题目：Genetic Control of Collective Behavior in Zebrafish

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32179471/

期刊：iScience

研究亮点

l 与人类精神疾病相关的基因会改变斑马鱼的群体行为

l 与野生型的差异导致了“分散型”“协调型”和“聚集型”三种行为表现

l 个体互动规则的改变可以解释群体层面的涌现模式

摘要

包括人类在内的许多动物进化出了群居生活和活动的方式。在人类身上，社交互动的紊乱是多种精神疾病的基本特征。然而，我们对基因如何调控社交行为知之甚少。斑马鱼或许是探索这一问题的理想模型。通过对比野生型斑马鱼与90个突变品系的行为，我们发现与人类精神疾病相关的基因突变能够改变成年斑马鱼的群体行为。我们将突变体的行为变异分为三类：“分散型”，即斑马鱼的群体凝聚力降低；“协调型”，即斑马鱼以更整齐的鱼群形态游动；以及“簇拥型”，即斑马鱼形成密集但杂乱的群体。个体互动规则的变化可以解释这些差异。这项研究揭示了动物群体的涌现模式如何因个体的基因改变而发生变化，并为理解社交信息处理的基本原理奠定了框架。

图文摘要

引言

在众多物种中，生存依赖于群体中个体的协同配合，比如鱼群、鸟群或蚁群。群体动态机制可提升觅食能力并迷惑捕食者。社交互动对人类同样至关重要，自闭症和精神分裂症等精神疾病患者因社交处理缺陷而出现的严重功能障碍就印证了这一点。多项针对不同物种的研究表明，动物群体中个体形成的运动模式，可能源于相对局部的互动行为。尽管已有研究证实刺鱼的群游行为受遗传调控，但目前仍不清楚集体行为的哪些特征可被基因调控，以及具体由哪些基因调控。为斑马鱼开发的遗传、神经和行为学研究技术，使其成为解答这些问题的理想模型。斑马鱼是高度社会化的动物，展现出一系列复杂的行为特征。近期多项研究对比了单一突变株与野生型斑马鱼，证实单个基因可改变斑马鱼的社交互动与集体行为。

结果

突变体斑马鱼群体在游泳行为上存在差异

我们利用CRISPR-Cas9技术对90个与精神疾病相关的基因进行突变处理（数据S1），并开展实验探究这些突变如何影响自由游动斑马鱼的群体行为。我们在斑马鱼成年后对其突变体进行评估，此时各类社交互动的发育已趋于成熟，通过观察它们在开放圆形竞技场中的游动状态来比较群体行为（图1A、视频S1）。除scn1lab和slc18a2基因外，所有突变体均以纯合成年个体的形式进行测试；这两个基因的纯合个体无法存活至成年，因此以杂合鱼的形式测试。我们对每个品系开展了多次试验，每次试验均使用不同的斑马鱼（表S1）。

斑马鱼倾向于成群游动，有时会与其他鱼对齐并一起移动（图1B），有时则以紧密且无序的姿态游动（图1C）。我们发现突变鱼的游动速度、群体间距和极化程度存在差异。尽管使用同一条品系进行的多次实验之间存在较大差异，但许多品系都表现出一致的趋势（图1D–1F）。

此前针对多种鱼类的研究表明，个体速度直接影响运动动态，速度越快，个体间的间距越宽、同步性也越强。与该研究结果一致，大多数游泳速度更快的突变品系，其个体间间距更大、群体极化程度更高（图1D–1F、图2A及补充图S2）。线性回归和指数回归分析显示，速度可解释个体间间距、群体极化程度、速度四分位距（IQR）、运动时间、最近邻距离以及群体质心速度总变异的约30%（补充图S2；详见透明方法）。然而，在剔除速度的影响并考虑实验批次的变异性后，仍有多个品系与野生型（WT）存在差异（图2B）。

图1. 不同突变品系的群体行为模式存在差异（A）在每次实验中，从上方拍摄六条成鱼在圆形竞技场中游泳的画面。（B和C）野生型（WT）鱼群的典型运动轨迹，分别呈现出排列整齐（B）和无序（C）的群体形态。每条轨迹均展示了1秒的游泳过程。（D–F）所有品系的鱼群在中位速度（D）、群体间距（E）和极化度（F）方面的箱线图。每个点代表一次实验的数据。线条按速度从低到高排列。彩色点突出显示了在某些行为特征上与野生型鱼群存在差异的品系示例。图S1包含其他行为指标的类似图表。另见图S1、表S1、视频S1和数据S1。 

图2. 速度仅能部分解释不同品系间群体行为的改变、在校正速度差异前（A）和校正后（B），七个行为指标中位数的突变株系与野生型（WT）的差异。各品系按速度递增顺序排列。五条高亮品系的颜色与图1中的约定相同。粗轮廓表示与野生型（WT）存在统计学上的显著差异，该判断基于给定品系各指标在重复试验中的变异性（Dunnett检验，(p<0.05)）。单位为各品系中位数的标准差。另见图S2。

三种模式揭示了显著的行为差异

我们发现，分散型、协同型和聚集型这三种总体模式构成了突变鱼游动行为最显著的差异。分散型表型的鱼群个体间间距大、极化度低，以突变系 scn1lab+/(编码 Nav1.1 蛋白和 ctnnd2b/(编码 δ-连环蛋白为代表。这些突变体的个体间间距较大，尽管偶尔会形成群体，但彼此分离的频率更高，集体协调性也更差。协同型表型指的是个体表现出更强的行进方向趋同倾向，并能作为一个群体连贯移动，以 chrna2a/(编码α2-烟碱型乙酰胆碱受体为代表。聚集型表型的特征是鱼群极化度低、间距紧密。这类群体通常密度较高但排列无序，鱼群更多时间在相对局部的区域游动，以 disc1/(编码精神分裂症相关蛋白和 immp2l/(编码线粒体内膜肽酶2样蛋白为代表。

我们在控制速度后，对每个品系行为指标的中位数进行主成分分析（PCA）（图2B），以描述和量化群体行为的不同模式（图3）。我们发现前两个主成分揭示了品系间大部分相对行为差异，体现了分散、协同或聚集表型之间的区别。需注意的是，尽管图3重点展示了五个在PCA维度上表现出明显差异的突变品系，但其他品系也与野生型（WT）存在差异（图3C和图S3）。通过自助法考虑实验变异性和有限采样的影响后，结果显示部分品系在前两个PCA成分中的一个或两个上与野生型分离，而另一些品系则与野生型重叠（图S3）。虽然前两个成分体现了最大比例的变异，但部分品系在第三个PCA成分中也表现出明显差异。例如，尽管两者均表现出聚集表型，但与disc1/斑马鱼不同，immp2l/斑马鱼会花费时间静止不动，即处于“冻结”状态。正因如此，这两个品系的PC3得分符号相反（图3B），通过改进的PCA方法可将它们在“冻结成分”上区分开来（图S4；详见透明方法）。

图3. 主成分分析揭示了遗传突变体中行为变异性的类别针对野生型（WT）的五条重点品系的输入指标，组间距发生了变化。第二个和第三个主成分反映了极化状态与移动时间占比的组合：主成分2（PC2）的正值（A）左图：在剔除速度因素后，品系间剩余变异的90.8%可由三个正交成分描述。第一个成分对应高极化且移动时间增加，而主成分3（PC3）的高值则对应高极化且频繁静止。右图：数值（B）中图：所有遗传品系的数据在前两个主成分上的投影；在第三个主成分上的投影单独展示在右侧。边缘图：野生型（WT）和五条重点品系的典型轨迹（1000帧，即17秒）。“分散型”表型表现为主成分1（PC1）为正值、主成分2（PC2）为负值；“协调型”表型表现为PC2为正值；“聚集型”表型表现为PC1和PC2均为负值。表S2按各主成分上的位置顺序列出了每条品系。另参见图S3、图S4和表S2。

模型拟合将群体行为与个体互动规则关联起来

有证据表明，群体运动的动态可以通过个体之间相对简单的互动规则来解释，比如一条鱼如何根据其同伴的位置改变自身的运动轨迹邻近个体。我们通过构建模型探究群体运动中显著的观测差异（即分散、聚集和连贯的群体运动模式）是否能由个体对邻近鱼类做出转向反应的方式差异来解释。该模型利用邻近个体的位置和速度，确定有效的吸引与对齐力，以此最佳预测鱼类在特定时间延迟后会向左还是向右转向（详见透明方法部分）。我们检测了野生型（WT）鱼类以及代表三种典型群体模式的突变品系——分散型（scn1lab+/-）、协调型（chrna2a-/-）和聚集型（disc1-/-）——在吸引作用的距离依赖性（((G_{att }(r_{j})))）、对齐作用的距离依赖性（((G_{ali}(r_{j})))）以及吸引作用相对于对齐作用的整体强度（a）方面的差异。

对于野生型（WT）斑马鱼，对同伴的有效“吸引力”随距离增加而增强，而趋同性则随距离增加而减弱（图4C）。这些趋势与以往关于斑马鱼的研究结果一致。与野生型相比，scn1lab+/-斑马鱼的吸引力随距离变化的相关性更弱，且趋同性随距离增加的下降速度更快（图4C）。这表明scn1lab+/-斑马鱼主要与近距离同伴互动，往往忽略远处的同伴，进而导致我们在这些品系中观察到的群体不稳定和分散行为。对ctnnd2b突变体的模型拟合也呈现出类似趋势（图S5B）。值得注意的是，该模型对scn1lab+/-斑马鱼转向决策的预测准确率低于野生型斑马鱼，这说明scn1lab+/-斑马鱼的运动决策受同伴影响的一致性更低（图4B）。相比之下，chrna2a突变体的运动行为比野生型更具可预测性，且对远处同伴表现出较强的吸引力（图4C），这也是这些品系形成的群体具有凝聚性的原因。disc1突变体的相互作用函数整体上与野生型相似，但吸引力与趋同性的比值更高（图4C），对immp2l突变体的拟合也显示出类似趋势（图S5B）。这种社交反应性的变化使得个体之间保持近距离，却无法作为一个整体协同运动。总体而言，我们的研究结果表明，个体斑马鱼对同伴的反应方式存在差异，这可能导致了所观察到的不同群体层面的模式。

图4. 简单模型揭示不同品系个体间相互作用规则的差异另见图S5：对远距离同伴的吸引力。disc1/突变体的相互作用函数总体上与野生型（WT）相似，但产生了更高的吸引力-对齐比率、对吸引力的距离依赖性，且对齐度随距离变化的下降速度更快。相比之下，chrna2a/突变体表现出相对较强的试验次数。为了拟合突变体品系，图中以黑色实线展示对野生型的整体拟合结果作为对照。与野生型相比，scn1lab+杂合鱼表现出更弱的距离吸引力(G_{att }(r_{i}))，以及对齐度的距离依赖性(G_{a k}(r_{i}))。粗线表示对所有试验次数的整体拟合，细线表示对单次试验的拟合。（C）对野生型及scn1lab、disc1、chrna2a突变体品系的拟合(+/-)。图中展示了吸引力/对齐比率a，以及能最佳预测试验中所有鱼类运动决策的有效吸引力和对齐力的距离依赖性。（B）模型的预测能力，展示了不同品系在不同试验中正确预测转向比例分布的箱线图。野生型（WT）的时间延迟为1秒（针对突变体的不同速度调整了延迟时间——详见透明方法）。该拟合得出了群体中鱼类的相互作用函数，模型以相对同伴位置和朝向为输入，预测个体在指定时间延迟后向左还是向右转向。（A）某一时刻单条目标鱼（黑色）的示意图，其周围有五条不同位置的同伴（红色），箭头表示朝向。

讨论

本研究采用量化行为学指标，揭示了基因如何调控集体行为模式。群体中形成的模式——包括其结构、凝聚力、领导力及动态变化——会影响物种的适应度与对环境变化的适应能力，进而影响物种的进化。本研究为理解基因、社会互动与感觉运动转换之间的关系奠定了基础。已有研究表明，仅靠游泳速度就能推动鱼群结构和动态的变化，而我们发现，改变速度的突变体总体上确实会以可预测的方式改变群体行为。不过，我们也发现了一些突变体，其对群体模式和动态的影响与速度的影响相互独立。这些突变体的表现可分为三类：协调型、分散型和聚集型，每一类都对应着若干突变斑马鱼品系的行为特征，其形成可能源于个体间互动规则的差异。

在我们的结果中，我们重点标注了五条与野生型（WT）行为差异显著的品系：scn1lab+/-、ctnnd2b-/-、chrna2a-/-、immp2l-/-和disc1-/-。不过我们也注意到，除此之外，其他突变品系也与野生型存在明显差异（图2、图3及补充图S3）。我们还注意到存在这种可能性部分基因未表现出行为表型，原因可能是旁系同源基因的活性，或是CRISPR-Cas9触发了旁系同源基因或其他基因的转录上调。 

这些突变对单个斑马鱼的影响可能体现在感觉、运动或整合过程中，我们无法认定受影响的基因在功能上具有特定的“社会性”，而是这类对个体的影响会表现为群体行为的改变。例如，已知纯合缺陷型scn1lab突变体斑马鱼幼鱼（与本研究中研究的杂合突变体斑马鱼不同）在与视动反射相关的眼跳后，会部分丧失维持眼球位置的能力，且作为单个幼鱼时其游动活跃度也会升高。在后续研究中，明确构成集体和社会行为基础的感觉运动转换机制及相应的神经活动特征将是关键。借助透明的斑马鱼幼鱼，全脑成像技术可从刺激发生到后续的运动输出全过程对神经活动进行检测。包括固定斑马鱼结合虚拟现实技术在内的新工具，或许能实现对成年斑马鱼集体行为相关的类似评估。

多种能产生独特集体行为模式的突变存在于与人类精神疾病相关的基因中。例如，CTNND2 的变异与自闭症相关；DISC1 与精神分裂症、双相情感障碍和重度抑郁症相关；CHRNA2 与尼古丁和大麻滥用相关；SCN1A 与自闭症和癫痫（“德拉韦综合征”）相关；而在部分研究中，IMMP2L 也与自闭症相关。尽管我们在将鱼类的集体行为与人类任何特定社会表型关联时持谨慎态度，但我们注意到，“社会大脑”的相关成分已被证实从鱼类到人类都具有保守性。此外，社会相互作用实验或许能为评估药物对遗传背景明确的动物行为缺陷的作用提供灵敏方法。针对鱼类其他行为表型逆转的药物筛选研究，已发现了可有效治疗人类精神疾病的药物。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。