题目：ALPK2 Promotes Cardiogenesis in Zebrafish and Human Pluripotent Stem Cells

原文链接:https://doi.org/10.1016/ j.isci.2018.03.010

期刊：iScience

摘要

心脏发育需要WNT/β-连环蛋白信号通路的协调双相调控。通过整合基因表达分析与功能缺失小干扰RNA筛选，我们鉴定出α蛋白激酶2（ALPK2）为心脏发生过程中WNT/β-连环蛋白信号通路的候选负调控因子。在人胚胎干细胞（hESCs）分化过程中，随着人胚胎干细胞从中胚层向心脏祖细胞转变，ALPK2的表达水平显著升高。通过在人胚胎干细胞和斑马鱼中进行反义敲低及CRISPR/Cas9基因编辑，我们证实ALPK2可促进心脏功能及心肌细胞分化。定量磷酸化蛋白质组学、蛋白质表达谱分析及β-连环蛋白报告基因实验表明，ALPK2缺失会导致β-连环蛋白稳定并增强WNT信号通路活性。此外，通过小分子化合物XAV939直接抑制WNT信号通路，可呈剂量依赖性挽救ALPK2缺失引发的心脏缺陷。综上，这些结果表明ALPK2在心肌细胞发育定型过程中调控β-连环蛋白依赖性信号通路。

图文摘要

引言

从人胚胎干细胞（hESCs）向心肌细胞进行定向分化，可作为阐明人类心脏发育过程中调控机制的体外模型（Hofsteen 等人，2016；Palpant 等人，2015a）。心肌细胞的分化需要对 WNT/β-连环蛋白信号转导通路进行时间调控（Hofsteen 等人，2016；Lian 等人，2012；Naito 等人，2006；Palpant 等人，2015b；Ueno 等人，2007）。WNT/β-连环蛋白信号的激活对于细胞退出多能性状态和中胚层形成至关重要，而抑制该通路则是细胞向心肌细胞谱系转化的必要条件（Davidson 等人，2012；Hofsteen 等人，2016；Palpant 等人，2015b）。研究表明，调控 Wnt 通路足以引导细胞在分化过程中完成阶段特异性的转化（Burridge 等人，2014；Lian 等人，2012）。因此，鉴定能够抑制 WNT/β-连环蛋白信号的调控因子，对于理解人类心脏发育具有关键意义。

WNT/β-连环蛋白信号通路受β-连环蛋白翻译后修饰的调控（Gao等人，2014；Moon等人，2004）。一种包含支架蛋白和蛋白激酶的“降解复合物”使β-连环蛋白发生磷酸化，从而暴露出可被泛素化的基序，该基序会被蛋白酶体识别并介导其降解（Stamos和Weis，2013）。β-连环蛋白磷酸化的缺失会激活WNT信号通路（Stamos和Weis，2013）。稳定化的β-连环蛋白穿梭进入细胞核，并与转录因子（尤其是TCF/LEF家族成员）结合，从而激活WNT靶基因的转录（Hsu等人，1998；MacDonald等人，2009）。中胚层中WNT/β-连环蛋白信号通路的持续激活会抑制心肌细胞命运，并促进内皮细胞和造血细胞命运的形成（Palpant等人，2015b；Wam- Woll等人，2008）。因此，鉴定能够抑制WNT/β-连环蛋白信号通路的调控因子，对于人类心脏发育过程中细胞命运决定的调控至关重要。

在本研究中，我们通过组合筛选鉴定出一种非典型α蛋白激酶家族成员——α蛋白激酶2（ALPK2），将其确定为心脏发育调控因子及WNT/β-连环蛋白信号通路抑制剂。该蛋白家族拥有高度保守的α蛋白激酶结构域，与传统蛋白激酶不同的是，它们在进化上仅存在于脊椎动物中（米德尔贝克等人，2010年）。α激酶共有六种：真核延伸因子2激酶（eEF2K）、瞬时受体电位离子通道蛋白（TRPM6和TRPM7），以及根据其来源组织命名的淋巴细胞α激酶（LAK，又称ALPK1）、心脏α激酶（HAK，又称ALPK2）和肌肉α激酶（MAK，又称ALPK3）（德伦南、里亚赞诺夫，2004年；米德尔贝克等人，2010年）。ALPK2已知可通过调控细胞周期和DNA修复基因在癌症中发挥作用（吉田等人，2012年），同时也是高血压的候选调控因子。（Chauvet 等人，2011），而其在心脏发育过程中的作用尚未得到阐明。我们的研究数据表明，ALPK2 的功能之一是在人类胚胎干细胞和斑马鱼的心脏发育过程中，负向调控 WNT/β-连环蛋白信号通路。

结果

ALPK2 在心肌细胞发育过程中表达并受调控

为了鉴定WNT/β-连环蛋白信号通路的负调控因子，我们开展了一项组合筛选实验：将人胚胎干细胞（hESC）分化的中胚层和心脏祖细胞（CPCs）已发表的RNA表达数据（Paige等人，2012年），与使用携带由β-连环蛋白激活的报告基因（BAR）驱动荧光素酶表达的结直肠癌细胞（hRKO）进行的小干扰RNA（siRNA）筛选结果进行对比（James等人，2009年）（图1A）。通过对这些数据集进行交叉分析，我们筛选出了在CPCs中高度诱导且在siRNA敲低后能显著增强BAR活性的基因。该分析鉴定出一种此前未被鉴定的、推测与心脏发育及WNT/β-连环蛋白信号相关的蛋白激酶——α蛋白激酶2（ALPK2；图1B）。ALPK2在CPCs中的表达水平上调了68倍，而在siRNA介导的敲低后，其对BAR活性的增强作用提升了4倍。

我们通过调查人类胚胎干细胞（hESCs）心肌细胞分化分阶段时间进程中的表观遗传图谱，进一步探究了ALPK2的作用（Paige等人，2012）。染色质表观遗传组蛋白修饰标记H3K4me3（活性启动子）和H3K36me3（RNA聚合酶II活性）表明，随着细胞从中胚层（第2天）向心血管前体细胞（CPCs，第5天）和定型心肌细胞（CMs，第14天）转变，ALPK2受到表观遗传调控（图1C）。值得注意的是，抑制性组蛋白标记H3K27me3在整个分化过程中未发生改变（图1C）。我们旨在进一步明确ALPK2的表达特征，并评估其在心脏发育过程中的作用。为此，我们采用高密度单层分化方案将人类胚胎干细胞分化为心肌细胞（Palpant等人，2015a）。通过激活素A（Activin A）和骨形态发生蛋白4（BMP4）诱导人类胚胎干细胞分化，同时连续小分子激活并抑制经典WNT/β-连环蛋白信号通路（图1D）。这种定向分化方案通常能产生高纯度的心肌细胞((>80%)心肌肌钙蛋白T；TNNT2*），流式细胞术检测结果证实了这一点（图1D）。我们分析了未分化人类胚胎干细胞（第0天）、中胚层细胞（第2天）、心血管前体细胞（第5天）和心肌细胞（第14天）中的转录本丰度。泛中胚层标记物T-box转录因子T（BRYT）的表达在第2天达到峰值，并在第5天降至基线水平。在BRYT表达达到峰值后，早期心脏标记物T-box 5（TBX5）可在第5天和第14天被检测到。最后，肌节基因心肌肌钙蛋白T（TNNT2）在第14天呈高水平表达。这些数据表明，正常的中胚层形成、心血管前体细胞特化和心肌细胞分化均已发生。在此时间进程中对ALPK2的分析显示，其表达从第5天开始，并在第14天水平升高（图1E，多能性状态下表达上调2896倍），这表明ALPK2在心血管前体细胞特化和心脏定型过程中呈时间特异性表达。

我们随后比较了ALPK2在三种不同中胚层祖细胞谱系（心肌祖细胞CPCs、心内膜样内皮细胞ECs以及生血内皮细胞）中的表达和表观遗传调控，以探究ALPK2是否在非心肌细胞谱系中存在表达及调控。这些细胞群的获取方式为：如透明方法中所述（Palpant等人，2015b），在分化起始阶段，通过不同剂量的激活素A（Activin A）和骨形态发生蛋白4（BMP4）刺激，定向诱导出不同的中胚层亚群。我们对ALPK2基因座的RNA测序结果以及H3K4me3和H3K27me3组蛋白修饰情况进行了对比，发现ALPK2在心肌祖细胞（CPCs）中呈高表达且受严格调控，而在心内膜样内皮细胞（ECs）或生血内皮细胞中则无此特征（图1F）（Palpant等人，2017）。综上，这些数据表明，在人类胚胎干细胞（hESCs）向心肌细胞谱系分化的过程中，ALPK2受到特异性调控。

斑马鱼（Danio rerio）因发育机制高度保守且与人类基因组具有相似性，被用作心脏发育的体内模型（Bakkers, 2011; Howe et al., 2013; Stainier and Fishman, 1994）。具体而言，序列分析表明，在脊椎动物中，ALPK2 呈现出较高的保守程度，尤其是在α激酶结构域内（图S1）。为了观察整个胚胎发育过程中的时空表达模式，我们通过原位杂交技术分析了斑马鱼alpk2基因，并将其表达谱与心脏转录因子gata4进行了对比。受精后13小时（hpf），gata4在双侧心脏中表达，形成前心中胚层区域，而alpk2则在体节中胚层的慢肌纤维前体细胞（轴旁细胞）中表达。受精后22小时（hpf），gata4与alpk2在发育中的心脏中共表达（图1G）。由此可见，ALPK2在体内外的心脏发育过程中均有表达。

图1. ALPK2鉴定和表达分析（A）hESC心肌细胞从人类胚胎干细胞（hESCs）分化的RNA表达的组合筛选示意图，结合使用b-catenin激活的报告（BAR）-转导的人类RKO结肠癌细胞（hRKO）用重组Wnt3A刺激的siRNA筛选。（B）识别α蛋白激酶2（ALPK2）的维恩图。（C）染色质沉淀，然后对hESC衍生培养物中的组蛋白标记H3K4me3、H3K36me3和H27K4me3进行深度测序（ChIP-Seq）：hESC（第0天）、中胚层（第2天）、心脏祖细胞（CPCs，第5天）和心肌细胞（第14天）（N=2）。（D）hESC衍生的心肌细胞的高密度单层定向分化方案，产生高百分比的心肌肌钙蛋白T（TNNTT）（E）定量RT-PCR分析中胚层（Brachyury T，BRYT）、心脏祖细胞（T-box 5，TBX5）、心肌细胞（TNNT2）和ALPK2在第0、2、5、14天心肌细胞分化期间的标志物。

敲低Alpk2会损害斑马鱼心脏发育

我们接下来试图通过使用剪接阻断吗啉代寡核苷酸（MO）敲除斑马鱼中的Alpk2，来确定Alpk2在体内的作用。注射Alpk2 MO会导致可变剪接和外显子4缺失，从而在外显子6中产生提前终止密码子（图2A-2D）。与注射乱序阴性对照MO的动物相比，Alpk2 morphant在24小时胚胎期（hpf）未观察到明显的结构缺陷（图2E和2F）。然而，对一组在心脏早期发育中具有已知功能的基因（nkx2.5、gata4、mef2ca、mef2cb、cmlc2、tnnt2、atp2a2、cacnalc2、cx43和ryr2）进行转录谱分析后发现，在24小时胚胎期（hpf），Alpk2 morphant（吗啉代敲低胚胎）的所有转录本中，除nkx2.5和ryr2外，其余mRNA表达水平均显著降低（图2G）。在48小时胚胎期，Alpk2 morphant表现出心率显著下降（对照组为120.0±1.29次/分钟；alpk2吗啉代组为60.0±2.19次/分钟；图2H），心肌细胞数量也减少（cmlc2:DsRednuc标记；对照组259±21个，Alpk2吗啉代组119±8个；51小时胚胎期；图2I-2K）。值得注意的是，根据活化白细胞细胞粘附分子（ALCAM）的染色结果，未观察到内皮细胞存在差异（图2I-2K）。到72小时胚胎期，Alpk2 morphant出现心包和卵黄囊积液，伴随明显的心脏畸形，同时后部发育也出现缺陷（图2L-2O）。我们还利用携带荧光心外膜细胞报告基因的斑马鱼（tcf21:DsRed，Kikuchi等人，2011），评估了Alpk2缺失斑马鱼的心外膜形成情况。斑马鱼心外膜是心脏的浆膜上皮衬层，其细胞来源于心外来源的原心外膜，原心外膜在原始心管形成阶段位于心包囊和静脉极附近（Plavicki等人，2014；Serluca，2008），且其形成需要正常的心脏功能状态（Peralta等人，2013；Plavicki等人，2014）。与对照组相比，Alpk2 morphant在96小时胚胎期缺乏tcf21阳性的心室心外膜。在正常发育过程中，此阶段心外膜会包裹斑马鱼心室，但不包裹心房（图2P和2Q；白色箭头所示）（Plavicki等人，2014）。

图2. Alpk2对斑马鱼心脏发育至关重要（A）斑马鱼Alpk2基因座和通过剪接阻断吗啉寡核苷酸（MO）靶向区域。*表示终止密码子。（B-D）RT-PCR和Sanger测序显示剪接阻断MO引起的替代剪接导致131碱基对缺失和过早终止密码子。*表示终止密码子。（E和F）斑马鱼在受精后24小时注射阴性对照MO（E）或Alpk2 MO（F）。（G和H）转录本分析（G）和心脏跳动率（H）的对照和Alpk2形态分别在24和48 hpf（N=5，每N 15-22池胚胎）。（I-O）对照和Alpk2 MO注射心脏的代表性图像携带cmlc2的转基因：DsRed-nuc量化心肌细胞核（K）在51 hpf（N=7-9）。红色表示cmlc2：DsRed-nuc和品红色是活化血白球细胞粘附分子（ALCAM）的抗体染色。对照MO（L）和Alpk2 MO（M）的代表性明场图像以大约72 hpf注射斑马鱼。对照MO（N）和Alpk2 MO（O）的代表性图像注射斑马鱼心脏携带转基因（cmlc2：DsRed-nuc）以表示大约72 hpf的心脏形态。（P和Q）对照和Alpk2形态鱼携带myl7：GFP和tcf21：DsRed在96 hpf的共聚焦图像。白色箭头表示心脏心室上的tcf21+心外膜细胞。N=3；除非另有说明，否则每个N具有45-76个池化动物的独立生物复制。数据是平均G SEM；*表示p%0.05。

关于使用MOs研究基因功能的问题仍存在争议（Rossi等人，2015；Schulte-Merker和Stainier，2014）。为解决这一问题，我们利用CRISPR/Cas9诱变技术在Alpk2基因的第2外显子中诱导插入缺失突变。预实验结果显示，F0代斑马鱼出现了显著的心脏缺陷和尾部发育异常，这一表型与MO实验的结果一致。为避免注射胚胎中嵌合突变可能带来的人为误差，我们培育出F1代斑马鱼品系，其Alpk2基因第2外显子存在5个碱基的杂合移码突变，该突变导致第159位氨基酸处出现提前终止密码子（Alpk2Δ5，图3A-3D）。杂合子斑马鱼未表现出明显的发育表型，我们对其进行杂交以获得F2代纯合Alpk2Δ5斑马鱼。与Alpk2基因敲低的斑马鱼胚胎一样，这些纯合子也未出现明显的在纯合Alpk2D5突变体中，24小时受精阶段观察到的表型无异常。然而，心管形成后，纯合Alpk2D5突变体出现心包腔和卵黄囊积液，伴随明显的心脏畸形且心率降低（图3E-3I）。值得注意的是，研究未对Alpk2D5斑马鱼的心肌细胞数量进行检测。使用邻茴香胺进行血红蛋白过氧化物酶染色显示，Alpk2D5斑马鱼可形成红细胞，但在尾部躯干处无血液循环（图3J-3K0）。这表明血液循环缺陷是心脏功能降低的继发表现。这些结果表明，Alpk2在决定心肌细胞数量、正常心脏形态、心外膜形成以及心脏功能方面发挥着重要作用。

图3. 斑马鱼Alpk2基因的CRISPR/Cas9敲除抑制心脏发育（A）斑马鱼Alpk2基因座及CRISPR/Cas9靶向区域示意图。*表示终止密码子。（B和C）用于获得Alpk2纯合敲除突变体的显微注射与繁育方案。（D–H）（D）纯合突变体的桑格测序结果，显示存在5个碱基的缺失。野生型（E、G）和Alpk2敲除斑马鱼（F、H）在72小时胚胎发育阶段（hpf）的明场图像（E、F），以及携带myl7:GFP转基因的斑马鱼在120 hpf时的荧光图像（G、H）。（I）72 hpf时Alpk2敲除斑马鱼与野生型同胞的心脏搏动率定量分析。*表示p<0.05。（J和K）72 hpf时野生型（WT）和Alpk2纯合缺失（Alpk2Δ5）胚胎经邻茴香胺染色的血红蛋白过氧化物酶明场代表性图像。数据来自≥3次独立繁育实验，每次繁育的胚胎数量为30–150枚。hpf：受精后小时数。

ALPK2 促进人胚胎干细胞来源的心肌细胞分化

为确定 ALPK2 是否在人类心肌细胞发育中发挥功能性作用，研究人员通过慢病毒短发夹 RNA（shRNA）在人胚胎干细胞（hESCs）中敲低（KD）了 ALPK2（图 4A、4B），并对细胞进行心肌细胞分化诱导。在整个分化过程中，ALPK2 敲低显著降低了 ALPK2 的表达水平（图 4C），且未破坏人胚胎干细胞的集落形态或多能性相关基因的表达（图 4D）。为评估 ALPK2 在早期发育阶段的作用，研究人员在分化第 2、5、14 天检测了中胚层、心肌前体细胞（CPCs）和定型心肌细胞标志物的转录丰度（图 1D）。结果显示，全中胚层标志物 BRYT 的表达无变化，而心肌前体细胞标志物 TBX5、Islet 1（ISL1）以及 TNNT2 的表达在 ALPK2 敲低细胞中均被下调（图 4E–4H）。此外，ALPK2 敲低细胞更倾向于分化为 TNNT2 阴性和平滑肌肌动蛋白（SMA）阳性的细胞类型（图 4I–4L）。这些数据表明，ALPK2 在中胚层向心肌细胞谱系转化的过程中发挥作用。为进一步验证这一假设，研究人员检测了 ALPK2 敲低细胞从中胚层亚群分化形成心内膜样内皮细胞和生血内皮细胞的效率。结果显示，ALPK2 敲低对心内膜样或生血内皮细胞的占比无影响（基于分化第 5 天 KDR/CD34 的表达，图 S2），说明 ALPK2 特异性地在促进心肌细胞谱系发育中发挥作用。

我们通过在进行心脏定向分化的人胚胎干细胞（hESCs）中开展无标记定量（LFQ）蛋白质组学分析，对ALPK2的潜在下游效应因子进行了表征（图S3A、表S2：无标记蛋白质组学鉴定的所有蛋白，与图4相关）。为评估其对早期心脏细胞命运特化的影响，我们用对照或ALPK2短发夹RNA（shRNA）转导人胚胎干细胞，分别在人胚胎干细胞阶段及分化为心血管前体细胞（CPCs）后进行分析。通过Fusion Orbitrap质谱仪上的纳升液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对标准化的蛋白酶解产物进行检测，并采用无标记方法进行定量（Hofsteen等人，2016）。所有样本的无标记定量结果均具有良好可重复性，皮尔逊相关系数平均值为0.90（图S3B；代表性图像）。为验证实验方法，我们分析了人胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中肌钙蛋白T2（TNNT2）和ALPK2的蛋白表达。正如预期，随着细胞向心肌细胞分化，TNNT2和ALPK2的蛋白水平均有所升高（图S3C、S3D）。对照人胚胎干细胞分化为心血管前体细胞，再分化为心肌细胞的过程中，ALPK2蛋白表达逐步升高，这与mRNA表达模式一致。经ALPK2短发夹RNA慢病毒处理后，心血管前体细胞和心肌细胞中的ALPK2蛋白表达量均下降（图S3D）。

接下来，我们对样本进行了无偏层级聚类分析，发现重复样本与实验条件各自聚为一类（图S3E）。我们采用(p ≤0.05)数据库，以2倍（log2）变化为阈值，对ALPK2调控的蛋白质进行分析。该分析在心肌前体细胞（CPCs）中鉴定出241个ALPK2调控蛋白（126个上调、115个下调；图4M、表S3：通过LFQ蛋白质组学在心肌前体细胞中鉴定的ALPK2调控蛋白。与图4相关）。我们未在对照组与ALPK2敲低的未分化人胚胎干细胞（hESCs）之间观察到ALPK2调控的蛋白。基因本体论（GO）术语分析显示，ALPK2调控的过程涉及RNA与蛋白结合、蛋白激酶结合、细胞-细胞黏附、细胞外基质、肌动蛋白丝及其功能，以及经典WNT信号通路（表S4：通过LFQ蛋白质组学在心肌前体细胞中ALPK2敲低富集的GO术语。与图4相关；表S5：通过LFQ蛋白质组学在心肌前体细胞中ALPK2敲低抑制的GO术语。与图4相关）。具体而言，ALPK2敲低降低了心肌前体细胞中TNNT2和GATA4的表达（图4N），并诱导了WNT/β-连环蛋白拮抗剂分泌型卷曲相关蛋白1（sFRP1）（Ren等人，2013）以及WNT信号转导子β-连环蛋白（CTNNB1）的表达（图4N）。这些蛋白质组学数据表明，在心肌细胞分化过程中，ALPK2调控WNT/β-连环蛋白信号通路的关键介质以及心脏发育相关蛋白。

图4. ALPK2 shRNA敲除抑制心肌细胞从hESCs分化（A）ALPK2位点和shRNA靶位点示意图。（B-D）（B）病毒转染后3天，通过qRT-PCR验证人类胚胎干细胞（hESC）来源的心肌细胞中的三种ALPK2 shRNA。在心肌细胞分化的一段时间内，对照或ALPK2慢病毒shRNA转染后，ALPK2（C）和OCT4（D）的转录本表达分析。（E-H）中胚层（BRYT）、初级（TBX5）和次级（ISL1）心脏场基因和心脏结构基因（TNNT2）的RT-qPCR分析。（I）对照和ALPK2 shRNA处理的细胞定向分化向心肌细胞（第14天）后的代表性明场图像。箭头表示收缩心肌细胞。（J-L）对照和ALPK2 shRNA慢病毒转导（N=3）后分化第14天的流式细胞仪（y轴，TNNT2；x轴，平滑肌肌动蛋白，SMA）。（M）通过全系统无标签定量蛋白质组学（FDR，错误发现率）比较转染对照或ALPK2 shRNA的心脏祖细胞（CPCs）的火山图。（N）TNNT2、GATA4、sFRP1和CTNNB1（LFQ信号强度；log2转化）在对照和源自hESCs的ALPK2 shRNA中的蛋白质表达。蛋白质组学数据代表了两个生物重复，它们被汇集、处理和一式三份测量。数据是平均G SEM；*表示p%0.05；LFQ，无标签定量。另见图S2和S3。

ALPK2 通过负调控 WNT/β-连环蛋白参与心脏发育

LFQ蛋白质组学研究表明，ALPK2敲低会影响心脏发育过程中的WNT/β-连环蛋白信号通路。为更明确地评估ALPK2在调控WNT/β-连环蛋白信号通路中的作用，我们用慢病毒BAR载体稳定转导人胚胎干细胞以驱动金星荧光蛋白表达（图S4A）。随后，用对照或ALPK2短发夹RNA转导BAR-人胚胎干细胞，并对其进行定向分化随后通过活细胞流式细胞术评估金星荧光蛋白的表达分析（图S4B）。ALPK2 敲低显著降低了 ALPK2 的表达（图5A），并提高了活细胞金星荧光蛋白的总体平均荧光强度（几何平均值：对照组，2.39±0.03×10³；ALPK2 敲低组，3.01±0.44×10³），同时显著提高了表达金星荧光蛋白的心肌前体细胞比例（金星阳性+DsRed阳性；对照组，18.4±0.8%；ALPK2 敲低组，27.6±0.4%）（图5B），这表明 ALPK2 敲低会增强 β-连环蛋白依赖的 WNT 信号通路。

图5. ALPK2抑制WNT/β-连环蛋白信号通路以促进心脏发生(A) 人胚胎干细胞（hESCs）来源的心脏祖细胞（CPCs）在对照组和ALPK2短发夹RNA（shRNA）转染组中ALPK2的转录本丰度。(B) 人胚胎干细胞（hESCs）来源的心脏祖细胞（CPCs）经对照组或ALPK2短发夹RNA（shRNA）转染后，通过流式细胞术图谱和图表定量分析活细胞中β-连环蛋白激活报告基因（BAR）驱动的金星蛋白表达。(C) 经小分子端锚酶直接抑制剂XAV939（1微摩尔）处理的野生型和CRISPR/Cas9介导的ALPK2突变体人胚胎干细胞（hESCs）来源的心脏祖细胞（CPCs，ALPK2Δ10）中，WNT/β-连环蛋白信号通路调节因子的蛋白质印迹表达分析。(D) 野生型和ALPK2Δ10细胞在添加或不添加XAV939（0或1微摩尔）时，WNT/β-连环蛋白信号通路靶标LEF1的蛋白质印迹检测结果。(E) 经XAV939（0、1、5微摩尔）处理的野生型和ALPK2Δ10人胚胎干细胞（hESCs）来源的第14天心肌细胞的肌钙蛋白T2（TNNT2）流式细胞术定量分析。(F) 96小时 post-fertilization（hpf，受精后96小时）携带心外膜转基因（tcf21:DsRed）的热休克（hs）野生型和hsWnt8b转基因斑马鱼的代表性图像。鱼用活化白细胞黏附分子（ALCAM；品红色）进行复染。n=3-5个生物学重复，数据以平均值±标准误（mean±SEM）显示。*=p<0.05。另见图S4。

为进一步评估 ALPK2 及 WNT/β-连环蛋白信号通路的作用，我们利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术对人胚胎干细胞（hESCs）中 ALPK2 的蛋白激酶结构域进行突变。该方法成功构建了一株携带纯合 10 个碱基对移码缺失的人胚胎干细胞系，该缺失会导致第 9 外显子出现提前终止密码子（ALPK2Δ10；图 S4C 和 S4D）。将野生型和 ALPK2Δ10 人胚胎干细胞分化为心肌前体细胞（CPCs）（图 1D），并对转录组进行分析通过RT-qPCR检测ALPK2的表达丰度。与对照组相比，ALPK2D10心肌前体细胞（CPCs）的ALPK2表达水平显著降低（图S4E），这表明ALPK2D10细胞发生了无义介导的mRNA降解。随后，按照图1D中的方法将ALPK2D10细胞和野生型人胚胎干细胞（hESCs）诱导分化为心肌细胞，并分别在第5天和第14天通过免疫印迹法和肌钙蛋白T（TNNT2）流式细胞术进行分析。我们检测了LRP6、pLRP6、CTNNB1和LEF1的表达，以此作为ALPK2缺失的心肌前体细胞中WNT/β-连环蛋白信号通路激活的指标。WNT共受体LRP6在WNT配体结合后，会被糖原合成酶激酶3β（GSK3β）和酪蛋白激酶1（CK1）磷酸化（Davidson等人，2005；Zeng等人，2005）。此外，WNT/β-连环蛋白信号通路的激活与LEF1等靶蛋白表达的上调相关（Hsu等人，1998）。与野生型心肌前体细胞相比，ALPK2D10心肌前体细胞中pLRP6、CTNNB1和LEF1蛋白的表达水平有所升高（图5C）。为进一步探究ALPK2在WNT/β-连环蛋白信号通路中的作用，我们分别用或不用小分子WNT/β-连环蛋白信号通路抑制剂XAV939（0或1μM）处理野生型和ALPK2D10心肌前体细胞，分析LEF1的表达情况。在野生型细胞中，XAV939可将LEF1的表达水平降至几乎检测不到的程度。尽管ALPK2D10心肌前体细胞中LEF1的基础表达水平有所升高，但XAV939处理后其蛋白丰度同样降低（图5D），这提示ALPK2对WNT信号通路的抑制作用至少有一部分发生在XAV939的靶点——轴蛋白稳定酶坦帕酶（tankyrase）的上游（Huang等人，2009）。

接下来，我们试图通过增加通路抑制剂 XAV939 的剂量来减弱 WNT/β-连环蛋白信号通路，以挽救 ALPK2 介导的心肌细胞分化缺陷。在分化方案的第 3 天，将野生型和 ALPK2D10 细胞暴露于 0、1 和 5 μM 的 XAV939 中持续 2 天，并在第 14 天收集细胞进行流式细胞术分析（TNNT2）。XAV939 表现出剂量依赖性的恢复 ALPK2D10 细胞心肌生成潜能的能力，例如暴露于 5 μM XAV939 可将心肌分化水平恢复至野生型水平（图 5E）。因此，抑制 WNT/β-连环蛋白信号通路可恢复 ALPK2D10 细胞中观察到的心肌细胞分化缺陷。

在人胚胎干细胞中，WNT/β-连环蛋白信号通路的调控对于心外膜的分化是必需的（Bao 等人，2016；Iyer 等人，2015），而敲除 ALPK2 的斑马鱼则表现出的心外膜形成受损（图2）。为了更特异性地检测 WNT/β-连环蛋白信号在斑马鱼心外膜形成过程中的作用，我们利用热休克诱导型斑马鱼品系（hsp70:wnt8b-GFP [Weidinger 等人，2005]）与心外膜细胞报告基因品系（tcf21:DsRed）杂交，通过基因过表达 wnt8 来诱导经典 WNT 信号通路。斑马鱼在心管形成后（24和48小时胚胎期）接受热休克处理，并在96小时胚胎期评估心外膜的形成情况。与敲除 ALPK2 的斑马鱼结果一致，WNT/β-连环蛋白信号通路在胚胎发育后期至幼体阶段的激活会抑制心外膜的形成（图5F）。综合来看，这些数据表明 ALPK2 对 WNT/β-连环蛋白信号通路的抑制作用，对于心肌和心外膜的形成均是必需的。

定量磷酸化蛋白质组学揭示ALPK2的磷酸化基序及候选底物蛋白

为鉴定ALPK2的靶标，我们开展了定量磷酸蛋白质组学研究，对比野生型与ALPK2D10心肌前体细胞（参见补充信息中的透明方法及图6A）。通过细胞培养中氨基酸稳定同位素标记（SILAC）技术对细胞进行标记，并进行定向分化后，收集野生型和ALPK2D10心肌前体细胞，开展蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析。我们共检测到2664种蛋白质，其中317种（157种诱导表达、160种抑制表达）存在差异表达（图6B及图S5，以及表S6：SILAC蛋白质组学鉴定的所有蛋白质。与图6相关）。基因本体（GO）术语分析显示，受ALPK2调控的蛋白质在WNT/β-连环蛋白信号通路的负向调控、β-连环蛋白-TCF复合物组装中具有已知作用，同时也包括在心脏发育调控、肌动蛋白行为与功能调控中发挥作用的蛋白质（图S6C，表S7：SILAC蛋白质组学鉴定的ALPK2D10心肌前体细胞中富集的GO术语。与图6及图S8相关；表S8：SILAC蛋白质组学鉴定的ALPK2D10心肌前体细胞中受抑制的GO术语。与图6相关）。

图6. 定量磷酸化蛋白质组学揭示ALPK2的磷酸化基序及候选底物蛋白（A）利用从人类胚胎干细胞（hESCs）分化而来的野生型和ALPK2D10心脏祖细胞，进行细胞培养中氨基酸稳定同位素标记（SILAC）定量磷酸化蛋白质组学的示意图。（B，左）对比野生型和ALPK2D10心肌祖细胞（CPCs）的差异蛋白丰度瀑布图。（B，右）蛋白激酶N2（PKN2）和Scribble（SCRIB）的蛋白质免疫印迹结果，N=3次独立分化实验。（C）对比野生型和ALPK2D10心肌祖细胞（CPCs）的磷酸肽丰度总体分布。（D和E）推测的ALPK2磷酸化底物基序，以及（E）因ALPK2突变导致磷酸化事件缺失的蛋白。蛋白以颜色编码标注其功能：同时参与WNT信号通路和心脏发育或疾病（绿色）、仅参与心脏发育或疾病（红色）、仅参与WNT信号通路（品红色）或其他功能（黑色）。另见图S5。

我们通过免疫印迹法检测两种在调控经典和非经典WNT信号通路中具有已知作用的蛋白质，以此验证蛋白质组学筛选结果。蛋白激酶N2（PKN2）此前被描述为WNT/β-连环蛋白信号通路的负调控因子（James等人，2013年），且预测在源自ALPK2D10人胚胎干细胞的心肌祖细胞（CPCs）中其表达会上调。另一方面，细胞极性和非经典WNT信号通路调控因子Scribble（SCRIB）（Sisson等人，2015年）被预测在ALPK2D10心肌祖细胞中表达无变化。对PKN2和SCRIB的蛋白质印迹分析证实，在ALPK2D10心肌祖细胞中，PKN2的表达上调，而SCRIB的表达未发生改变（图6B）。我们还检测并定量了对应846种蛋白质的1972个磷酸化肽段（图6C、表S9：通过SILAC蛋白质组学鉴定的ALPK2D10心脏祖细胞中所有已鉴定的磷酸化肽段及差异磷酸化肽段，与图6相关）。磷酸化基序分析显示ALPK2 的预测靶蛋白带有丝氨酸脯氨酸（SP）氨基酸残基（图 6D）。在 ALPK2 的预测靶底物（即在 ALPK2Δ10 心脏祖细胞中发生磷酸化缺失的蛋白）当中，约三分之一蛋白已知参与调控 WNT/β连环蛋白信号通路（占比 32.6%）以及心脏发育与心脏疾病（占比 34.7%，图 6E）。因此，本研究数据支持下述假说：在心脏发育过程中，ALPK2 通过磷酸化与 WNT/β连环蛋白信号通路相关的底物蛋白，进而调控心脏发育。

讨论

长久以来已知，WNT/β连环蛋白信号通路的调控对心脏发育、心脏稳态维持以及心脏疾病均至关重要（Hofsteen 等人，2016；Moon 等人，2004、2017；Ozhan 与 Weidinger，2015；Ueno 等人，2007）。本研究结合人胚胎干细胞向心肌细胞分化的靶向组合筛选，以及人肿瘤细胞的 siRNA 筛选，发掘此前尚未被报道的心脏发育与 WNT/β连环蛋白信号通路调控因子。本研究证实：无论体内还是体外实验，敲低或敲除 ALPK2 均会造成心脏发生过程受损，同时 WNT/β连环蛋白信号通路活性升高。ALPK2 在心脏发生过程中呈阶段依赖性高表达，是人胚胎干细胞心肌细胞分化以及斑马鱼心脏发育的重要调控分子。

此外本研究发现，细胞向心脏谱系定向分化后，ALPK2 通过抑制 WNT/β连环蛋白信号通路调控心脏发生。为解析 ALPK2 在心脏发生过程中调控 WNT/β连环蛋白信号通路的具体方式，本研究开展了定量蛋白质组筛选。组学结果进一步印证前述组合筛选结果，提示 ALPK2 既调控多种心脏相关蛋白，也调控 WNT/β连环蛋白信号通路的信号介导分子。我们反复观察到，ALPK2 缺失后，一批可抑制 WNT/β连环蛋白通路的蛋白表达上调，典型代表包括经典 WNT 通路蛋白 PKN2 与 sFRP1；这些蛋白上调很可能作为代偿机制，试图抑制该信号通路。

由于存在基因复制、物种差异以及代偿机制，需要借助多种模式生物对比研究才能准确解析基因功能（Jensen 等人，2013；Olson，2006；Rossi 等人，2015）。斑马鱼胚胎的 alpk2 表达分析显示该基因在发育中的心脏表达；而在人胚胎干细胞体系中，ALPK2 表达于心脏祖细胞与心肌细胞。与之对应，两种模式体系中，敲低或敲除 ALPK2 都会造成显著的心脏发育缺陷。

综上，脊椎动物心脏发育过程中，需要对信号级联反应进行精密调控，以此协调动态的细胞命运抉择与形态建成变化。本研究证实ALPK2 对 WNT/β连环蛋白通路的调控，在人胚胎干细胞向心肌细胞分化、斑马鱼心脏成熟过程中均发挥关键作用。据此，本研究提出：ALPK2 是进化上保守的 α蛋白激酶，通过抑制 WNT/β连环蛋白信号通路，在脊椎动物心脏发育的早期阶段发挥重要功能。

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