题目：Optimized chemogenetic ablation and regeneration of enteric nervous system neurons in zebrafish

原文链接:http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

期刊：Stem Cell Reports

摘要

肠神经系统（ENS）是肠道的内在神经系统，可调控肠道蠕动等关键生理功能。肠神经系统的缺失与赫希施普龙病等胃肠道疾病相关。通过刺激神经元再生来补充缺失的神经元，为治疗肠神经系统疾病提供了极具前景的方法。为研究肠神经系统的再生机制，我们利用Gal4/UAS-NTR 2.0系统在斑马鱼中构建了靶向化学遗传学神经元消融模型。通过形态学变化、神经元缺失定量分析和TUNEL检测，证实了该模型实现了空间和时间可控的神经元死亡。我们观察到治疗后1天（dpt）出现的急性免疫反应恢复正常。研究发现，到治疗后9天，肠神经系统的神经元数量完全恢复至对照组水平，肠道蠕动功能也随之恢复。我们还发现不同神经元亚型在再生能力和/或细胞替换时机上存在特异性差异。本研究为解析肠神经系统再生的细胞分子机制、开发肠神经系统相关疾病的潜在治疗方法奠定了坚实的平台。

引言

肠神经系统（ENS）是外周神经系统中最大的亚部分，它由源自神经嵴祖细胞的复杂神经元和神经胶质细胞网络组成，这些祖细胞会迁移至发育中的胃肠道（GI）（Ganz, 2018; Hao and Young, 2009; Taylor et al., 2016）。这一复杂网络在调节肠道动力、营养吸收和上皮分泌等关键胃肠道功能中发挥着关键作用（Kuil et al., 2021; Kunze and Furness, 1999; Niesler et al., 2021）。肠神经系统功能异常或缺失与多种胃肠道疾病相关，例如先天性巨结肠病（HSCR）、贲门失弛缓症以及自闭症谱系障碍（Niesler et al., 2021）。先天性巨结肠病的特征是远端肠道肠神经系统神经元出现不同程度的缺失。它是肠神经系统最常见的先天性异常之一，会导致新生儿严重的肠梗阻，估计发病率为每5000名活产婴儿中1例（Butler Tjaden and Trainor, 2013）。迄今为止，肠神经系统疾病只能通过对症治疗或手术切除存在肠神经系统神经元缺失的区域来进行治疗。目前先天性巨结肠病的标准治疗方法是手术切除受影响的肠道段。然而，患者的预后差异很大，大多数患者仍会终身存在胃肠道缺陷，这凸显了对替代疗法的需求。先天性巨结肠病的一种治疗方法是刺激驻留干细胞以再生缺失的肠神经系统细胞，该方法已取得有前景的结果，但疗效存在差异效果取决于年龄和肠道的特定区域（伯恩斯等人，2016；约瑟夫等人，2011；索雷等人，2020）。要成功转化这些研究方法，需要全面理解支撑肠神经系统有效再生的细胞和分子机制。阐明这些机制需要开发一种可靠的动物模型，该模型能在损伤后实现肠神经系统神经元稳定且可重复的再生。迄今为止，仅有少数研究（主要基于哺乳动物模型）通过化学、机械或化学遗传学（化学遗传）损伤的方式探究了肠神经系统的再生。尽管这些研究提供了有价值的见解，但哺乳动物模型中肠神经系统的神经元再生效果有限且不完整（吕克特和甘茨，2022；斯塔夫利等人，2024）。相比之下，斑马鱼（斑马属）是研究器官再生的理想模型，其可研究神经系统的多个部分，如大脑（基泽尔等人，2012）、视网膜（哈诺维茨等人，2019）、肠神经系统（埃尔-纳谢夫和布伦纳，2020；大野等人，2021），还可研究肾脏（迪普等人，2011）、心脏（曹和波斯，2018）、鱼鳍（罗梅罗等人，2018）等其他器官。斑马鱼还具备诸多实验优势，包括生长发育迅速、后代数量多、身体透明便于活体成像，且与人类的遗传同源性较高（豪等人，2013）。尽管具备这些实验优势（库尔等人，2021；甘茨，2018），但截至目前，仅有两项研究利用激光消融技术探究了斑马鱼肠神经系统的再生方法（埃尔-纳谢夫和布罗纳，2020年；大野等，2021年）。这些研究首次提供了证据，表明斑马鱼的肠神经系统在局灶性神经元丢失后能够再生。具体而言，大野等的研究显示，神经嵴来源的细胞迁移至消融区域，发生增殖并分化为新的神经元，使肠神经系统的神经元数量得到部分恢复。然而，要证实斑马鱼肠神经系统能够完全再生，仍有几个关键问题有待解决：其一，在研究的时间范围内，再生神经元的数量未达到对照组水平；其二，肠神经系统的不同神经元亚型是否具备再生能力，仍有待验证；其三，再生神经元是否能功能性整合到现有神经元回路中，以恢复肠道的正常功能，目前尚不明确。此外，局灶性激光消融术存在多项技术局限性，包括对周围组织造成附带损伤、实验操作耗时费力，以及仅能在小肠区域消融少量细胞，这些问题均会阻碍对功能恢复评估的后续分析（大野等，2021年）。

为克服这些挑战，我们采用了一种成熟的时空特异性细胞消融方法：化学遗传细菌硝基还原酶（NTR）系统。该方法利用NTR酶，将甲硝唑（MTZ）等前药转化为细胞毒性物质，从而选择性杀死表达NTR的细胞（布里奇沃特等人，1997；梅迪科等人，2001）。在斑马鱼中，这种化学遗传方法已通过消融心脏、胰腺、肝脏、视网膜及其他器官的特定细胞群，成功应用于再生研究（有贺等人，2010；库拉多等人，2007；沙罗克等人，2022；怀特等人，2017）。然而，该方法尚未用于肠神经系统神经元的消融实验。

在本研究中，我们借助Gal4/UAS系统精准的时空调控能力（Asakawa等人，2008；Zhang等人，2019），对胚胎后斑马鱼幼虫的肠神经系统（ENS）神经元进行化学遗传学消融（图1A）。我们还采用了NTR技术的最新迭代版本NTR 2.0，与原始NTR系统相比，该版本在甲硝咪唑（MTZ）浓度低约10至100倍的情况下即可有效消融靶细胞（Sharrock等人，2022）。利用这一方法，我们通过仅用甲硝咪唑（MTZ）处理消融表达NTR的神经元，建立了一套稳定的肠神经系统（ENS）神经元再生实验范式。形态学分析和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）分析证实，消融细胞发生细胞死亡的同时伴随急性免疫反应，该反应在处理后1天（dpt）恢复正常。到处理后9天（dpt），神经元已完全恢复，大多数神经元亚型（包括氮能神经元、胆碱能神经元和血管活性肠肽能神经元）均完全恢复。我们的研究首次证实，肠神经系统（ENS）神经元数量可实现功能恢复，包括肠道的修复运动性。这些研究结果为理解肠神经系统再生的细胞和分子机制奠定了基础，这是未来为与肠神经系统功能障碍相关的胃肠道疾病开发新治疗方法的第一步。

结果

用于特异性消融肠神经系统神经元的Gal4驱动系的鉴定

为了找到能最大化肠神经系统（ENS）神经元消融范围和选择性的Gal4驱动系，我们基于日本国立遗传学研究所斑马鱼Gal4文库（https://nig-zebra.nbrp.jp；Asakawa等人，2008年）中报道的这三种Gal4基因陷阱驱动系（495A:Gal4、234A:Gal4、217B:Gal4）在肠道及周围组织的表达模式，获取了它们。我们将这些品系与UAS报告系杂交，以分析报告基因在ENS及周围组织中表达的范围和特异性。为了确定ENS内的报告基因表达是否主要局限于神经元，从而最大限度减少脱靶消融，我们在5天龄（dpf）时对495A:Gal4xUAS:GFP和234A:Gal4xUAS:NTR:dsRed品系、以及在5、6、7天龄（dpf）时对217B:Gal4xUAS:GFP品系的ENS进行了报告基因与全神经元标志物HuC/D的共表达分析（图1）。

我们的分析揭示了不同驱动子系之间共表达谱存在显著差异。495A:Gal4品系此前有研究报道其表达主要局限于肠道，但尚未明确是肠道中的哪些细胞表达该报告基因（Asakawa等人，2008）。我们发现，495A:Gal4品系的肠道中仅存在约一半的HuC/D+/报告基因阳性细胞，且许多报告基因阳性细胞为HuC/D阴性，同时还存在HuC/D+/报告基因阴性细胞（图1B）。有研究表明234A:Gal4在肠神经系统（ENS）中表达，同时也在肠道外广泛表达（Kawakami等人，2010；Heanue等人，2016）。相比之下，与234A:Gal4品系相比，217B:Gal4品系的报告基因仅在肠道中表达，肠道外的表达极少。与这些研究结果一致，我们发现234A:Gal4和217B:Gal4两种驱动子系均表现出HuC/D阳性与报告基因的高共表达，仅存在少量HuC/D阴性/报告基因阳性和HuC/D阳性/报告基因阴性细胞（图1B和1C）。234A:Gal4和217B:Gal4品系的肠道中均含有充足的报告基因阳性细胞。然而，234A:Gal4会驱动报告基因在肠神经系统（ENS）外以及肠神经系统祖细胞中广泛表达（Heanue等人，2016），这会导致额外的非靶向细胞被消融。因此，我们选择217B:Gal4品系以最大程度地实现肠神经系统（ENS）神经元的消融，同时保证消融的特异性（图1C）。

图1.为肠神经系统神经元建立可靠的化学遗传消融检测方法

为肠神经系统神经元建立可靠的化学遗传消融检测方法

为建立可靠的肠神经系统神经元消融实验方法，我们采用217B:Gal4品系与UAS:YFP-NTR 2.0转基因品系杂交产生的后代，该后代的肠道细胞会共表达YFP和NTR 2.0（即YFP阳性细胞）。为消融表达YFP-NTR 2.0的细胞，我们从受精后5天或12天开始，用400微摩尔的甲硝唑对YFP阳性幼体处理24小时（Sharrock等人，2022年）。为评估肠神经系统细胞的缺失程度，我们在受精后6天和13天（经甲硝唑处理的幼体为处理后1天）对YFP阳性细胞的数量进行了定量分析。在未处理的对照组中，无显著差异在 5 至 6 天pf 或 12 至 13 天pf 时观察到 YFP+ 细胞的变化。相反，与 0 天pt（治疗前）和未处理的对照组相比，MTZ 处理组在 1 天pt 时 YFP+ 细胞数量几乎完全丧失（图 2A–2C）。

由于24小时的MTZ处理在两个发育阶段均能有效消除YFP阳性细胞，我们决定在受精后12天（12 dpf）进行MTZ处理，以开展进一步分析。受精后5天（5 dpf）时，胚胎的神经发生过程仍非常活跃（Olden等人，2008；Roy-Carson等人，2017）。因此，在受精后5天（5 dpf）消除神经元可能会涉及以下过程是发育性神经发生，而非神经元再生，这正是我们旨在避免的情况。

为确认 12 天龄（dpf）时 YFP+ 细胞为神经元，我们分析了 217B:Gal4; UAS:YFP-NTR 2.0 转基因鱼中 YFP 与 HuC/D 的共表达情况。定量分析显示，在总共 204.6 个 HuC/D+ 神经元中，平均可观察到 44.4 个 YFP+ 神经元。我们发现 96.3% 的 YFP+ 细胞为 HuC/D+，表明绝大多数 YFP+ 细胞是肠神经系统（ENS）神经元，而仅有 3.7% 的 YFP+ 细胞为 HuC/D-。因此，下文我们将这些品系中的 YFP+ 细胞称为 YFP+ 神经元（图 2D–2F）。

图2. 肠神经系统神经元高效消融模型的建立

经甲硝咪唑（MTZ）处理后，YFP+ 神经元会发生DNA损伤诱导的细胞死亡，这一过程会引发免疫细胞的急性激活

为确定神经元消融的时间进程，我们在处理后6、12和24小时量化了YFP阳性神经元的数量。我们发现，处理后24小时YFP阳性神经元基本消失，表明MTZ诱导的YFP阳性神经元消融在处理后24小时内完成（图S1A和S1B）。为检测MTZ处理后YFP阳性神经元是否发生细胞死亡，我们评估了神经元形态的变化，并进行TUNEL实验以检测细胞正在发生细胞死亡。未处理的对照组幼虫中的YFP+神经元呈现正常形态，未观察到形态变化的明显迹象。相比之下，甲硝唑（MTZ）处理样本中的YFP+神经元出现了显著的形态变化，包括与正在发生细胞死亡的神经元相符的细胞体碎裂[图S1C（Cusack等人，2013；Ham等人，2010）]。此外，我们进行了末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）实验，并结合YFP免疫染色，以评估处理后6小时（hpt）对照组和甲硝唑处理组斑马鱼的DNA损伤情况。正如预期的那样，我们在处理组和对照组中均发现了绿色荧光蛋白阳性/末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记阳性（GFP+/TUNEL+）细胞，因为在受精后12天（dpf），细胞凋亡是一个持续的细胞过程（Lee等人，2023）。然而，与未处理的YFP+对照组相比，甲硝唑处理组中观察到的GFP+/TUNEL+细胞数量显著更多（图3A和图3B）。此外，GFP+/TUNEL+神经元表现出明显的形态变化，表明YFP+神经元正在发生细胞死亡（图3C）。这些结果表明，甲硝唑处理会诱导DNA损伤，进而导致细胞死亡，且该过程伴随显著的结构改变，这与先前使用该系统进行选择性细胞死亡的研究结果一致（Kulkarni等人，2018；White和Mumm，2013）。

图3. MTZ处理诱导YFP+神经元发生DNA损伤性细胞死亡，且肠道内YFP+细胞死亡后L-质体阳性免疫细胞迅速增多

免疫细胞活化在神经元再生中发挥关键作用（Kyritsis 等人，2012；White 等人，2017）。为了确定 MTZ 诱导的细胞消融是否会刺激免疫反应，我们使用泛白细胞标志物 L-塑性蛋白（Hiroto Shinomiya，2012）分析了免疫细胞动态变化。在 YFP- MTZ 处理（未消融）和 YFP+ MTZ 处理（消融）的幼虫中，我们在神经元细胞死亡的各个时间点（6 小时处理后、12 小时处理后和 1 天处理后；参见图 S1）对肠道内 L-塑性蛋白阳性细胞的数量进行了定量分析。在 6 小时处理后，与 YFP- MTZ 处理的幼虫相比，YFP+ MTZ 处理的幼虫的 L-塑性蛋白阳性细胞数量显著增加。到 12 小时处理后和 1 天处理后，未检测到显著差异（图 3D 和 3E）。一致的是，倍数变化分析显示 L-塑性蛋白阳性细胞数量在 6 小时处理后达到峰值，并在 1 天处理后稳步下降至正常水平（图 3F）。这些发现表明，MTZ 诱导的 YFP+ 细胞消融会在肠道内触发短暂的免疫反应，其特征是 L-塑性蛋白阳性细胞的急性聚集，并在 24 小时内消退。

靶向消融后YFP阳性神经元发生再生

接下来，我们探究了YFP阳性神经元的数量是否恢复至对照组水平，这一结果将表明它们在甲硝唑处理后发生了再生。我们在YFP阳性甲硝唑处理组和YFP阳性对照组幼虫中，于处理前后的不同时间点对整个肠道的YFP阳性神经元进行了定量分析。

YFP+ 对照组幼虫在伤后0至15天表现出明显的神经元网络（图4A和4B）。相比之下，YFP+ 甲硝哒唑（MTZ）处理组幼虫在伤后1天时YFP+ 神经元数量减少，证实YFP+ 神经元已成功被消融（图4A和4B）。到伤后2天，我们观察到少量YFP+ 神经元以及跨越肠道的发育中神经突（图S2）。YFP+ 神经元数量持续增加，但截至伤后6天，其数量与对照组相比仍存在显著差异。到伤后9天，再生的YFP+ 神经元数量达到与对照组相当的水平，并在伤后12天和15天维持在该水平（图4A和4B）。我们注意到，约半数的YFP+ 甲硝哒唑（MTZ）处理组幼虫在伤后9天后出现异常体态。该表型可能是由脊髓区域报告基因阳性细胞的脱靶消融引起的（图S3）。为探究该现象是否影响YFP+ 神经元的再生，我们在伤后12天对比了体态正常与体态异常幼虫的再生YFP+ 神经元数量，但未发现显著差异（图S4）。这表明体态缺陷并未对神经元再生造成影响。为确定肠道不同区域的神经元再生时间线是否与全肠道存在差异，我们对肠道三个主要区域——前肠、中肠和后肠的YFP+ 神经元数量进行了定量分析（Jianlong等人，2020；Wallace等人，2005）。结果发现，三个肠道区域的YFP+ 神经元再生时间线与全肠道一致（图4B-4F）。

图4. 全肠道及特定肠道区域中YFP阳性神经元再生的时间线

如上所示，YFP+ 神经元与一小部分 HuC/D+ 神经元共定位，表明只有一部分肠神经系统（ENS）神经元被消融（图2D–2F）。为了评估YFP+神经元的消融是否对YFP标记的肠神经系统神经元群体产生影响，我们在消融处理前（0天）以及处理后1天和3天，对YFP+甲硝唑（MTZ）组和YFP+对照组中的HuC/D+神经元进行了定量分析。我们发现，在YFP+神经元被消融后，处理组与对照组的HuC/D+神经元数量无显著差异（图S5A–S5D）。这种无显著性差异可能是由于YFP+神经元在HuC/D+总群体中所占比例相对较小——平均为204.6个神经元中的44.4个（图2E）。此外，仅在YFP标记的甲硝唑处理组幼体中进行甲硝唑处理，并未显著降低HuC/D+神经元的总数（图S5E）。

特定共表达的神经元亚型在消融后实现再生

肠神经系统由多种神经元亚型组成，这些亚型控制着肠道的不同功能，包括肠道3a+、slc18a3a+）以及血清素能神经元[5-羟色胺阳性，5-HT+]（Kuil 等人，2023；Li 等人，2025；Uyttebroek 等人，2010）。为了确定YFP+神经元群体内的神经元亚型组成，我们在MTZ处理前的12天胚胎期（dpf）分析了这些亚型标志物与YFP的共表达情况。在处理后0天（dpt），我们发现57.54%、12.26%、13.33%和6.58%的YFP+神经元分别共表达nNOS、5-HT、vip和slc18a3a（图S6），这表明在消融前存在不同的YFP+神经元亚型，这些亚型属于肠神经系统（ENS）神经元的三大主要类别。这种分布表明，相较于其他肠神经系统亚型，YFP+群体富含氮能抑制性神经元（Kuil 等人，2023；Li 等人，2025；Uyttebroek 等人，2010）。

图5. YFP+/nNOS+、YFP+/vip+和YFP+/slc18a3a+神经元可在消融后再生，而YFP+/5-HT+神经元则不能

为了探究YFP+神经元群体中的所有神经元亚型是否均能再生，我们分析了9天处理后（dpt）甲硝咪唑（MTZ）处理组中YFP+神经元群体内YFP+与各亚型共表达细胞的百分比（[YFP+/亚型+]/YFP+神经元占比），并与未处理的对照组进行了对比（图5）。值得注意的是，MTZ处理组与对照组的YFP+/nNOS+神经元占比无显著差异，这表明YFP+/nNOS+神经元具有极强的稳定性和再生能力（图5A、5B）。对YFP+/5-HT+神经元的分析显示，两组间存在显著差异，说明该神经元亚型的再生能力有限或再生动力学存在延迟（图5C、5D）。通过杂交链式反应（HCR）检测血管活性肠肽（vip）和囊泡单胺转运体18a3a（slc18a3a）的表达，我们发现MTZ处理组与对照组的YFP+/vip+和YFP+/slc18a3a+神经元占比无显著差异，提示这些神经元亚型在再生后也成功恢复（图5E-5H）。总体而言，这些研究结果表明，在神经元消融前和再生完成后，大多数YFP+细胞均为氮能神经元（图5A、5B及图S6）。再生完成后，YFP+/nNOS+、YFP+/vip+和YFP+/slc18a3a+神经元的占比均成功恢复；相比之下，YFP+/5-HT+神经元的再生能力相较于其他亚型更低和/或更慢。

神经元再生后，肠道蠕动减弱恢复至正常水平

肠神经系统（ENS）神经元在调节肠道蠕动中发挥关键作用。兴奋性运动神经元介导肌肉收缩，抑制性运动神经元诱导肌肉松弛（Furness, 2012; Kunze and Furness, 1999）。我们发现黄色荧光蛋白（YFP）阳性神经元的主要部分共表达抑制性以及兴奋性运动神经元标志物（图S6）。因此，我们旨在确定1）YFP+神经元的缺失是否会影响肠道动力，以及2）消融后再生的神经元是否能恢复肠道功能。

为评估这一情况，我们检测了一项肠道动力指标，即顺向蠕动波间隔（PWI）的时长（Holmberg 等人，2006年）。我们在处理后第1、3、9天，分别检测了黄色荧光蛋白阳性（YFP+）和黄色荧光蛋白阴性（YFP-）甲硝唑（MTZ）处理组鱼，以及YFP+未处理对照组的PWI。设置YFP-甲硝唑处理组的目的，是确定单独使用甲硝唑处理是否会对PWI产生影响。处理后第1天，我们发现对照组与处理组的PWI时长无显著差异（图6A，视频S1、S2、S3）。然而在处理后第3天，YFP+甲硝唑处理组的PWI时长相较于两个对照组均显著增加，表明该组的蠕动运动速度变慢（图6B，视频S4、S5、S6）。处理后第9天，YFP+甲硝唑处理组的PWI时长恢复至对照组水平（图6C，视频S7、S8、S9）。总体而言，我们的研究结果表明，YFP+神经元缺失后肠道动力功能会受到影响，而在再生后该功能得以恢复，这意味着肠道动力实现了功能修复。尽管YFP+神经元仅占HuC/D+肠神经系统（ENS）群体的一部分（图2D-2F），但该群体中富含一氧化氮合酶阳性（nNOS+）抑制性运动神经元（图S6）。由于氮能神经元负责调节肠道舒张和蠕动节律，因此仅靶向一小部分肠神经系统神经元，其缺失仍可解释PWI时长增加的现象（Furness，2012年；Kunze和Furness，1999年）。

图6. YFP+神经元消融后，蠕动间隔波时间在9天移植后恢复

讨论

过去十年，修复再生这一主题因其潜在的治疗意义而获得了广泛关注，例如用于治疗肠神经系统神经元缺失的肠神经系统疾病。然而，迄今为止，尚无研究在哺乳动物模型或斑马鱼中证实肠神经系统神经元的功能性再生。本研究首次在斑马鱼中实现了肠神经系统神经元的靶向化学遗传消融与功能性再生（图7）。研究结果明确了靶向神经元消融的时空细胞动态变化，6小时后移植时TUNEL标记信号增强即可证明这一点。此外，研究观察到6小时后移植时出现急性L-质膜蛋白阳性免疫细胞反应，该反应在移植后1天内消退（图7）。对于所研究的大多数肠神经系统神经元亚型，消融的神经元数量在移植后9天完全恢复。具体而言，研究发现氮能、胆碱能和血管活性肠肽能亚型均完全恢复，但仅血清素能神经元的部分或延迟再生。重要的是，我们还证实了神经元消融对肠道动力参数及其恢复的影响，这表明我们的系统中存在功能性再生（图7）。

图7. 斑马鱼肠神经系统神经元特异性消融与再生后的事件时间线

斑马鱼肠神经系统神经元的大量消融与完全再生

在斑马鱼中，仅有两项关于肠神经系统（ENS）神经元再生的研究采用聚焦激光消融技术，针对肠道小区域内的少数肠神经系统神经元进行靶向操作。两项研究均报道了消融后会有新神经元生成（El-Nachef 和 Bronner，2020；Ohno 等人，2021）。然而，对再生神经元的定量分析显示，在所分析的时间范围内，其数量并未恢复至对照组水平，且肠道功能受到的影响也未得到研究（Ohno 等人，2021）。在本研究中，我们通过化学遗传学消融约44.4个肠神经系统神经元，发现消融细胞在损伤后第9天（9 dpt）就已高效再生并恢复至对照组水平，且这一水平在我们分析的最后一个时间点——损伤后第15天（15 dpt）——始终保持稳定。我们发现，肠神经系统三大类神经元中的不同亚型均具备再生能力，但在再生能力或再生时机上存在有趣的亚型特异性差异（图7）。本研究还首次证实了肠道功能参数——肠道蠕动传播——的恢复，这表明肠神经系统神经元实现了功能性再生（图7）。此外，与激光消融法相比，本研究的方法具备多项实验优势。首先，激光消融法的效率较低，因为其仅能消融有限数量的特定肠道区域内的神经元数量（El-Nachef 和 Bronner，2020；Ohno 等人，2021）。例如，有一项研究仅在受精后10至15天消融了肠道后部单体节宽度范围内约16个神经元（Ohno 等人，2021）。相比之下，我们的化学遗传学消融系统成功消融了整个肠道内平均44个神经元，显著提高了效率。其次，激光消融耗时较长，因为需要对单个幼体进行准备并进行精准的人工靶向定位（Ohno 等人，2021）。而我们的方法能够同时对数百条幼体的肠神经系统神经元进行消融。由于可同时诱导大量幼体发生神经元消融，该化学遗传学系统还可应用于化学或遗传筛选研究，以鉴定肠神经系统再生的调控因子，为后续研究提供基础。第三，激光照射可能会对神经元周围的非神经元组织造成意外损伤，包括平滑肌细胞和上皮细胞，这可能会影响再生过程，并使肠道蠕动等后续分析变得复杂。相比之下，我们的方法是一种时空可控的消融技术，仅精准靶向特定的肠神经系统神经元，对肠道内的整体神经元群体无不良影响（图7）。

斑马鱼是研究肠神经系统再生的强大模型系统

到目前为止，肠神经系统再生研究大多集中在哺乳动物模型系统上，相关研究工作仅在方面开展得有限非哺乳动物模型，例如斑马鱼（Corvetti 等人，2001；El-Nachef 和 Bronner，2020；Gabella 和 Trigg，1984；Galligan 等人，1989；Hanani 等人，2003；Jew 等人，1989；Joseph 等人，2011；Karaosmanoǧlu 等人，1996；Laranjeira 等人，2011；Luck 等人，1993；Ohno 等人，2021；Stavely 等人，2024；Tokui 等人，1994）。此前在哺乳动物模型中开展的研究，采用手术（Galligan 等人，1989；Karaosmanoǧlu 等人，1996；Tokui 等人，1994）、狭窄（Corvetti 等人，2001；Gabella 和 Trigg，1984；Jew 等人，1989；Joseph 等人，2011）以及化学（Hanani 等人，2003；Laranjeira 等人，2011；Luck 等人，1993）消融方法，均一致报道神经元再生不完全，且肠神经系统（ENS）神经元的再生结果存在肠道区域或物种特异性差异（Rueckert 和 Ganz，2022）。值得注意的是，此前所有方法均因周围组织的间接损伤，在损伤部位出现了结构异常。为解决这一问题，近期针对成年小鼠的研究采用基于白喉毒素的化学遗传学消融方法，实现了肠神经系统神经元的特异性局灶性消融（Bhave 等人，2019；Stavely 等人，2024）。尽管该研究报道了尽管成年小鼠体内成熟的有丝分裂后肠神经系统神经元在损伤后能够再生轴突并重新支配肠道，但神经元的再生在消融后即使三个月也仍然十分有限（Stavely 等人，2024）。这表明哺乳动物的肠神经系统再生能力总体上较为有限。相比之下，本研究证明斑马鱼是研究肠神经系统功能性再生背后信号及细胞分子过程的理想模型。我们通过时空特异性调控的方法，诱导细胞死亡消融了约五分之一的肠神经系统神经元，仅9天后这些神经元便完全恢复。对整个肠道进行消融分析，能够探究肠神经系统再生过程中活跃的细胞反应和基因调控程序，因为我们可以对完整肠道进行研究。研究发现，细胞死亡阶段会出现急性免疫反应，并在损伤后1天恢复正常。针对成年斑马鱼脑部创伤以及视网膜中视杆细胞选择性消融的研究表明，免疫反应是再生过程的关键组成部分（Kyritsis 等人，2012；White 等人，2017）。在本研究中，肠神经系统神经元的选择性消融（图7）导致MTZ 处理后 6 小时，L-质素阳性细胞就显著聚集。鉴于 L-质素在白细胞（包括巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞）中高表达（Hiroto Shinomiya，2012），这一发现表明肠神经系统的选择性神经元死亡会触发急性免疫细胞募集，这与创伤性脑损伤和视网膜再生模型中的情况类似（Kyritsis 等人，2012；White 等人，2017）。未来的研究需要揭示免疫-神经相互作用（Graves 等人，2021）如何调控肠神经系统再生的机制。因此，本研究的方法为未来鉴定肠神经系统神经元再生相关的信号和细胞反应提供了快速的实验体系（图7）。

斑马鱼中枢神经系统与肠神经系统的神经元再生

斑马鱼中枢神经系统的再生能力已得到广泛研究（卡斯林等人，2009；2013；马尔茨等人，2010），而关于肠神经系统的再生机制则知之甚少（大野等人，2021）。在中枢神经系统中，不同脑区对神经元亚型的再生能力存在差异。在斑马鱼端脑中，所有被消融的神经元类型均能实现再生（巴博萨等人，2015；克罗内等人，2011；赖默等人，2008），而小脑能够再生多种但并非全部的神经元类型（卡斯林等人，2017）。小脑这种可变的再生能力归因于其干细胞和祖细胞在整个生命周期中生成神经元与神经胶质细胞的能力存在差异（卡斯林等人，2009；2013）。我们还发现肠神经系统中不同神经元亚型的再生也存在差异，其中部分亚型（氮能、胆碱能和血管活性肠肽能神经元）可完全再生，而血清素能神经元则无法恢复至对照水平（图7）。造成这种再生差异的原因可能有三种：（1）血清素能神经元的再生需要更长时间；（2）在胚胎后发育的这一阶段，用于再生血清素能神经元的祖细胞或细胞机制未被激活；（3）血清素能细胞的损失量过低，不足以触发其细胞替代过程。后续研究将明确细胞消融后会触发哪些细胞反应，以及在斑马鱼体内生成新的肠神经系统神经元和神经元亚型的祖细胞群。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。