水平，发现osr1的转录水平未发生变化（图5K）。本研究结果既无法排除吗啉代寡核苷酸的副作用，也无法排除遗传补偿反应的影响。因此，osr2是否影响肾脏发育仍需后续的详细研究。

本研究利用CRISPR/Cas9敲入技术成功构建了Tg(osr2:EGFP)斑马鱼品系。该斑马鱼品系可通过追踪EGFP信号，动态观察原肾管近端曲小管（PCT）整个生命周期的发育进程，是极具价值的研究模型。此外，该转基因鱼系还可实现肾单位再生的定量分析。综上，Tg(osr2:EGFP)斑马鱼品系是筛选与PCT发育相关突变体，以及靶向PCT发育及相关疾病的潜在药物的理想工具。

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苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。