题目：Demarcation of Topologically Associating Domains Is Uncoupled from Enriched CTCF Binding in Developing Zebrafish

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32334414/

期刊：iScience

研究亮点

l 利用标记的ctcf等位基因鉴定斑马鱼胚胎中的CTCF结合位点

l 启动子处的CTCF结合与基因表达水平相关

l 斑马鱼胚胎拓扑结构域边界没有一般CTCF富集

概要

CCCTC-结合因子（CTCF）是一种保守的结构蛋白，在基因调控和三维（3D）染色质组织中起着至关重要的作用。为了更好地了解脊椎动物基因组组织的机制和进化，我们利用内源表位标记的CTCF敲入等位基因分析了斑马鱼CTCF的基因组占有率。斑马鱼CTCF与其哺乳动物对应物具有相似的方面，包括与增强子、活性启动子和重复元件的结合，以及其结合位点的二分序列基序。然而，我们发现体内CTCF结合在发育中的斑马鱼拓扑关联域（TADs）的边界处并不丰富，而TAD通过染色质标记划分与哺乳动物没有区别。我们的数据表明，3D染色质组织的一般机制，特别是CTCF在此过程中的参与，在遥远的脊椎动物物种之间有所不同。

图文摘要

引言

CCCTC-结合因子（CTCF）是基因表达的关键调节因子，在哺乳动物基因组的3D组织中起着核心作用。在哺乳动物中，CTCF在拓扑上划定关联域（TAD）边界，这些区域中CTCF位点的破坏导致相邻域之间形成异位接触。CTCF及其在基因调控中的作用在整个双足动物中是保守的，而CTCF在3D基因组组织中的功能在无脊椎动物和脊椎动物之间发生了分化。与哺乳动物相比，果蝇CTCF对于胚胎发生不是必需的，其结合在TAD边界处没有富集。鉴于CTCF在果蝇和哺乳动物中的功能差异，其他非哺乳动物脊椎动物物种中的CTCF分析对于理解3D染色质组织的进化和调节是关键。虽然CTCF在斑马鱼发育中的功能以前已经被探索过，但迄今为止在斑马鱼中还没有实现全基因组CTCF体内结合数据。与哺乳动物类似，预测的CTCF结合基序在斑马鱼中的TAD边界以不同的方向分布，表明CTCF在TAD划界中的保守作用。在这里，我们使用ctcf的表位标记等位基因确定并表征CTCF在斑马鱼胚胎发育中的占有率。虽然斑马鱼CTCF的几个基因调控功能类似于哺乳动物，但在斑马鱼胚胎的TAD边界上没有检测到体内CTCF占用的富集，这表明CTCF在脊椎动物之间的3D基因组架构中的功能差异。

结果和讨论

使用ctcf HPSH斑马鱼等位基因鉴定体内CTCF结合位点

为了确定斑马鱼基因组中的CTCF占有率，我们生成了一个标记的ctcf等位基因，其中在ctcf的起始密码子之后的框架中插入了一个三方HA-PreScsion-He标签，从而产生了由HPSH标记的N-末端内源性CTCF（ctcf HPSH等位基因）（图1A和S1A以及透明方法）。我们确认了ctcf HPSH/HPSH斑马鱼中标记蛋白的表达（图1B）。纯合ctcf HPSH/HPSH斑马鱼发育正常，存活且可育，表明CTCF的功能不受标签的影响（图S1B和S1C）。24小时后受精（hpf）ctcf HPSH胚胎中CTCF结合的染色质免疫预处理测序（ChIP-seq）分析显示生物重复之间的高度相关性（图1C和S1D），并证实了先前报道的CTCF与其启动子的自动调节结合（图S1E）。在从两个重复合并的ChIP-seq数据中，我们确定了36,540个CTCF峰，显示出比随机对照区域更高的phastCons序列保守性（图1D和透明方法）；仅考虑不重叠外显子的CTCF峰时也观察到相同的趋势（图S1F）。值得注意的是，在斑马鱼基因组中识别的CTCF峰的数量大致对应于哺乳动物基因组中的CTCF位点的数量。因此，ctcf HPSH斑马鱼等位基因能够可靠且可重复地检测斑马鱼基因组中的体内CTCF占有率。

图1.斑马鱼中CTCF结合的鉴定（A）ctcf HPSH斑马鱼等位基因的示意性表示。橙色和紫色框分别表示插入的序列和外显子。（B）在野生型（WT）和ctcf HPSH/HPSH整个胚胎和成人大脑的提取物上使用抗血凝素（HA）抗体进行蛋白质印迹。分子量在右侧表示。Y-微管蛋白作为加载控制。（C）轨道显示CTCF峰（紫色条）的例子在神经d2和mycla基因座（都位于反向链上）。显示的信号分布和峰对应于生物重复（Rep 1，Rep 2）。信号在y轴上表示为CTCF ChIP-seq信号的(-log10)（p值）。（D）CTCF峰和控制区的平均序列守恒的分布使用峰中心作为参考点。另见图S1和表S1和S2。

脊椎动物CTCF结合位点的共同特征

由于哺乳动物CTCF在建立增强子-启动子相互作用中的功能，我们分析了斑马鱼CTCF在24-hpf斑马鱼胚胎中组蛋白修饰和DNA可及性方面的结合（表S1和S2以及透明方法）。我们发现斑马鱼CTCF峰富集用于平衡（H3K4me1）、活性（H3K4me3、H3K27ac）和可及染色质（ATAC-seq），但不富集于非活性染色质（H3K27me3）（图2A）。此外，de novo motif发现发现了一个20-bp核心基序，该基序存在于78%的CTCF峰中，并且与人类CTCF基序比人类CTCFL或果蝇CTCF基序更相似（正如对其他脊椎动物物种的报道，我们还确定了富集的CTCF上游基序，通过8-或12bp间隔物与核心基序分离（图2C和S2A）。类似于哺乳动物CTCF结合位点，其中一部分通过重复元件的逆向转座在基因组中繁殖，非自治DNA转座子在CTCF结合位点上显着富集（图2D、S2B、S2C和表S3）。综上所述，我们的分析表明斑马鱼和哺乳动物CTCF结合位点具有相似的特征。

图2. CTCF峰与结合位点的特征分析(A)按显示区域CTCF ChIP-seq信号从高到低排序的CTCF峰处四种组蛋白修饰和ATAC-seq数据的热图谱。ATAC-seq的归一化信号以每百万映射片段数（FPM）表示，组蛋白修饰的归一化信号以每百万每千碱基读取数（RPKM）表示。所有数据集均对应24小时 post-fertilization（hpf）的斑马鱼胚胎阶段。(B) 代表CTCF和CTCF基序分层聚类结果的树状图。36540个CTCF ChIP-seq峰中，共有28538个包含至少一个与斑马鱼基序匹配的位点，而36540个对照序列中仅有7360个包含匹配位点。x轴上每个位置的信息量以y轴的比特数表示。Ncor为归一化皮尔逊相关系数。(C) 直方图显示CTCF核心基序与上游基序在不同间距（6–25碱基对）下的共现次数。无显著富集的间距以灰色表示，富集间距以粉色表示，最高富集间距以红色表示。下图为利用与CTCF核心基序指定距离处的参考基序匹配的序列推导的上游基序。x轴上每个位置的信息量以y轴的比特数表示。(D) 富含CTCF结合位点的前五类DNA转座子类型。y轴显示至少重叠一个CTCF基序的重复序列比例。对于对照区域，展示了通过自举分析计算的平均值和标准差（误差棒）。另见图S2、表S1–S3及数据S1。

启动子处CTCF丰度与基因表达水平相关

虽然CTCF峰主要位于内含子和基因间区域，但6%的峰出现在启动子内（图3A）。在人类中，启动子和基因内区域的一部分CTCF位点参与循环这些因素会影响外显子的包含情况，这也为斑马鱼中存在类似机制提供了可能性。由于现有斑马鱼高通量染色体构象捕获（Hi-C）数据的分辨率仅为20千碱基对，无法对这类环状相互作用进行研究，我们旨在确定CTCF结合启动子的基因的独特特征。所有在启动子区域表现出CTCF结合的基因，均根据CTCF峰的信号强度被分为三类，信号强度从高（前10%分位数）到低（后10%分位数）不等（图3B及透明方法部分）。我们发现，无论CTCF基序相对于转录的方向如何，其存在与CTCF结合丰度均呈正相关（图S3A）（((x)) 独立性检验，p值 (≤7.9 ×10^{-10})）。启动子处CTCF结合丰度的增加也与基因表达水平的提高（图3C）以及DNA可及性的提升（图3D）呈正相关。值得注意的是，启动子处的CTCF结合并非仅仅是染色质开放状态的反映，因为我们还发现了一些ATAC-seq信号较高但无CTCF结合的启动子（图S3B）。CTCF启动子结合丰度高的基因，其组蛋白修饰信号也较高，这些组蛋白修饰分别与增强子（H3K4me1、H3K27ac）、活性启动子（H3K4me3、H3K27ac）以及转录延伸相关（图S3C-S3F）。相比之下，我们未发现抑制性染色质修饰（H3K27me3）与CTCF结合丰度之间存在相关性（图S3G），但在CTCF结合启动子处，H3K27me3这一抑制性修饰的富集程度总体上高于无CTCF峰的启动子（图S3H）。综上，我们的研究结果表明，启动子处的CTCF结合通常与有利于转录的染色质状态相关。这一现象可由CTCF参与核小体缺失区域的形成来解释，也可能反映了CTCF在特定细胞类型中结合以阻止异位基因表达的作用，这与此前关于斑马鱼runx1顺式调控元件的研究报道一致。

图3. 启动子处CTCF结合的高丰度与高基因表达水平相关(A)不同斑马鱼基因组区域中CTCF峰的分布。百分比代表每个类别的CTCF峰数量。(B) 启动子区域的平均CTCF ChIP-seq信号图谱。每条线代表启动子处CTCF丰度定义的三类基因之一（低、中、高）或无CTCF峰的启动子（无峰）。(C) 分层基因类别和启动子处无CTCF峰的基因的表达情况。根据双侧Wilcoxon秩和检验((p value ≤1.5 ×10^{-5} ))，分布差异标注为显著（*）和不显著（n.s.）(D) 按(B)中所述的CTCF丰度定义的各类基因启动子区域的平均ATAC-seq信号图谱。另见图S3。

斑马鱼胚胎中TAD边界处不存在CTCF结合的富集现象

接下来，我们试图通过分析CCCTC结合因子（CTCF）在拓扑关联结构域（TAD）边界的分布，探究其在斑马鱼3D基因组组织中的作用。对现有24小时受精后（hpf）的高通量染色体构象捕获（Hi-C）数据的可视化分析显示，着丝粒与端粒的相互作用富集，且信号在染色体上的分布不均（图S4A），这一现象在发育早期阶段更为显著（图S4B）。尽管这种信号分布反映了细胞分裂周期中染色体连续臂配对的拉布（Rabl）构型以及24小时受精后胚胎的细胞周期异质性（图S4B和S4C），但我们仍通过绝缘评分法鉴定出1307个拓扑关联结构域（中位数(size =580 ~kb)）（图S4D、表S4及透明方法）。之所以能实现这一鉴定，是因为24小时受精后的Hi-C图谱是分裂期细胞和间期细胞中相互作用的综合结果，而这两种细胞分别以拓扑关联结构域的缺失和存在为特征。

尽管带注释的CTCF基序在TAD边界的可访问染色质位点中富集，但这种富集并非边界特异性的，因为它也在TAD内的可访问位点中被发现富集（富集编号(p values <1 ×10^{-20})) 图S5A）。我们的分析显示，计算机预测的CTCF位点及其反向方向偏好在TAD边界的可访问染色质中存在中等程度的富集，这与之前的研究报告一致（图4A和S5B）。与小鼠CTCF类似，只有一小部分斑马鱼CTCF峰位于TAD边界（图S5C）。然而，与哺乳动物中TAD边界处CTCF结合富集的情况不同（图4B），在24小时pf的斑马鱼胚胎中，CTCF峰和体内鉴定的CTCF基序均未在TAD边界处富集（图4C和S5D）。为了排除分析偏差，我们采用了反向绝缘方法并确定了层级结构域。与哺乳动物 CTCF 形成对比，且与我们上述斑马鱼的研究结果一致，研究未发现斑马鱼 CTCF 富集程度明显达到最大值的互作绝缘值（图 S5E、S5F 及透明方法部分），这可能反映了基因组序列组成的变异性较低。同样，我们发现在互作绝缘值为 72.5%（即边界与 CTCF 峰 summit 重叠百分比最高的数值）所确定的结构域边界处，不存在斑马鱼 CTCF 富集现象（图 S5G）。与先前的研究报道一致，我们发现斑马鱼 TAD 边界处富集与活性转录相关的染色质标记（图 4D、4E），缺乏 H3K27me3 抑制性标记（图 4F），且未检测到 H3K27ac 富集（图 S5H），这表明斑马鱼 TAD 边界的生化特征与哺乳动物相似。本研究结果并非意味着 CTCF 对斑马鱼基因组中 TAD 的建立不可或缺，因为我们发现 TAD 边界处开放染色质内的预测 CTCF 基序存在中度富集，且基序方向存在偏好性；但这些结果表明，与哺乳动物不同，斑马鱼 TAD 边界与 CTCF 高度富集之间并无强相关性。值得注意的是，需进一步研究以确定这种 CTCF 的中度富集是否足以在斑马鱼中建立 TAD 边界。此外，有理由推测，与果蝇及其他缺乏该结构蛋白的真核生物类似，其他结构蛋白或活性染色质状态可能在斑马鱼 TAD 建立过程中发挥作用。有趣的是，与 TAD 分布紧密相关的复制时序与斑马鱼的转录状态相关，这为上述假设提供了支持。此外，研究斑马鱼中 CTCF 与黏连蛋白结合的共定位情况也十分重要，因为哺乳动物中介导与黏连蛋白相互作用的 N 端 CTCF 区域，其氨基酸组成在斑马鱼中存在差异。事实上，这一 N 端区域在 CTCF 富集于 TAD 边界的生物（包括哺乳动物和鸡）中高度保守，但在 CTCF 不界定 TAD 边界的果蝇中则不保守。因此，斑马鱼中 CTCF 与黏连蛋白相互作用的潜在差异，或许能解释其 TAD 边界处缺乏 CTCF 富集的现象。后续需在特定细胞类型中开展 CTCF/黏连蛋白的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和高通量染色体构象捕获（Hi-C）分析，并结合单细胞技术，以进一步探究 CTCF 在斑马鱼基因组高阶组织中的功能。

图4. 活性染色质修饰而非CTCF在TAD边界处富集(A) 24小时pf斑马鱼中，以TAD边界为中心的600千碱基区域（x轴）上，ATAC-seq峰（紫色）内预测的CTCF基序的分布。y轴显示位于每个基因组位置的600千碱基区域中总峰数的百分比。虚线代表平均背景分布，灰色带表示相对于平均值的G1标准差范围。通过Z评分评估平均百分比（中心60千碱基）的差异。无显著性差异，n.s.；*p < 1 (^{*} p<1 ×10^{-5}) (* p<1 ×10^{-20}) (B) 参照(A)中的描述，相对于小鼠胚胎干细胞中鉴定的TAD边界，CTCF峰（橙色）的分布。(C) 参照(A)中的描述，相对于24小时pf斑马鱼胚胎中鉴定的TAD边界，CTCF峰（橙色）的分布。(D) 参照(A)中的描述，沿TAD边界富集H3K4me3的峰的分布。(E) 参照(A)中的描述，沿TAD边界富集H3K36me3的峰的分布。(F) 参照(A)中的描述，沿TAD边界富集H3K27me3的峰的分布。另见图S4、图S5和表S4。

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