题目：Mechanical Characteristics of Ultrafast ZebrafishLarval Swimming Muscles

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32755560/

期刊：Biophysical Journal

摘要

斑马鱼（*Danio rerio*）在受精后数天内便依靠轴肌节的肌肉进行游动。通过适配为离体肌肉力学开发的实验方案，可在完整的幼鱼尾中快速测量这些肌肉产生的力。但目前尚不清楚这些测量结果能在多大程度上反映底层肌纤维和肌小节的功能。本文结合5日龄野生型斑马鱼尾的解剖结构，对完整鱼尾的肌肉生理学测量方法进行了技术改进。具体而言，我们量化了力、长度与缩短速度之间的基本关系，并测定了斑马鱼以80–100赫兹的尾鳍拍打频率游动所需的极高收缩速度。为此，我们分析了每秒1000帧的视频，追踪透明鱼尾中可见的、与肌小节长度相关的结构运动；同时测定样本的被动粘弹性特性，以分离鱼尾内非肌肉结构产生的力。肌节肌肉在体内实际肌肉长度范围内产生的等长应力超过其最大等长应力的95%（((76 pm 3 mN / mm^{2}))）。其抽搐动力学特性迅速（半最大应力处全宽为11±1毫秒），且抽搐/强直比值较高（0.91±0.05），表明其为快速兴奋-收缩耦联做出了适应性调整。尽管收缩应力相对较低，但在模拟游泳过程中肌纤维体内动态的循环功-环实验中，肌节肌肉仍能产生较高的净功率（80赫兹下为134±20瓦/千克）。当肌肉以7±1肌节长度/秒的恒定速度缩短时，可产生86±2%的等长应力；而100赫兹功-环实验中的峰值瞬时功率则出现在18±2肌节长度/秒的速度下。本研究通过为实验干预提供快速且灵敏的功能检测手段，有望提升斑马鱼作为肌肉研究模型系统的实用价值。

研究意义

 斑马鱼（*Danio rerio*）有望成为研究脊椎动物肌肉生理学的独特高效模型系统。透明且可渗透药物的幼鱼本质上是功能完整的肌肉，可快速、低成本地大量培育。关键在于，斑马鱼基因组包含主要肌肉基因的同源序列，且极易进行基因操作。要充分发挥其应用价值，需借助可靠（且最好是快速）的方法，观察实验干预对幼鱼肌肉功能的影响。本研究证实，对完整的幼鱼尾进行力学测量，可直接反映肌肉的基础力学特性。此外，本研究还发现这类肌肉的收缩速度是目前已测肌肉中最快的，因此其本身就具备重要的研究价值。

引言

斑马鱼（Danio rerio）的幼体在受精后18小时内开始活动，3日龄时可自由游动。驱动这些运动的尾部肌肉发育迅速且早期具备功能，这使得斑马鱼成为研究脊椎动物肌肉发育与疾病的重要模型。由于其在脊椎动物肌肉的遗传和结构保守程度方面，多种人类肌病（如杜氏肌营养不良症）在斑马鱼中具有相似的表型，基于其多项独特特性，斑马鱼幼鱼成为了优选的模型系统。值得注意的是，幼鱼身体透明，可实现对其内部肌肉组织的活体成像，且对药物具有通透性，适合开展高通量研究。斑马鱼的基因编辑工具已十分成熟，其运动系统的早期功能通常还能用于研究在其他脊椎动物模型系统中会导致胚胎致死的突变和转基因。

幼虫尾部的肌纤维与尾部的长轴几乎平行，构成了尾部大部分的组织量。因此，研究人员将完整的尾部安装在力传感器和控制尾部长度的伺服电机之间，随后对尾部进行电刺激使其收缩。通过这一方法，研究人员明确了幼虫发育多个阶段尾部的力、长度与缩短速度之间的关系，也探究了尾部在实验性干扰下的相关变化规律。该方法让研究肌肉功能分子决定因素的研究人员，能够便捷地利用斑马鱼模型的研究优势。然而，从完整安装尾部的力学行为中得出的某些基础肌肉力学参数，与快速幼虫游动显然所需的极高收缩速度和功率并不匹配。这些差异是否部分源于“完整幼虫尾部的力学特性直接反映其底层肌肉组织力学特性”这一简化假设？具体而言，尾部长度的变化是否等同于肌纤维长度的变化？更关键的是，是否等同于肌纤维基本组成单位——肌小节长度的变化？在本研究中，我们旨在明确尾部与肌小节层面力学特性的关联，以提升斑马鱼完整幼虫尾部制备模型的应用价值。为此，我们利用高速成像技术追踪透明幼虫尾部中可见的结构特征位置，并将这些位置与底层肌纤维和肌小节的长度建立关联。通过该技术，我们对尾部内部的缩短现象进行了校正，从而在刺激肌肉产生力的过程中，维持肌纤维真正的等长状态。此外，由于尾部内部存在大量非肌肉结构（如脊索），这些结构必然会影响尾部的力学特性，因此在解释电刺激后尾部力产生的来源之前，必须先明确这些非肌肉结构的被动力学特性。

通过我们的研究方法，我们在完整的5日龄斑马鱼尾中建立了一组肌肉力学测量基准，将尾部力量与真实的肌纤维和肌节长度以及缩短速度关联起来，并采用改良的功环法在近似体内收缩条件下测量了机械功率。研究结果表明，尾部肌纤维在尾部的体内静息长度下能产生最大力量，且在该长度下，持续25毫秒的抽搐力量几乎与强直收缩时产生的力量相当。值得注意的是，幼鱼尾肌纤维在接近20倍长度/秒的速度下缩短时能产生最大功率，这一速度此前未在脊椎动物骨骼肌中被观测到。凭借如此动态的收缩能力，肌节肌肉具备为野外逃避捕食者所需的快速游泳爆发速度提供动力的能力。

结果

5日龄斑马鱼尾的解剖学特征

斑马鱼幼鱼尾部作为探究肌肉生理学和力学特性的模型系统，其实用性取决于能否将完整幼鱼的长度和力测量结果转化至运动肌纤维及其肌小节的原始来源。因此，为明确与肌纤维及其他非肌肉结构排列相关的尾部大体形态，我们结合活体成像技术以及固定切片组织的光学显微镜和透射电子显微镜（TEM）进行了研究。

图1展示了受精后5天幼虫尾部的主要解剖特征，分别为纵视图（图1的A、B部分）和横视图（图1的D、E部分）。运动肌几乎贯穿尾部全长，由呈V形排列的25个肌节组成，这些肌节通过结缔组织边界（即肌隔）分隔开（图1的A至C部分）。每个肌节由成束的横纹肌纤维构成，纤维长度为100微米，横跨整个肌节并在两端附着于肌隔上（图1的B部分）。尽管肌隔与尾部长轴呈45度角，但纤维在肌隔上的附着角度使其几乎与尾部长轴平行。在尾部中央区域，运动肌肉占幼虫横截面积的67.3±0.4%，并环绕脊髓和脊索。脊索是一种半刚性结缔组织鞘，包裹着带有大型加压液泡的细胞（图1，D和E）。脊髓和脊索均贯穿尾部全长。在发育的这一早期阶段，快肌纤维和慢肌纤维均有表达，且二者在解剖结构上相互分离(23)。具体而言，慢肌纤维在尾部侧面形成一层薄薄的单细胞层，占尾部横截面积的5.4±0.2%（图1E）。而快肌纤维占主导地位，占尾部横截面积的61.2±0.5%（图1E）。

图1 5日龄斑马鱼幼体的肌膜解剖。（A）完整尾部1毫米长区域的横向明场图像，用作这些研究的准备（参见材料和方法）。游泳肌肉排列成一系列人字形肌膜（虚线轮廓）。（B）单个背侧肌膜的纵向组织学切片染色以显示结构细节。肌肉纤维跨越几乎平行于尾部长轴的肌膜，并插入分离单个肌膜的结缔组织（肌视网膜）平面上。在图像的底部也可以看到脊髓的区域。（C）活幼体的背侧和侧视图，显示主要的解剖学特征。（D）尾部三个点的组织学横截面，相距0.5毫米，显示脊索和脊髓的位置，脊索和脊髓贯穿尾部的全长。（E）((D))黑匣子）。在这一水平上，肌体肌肉占尾部CSA的67.3 5 0.4%-((n=3))）。该区域90%以上由快速纤维组成（箭头标记为“f”）。这个年龄的缓慢肌肉纤维仅限于单个皮下细胞层（在箭头标记为“s”之间）。 

快肌纤维的超微结构形态与脊椎动物横纹肌的典型特征一致，可从纵切面（图2，A和C）和横切面（图2，B和D）观察到。透射电子显微镜图像。具体而言，单根肌纤维包含肌原纤维，肌原纤维具有边界清晰的肌节（长1.84±0.03微米），可识别出Z线和M线，以及代表细肌丝（含肌动蛋白）和粗肌丝（含肌球蛋白）重叠区域的A带（图2C）。单个肌原纤维以一定角度附着在肌隔上，形成阶梯状排列，这一结构使肌原纤维与相邻肌原纤维保持肌节的对位关系（图2A）。肌原纤维周围被发育良好的肌浆网膜网络包裹，该网络在与横小管相邻的Z线附近存在膨大结构（即侧囊）（图2A-D）。在横截面中，可清晰看到每条粗肌丝周围细肌丝高度有序的六方晶格排列（图2D插图）。

图2 快肌纤维超微结构。(A) 快肌的纵向透射电子显微镜（TEM）图像。单个肌原纤维（标有“f”的箭头）被肌浆网（标有“sr”的箭头）包围，以与图1B中纤维取向一致的角度附着在肌隔上（标有“p”的箭头 ("p"))）。(B) 快肌纤维的横截面透射电子显微镜（TEM）图像。单个肌纤维（边界由标有“mf”的箭头标识）中央有一个线粒体（标有“m”的箭头），分布均匀的肌浆网（标有 ("sr")) 的箭头）环绕着直径为1微米的单个肌原纤维（标有“f”的箭头）。(C) 高放大倍数下的纵向透射电子显微镜（TEM）图像。肌原纤维内（标有“f”的箭头之间）的肌节（长度为1.84±0.03微米）具有清晰的结构特征：A带、M线和Z线，与下方示意图中肌节所示的粗、细丝位置相关。Z线处可见三联体结构，由横小管（标有“tt”的箭头）和侧囊（标有“ls”的箭头 ("Is")）组成，肌原纤维旁有肌浆网（标有 ("sr") 的箭头）。( ((D)) ) 高放大倍数下的横截面透射电子显微镜（TEM）图像，突出显示了粗（肌球蛋白）丝和细（肌动蛋白）丝规则的六边形排列，如下方插图所示。肌原纤维被肌浆网（标有“sr”的箭头）包围。 

在完整安装的尾部测量力和长度

为了测量尾部肌体肌肉产生的力和缩短，我们在力传感器和高速伺服长度控制器（图3，A和B）之间夹持了1毫米的5天龄幼虫尾巴在体内（起始）长度的切片。因为尾巴是透明的，我们能够通过激光衍射直接在安装的尾巴中测量肌节长度，其起始长度（1.87 5 0.02毫米）与上述组织学测量相似。因为激光衍射信号的质量对位置和运动高度敏感，肌节长度在主动肌力发展的时间过程中无法可靠地监测。因此，我们研究了沿尾巴长轴测量的肌节长度是否可以在机械实验中用作肌纤维和肌节长度的代理。为此，我们开发了定制的MATLAB软件来识别和跟踪肌视膜，肌视膜在明场视频图像中显示为清晰定义的深色人字形线（图1 A）。具体来说，该软件使用峰值检测来测量沿着平行于尾部长轴绘制的扫描线（图3，B和C）的相邻肌视膜之间的距离（即肌孔长度）。当尾巴在1.00到1.09倍起始长度之间放松时，在制备中心附近测量的肌孔和肌节长度增加了类似的量（分别为起始长度的1.09 5 0.02和1.08 5 0.01倍，(n=4)）（图3 D）。

当保持固定长度并在28C下通过夹具直接用亚毫秒电流脉冲刺激时（见材料和方法），尾部会有典型的“抽搐”反应，每次刺激后25毫秒内力量迅速上升并返回基线（图3 E）。在高达40赫兹的刺激频率下观察到类似的抽搐反应（图3 F）。在较高频率下，单个抽搐合并，在300赫兹时形成完全融合的破伤风（图3 F）。短抽搐持续时间和高破伤风刺激频率与在体内观察到的尾鳍拍打频率极高。然而，尽管在此刺激方案中尾长保持恒定（即等长状态），但在以1000帧/秒拍摄的视频中测量发现，肌节在收缩过程中长度始终发生变化（视频S1）。具体而言，无论是单收缩还是强直收缩，远离夹具的内部肌节均会与力的产生同步沿尾部长轴缩短多达15%，而靠近标本末端的肌节则会伸长（图3，G和H）。我们将这种应变模式解读为夹具自身的挤压作用导致局部组织损伤的结果。具体来说，在收缩过程中，标本末端受损且因此柔韧性增加的区域会被中央健康肌节产生的力所拉伸。尾部的外观也证实了这一结论——收缩过程中缩短的肌节具有清晰可辨的肌隔，而靠近夹具的肌节则无此结构。为了统一实验方法并避开标本健康区域与受损区域的边界，我们将肌节长度定义为最靠近中央的三个相邻肌节的平均长度（图3，B、G和H）。在刺激前和强直平台期，从标本中央部分测量的稳态肌节长度也显示，肌节的缩短比例与以此方式测量的肌节长度缩短比例相同（图3D）。这一观察结果验证了在后续描述的各种实验方案中，肌节长度与肌纤维和肌小节长度具有良好的相关性，本研究在肌肉松弛和激活两种尾部状态下均采用了这一指标。

图3 完整斑马鱼幼鱼尾鳍的力和长度测量。(A) 与图1相同的5日龄幼鱼，标有“切割”的虚线代表进行力学研究固定前幼鱼的切割位置（参见材料与方法）。(B) (A)中1毫米长的尾鳍段通过弹簧夹具固定在力传感器和伺服电机之间。(C) (B)中的肌肉长度通过两种方式测量：1）在肌纤维层面，通过对1000帧/秒视频图像进行自动分析，分析图像像素强度检测的线扫描（图((B)))中的黑色水平线）以识别反映肌节边界的强度最小值（参见材料与方法）；或2）在肌小节层面，通过激光衍射法测量（参见材料与方法）。(D) 对比肌节和肌小节长度的比例变化，分别对应制剂被动拉伸至初始长度的1.10倍（图((n=4))），以及对制剂施加300赫兹、150毫秒的强直刺激（单个超最大电流脉冲引发的强直刺激在25毫秒内完成）。(图((F))) 随着刺激脉冲频率升高，单次抽搐的力曲线逐渐融合，在300赫兹时达到完全融合的强直收缩。(G) 尾鳍制剂在收缩过程中的静态帧图像，制剂通过肌隔（图C中标注）和夹具固定，强直收缩的力曲线位于下方。图中展示了收缩前（静息状态）和300赫兹、50毫秒强直收缩平台期（强直状态）的长度变化，静息状态下的肌隔位置以白色实线标注，部分用于识别中央肌节（图C）。为突出肌隔和肌节的运动，将静息状态下的肌隔位置叠加到收缩过程的长度变化图像中（白色虚线标注）。(H) 从1000帧/秒的视频（视频S1）中提取的纵向长度变化曲线，显示了制剂两端被标记为“左侧”和“右侧”的区域，以及由肌隔分隔的中央肌节（1、2、3号及平均值）的收缩情况，强直收缩的力曲线位于底部。 

静息尾部标本的粘弹性特性

肌肉长度和力量在放松（即被动）和主动条件下的关系是肌肉最基本的生理特征。因为快速肌肉纤维几乎平行于尾巴的长轴运行（图1），我们可以通过改变准备长度来探测这种关系。然而，尾巴的结构复杂性，具有相当大的脊索和脊髓，可能有助于尾巴准备的被动粘弹性特性，因为这些结构被拉伸。为了表征任何这样的粘弹性贡献，我们在恒定速度（1-10长度/秒）下将非刺激准备物拉伸到比起始长度长（2.5-10%）的一系列长度，然后随时间测量产生的力响应（图4，A和B）。增加准备长度导致初始的非线性力上升与长度变化一致，随后几分钟内力放松到新的更长长度下更低的稳态水平（图4 B）。初始非线性力/长度关系是包括肌肉在内的大多数生物组织（例如肌腱、肺）的典型特征。然而，与肌肉不同，尾巴对拉伸的大部分力反应随着时间而衰减，反映了尾巴内结构（例如脊索）的粘弹性性质。因此，在激活条件下，必须考虑这些粘弹性元件对尾巴产生的总力的贡献，以表征底层肌肉纤维的主动力产生。然而，在刺激时，肌丝缩短（图3，G和H）。当这样做时，肌丝长度的变化是否会影响负责上述被动粘弹性力的结构的长度，或者这些结构是否会保持它们的长度并随之保持它们对总力的贡献。

为了区分上述两种可能的情况，我们在10长度/秒拉伸到起始长度的1.1倍后立即诱发一系列抽搐，5分钟后，当更长长度的被动力衰减到其低稳态水平时（图4，C和D）。对于每次抽搐，记录抽搐前的被动力和每次抽搐峰值时的总力，这使得主动力被定义为总减去被动力（图4，D和F）。此外，在抽搐的高峰期确定了最大的肌丘缩短（图4，C和E）。有趣的是，主动抽搐力是恒定的，肌丘缩短相似，而不管拉伸后的时间如何（图4，E和F）。这些结果表明，两个时间点之间总抽搐力的差异反映了被动力衰减的程度，对于有和没有叠加抽搐的协议，这种力衰减的程度相似（图4，B和D）。更重要的是，尾巴粘弹性的时间依赖分量不受伴随收缩的肌丘长度变化的影响，因此，主动力是底层尾部肌肉的真正测量。

图4 尾部制备的被动粘弹性特性对测得力的贡献。(A) 以不同速率对不同长度进行伺服施加拉伸时的制备长度轨迹。( ((B)) ) 静止尾部制备对(A)中拉伸的即时和延迟力响应，由灰度强度协调。初始非线性响应之后是衰减阶段，这表明存在纯肌肉组织不典型的缓慢粘性成分。(C和D) 尾部制备的制备长度（灰色）和肌节长度（黑色）轨迹(C)，以及力响应( ((D)) )：以10长度/秒的速度拉伸至起始长度的1.1倍（与( ((A)) )和( ((B))) )中最深的虚线轨迹一致），并在拉伸后立即（组1）和5分钟后（组2）分别进行四次颤搐刺激。(E) 针对(F)中的两组颤搐刺激，分别在“颤搐前”即刻和“颤搐峰值”时测得的肌节长度（相对于起始肌节长度的归一化值）。(F) 对比( ((D)) )中所示的颤搐组之间的被动力、主动力和总力。在(E)和(F)中，单个颤搐的数据（灰色空心圆）均标注在其平均值±51标准差（SD）旁。

主动力的长度依赖性

在确定了松弛尾部的被动粘弹性力/长度特性后，我们确定了其依赖性关于主动力对肌节长度的影响。因此，对尾部标本（((n=5))）在5秒内从初始长度拉伸至1.17倍，同时每0.5秒诱发一次颤搐（图5，A和B）。肌节在每次颤搐过程中缩短，且随着标本长度增加，缩短程度逐渐减小（图5A）。为了将主动力产生与每次颤搐峰值时的肌节长度关联起来，我们如上所述，将主动力定义为总力减去在相同标本长度下测得的被动力。不过，我们将总力和主动力与颤搐峰值时达到的肌节长度进行了绘图对比（图5C）。按照该实验方案，主动收缩过程中肌节长度的范围在初始肌节长度的0.90至1.10倍之间。被动颤搐力和总颤搐力均随标本长度和肌节长度的增加而上升，而主动颤搐力则达到峰值接近初始肌节长度的1.00倍，且在肌节长度超过初始长度时下降（图5C）。有趣的是，在肌节长度为初始长度的0.95至1.05倍范围内，可产生超过90%的峰值主动颤搐力；这一范围与体内预计的肌肉使用长度范围相当。

图 5 幼鱼肌节肌肉的长度力关系(A) 代表性标本长度（灰色）与肌节长度（黑色）轨迹：标本被缓慢拉伸至标本初始长度的 1.17 倍，拉伸过程中每 500 ms 诱发一次单收缩。 (B) 对应 (A) 的力轨迹。单收缩前即刻测定被动力；总力在每次单收缩的峰值（此时肌节收缩至最短）处测得。假设单收缩过程中被动力基本保持恒定（见图 4），每次单收缩的主动力由总力减去被动力计算得到。 (C) 以归一化肌节长度为横坐标绘制的力曲线。本实验中每一次单收缩（标记为 ai）对应的尾部标本数据以空心符号标出；另外 4 组尾部标本数据以灰色显示。总力长度关系（虚线、方形符号）相较于被动力长度关系（点划线、三角形符号）发生左移。主动力长度关系（实线、圆形符号）在肌节初始长度附近出现平台。

近等长条件下的最大单收缩和强直张力

活性肌节应力（活性力/肌肉横截面积）产生的时间进程和幅度取决于刺激频率（图3F）和肌节长度（图5C）。因此，在单次抽搐和强直收缩过程中，肌节缩短5%至15%（图3，G和H、图4E和5A）中，无法确定肌节在最佳长度下的最大主动等长发力能力。鉴于肌节缩短发生在刺激后的最初10–15毫秒内，而基于视频图像分析的实时长度反馈受处理时间限制无法实现，因此我们采用了迭代前馈方法来补偿颤搐收缩和强直收缩过程中的肌节运动（图6）。

为了在收缩过程中保持肌节水平的制备处于等长状态，我们记录了施加刺激后肌节缩短的时间过程（图6，A和B），随后在一次后续收缩中，向伺服长度电机施加一个信号，该信号将以大小相等、方向相反的方式拉伸制备体。为了在肌节产生张力的最佳长度下，对肌节长度补偿前后的单收缩和强直收缩张力进行比较（图5C），首先需要将肌尾（((n=5))）预拉伸至实验起始长度的1.10倍（图6A），这样当肌节在单收缩和强直收缩过程中缩短时，其最终缩短长度能控制在肌节起始长度的53%以内（即主动张力产生的最佳长度；图5C）。如前所述，记录肌节的缩短反应，并将其作为长度伺服系统的有效前馈信号。随后，将实验装置的长度恢复至起始长度，在施加补偿性长度控制的条件下诱发单收缩和强直收缩（图6C，灰色实线轨迹，视频S2）。通过该实验方案，刺激前肌节长度保持近乎等长状态，与起始肌节长度的偏差最大不超过3%（图6C，黑色实线轨迹）。最后，在无刺激的情况下重复校正-拉伸实验流程（图6C、D，虚线轨迹），并从受长度控制的总单收缩和强直收缩张力反应中减去被动张力反应，以计算校正后的主动张力（图6D，红色轨迹）。通过此方法减小肌节缩短，对主动单收缩张力的幅度（图6E）和时间进程（图6F、G）均产生了显著影响，而对主动强直收缩张力则无影响（图6E）。具体而言，当肌节长度保持近乎等长时，主动单收缩张力显著提升10%（图6E），且激活时间((t_{10-100}))、半最大张力时的全宽((t_{50-50}))以及舒张时间((t_{100-10}))均显著缩短（图6G）。利用补偿后的数值，最大张力的单收缩/强直收缩比值为0.91±0.05（((n=5))）

缩短速度对主动力的影响

力与速度的关系是肌肉最基本的生理特性之一，其中主动力会随收缩速度的增加而降低。因此，为了确定28℃下幼虫尾部的这一关系，我们在强直收缩平台期以1至7个体节长度/秒的速度施加4%的收缩斜坡（图7A）。收缩前，尾部先被拉伸，这样在产生力的过程中，体节在施加收缩斜坡前会缩短至接近主动力峰值的最佳长度（图7A）。对这些收缩斜坡的反应是，力下降，斜坡结束时的力值（图7C中的(" a ")）相对于尾部在新的更短长度下等长恢复的力进行归一化（图7C中的“b”）。随着收缩斜坡速度的增加，归一化后的力呈下降趋势（图7D）。有趣的是，体节在以6.5±0.9个体节长度/秒的速度收缩时，仍能维持其等长肌力水平的0.86±0.02。为了进一步拓展力-速度关系的范围，我们将实验腔室温度降至18℃。即使在该温度下，体节仍能维持0.74±以4.35±0.3肌节长度/秒的速度缩短时，其等长肌力为0.1（图7D）。将温度降低10℃也使刺激后肌力发展过程中达到的峰值瞬时肌节缩短速度从13.25±2.1长度/秒降至9.75±1.1长度/秒（图7，B和D）。

图7 缩短速度对稳态主动力的影响。(A) 强直收缩中期（300 Hz，100 ms）施加等速缩短斜坡时，代表性标本（灰色）及其肌节长度轨迹（实线为28℃，虚线为18℃），标本尾部预先拉伸至初始长度的1.12倍。(B) 瞬时速度和(C) 标准化为标本恢复后的力的主动力轨迹，如(A)中所示施加缩短斜坡后恢复的力。阴影竖线代表等速斜坡阶段。与特定肌节缩短速度相关的主动力为等速斜坡结束时、斜坡后恢复的等长力a（参见材料与方法）。(D) 及内嵌图：各温度下的相关数据。每个尾部的单个数据点均已展示（灰色数据来自(A)–(C)中所示实验，对应多个速度，包含小鼠伸趾长肌尾部 (n=5)、(V_{max })，实验条件为14倍长度/秒、37℃，参考文献45）；同时展示了在100 Hz功环中峰值瞬时功率下观察到的肌节缩短速度（18.1个符号），以及如下文及图8所述的平均值±1标准差（SD）数据（黑色符号为2.1倍长度/秒、28℃）。(灰色虚线框内) 结合快速游泳时推断的幼体肌肉体内缩短速度（30倍长度/秒、28℃，参考文献26），展示主动力与测得的肌节缩短速度的关系，每个施加速度对应一组符号。大图展示了内嵌图的数据 

近似体内应变和频率下的循环功率输出

为驱动幼体游动，尾部肌肉组织必须经历重复的连续激活周期，在收缩时产生力量，并在放松时由拮抗肌肉使其伸长。完整运动周期内的功率定义为每个周期时间内的净正功，净功则为收缩时产生的功减去伸长时吸收的功。在5日龄时，斑马鱼幼体的尾鳍拍打频率可达100赫兹，肌肉应变预估为10%（为尾部静息长度的55%）。为评估肌节肌肉在近似体内应变和周期频率条件下产生循环功率的能力，我们采用改良的功环法进行实验。具体而言，在28摄氏度下，以40、60、80、100和120赫兹的频率，将制备长度以8%的幅度进行正弦变化（图8A）。尾部标本((n=5))在正弦长度周期内单次触发一个脉冲，以最大化主动功环中的净功（图8A和B）。还在松弛的标本中获得了被动功环（图8A和B）。在周期的每个节点测量肌节长度，通过在每个时间点绘制力与肌节长度的关系图来生成功环（图8B）。这对于计算真实的功和功率值至关重要，因为肌节内部的主动力和被动力会导致肌节长度与标本长度之间出现偏差（图8A），这一点也通过长度/力测量得到了验证（图5A）。

图8B展示了一个典型的80赫兹主动功环，随后是被动功环。对于主动功环，环的轨迹呈逆时针方向，这代表了由环内面积估算的净正功输出。而在被动功环中，环的轨迹收缩且呈顺时针方向，代表极低的净负功（即该装置吸收来自伺服系统的功）。净每次有效工作循环的做功量随循环频率的增加而降低，从 40 Hz 时的每千克肌肉 2.63±0.18 焦耳降至 120 Hz 时的每千克肌肉 0.43±0.27 焦耳（图8，C和D）。然而，最大净功率（图8D）出现在 80 Hz 时。(134.4±519.9 瓦/千克)，并在100赫兹时仍保持在较高水平(122.9±511.1 瓦/千克)，这是幼体快速游动期间观察到的最大尾鳍摆动频率，随后在120赫兹时功率急剧下降。收缩阶段的峰值功率在80赫兹时为498.9±5127.0 瓦/千克，在100赫兹时为640.2±5151.5 瓦/千克。这些数值比基于尾部运动运动学分析估算的该游动模式所需的肌肉功率密度高出50%。值得注意的是，在100赫兹的工作循环中，活性制剂以18.1±52.1 肌节长度/秒的速度收缩时产生了峰值功率(图8A)。

图8 模拟体内收缩方案下尾部的做功与功率输出。(A) 时域内典型的功环长度和力曲线。施加的80赫兹正弦式肌肉节长度变化（灰色曲线）会导致肌节长度发生类似变化（黑色数据点）。在前两个周期中，每个周期都会刺激尾部（箭头）使其发生抽搐，使得力（虚线曲线）在缩短阶段达到最高值。后两个周期则未受刺激。(B) 以力为纵轴、肌节长度为横轴的典型功环周期。主动功环周期内所做的净功与逆时针环内的面积成正比。在被动功环周期中，会吸收少量功，其大小与顺时针环内的面积成正比。(C) 在所研究的各循环频率下的典型功环（上方为五个主动功环，下方为五个被动功环，同(((B))))）。(((D))) 主动功环周期的净功随循环频率的变化关系（((n=)，共5条尾部）。(E) 主动功环周期的净功率随循环频率的变化关系（(n=5)，共5条尾部）。图中展示了单条尾部的(((D)))和(((E)))数据（空心符号），并标注了其平均值±5倍标准差（SD）。 

讨论

利用斑马鱼幼体研究肌肉生物学的优势在于，该模型系统能相对简便地在功能完整的肌肉系统中开展基因及其他操作，同时也易于测定此类实验干预对肌肉力学产生的影响。值得注意的是，正如本文及其他研究所证实的，斑马鱼幼体尾部可直接安装在肌肉测试装置中，无需进一步解剖，从而能沿尾部长轴测量收缩过程中产生的力。我们对这一通用方法进行了重大改进，主要考虑了两点：非肌肉结构（即脊髓、脊索）对力学的显著贡献等长尾部收缩过程中发生的肌节内部缩短。这些改进使我们能够从尾部力学数据中推导肌节水平的力与运动产生机制，且无需大幅增加实验的复杂度。

技术创新

本研究中报告的肌肉力学参数需要进行一系列技术改造，这些改造应适用于大多数标准的离体肌肉测试系统。具体包括以下几点：用于实现肌隔可视化的光学装置和明场照明系统；用于捕捉超快肌节肌肉运动的高速数码相机；用于自动图像分析和肌节长度追踪的软件；一种基于肌节长度轨迹实施“前馈”伺服控制信号的方法。重要的是，大多数参数仅需通过部分技术改造即可测量。具体而言，只有抽搐的幅度和时程需要前馈肌节长度补偿（图6，E-G）。本研究中的其他所有参数均可通过预拉伸以及肌节长度和速度的自动追踪相结合的方式获得。在某些情况下（等长强直张力、长度/张力、张力/速度），需对肌节进行离散的手动测量高速图像中的长度可替代自动追踪。

等长抽搐与强直

肌节肌肉的快速抽搐以及为实现完全融合强直收缩所需的高刺激频率（300赫兹），均与幼体以接近100赫兹的尾拍频率游动的能力相符。占肌节肌肉横截面积7%的慢肌纤维，对完整尾部标本测得的肌力贡献程度尚不清楚，不过我们在肌力记录中未发现存在收缩速度较慢的纤维亚群的证据。在脊椎动物肌肉中，肌力产生和舒张的时间进程部分取决于兴奋性刺激下钙离子向胞质递送及从胞质移除的速率(Ca^{2+})。肌节肌肉的超微结构（图2）显示了肌浆网的适应性结构，这会加快这些钙离子处理过程的速率：1）高度膨大的侧囊，是肌质中钙离子(Ca^{2+})释放的位点；2）围绕每个肌原纤维的广泛且分布均匀的肌浆网网络，该网络包含肌浆网钙泵，可在舒张期将钙离子(Ca^{2+})重新摄取回肌浆网。抽搐肌力几乎与强直收缩时肌力相当这一现象表明，激活时释放的(Ca^{2+})激活时释放的物质必须在单次肌肉抽搐的时间范围内达到接近饱和的水平。

长度与力的关系

主动肌产生力的能力对肌肉长度的依赖性是肌肉最基本的生理特性之一，这一特性由肌节内相互交错的粗肌丝（肌球蛋白）和细肌丝（肌动蛋白）的重叠程度决定（图2）。传统观点认为，当粗、细肌丝的重叠状态能使与细肌丝结合的产力型肌球蛋白横桥数量达到最大值时，肌节长度即为主动产力的最佳长度。当肌节长度短于或长于该最佳值时，主动产力能力都会下降。值得注意的是，体内大多数骨骼肌会通过在最佳肌节长度附近或处于该长度的状态下工作，来利用长度与肌力的关系。在以往的幼体尾部力学研究中，研究人员在每次收缩前测量肌节长度，结果发现当肌肉长度比体内静息长度长8%至12%时，其受激产生的肌力达到最大值。这一发现表明，幼体游动的动力可能来自于在远低于自身最佳产力肌节长度范围下工作的肌肉。更有可能的情况是，肌纤维内部发生了显著的缩短，由于此处所报告的制备依从性问题，这些早期研究中并未考虑这一因素。对这种内部缩短情况进行校正后（图3和图6），实现最大肌节力量输出的最佳长度（图5）确实与幼虫体内静止时的尾部长度一致，而幼虫在游动过程中很可能正是以这一长度发挥作用的。

缩短速度与能量产生

1938年，A.V.希尔描述了肌肉缩短速度与缩短所受负荷之间如今经典的双曲线关系。在极端情况下，肌肉在无负荷条件下以最大速度缩短（((V_{max }))），而在等长收缩条件下则不发生缩短，此时肌肉产生最大力量。尽管肌肉在这两个极端情况下不产生功率（即力-速度关系），但当肌肉在0.15至0.40的范围内缩短时（(V_{max })），会产生最大的机械功率，且一般运动肌肉在生物力学上被设计为在体内该范围内运作。鉴于尾部肌肉为幼体的快速游泳运动提供动力，我们既旨在通过工作循环方案表征其力-速度关系，又估算其功率产生，这使我们能够将这些生理参数与游泳过程中从幼体身体运动学推导得出的估算值进行比较。

为描述力-速度关系，我们在强直收缩的力平台期以已知速度对尾部施加长度变化，随后测量由此产生的力下降情况（图7）。然而，实验设备的时间分辨率将长度变化的最大速度限制为6.5个体节长度/秒。值得注意的是，在28℃下，该速度仅使强直主动力下降了14%。因此，我们无法完整表征力-速度关系在整个力范围内的形态，需要能够施加并记录这些幼体尾部可能具备的高速收缩速度的设备（图7）。事实上，游泳过程中的身体运动学分析表明，5日龄幼体尾部的快肌体节肌纤维最大收缩速度可达30个体节长度/秒，但这一数值仍未达到26a201d6b2b9，因为游泳是一种受负荷的运动。基于我们在刺激后力发育阶段进行的高速体节成像，观察到28℃下体节内部收缩速度超过13个体节长度/秒（图3H和图7B、D），这一数值同样未达到42c4-94a5-360a96a20e17。推测这些高收缩速度（无论其精确绝对值如何）反映了发育中幼体表达的快肌骨骼肌肌球蛋白重链固有的肌动球蛋白ATP酶活性。

由于缺乏完整的力-速度关系来估算峰值功率输出及其对应的速度，我们采用了功环方案，在近似体内条件下直接估算肌肉的做功量和功率输出。条件。有趣的是，幼虫尾部在其体内功环频率的整个范围内都能产生较高的净功率（图8）。更令人惊讶的是，在该实验流程中，当肌节以超过18肌节长度/秒的速度缩短时，在100赫兹的功环频率下峰值功率达到最高（图8A）。因此，若假设该速度代表0.4 (V_{max })，我们可以粗略但保守地估算出28摄氏度时肌节的(V_{max })为45肌节长度/秒，这使其成为收缩速度最快的脊椎动物运动肌肉，速度是现有最快肌肉的2倍。作为参考基准，研究充分的以快肌纤维为主的小鼠趾长伸肌（EDL）在37摄氏度时，据报道其(V_{max })为14肌节长度/秒。

某些特定种类的幼鱼肌节肌肉与脊椎动物的“超快速”肌肉在某些方面相似，这类肌肉仅存在于发声器官系统中，其循环频率可达100至200赫兹。使超快速肌肉能以如此高频率循环的生理适应性是以力量产生能力为代价的。具体而言，肌肉细胞体积和能量消耗的很大一部分都用于钙离子处理（图2），这减少了肌节的可用空间。此外，为了加快舒张速度，超快速肌肉表达的肌球蛋白与肌动蛋白的分离速率很高，形成了低占空比的分子马达，其力量生成能力较弱。肌节肌肉可能也存在类似的权衡：在(76 mN / mm^{2})（图6）的研究中，肌节肌肉产生的最大等长应力介于小鼠伸趾长肌((243 mN / mm^{2}))与蟾鱼超快速的鳔肌((24 mN / mm^{2}))之间。肌节肌肉的独特之处在于其发电能力。尽管斑马鱼幼鱼的主动等长应力相对较低，但其独特的力/速度特性使其在正弦功循环中产生的肌肉重量比功率与小鼠伸趾长肌相当，而循环频率却高出十倍（分别为100赫兹时122瓦/千克和9赫兹时132瓦/千克）。

斑马鱼幼虫肌肉极致的机械性能如何影响其作为模型系统的价值？尽管这些肌肉在机械或遗传层面与人类肌肉的相似度不及小鼠肌肉，但它们为解答基础问题提供了独特的契机。例如，脊椎动物肌肉的机械特性（如(V_{max })）是如何被调节，以适配特定肌肉驱动行为所带来的限制的？斑马鱼幼虫阶段需要肌肉具备超快性能才能游动，而在其生长至成年的过程中，体重增长了1000倍，对其运动器官的生物力学和环境需求也在持续变化。从肌节层面探究这一调节机制，对人类生理学具有重要意义，因为本研究中涉及的调控肌肉-机械关系的基因（如肌球蛋白结合蛋白C），在斑马鱼体内均存在同源基因。

结论

斑马鱼幼鱼凭借其快速的发育特性和易操作性，有望成为研究健康与疾病状态下肌肉功能的实验灵活性模型系统。幼鱼运动肌肉的结构使得研究人员可利用为离体肌肉力学研究开发的设备和方法，对完整的尾部展开研究。本研究对该方法进行了改进，纳入了对肌肉长度和主动力的精准测量，从而可开展一系列经典的肌肉力学实验，以确定肌肉的基本收缩参数。借助这一方法，斑马鱼幼鱼尾可成为一种完整的肌肉力学制备样本，适用于高通量药物筛选或高迭代率的转基因研究，而这些研究在小鼠模型中要么无法开展，要么成本过高。斑马鱼幼鱼肌肉不仅可作为模型系统发挥作用，研究还表明其肌肉的缩短速度超过了所有已知脊椎动物的骨骼肌。仅这一发现就值得进一步研究，以明确肌节内实现这种极端力学性能的分子适应性机制。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。