题目：Microbiota Regulate Intestinal Absorption and Metabolism of Fatty Acids in the Zebrafish

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22980325/

期刊：Cell Host & Microbe

摘要

肠道膳食脂肪吸收的调控对维持机体能量平衡至关重要。肠道微生物组显然会影响宿主的能量平衡，但它们在膳食脂肪的肠道吸收以及肠外代谢中发挥的作用尚不明确。本研究利用无菌斑马鱼模型，结合荧光脂肪酸类似物活体成像技术，发现微生物能够刺激肠道上皮与肝脏对脂肪酸的摄取以及脂滴形成。微生物可以膳食依赖的方式增加肠道上皮细胞内脂滴的数量。摄食会促使肠道中厚壁菌门细菌富集；经膳食富集的厚壁菌门及其代谢产物足以使上皮脂滴数量增多，而其他类群细菌则会增大脂滴体积。由此可见，肠道微生物的不同成员通过截然不同的机制促进脂肪酸吸收。膳食诱导的微生物群落组成改变会影响脂肪吸收，这为解析 “微生物膳食互作调控宿主能量平衡” 提供了机制层面的新见解。

引言

膳食脂肪可为饮食提供大量能量。母乳喂养的人类婴儿，膳食脂质可满足其 45%55% 的能量需求；西式饮食中，脂质占总热量的 40%55%。脊椎动物体内，膳食脂肪以甘油三酯的形式在肠腔被脂肪酶消化，释放游离脂肪酸与单甘油酯，随后被肠道上皮的肠上皮细胞吸收。胆汁盐胶束或脂质体可增溶脂肪酸，促进肠上皮细胞刷状缘对脂肪酸的吸收。脂肪酸被肠上皮细胞摄取后有 4 条代谢去向：①氧化供能；②重新酯化为甘油三酯，以胞质脂滴形式暂时储存；③组装成乳糜微粒，分泌进入淋巴循环；④以游离脂肪酸形式释放入血液循环。经乳糜微粒或游离脂肪酸进入循环的外源性脂肪酸，可在肝脏等肠外组织中氧化分解或者储存。外源性脂肪酸被肠上皮摄取、组装为脂滴与乳糜微粒的诸多过程，仍存在大量未解问题。阐明调控膳食脂肪酸吸收与脂滴生成的调控因子，有望为肥胖状态下降低膳食能量获取效率、以及营养不良状态下提升能量吸收效率开辟新思路。

肠道微生物与膳食这类环境因素，是调控膳食脂质吸收与能量平衡极具潜力的靶点。消化道自出生起即定植复杂的微生物群落（肠道微生物组），深刻调控肠道及肠外生理功能。肠道微生物组重塑膳食营养代谢，是宿主肠道微生物共生关系的核心特征，该现象在反刍动物前胃、人和啮齿类后肠（结肠）中研究最为充分：微生物发酵宿主无法消化的膳食复合碳水化合物，生成单糖与短链脂肪酸，供宿主吸收利用。

小鼠定植肠道微生物后，脂肪组织脂质储存量升高，血清、肝脏、脂肪组织内次级脂质代谢物发生显著改变。但上述脂质谱变化，既可能源于微生物对外源膳食脂质肠道吸收 / 代谢的调控，也可由肝脏合成、代谢内源性脂质造成。因此，肠道微生物究竟如何影响膳食脂质的肠道吸收，至今尚不清晰。

微生物能够改变宿主获取膳食营养的效率，而膳食反过来也塑造肠道微生物群落的组成与功能。大量人类及哺乳动物研究表明，肠道微生物群落组成和膳食结构高度相关。越来越多证据显示，热量摄入可调控脊椎动物肠道两大优势菌门 —— 厚壁菌门、拟杆菌门的相对丰度。例如饥饿 24 h 的小鼠，肠道厚壁菌门丰度下降、拟杆菌门丰度上升；与之相反，肥胖人群、摄入高热量饮食的人群、多食肥胖 ob/ob 小鼠、饲喂西式高热量饲料的小鼠、进食后的蟒蛇，其肠道微生物均表现为厚壁菌门占比升高，拟杆菌门及其他菌门占比被挤压下降。无菌小鼠实验证实，膳食诱导的肠道厚壁菌门富集，与宿主正能量平衡密切相关。但热量摄入如何驱动厚壁菌门在肠道富集，背后生态学机制仍不清楚；膳食改变微生物群落之后，又会怎样影响肠道膳食脂质吸收，也有待解答。

本研究选用斑马鱼模型，探究微生物膳食互作如何调控肠道上皮脂质吸收。斑马鱼的消化道解剖结构、生理功能、脂质代谢通路和哺乳动物等脊椎动物高度保守。斑马鱼幼鱼受精后第 5 天（dpf）开始外源摄食，受精后第 6 天完全消耗内源性卵黄。既往对比无菌斑马鱼与常规菌群定植斑马鱼的研究证实，微生物组参与调控宿主多种生理过程。斑马鱼肠道微生物和人类、哺乳动物类似，以变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门为主；但膳食如何塑造斑马鱼肠道微生物，肠道菌群和水环境微生物的关联，尚不明确。本课题组建立了利用 BODIPY 荧光标记脂肪酸类似物的脂质体孵育体系，可活体监测肠道上皮对脂肪酸的吸收。本研究借助该技术，解析微生物定植、膳食对肠道脂肪酸吸收的影响，揭示膳食依赖模式下微生物促进肠道及肠外组织脂肪酸吸收的宿主微生物互作生态学机制。

结果

肠道菌群以饮食依赖方式促进脂肪酸积累

为了确定微生物群对肠道饮食脂质吸收的影响，我们使用了BODIPY标记的棕榈酸（BODIPY- (C_{16})，它是甘油三酯中最常见的饱和长链脂肪酸）和中链戊酸（BODIPY- (C_{5})；BODIPY荧光团可有效使C5:0脂肪酸主链的碳链长度增加2-3个），后者是在肠道中吸收得更快。我们将 6 天龄（dpf）的无菌（GF）和常规定植（CONVD）斑马鱼与包被在蛋黄脂质体中的 BODIPY-(C_{5}) 或 BODIPY-(C_{16}) 共同孵育 6 小时（图 1A）。为了检测动物先前的营养状态是否会影响膳食脂质的吸收，我们从 3 天龄（dpf）开始，在无（饥饿处理）或有无菌对照饲料（C 喂养组；表 S1）的条件下进行了该实验。3 天龄（dpf）开始喂食，为斑马鱼和微生物群均提供营养丰富的环境；然而，斑马鱼直到 5 天龄（dpf）才开始进食。因此，在饥饿条件下饲养的斑马鱼，在 6 天龄（dpf）实验终点前仅被剥夺外源营养 1 天。对活体斑马鱼近端肠道的共聚焦成像显示，在所有测试条件下均观察到肠腔和上皮细胞的荧光，分别代表脂肪酸类似物的摄入和吸收（图 1B、1C）。对肠道上皮细胞荧光的定量分析显示，与无菌（GF）斑马鱼相比，常规定植（CONVD）斑马鱼的 BODIPY-(C_{5}) 和 BODIPY-(C_{16}) 荧光水平更高（(C_{5}) 对应 d7a2bd99-647d-4d14-afcd-db42fdb7858bd，(C_{16})），且先前接触饲料会进一步增强这一现象（图 1D、1F）。相反，我们观察到无菌（GF）斑马鱼的肠腔荧光始终高于常规定植（CONVD）斑马鱼（cec4a0bd-8391-4b39-858d-0aae632f0000 对应 (p<0.05)，(C_{16} )) 无显著差异，n.s.）（图 1E、1G）。这些结果表明，微生物群以饲料依赖的方式促进膳食脂肪酸在肠道上皮细胞中的积累。

图1. 存在微生物群和饮食时脂肪酸在肠上皮细胞中积累以及用 BODIPY 标记的脂滴的基底外侧积累（白色箭头头）-(C_{5}) (A) 无菌斑马鱼中 BODIPY-FL 递送实验的示意图。受精后 0 天（dpf）的无菌（GF）斑马鱼要么无菌饲养（上图），要么在 3 dpf 接种正常微生物群（常规化，CONVD；下图）。从 3 到 6 dpf，斑马鱼要么禁食，要么喂食对照（C）或低热量（LC）饲料（见表S1）。在 6 dpf 时，将斑马鱼与 BODIPY-FL 脂质体孵育 6 小时，然后进行成像或固定以用于后续成像。(B 和 C) 6 dpf 活体 GF 和 CONVD 斑马鱼肠道与 BODIPY-FL (C_{5}) 或 (C_{16}) 孵育后的代表性共聚焦图像。比例尺，50 毫米。(B) 标注了 GF 和 CONVD 斑马鱼的肠腔（Lum）和上皮（Epi；虚线边界）。上皮显示顶端（白色箭头）(C) 与 BODIPY-FL (C_{16}) 孵育 (D–G) 斑马鱼上皮总荧光（D 和 F）和腔荧光（E 和 G）的定量，以相对荧光单位（RFU）表示，斑马鱼在 BODIPY-FL (C_{5})（D 和 E）或 (C_{16})（F 和 G）中孵育。数值代表三次独立实验的平均值±标准误：*p < 0.05；**p < 0.01。(p <0.05)；(^{*} p<0.01)。

肠道微生物群增加肠道上皮细胞中脂滴的数量和大小

接下来，我们旨在探究观察到的BODIPY标记脂肪酸在肠上皮细胞中的积累，是否是由肠上皮细胞中脂滴（LD）形成的改变所导致。由于微生物定殖和喂食对BODIPY标记的中长链脂肪酸在上皮细胞中的积累表现出相似的影响（图1），我们选用中链脂肪酸类似物BODIPY-(C_{5})，建立了一种用于检测肠上皮细胞脂滴形成的定量分析方法（详见实验方法及图S1A–S1F）。用BODIPY-FL (C_{5})进行的时间梯度实验显示，孵育3小时后，无菌（GF）鱼和常规饲养（CONVD）鱼的上皮细胞脂滴数量无差异（图S1G、S1H）；而仅在同时进行微生物定殖和喂食的斑马鱼中，延长孵育时间至6小时后，其上皮细胞脂滴数量才出现增加（图2A、2B）。这一结果证实，微生物群与饮食的相互作用可促进脂肪酸的吸收（图2B）。通过分析脂滴尺寸的相对频率，我们发现在所有实验条件下，3小时孵育后均出现了高比例的小脂滴（图S1I）。6小时孵育后，所有常规饲养（CONVD）条件下的大脂滴比例均有所增加（即(5.6-11 mu m^{2})区域、(p<0.01)）；而小脂滴（即(<0.55 mu m^{2})区域、(p<0.001)）和中脂滴（即0.55 (1.64 mu m^{2})区域、(p<0.001)）的比例则受饮食的显著影响（图2C）。这些结果表明，微生物群的存在可促使上皮细胞脂滴形成两种不同的表型：无论饮食史如何，脂滴尺寸均增大；而仅在喂食的动物中，脂滴数量才会增加。这两种表型仅在BODIPY-FL孵育6小时后才出现，提示微生物群可能是增强肠上皮细胞的脂肪酸储存能力，而非加速脂滴的初始形成。值得注意的是，即使斑马鱼喂食低热量饮食（LC-fed，该饮食因蛋白质含量降低55.6%，热量较对照饮食减少31.4%），微生物群仍能使其脂滴数量和尺寸增加，如图所示，这表明饮食依赖的微生物对斑马鱼肠道脂质滴积累的刺激作用，并非由饮食的热量值或蛋白质含量决定。

图2. 微生物群刺激脂质吸收进入肠上皮脂质滴和肠外组织(D)用BODIPY-FL (C_{5})孵育6小时的6天post-fertilization（dpf）无菌（GF）和常规驯化（CONVD）斑马鱼肝脏的代表性共聚焦图像。比例尺，20毫米。上皮感兴趣区域（((7,500 mu m^{2}))）。图表显示至少两次独立实验的平均值±标准误（每种条件/实验3-15条鱼）。(A) 固定的6dpf (Tg/) 4.5fabp2:DsRed）GF和CONVD斑马鱼喂食对照饮食并用BODIPY-FL (C_{5})孵育6小时的代表性共聚焦图像。比例尺，20毫米。表达DsRed的肠上皮细胞在表皮和固有层中显示BODIPY-(C_{5})作为脂滴（LDs）积累（白色箭头）。在CONVD斑马鱼的表皮中检测到大脂滴（黑色箭头）。(B和C) 使用Volocity软件开发的脂滴定量分析（见图S1A–S1F），用于统计显著性分析中确定脂滴数量（B）和大小频率（C）：a，与喂食相同饮食的GF组相比有显著性；b，与相同微生物条件下的饥饿组相比有显著性。3小时时间点的数据见图S2。(E) 6dpf GF和CONVD斑马鱼肝脏的BODIPY-(C_{5})荧光评分。图表显示两次独立实验的平均值±标准差（每种条件/实验3-5条鱼），采用盲法评分（评分标准0-5）。(F) GF和CONVD喂食C饲料的斑马鱼的非胃肠道BODIPY-(C_{5})荧光。数据为两次实验的平均值±标准差（每种条件/实验20-30具尸体和9-10条完整幼体）。显著差异标注如下：(p 0.05)（图E和F）

微生物对膳食脂质吸收进入肠外组织的刺激作用

我们推测，喂食CONVD的斑马鱼中脂滴数量和体积增加，可能是由于乳糜微粒或游离脂肪酸向循环系统的输出延迟，或是肠腔中脂肪酸的吸收增加。事实上，此前在小鼠中的研究表明，大型脂滴的积累可能与乳糜微粒胞吐减少有关（Buhman等人，2002）。为了验证喂食CONVD的斑马鱼中乳糜微粒胞吐是否受损，我们开展了洗脱实验，在BODIPY-FL (C_{5})孵育后，比较GF型和CONVD型斑马鱼从上皮细胞中清除脂滴的能力。我们将6天龄的GF型和CONVD型C-喂食斑马鱼与BODIPY-FL (C_{5})共同孵育3小时，随后在无菌GZM中对每种条件下的部分斑马鱼额外洗脱5小时（图3A）。

与我们先前的观察结果一致（图2），3小时的标记使无菌（GF）和常规化（CONVD）动物的肠道中脂滴（LD）数量相近（图3B和图3C）。清洗处理减少了无菌和常规化斑马鱼上皮细胞中的脂滴数量；然而，这种减少在常规化斑马鱼中更为显著（图3B和图3C）。这些数据表明，常规化动物肠道的脂肪酸（FA）转运能力强于无菌斑马鱼。对清洗处理后无菌和常规化动物脂滴大小频率的分析显示，小脂滴数量出现了类似的减少（图3D），而中等大小（图3D）和大尺寸脂滴（图3D）的数量则有所增加。这一结果说明，清洗处理后常规化动物脂滴数量的显著减少（图3C）并非由微生物群存在时脂滴融合增强所导致。此外，这些数据表明，常规化斑马鱼中观察到的脂滴数量和大小的增加（图2）并非由肠道脂质输出受损引起。喂食状态下常规化斑马鱼上皮脂滴积累的增加也与以下方面无显著关联：摄取率、消化器官大小，或肠道腔中消化酶磷脂酶和蛋白酶的体内活性（图S2）。

图3. 微生物群存在时脂质滴清除效率更高（A）BODIPY-FL (C_{5}) 洗脱实验的示意图。（B）正常喂食的 GF 和 CONVD 斑马鱼在洗脱前后的代表性共聚焦图像。比例尺，10 毫米。（C 和 D）脂质滴（LD）数量（C）和相对大小频率（D）的定量分析，图 S2。其他微生物条件下的洗脱实验。另见图；b，与相同微生物条件下的对照组相比差异显著（p < 0.001）；a，与相同条件下洗脱前相比差异显著。已识别出显著差异：***p < (###)。实验（每个条件/实验 4–14 条鱼）的结果以平均值±标准误（SEM）表示，来自两次独立实验

我们接下来探究了微生物群诱导的肠道上皮脂滴（LD）积累增加是否与脂肪酸（FA）从肠道向其他组织的输出增加相关。BODIPY-(C_{5}) 分子被斑马鱼肠道吸收并输出后，其主要积累部位之一是肝脏内的脂滴（Carten 等人，2011年）。我们发现，在BODIPY-FL (C_{5}(p<0.01)) 中孵育6小时后，微生物群的存在导致肝脏脂滴中的BODIPY荧光强度增加（图2D和图2E）。这一现象在饥饿组和喂食碳水化合物（C-fed）的常规饲养（CONVD）斑马鱼幼虫中均被观察到（图2E），这表明微生物群可促进肠道对脂肪酸的吸收并将其输出至肝脏，且这一过程不受饮食史及饮食相关影响的制约。

微生物群对肠道脂滴数量的影响。此外，与无菌（GF）对照组相比，常规化（CONVD）动物在非胃肠道（GI）组织中BODIPY-(C_{5})荧光的积累显著增加（增幅为82%±16%）（图2F）。基于这些结果，我们得出结论：微生物群诱导肠道上皮细胞中脂滴积累的能力，与膳食脂肪酸向肠外组织的吸收增加相关。

饮食决定斑马鱼肠道细菌群落组成

我们的研究结果表明，微生物群会促进摄食状态下斑马鱼肠道上皮脂滴的数量，但在饥饿状态下则不会。我们推测这可能是由于饮食诱导的肠道微生物群组成发生改变所致。斑马鱼肠道微生物群的差异与饮食相关微生物群组成的变化可能是由于饮食对宿主肠道微环境的直接影响（例如宿主生理机能或免疫力的改变）。另外，这种变化也可能是由于饮食对周围水环境的间接影响（例如水体化学性质和营养物质可利用性的改变），而这会改变水体中的微生物群落，进而可供斑马鱼肠道定植。因此，我们分析了饮食对斑马鱼肠道及周围水体中形成的细菌群落的影响。在受精后3天（3 dpf），用常规的斑马鱼常规微生物群（接种物，图S3A）定植无菌（GF）斑马鱼胚胎，随后在受精后6天（6 dpf）前对其进行禁食或喂食无菌的C型或LC型饲料。从斑马鱼肠道和饲养水体中提取微生物基因组DNA，并采用基于16S rRNA基因焦磷酸测序的分析方法对相应细菌群落进行检测（图S3A和表S2）。基于非加权（评估群落组成）和加权（评估群落结构）算法（Lozupone等人，2007）得到的UniFrac主坐标分析（PCoA）图提供了多方面的见解。首先，每个样本组的生物学重复样本均稳定地聚集在一起（图4A和4B），表明决定这些细菌群落组成的过程具有可重复性。其次，我们观察到肠道样本和水体样本存在显著分离，这说明斑马鱼肠道会从周围水体中筛选或富集一类独特的细菌子集。值得注意的是，接种物样本在所有其他样本中处于核心位置，这反映出接种物样本中观察到的绝大多数操作分类单元（OTUs）也在其他样本中被检测到（108/111，即97.3%；图S3B–S3E）。第三，无论是肠道环境还是水体环境，喂食组样本均聚集在一起，并与禁食组样本分离，这表明喂食显著改变了肠道和以独特的方式影响水体中的细菌群落。此外，LC 喂养组和对照组喂养样本的聚类结果表明，饮食对这些群落的影响并非由饮食的热量和蛋白质含量所主导。

在主坐标分析（PCoA）中，肠道样本与水体样本呈现明显分离的特征，同时这两类样本中多种细菌类群的相对丰度存在显著差异（图4C、4D及表S3）。尽管所有样本均以变形菌门序列为主，但β-变形菌纲序列在水体样本中显著富集（在所有水体和肠道样本中，其占比分别平均为49.7%和6.4%；(p<0.0001)）。拟杆菌门序列也在水体样本中富集（平均占比分别为19%和3.3%；(p<0.01)），这一结果源于黄杆菌纲和鞘氨醇杆菌纲序列丰度的增加。相反，厚壁菌门序列在肠道样本中富集（平均占比分别为30.2%和0.6%；(p<0.05)），这是由芽孢杆菌纲和梭菌纲序列丰度上升导致的。值得注意的是，厚壁菌门的肠道特异性富集仅出现在喂食的斑马鱼中，而非饥饿的斑马鱼中（图4C、4D），这表明摄食会促使斑马鱼宿主的肠道内特异性富集厚壁菌门。

除了影响特定细菌类群的相对丰度外，这些细菌群落的整体多样性也会随饮食和环境的变化而改变。在肠道中，饥饿动物的细菌多样性和丰富度显著低于喂食C或LC饮食的动物（例如，饥饿组肠道样本的平均系统发育距离为1.87，而喂食C/LC饮食的动物为5.41；(p<0.005)）（图4E、4F及表S4）。相比之下，喂食和饥饿条件下水体群落的多样性与丰富度无显著差异。饮食诱导的肠道微生物多样性增加，并未伴随肠道可培养微生物密度的显著变化（图5A）。这些结果表明，饮食的存在能够促进斑马鱼肠道细菌群落的多样性，却不会在周围水体中引发类似的变化。

尽管生物学重复样本的趋势总体一致，但有两个案例中某一个重复样本与其他样本存在显著偏差（C-Fed 肠道1和饥饿肠道3，图4A–4C）。这些样本中的序列归属于在其他样本中也存在的操作分类单元（数据未展示），表明这些偏差并非源于外源污染，而是由操作分类单元的相对丰度差异导致。这两个异常样本可能由技术误差造成，也可能反映了肠道微生物群落组装过程中的随机性。

图4.16S rRNA基因测序揭示了斑马鱼肠道和水中不同的细菌群落，这些细菌群落受到饮食状态（A和B）的强烈影响。UniFrac主坐标分析（PCoA）使用未加权（A）和加权（B）算法绘制的图。每个重复样本由单个形状表示，每个形状周围的实心灰色椭球表示每个样本500个序列的100个折刀重复的可信区间。样品的明显集群用开放椭圆形表示。C喂肠道1（a）和饥饿肠道3（b）的样品被标记。另见表S2。

从斑马鱼肠道分离的厚壁菌门菌株在缺乏微生物竞争时对外源营养水平敏感

脊椎动物肠道内依赖饮食的厚壁菌门富集背后的生态过程目前仍不明确。我们推测厚壁菌门的富集部分归因于其在饮食营养物质存在时，启动或维持肠道定殖的能力得到提升。为验证这一可能性，我们在斑马鱼受精后3天（3 dpf）对无菌（GF）斑马鱼接种了斑马鱼微生物组中单个可培养的成员（该过程称为单关联定植；表S5），并在无其他微生物竞争的情况下，测定了其在斑马鱼肠道及周围水体中的定殖效率。值得注意的是，在饥饿条件下，代表性厚壁菌门菌株微小杆菌属（Exiguobacterium sp.）ZWU0009（芽孢杆菌纲）的菌落形成单位（cfu）密度在肠道和水体中均低于检测限，但在喂食条件下成功实现了稳定定殖（图5B）。相比之下，金黄杆菌属（Chryseobacterium sp.）ZOR0023（拟杆菌门，黄杆菌纲；图5C）和假单胞菌属（Pseudomonas sp.）ZWU0006（变形菌门，γ-变形菌纲；图5D）菌株在饥饿条件下即可定殖肠道和水体，且在喂食条件下菌落形成单位密度仅有小幅提升。这一结果表明，即便在无微生物竞争的简单群落中，我们所测试的厚壁菌门菌株（微小杆菌属）仍需要营养丰富的环境才能存活并成功定殖肠道，而其他类群的菌株（金黄杆菌属和假单胞菌属）即使在缺乏饮食营养的情况下也能完成定殖。这些结果提示，在常规定植（CONVD）斑马鱼肠道（图4D）中，厚壁菌门依赖饮食的富集现象可能至少部分是由于厚壁菌门在饮食存在时其定殖效率自主提升所致。

图5. 与单个群落成员的单关联揭示了代表性厚壁菌门物种的饮食依赖性定殖(A–D) 6天龄斑马鱼肠道（每解剖的肠道；每个(n=4-5 per)条件n = 4–5）或周围水体（每毫升；每个(n=3)条件n值）中的菌落形成单位（cfu）。结果代表至少两次独立实验的平均值±标准误（n.d.，未检测到），并标注了显著差异：*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001**。(A) 展示了常规饲养（CONVD）斑马鱼中常规微生物群的密度。同时还展示了与**微杆菌属**菌株ZWU0009（厚壁菌门）(B)、**金黄杆菌属**菌株ZOR0023（拟杆菌门）(C)或**假单胞菌属**菌株ZWU0006（变形菌门）(D)单关联的无菌（GF）斑马鱼的细菌密度。另见表S5

单关联分析揭示细菌促进肠道脂肪酸吸收的两种不同途径

我们的BODIPY-FL (C_{5})标记实验显示，微生物群会刺激肠上皮细胞脂肪酸吸收过程中的两种表型：依赖饮食的脂滴数量增加和不依赖饮食的脂滴体积增大。这一结果提出了一种可能性，即以饮食依赖性方式富集的细菌类群（如厚壁菌门）可能会促进脂滴数量的增加。为验证这一假设，我们使用上述三种相同的细菌菌株对喂食C饲料的无菌斑马鱼进行了单菌定殖实验，并开展了BODIPY-FL (C_{5})递送实验（图6A–6D）。尽管定殖对肠上皮细胞脂滴数量存在整体效应（((p<0.001))），但仅有厚壁菌门的微小杆菌属菌株能够显著使脂滴数量增加（图6B）。相比之下，与微小杆菌属单一定殖的斑马鱼，其脂滴大小频率与无菌对照组无差异，而另外两种测试菌株则导致肠道上皮中大脂滴的相对频率上升（图6F）。对单一定殖斑马鱼肝脏中BODIPY荧光的分析显示，与无菌对照组相比，三种测试菌株的定殖均产生了显著效应（(p<0.05) 图6G）。然而，在肝脏中能显著提升BODIPY荧光的唯一单一菌株仍是微小杆菌属（图6G）。这些结果表明，细菌促进肠道脂肪酸吸收存在两种机制：厚壁菌门介导的肠上皮细胞脂滴数量诱导，这与脂肪酸高效输出至肝脏相关；以及非厚壁菌门细菌诱导的肠上皮细胞脂滴大小变化（图7）。

我们推测，单个细菌菌株对肠上皮细胞脂肪酸吸收的这些不同作用可能是由不同的细菌因子引起的。为验证这一可能性，我们将3天龄的无菌斑马鱼幼鱼置于经三种测试细菌菌株之一预处理并过滤灭菌的培养基中，随后在6天龄时进行BODIPY-FL (C_{5})递送实验。我们发现，仅来自厚壁菌门微小杆菌属的预处理培养基足以显著增加肠上皮细胞脂滴数量（图6H）。脂滴数量的这一增加与在定植活微小杆菌属的单菌关联斑马鱼中观察到的结果相似（图6E），表明该厚壁菌门菌株可通过其细菌产物增加脂滴数量。相比之下，所有预处理培养基均无法增加肠上皮细胞脂滴大小（图6I），这说明在定植金黄杆菌属或假单胞菌属的单菌关联动物中观察到的脂滴大小增加，可能需要活细菌细胞的活性。综上，这些结果表明，细菌菌株对肠上皮细胞脂滴积累的不同作用源于不同的分子机制，且厚壁菌门微小杆菌属的细菌产物足以增加肠上皮细胞脂滴数量。

图 6. 单菌定植揭示诱导肠道上皮脂肪酸吸收的不同细菌作用机制与无菌对照相比，单关联斑马鱼的上皮细胞。(F) 单关联斑马鱼肠道脂滴大小的相对频率。数据代表至少两次独立实验的平均值±标准误（每个条件/实验5-16条鱼）。与无菌对照相比存在显著差异，标注如下：(p 0.05) : (^{* *} p<0.001) (G) 与无菌对照相比，单关联斑马鱼肝脏中BODIPY荧光评分。图表代表至少两次独立实验的平均值±标准误（每个条件/实验2-7条鱼），采用盲法评分（评分范围0-5）。与无菌对照相比存在显著差异，标注如下：(p 0.05) (H和I) 经滤过除菌的微小杆菌属、金黄杆菌属或假单胞菌属条件培养基处理的无菌斑马鱼的肠道脂滴数量(H)和肠道脂滴大小相对频率(I)。结果以至少两次独立实验的平均值±标准误呈现（每个条件/实验3-7条鱼），与无菌对照相比存在显著差异，标注如下：(^{*} p<0.01)。(E) 标注了肠道内脂滴的定量分析。(A-D) 6天龄喂食C饲料的斑马鱼，分别饲养于无菌条件(A)或单关联微小杆菌属(B)、金黄杆菌属ZWU0023(C)或假单胞菌属ZWU0006(D)，其肠道上皮细胞的代表性共聚焦图像；箭头指示上皮细胞内的大型脂滴（黑色箭头头）和固有层内的脂滴（白色箭头）；用BODIPY-FL染色6小时。BODIPY- 累积情况。

图7. 饮食依赖性微生物对肠道脂肪酸吸收的调控模型

讨论

目前，人们对肠道菌群对脊椎动物营养代谢的贡献研究兴趣浓厚以及能量平衡。尽管微生物对膳食复合碳水化合物降解的贡献已得到广泛研究，但微生物群对膳食脂质代谢的影响却相对较少受到关注。此前对无菌哺乳动物膳食脂质代谢的研究主要检测了血清脂质代谢物，这类指标无法区分外源性和内源性脂质来源；同时也检测了血清乳糜微粒，但这些指标无法区分膳食脂质和微生物产生的脂质。本研究采用透明斑马鱼幼虫的活体成像技术，揭示了微生物群在促进肠道上皮细胞及肠外组织吸收膳食脂肪酸方面的作用。研究结果表明，肠道微生物群落可作为调控膳食脂肪吸收与能量平衡的靶点。

脂肪酸的吸收、肠上皮细胞内脂滴的组装以及随后以乳糜微粒和游离脂肪酸形式的分泌已得到广泛研究。然而，我们对体内这些生理过程的机制理解仍不完整，这为理解它们如何受微生物群等环境因素调控带来了挑战。本研究数据表明，微生物群的定殖能促进肠上皮细胞对脂肪酸的吸收，进而导致肠上皮细胞内脂滴的积累，并使膳食脂肪酸在肠外组织中的蓄积量增加。我们提出微生物可能通过四种非排他性机制刺激肠上皮细胞中的脂肪酸吸收和脂滴积累。首先，微生物可通过改变胆汁盐的生成或组成来提高脂肪酸的生物利用度。其次，微生物可直接促进管腔脂解活性，为肠上皮的潜在吸收提供更多脂肪酸。第三，微生物可通过引发肠上皮的生理反应来间接增强脂肪酸吸收，从而刺激其固有的吸收能力。最后，微生物群可能降低肠上皮细胞的脂肪酸氧化速率，使脂肪酸能更多地以脂滴形式储存。明确相关潜在机制，有助于开发基于微生物的饮食脂肪吸收调控策略。

微生物群不依赖饮食促进肠道肠细胞内脂滴的大小（紫色虚线箭头）。饮食的存在会促进CONVD斑马鱼以及单定植厚壁菌门菌株（即微小杆菌属；棕色虚线箭头）斑马鱼体内的脂滴数量，同时诱导脂滴大小变化。与其他菌株（金黄杆菌属或假单胞菌属）单定植则会促进脂滴大小。尽管这些发现在其各自的门中是否具有普适性尚不清楚，但这些数据揭示了两种细菌机制可促成不同的脂滴积累表型：厚壁菌门诱导脂滴数量增加

我们的研究结果表明，微生物群的存在会促进肠上皮细胞内脂滴形成的两种不同表型：脂滴数量增加和脂滴体积增大。本研究中评估的大多数肠上皮细胞脂滴，推测代表的是高脂喂食后出现的暂时性储存脂滴。尽管肠上皮细胞脂滴的体积和数量反映了脂肪酸吸收的不同且可量化的方面，但它们很可能共享共同的细胞生物学过程。此前关于脂滴形成的遗传分析已证实，这些动态细胞器处于复杂的调控控制之下，且与其他细胞器和通路存在功能关联。不过，我们推测本研究中统计的至少一部分“小脂滴”（≤1 μm，对应标识符 ((<0.55 mu m^{2}))）代表乳糜微粒，因为这一小尺寸范围涵盖了硬骨鱼中乳糜微粒的预测尺寸。探究微生物和饮食对这些不同富含脂质细胞器的调控机制，有望为理解肠上皮细胞的脂质代谢提供新的见解。

除了揭示微生物群在促进脂肪酸吸收方面的作用外，我们的数据还表明，宿主对微生物群的这种反应会受饮食史的影响。尽管无论饮食史如何，微生物群都会使肠上皮细胞脂滴体积增大，但肠上皮细胞脂滴数量的持续增加仅在喂食的动物中观察到。这些结果令人意外，因为我们的数据仅在受精后6天收集，而这些斑马鱼通常在受精后5天才开始进食。这表明，观察到的饥饿对受精后6天斑马鱼的影响，可能主要由饮食对微生物群的依赖性作用决定，而非饮食对宿主的直接作用。与这一观点一致，我们发现饮食的存在会导致斑马鱼肠道微生物群发生改变，包括厚壁菌门细菌的富集。此外，我们发现无菌斑马鱼与代表性厚壁菌门菌株单关联会诱导脂滴数量增加，而另外两种非厚壁菌门菌株则会诱导脂滴体积增大。尽管目前尚不清楚这些发现是否适用于其各自门中的其他成员，但这些数据与我们的观察一致：喂食的常规饮食定植动物中，肠道富集厚壁菌门的个体脂滴数量增加，而所有常规饮食定植动物的脂滴体积均增大，这与饮食史无关。基于这些结果，我们提出两种不同的机制来解释肠道微生物生态与宿主脂肪酸吸收之间观察到的饮食依赖性相互作用。首先，厚壁菌门在喂食动物的肠道中富集，可增强宿主肠上皮细胞吸收脂肪酸的能力。其次，无论饮食状态如何，在肠道定植的非厚壁菌门细菌会诱导宿主肠上皮细胞内大型脂滴的积累增加。在喂食动物体内，这两种细菌信号共同作用，通过增加肠上皮细胞脂滴的体积和数量（图7）以及促进向肠外组织的输出，来刺激脂肪酸吸收。

我们的研究结果揭示了饮食对斑马鱼肠道微生物群的影响，以及斑马鱼肠道微生物群与周围水体之间的关系。在人类、小鼠和蟒蛇中，一个常见的观察模式是肠道内厚壁菌门的相对丰度与饮食热量摄入呈正相关。我们对喂食和饥饿斑马鱼肠道细菌群落的分析表明，这一生态学原理也适用于硬骨鱼类。值得注意的是，厚壁菌门细菌在肠道中（而非周围水体中）出现饮食依赖性富集，这有力地证明了饮食的存在对斑马鱼肠道和周围水体中的细菌施加了不同的选择压力。未来对斑马鱼肠道及周围水体的纵向分析，有助于阐明不同生境中饮食诱导的微生物群落组装与维持变化之间的时间关系。

在营养丰富的环境中促进厚壁菌门丰度的机制仍未明确。我们的单菌定植结果表明，饮食依赖性的厚壁菌门富集可能至少部分归因于细菌对饮食来源营养物质的自主需求，而这种营养需求是其成功定植的必要条件。相比之下，本研究测试的两种非厚壁菌门细菌菌株无论是在饥饿还是喂食条件下，这些微生物都能成功定殖，这表明宿主提供的营养生态位足以让这些微生物在斑马鱼肠道中稳定定殖。弄清楚在更复杂的微生物群落背景下，厚壁菌门的饮食依赖性富集是否也部分由微生物间竞争介导，将是一个有趣的研究方向。此外，明确饮食对肠道细菌定殖的影响是否通过允许肠道初始定殖和/或维持长期定殖来介导，也十分重要。由遗传或饮食诱导的肥胖所形成的厚壁菌门富集群落，已被证实能促进正向能量平衡。因此，揭示厚壁菌门饮食依赖性富集的潜在机制，有望为控制人类及其他动物的能量平衡提供新的方法。

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