题目： Visuomotor Transformations Underlying Hunting Behavior in Zebrafish

原文链接：http://dx.doi.org/10.1016/j.cub.2015.01.042

期刊：Current Biology

摘要

视觉运动环路会过滤视觉信息，并决定是否激活下游运动模块以产生行为输出。然而，介导显著刺激的感知并将其与适应性反应的执行相联系的环路机制仍知之甚少。我们将针对束缚的斑马鱼幼体的虚拟捕食实验与双光子功能性钙成像技术相结合，在自然行为过程中同时监测视顶盖的神经元活动。捕食反应对视觉特征（尤其是刺激大小、速度和对比度极性）的组合表现出混合选择性。我们鉴定出一类具有相似高度选择性调谐特性的顶盖神经元亚群，这类神经元对视觉特征表现出非线性混合选择性，很可能介导了对猎物的感知识别。通过对比反应性与非反应性试次中视顶盖的神经动力学，我们发现了运动前群体活动，该活动特异性地出现在捕食行为启动之前，且其解剖定位与运动变量相关。综上，视顶盖中存在非线性混合选择性神经元，它们很可能介导了对行为学相关感官刺激的可靠检测。小型顶盖神经集群的募集似乎通过提供释放捕食反应的运动前指令，将感知与行为联系起来。这些发现使我们能够为支撑自然行为的视觉运动转换构建一个模型环路。

引言

为产生视觉引导的行为，神经系统从视网膜图像中提取与任务相关的信息，以选择并控制恰当的反应。50多年前，神经行为学家提出了特定行为可由“关键刺激”在适宜条件下触发的观点。在此背景下，研究人员在视觉通路中发现了一些单个神经元，它们被认为可作为“特征检测器”。这类神经元对特定的时空特征具有选择性视觉场景中的时间模式，包含对定义关键刺激的视觉特征具有调谐特性的神经元。值得注意的是，刺激反应通路会受到多种调节因素的影响，因此“关键刺激”并非总能触发反应。动机状态、唤醒水平、注意力、近期经历以及长期记忆都会影响反应概率、刺激偏好和运动输出的选择（例如）。因此，要理解感觉运动回路如何将感知与行动联系起来，就必须同时监测神经活动和行为。在斑马鱼幼体中，神经系统的体积小且具有光学透明性，这使得在行为过程中能够以细胞分辨率对全脑的神经活动进行功能成像。本研究中，我们利用双光子（2P）钙成像技术，探究类猎物视觉线索的感知如何引发捕猎行为的启动。

在斑马鱼幼体中，捕食行为是一种视觉引导的行为。已有多项研究探究了捕食过程中的运动和眼动组件，包括定向转向的运动学特征（在]中被称为J形转向）、捕食游动以及胸鳍的协调运动[。与本研究尤为相关的是，斑马鱼幼体在捕食过程中会表现出一种特殊的眼动行为——眼球会聚。会聚扫视是所有捕食行为的起始动作，且双眼会保持较大的辐角，直至完成对猎物的攻击。在初始会聚扫视后，随着猎物距离的变化，双眼辐角会在追踪猎物的过程中进一步增大。通过扩大双眼视野的范围并将其移至动物口鼻部附近，眼球会聚可能形成一种立体视觉机制，用于判断目标距离并触发最终的捕食动作。

视顶盖（OTc）是硬骨鱼大脑中最大的视网膜接收结构，很可能对捕食行为具有核心重要性。视觉空间在视顶盖（OTc）上按视网膜拓扑映射排列，并与顶盖运动图谱对应，因此视顶盖（OTc）非常适合控制针对空间特定点的目标导向行为。这些行为包括定向和回避行为、眼球扫视运动，以及包括攻击猎物在内的捕食行为。事实上，近期已观察到斑马鱼幼鱼的视顶盖（OTc）神经活动会对活体猎物产生响应。通过切除顶盖的视网膜输入、沉默特定群体的顶盖中间神经元，或破坏视网膜顶盖传递时空保真度的基因突变，斑马鱼的捕食行为会大幅减少。幼鱼会对位于视觉空间额叶区域（即“反应感知区”）内的猎物做出响应场域”，该场域体现在视拓扑顶盖空间图谱的前部区域。值得注意的是，对前腹侧顶盖皮层（OTc）进行光遗传刺激，足以诱发会聚性扫视和J型转向。相比之下，有研究表明顶盖后部的投射神经元对于捕食行为并非必需。

在本研究中，我们对被固定的斑马鱼幼体的前顶盖进行了功能成像，同时该斑马鱼幼体在人工视觉刺激的呈现下表现出虚拟捕食行为。通过系统地改变视觉刺激的四个特征，我们发现猎物捕捉行为是由视觉特征的特定组合选择性诱发的。对视觉反应向量的无偏聚类分析表明，顶盖神经元对多种刺激特征表现出混合选择性。此外，我们还鉴定出了具有非线性混合特征选择性的细胞，其刺激调谐特性与捕食反应的刺激调谐高度匹配。为了探究这些特征分析神经元的激活如何与猎物捕捉行为的启动相关联，我们对比了有反应试次和无反应试次中的神经活动。这使我们能够揭示与捕食反应特异性相关的顶盖群体活动。顶盖神经元集群在行为启动之前或同时会产生爆发式活动，且这些活动局限于左侧或右侧顶盖半球，其偏侧性与会聚扫视的眼动参数不对称性相关。因此，这些群体动态很可能代表了控制捕食反应释放的运动前活动。总之，通过在自然行为过程中以单细胞分辨率对神经活动进行成像，我们从功能上鉴定出了神经环路组成可能介导对行为学相关刺激的感知识别并触发适应性行为反应的成分。

结果

斑马幼鱼束缚捕猎行为中的功能性钙成像

为了监测斑马鱼幼体识别类猎物视觉信号及启动捕猎行为时的神经活动，我们将适用于固定斑马鱼幼体的虚拟捕猎实验[13]与体内双光子功能成像技术相结合，实验所用的转基因幼体在泛神经元启动子Tg(elavl3:GCaMP5G) a4598的调控下表达基因编码的荧光钙指示剂（图1）。

为了监测斑马鱼幼体识别类猎物视觉信号及启动捕猎行为时的神经活动，我们将适用于固定斑马鱼幼体的虚拟捕猎实验[13]与体内双光子功能成像技术相结合，实验所用的转基因幼体在泛神经元启动子Tg(elavl3:GCaMP5G) a4598[23]的调控下表达基因编码的荧光钙指示剂（图1）。刺激诱发狩猎反应的速率（最佳刺激的响应率为5%-10%）使我们能够从与行为反应释放相关的神经活动中消除视觉诱发活动的歧义。

在虚拟狩猎试验期间，我们进行了2P钙成像来监测视神经tecta中的神经活动（图1C）。狩猎反应仅产生可以在后处理期间纠正的小运动伪影（参见实验程序），并且2P成像对幼虫健康或行为没有明显的有害影响。因此，这种方法使我们能够在感觉运动转换期间监测神经活动，该转换将猎物样视觉对象的识别与狩猎反应的启动联系起来。

图1.2P斑马鱼幼体虚拟狩猎行为中的功能性钙成像（A）实验设置示意图。幼体斑马鱼被拴在琼脂糖凝胶中，但能够自由移动它们的眼睛和尾巴。视觉刺激通过投影到动物前面的微型屏幕上呈现。使用2P显微镜对荧光钙信号进行成像，并使用红外相机通过显微镜物镜同时监测眼睛位置。（B）在2P成像期间，在掠夺性收敛扫视之前（左）和之后（右）记录眼睛位置。（C）记录在Tg（elavl3：GCaMP5G）转基因幼虫的视神经tecta中的神经活动。荧光的分数变化（D F/F）以绿色（任意色标）显示，覆盖在焦平面的解剖投影（灰色）上。该视场对应于FOV2，如图3A所示。背视图，前顶部。标尺条，50毫米。（d）行为测定的示意图（从上面看）。动物被呈现视觉刺激，这些刺激被投影到覆盖200个视觉空间的屏幕上。比例尺条，2毫米。（e）来自两个不同幼虫的两次试验的眼球位置记录示例。灰色条表示视觉提示从+100右到100左（上）或左右（下）扫过视觉空间的时期。条的不同长度对应于不同的刺激运动速度。白色刻度表示提示在0的时间，就在动物正前方。黑色符号表示自动检测到收敛的扫视。眼球位置轨迹的向下偏转对应于顺时针眼球旋转。

虚拟狩猎试验

为了研究狩猎反应的刺激调整，我们提出了一组移动点刺激，这些刺激在四个刺激特征方面有所不同：方向、大小、速度和对比度极性。对于每个特征，我们测试了两个值，总共有16个独特的刺激。具体来说，移动点可能在方向（左右或左右运动）、速度（快30/秒或慢15/秒）、大小（小3.5，大13.2）或对比度极性（黑暗背景上的亮点或明亮背景上的黑点）（见实验程序）上有所不同。刺激是出现在视觉空间的额叶部分，跨越自由游动的幼虫照顾活猎物的区域（大约60（左）到+60（右））。因此，移动点出现在动物扩展的矢状中面左侧或右侧100处，然后分别向右侧或左侧扫掠200处。

表明狩猎程序开始的行为反应被定义为双眼鼻部旋转的收敛扫视（实验程序(= 361)48条鱼的事件）。幼虫对刺激的反应最频繁的是当它们几乎直接领先时（中位方位角，5.56[左]，Wilcoxon符号秩测试与中位0(p=0.19)；图2A）。对于向左和向右移动的点，收敛扫视时目标的空间位置没有显著差异（(p=0.59)，Kolmogorov-Smirnov测试；图2B），对于缓慢和快速移动的点（((p=0.06))

会聚性扫视使眼部会聚角增加了19.03±0.49（平均值±SEM），扫视后的平均会聚角为44.4±0.43，与我们之前的研究（图2C）相似。扫视时刺激对侧的眼睛倾向于显示更大的鼻旋转，并采用更鼻的后扫视位置（与一致）。例如，由位于右侧的视觉线索触发的会聚性扫视，通常涉及更大的左侧旋转眼 ((p=9.13 ×10^{-9})，扫视后对侧眼与同侧眼的位置；(p=6.88 ×10^{-5})，眼位置变化的对侧与同侧配对t检验；图2D）。

总之，我们的行为学实验使我们能够在双光子功能成像过程中，向被固定的斑马鱼幼鱼呈现视觉刺激，以诱发与自然捕猎行为启动相关的眼动反应。

图2. 捕食反应对刺激特征复合物表现出混合选择性（a）会聚扫视时斑点位置的分布（48条鱼的(= 361)事件）。刻度表示中位位置，-5.56°。（b）会聚扫视时斑点位置的分布对于左右刺激（左）和慢快刺激（右）都没有不同。请注意，为了比较慢快刺激，所有斑点位置都被模拟为左右移动。（C）会聚扫视时眼角的变化。粗线表示平均值。（D）会聚扫视时斑点所在的视觉半球对侧的眼睛显示出更大的眼睛位置变化（鼻部旋转）。左：后扫视眼位置。较大的值表示更多的鼻部位置。右：眼睛位置的变化。数据显示为平均值±SEM。（E）16个移动斑点刺激的响应率（27条鱼236个事件）。黑点表示逻辑回归模型预测的响应率（交叉表示95%可信区间[CI]）。x轴以下的符号表示每个移动斑点刺激的特征：向左箭头，右-左；向右箭头，左-右；大符号，大；小符号，小；细长箭头，快；短箭头，慢；红色，明亮；黑色，暗。该表表示每个刺激按四个特征值编码的二进制编码方案。[-7.10，-5.92]，(p=3.13 ×10^{-127})：(beta_{1}=1.33[0.87,1.80])。(p=2.72 ×10^{-10})：(beta_{2}=1.87)[1.34,2.39]，(p=1.48 ×10^{-14})：(beta_{3}=0.90)[0.54,1.24]，(p=3.22 ×10^{-8})（F）逻辑回归模型，最好地解释响应率的方差，R，作为刺激特征的函数。插图表显示了系数的估计值以及指数系数（也称为优势比）。拟合系数（95%CI和p值）(beta_{0}=-6.51)

捕猎反应对视觉特征复合物具有选择性

在我们的视觉刺激组中，诱发捕猎反应的概率差异显著。我们将反应率（R）量化为诱发会聚扫视的刺激呈现比例（图2E）。最有效的刺激是极性反转（暗斑）且尺寸较大的光斑。快速移动的大型暗斑也比其他条件相同的慢速移动刺激更有效。这些结果表明，捕猎反应对多种刺激特征具有敏感性。

我们使用逻辑回归对反应率与四个视觉特征之间的关系进行建模。针对每种特征类型，我们采用二元编码方案来表示两个特征水平（例如，快速、慢速），这样每个刺激都由一个包含四个二元值的向量来描述（图2E，下方表格）。通过逐步回归，我们确定了图2F所示的模型，该模型能最准确地描述数据。为了比较不同模型，我们采用了交叉验证方法：在数据集的一半（训练集）上拟合模型系数，然后在另一半未见过的数据（测试集）上评估模型预测，以此估算交叉验证的(R^{2})（实验步骤）。图2F中的模型交叉验证的(R^{2})值为0.82，表明大小和对比度极性对捕猎反应有强烈的调节作用。大尺寸刺激会使反应概率增加3.8倍将（由 (e^{beta 1}) 给出的）折叠与暗刺激相比增加了 6.5 倍（((e^{B 2}))）。此外，模型中的交互项表明，当刺激物同时具备深色、大尺寸和快速这三个特征时，做出反应的几率增加了2.5倍（((e^{beta 3}))

我们得出结论，斑马鱼幼体对移动视觉信号的反应因多种刺激特征而异，并且对特定特征值的组合（特征复合物）具有敏感性。具体而言，大小、对比度极性和运动速度会相互作用，因此体积大、颜色深且移动速度快的刺激物最能有效引发捕食反应。

视顶盖及邻近区域的视觉反应特性

为了探究不同刺激——以及单个刺激特征——是如何被神经活动编码的，我们在视顶盖的吻侧部分（及邻近区域）进行了双光子钙成像实验（图3A）。除16个运动光点刺激外，我们还设置了两种对照刺激，即两种不同强度的3秒“全视野”闪光。我们在10至15个背腹侧层面进行成像，在每个焦平面上，以伪随机序列为18种刺激中的每一种呈现5至8次重复，同时监测动物的行为。

为了表征单个神经元的视觉反应特征，我们为每个细胞计算了一个视觉反应向量，具体步骤如下。首先，对成像平面进行自动分割定义与单个神经元胞体高度匹配的感兴趣区域（图S1）。定位于视顶盖突触神经纤维层的感兴趣区域（ROIs）被排除在外。随后，我们计算了每种视觉刺激重复呈现时的平均荧光钙信号（ΔF/F），最终将这些平均响应拼接起来，生成视觉响应向量（VRV）。因此，该视觉响应向量以18种视觉刺激的完整响应时程（每个细胞684个时间点）的形式，概括了每个神经元的视觉响应。

为了探究视觉反应特征的多样性，我们采用无偏聚类方法，基于视觉响应向量（VRVs）的相似性（通过相关性衡量，见实验方法）对14条斑马鱼的视觉响应细胞进行分组。我们的方法共生成20个聚类簇，每个聚类簇均包含至少6条斑马鱼的细胞（图3B；图S2；表S1）。这些聚类簇中的神经元具有更一致的视觉调谐特性，优于使用k-均值聚类得到的结果。在总共169371个感兴趣区域（ROIs，来自14条斑马鱼）中，我们的方法仅对5092个视觉响应细胞完成了聚类（占比3%）。这个相对较小的样本集很可能并非穷尽所有细胞，但足以让我们识别出在多条斑马鱼中均稳定出现的具有特征选择性视觉调谐的神经元群体。值得注意的是，另一种基于高斯混合模型的聚类方法得到了极为相似的聚类簇，但同样仅分离出数量相对较少的细胞（10条斑马鱼的101656个ROI中仅识别出1035个细胞，占比1%；图S3；实验方法）。图3B展示了基于相关性的聚类方法在相关性系数阈值为0.75的条件下，通过测量VRVs的相似性所识别出的20个聚类簇（更多聚类细节见图S2和表S1）。

集群大致可分为受背景亮度变化调控的集群和对运动光斑具有选择性的集群。背景亮度的阶跃式升高出现在呈现负极性（暗）运动光斑的过程中（光斑出现前2秒开始，光斑消失后2秒结束；实验流程），也出现在对照闪光刺激的过程中。对背景亮度变化有反应的六个集群（c15–20）表现出多样的反应特性和时间动态。其中包括集群20对亮度升高产生负调节（荧光信号下降，我们推测这与紧张放电率降低相对应）；其组成细胞分布在缰核、纵纹以及视顶盖中（图3C）。集群19对亮度降低表现出正调节，属于“暗探测神经元”；而包含神经元数量最多的集群16则对全视野亮度升高表现出正调节，即“开启”反应。这一点在对照刺激和暗光斑呈现时背景光水平的变化反应中，以及对大型、明亮的运动光斑的反应中均十分明显。其中大部分神经元（41%）位于纵纹中，具体在其头端极区（图4A）。

图3.视觉响应属性的聚类（A）2P焦平面显示5 dpf Tg（elavl3：GCaMP5G）幼虫大脑的背侧视图。框表示大小和视野的大致位置，用于前视蒂的功能成像。右OTc的层周围脑室和突触神经球区域被标记。前顶部。比例尺条，100毫米。（B）来自14条鱼的20个视觉反应神经元簇的集群质心（平均视觉反应向量）。对于每个簇，组成细胞的视觉反应向量除以它们的SD（以归一化具有不同幅度信号调制的细胞之间的反应），并计算平均视觉反应向量（彩色线）。薄黑线表示零DF/F。灰色阴影表示跨细胞的SD。右侧的数字是簇ID。阴影条表示视觉刺激呈现期。（C）来自每个簇的细胞的解剖分布。L，左；R，右；Hb，habenula；OTc，视顶盖；SPV，脑室周围层；Np，顶盖神经钉；TL，纵向环面。另见图S1-S3和表S1。

顶盖神经元对多种刺激特征具有选择性

我们识别出14个对光斑移动有响应且对背景亮度变化调制作用最小的簇。对簇质心（VRV的平均值）的分析集群内的细胞）显示，这些集群对16个移动光点刺激组的反应存在差异，并表现出方向、大小和极性选择性（图3B；表S1）。我们通过计算每个细胞的四个选择性指数（分别对应方向、速度、大小和极性）来量化特征调谐，计算基于16个刺激组的最大平均钙信号（实验步骤）。

镜面对称的星团可以在左右顶盖半球被识别出来，具有相似的特征调整。例如，星团9-12显示大小、极性和方向选择性，净偏好向左或向右移动的大亮点（图4B和4C）。星团9和10更喜欢向右-向左移动的斑点。尽管有类似的调整，但星团9和10是分开的，因为它们在不同的时间对扫过视野的斑点做出反应，从+100（右）到100（左）。斑马鱼幼体的视网膜顶盖投影完全交叉，使得左OTc受到来自右眼的视网膜神经节细胞的支配，右OTc接收来自左眼的输入。因此，星团9专门位于左OTc中并做出反应在右-左视觉提示（移动尾部）呈现的早期，而聚类10仅限于右OTc，并且在提示穿过左视觉半视野（鼻尾运动；图4B）后反应较晚。聚类11和12显示出相反的方向选择性（更喜欢左-右运动），并且分别类似地位于左和右OTc（图4C）。因此，聚类9和12形成镜像对称对，分别位于左侧和右侧。聚类10和11形成第二对调谐到鼻尾移动点。

狩猎反应最常由大的、黑暗的、快速移动的斑点引起。我们的无偏聚类程序确定了顶盖神经元调谐到大的、黑暗的斑点，这还显示出方向选择性。聚类1和2显示出向左移动的大的、黑暗的斑点的偏好，分别位于左和右OTc（图4D）。聚类3-6显示出相反的方向选择性，更喜欢向右运动。这四个聚类具有相似的调谐，不仅根据顶盖侧向性进行划分，还根据它们钙反应的不同时间点根据头尾顶盖位置进行划分（图4E）。根据视觉空间的视网膜定位映射，当视觉线索位于更多外围位置时，尾部位置更多的聚类（聚类3和6）会做出反应。我们的期望是，如果时间分辨率更高或聚类过程的相关阈值增加，其他聚类（例如聚类1和2）可以类似地细分。

图4.集群响应背景亮度变化并对移动点刺激的多个特征显示混合选择性（A）聚类16显示响应全场亮度增加的正调制。左面板显示聚类中每个细胞的VRV（每行对应一个细胞）。神经元显示响应背景亮度增加的钙信号增加，背景亮度增加与呈现黑暗，移动的斑点，以及响应大亮点和全场闪光。中间面板显示聚类16细胞在habenula和纵向圆环中的位置，右面板显示两个代表性幼虫中所有检测到的聚类16神经元的解剖位置。神经元位置被标记为x-y质心（彩色斑点）覆盖在来自成像体积背腹侧中点的单个解剖图像上。许多聚类16细胞位于纵向圆环和habenulae。标尺条，50毫米。（B和C）镜像对称的簇对，显示出对大的、明亮的、移动的斑点的净偏好。（B）簇9和10被调谐到向左移动的刺激，并分别定位到左右视蒂。（C）簇11和12被调谐到向右移动的刺激。直方图显示每个簇中细胞的特征选择性指数分布。解剖图上的箭头表示首选的运动方向。（D和E）簇对大的、黑暗的、移动的斑点做出反应。（D）簇1和2被调谐到向左移动的大的、黑暗的斑点。（E）簇3-6更喜欢向右移动的刺激。这些簇根据不同的响应时间进行划分，对应于不同的空间感受野位置。因此，它们在顶盖空间图中占据不同的位置。

总之，我们发现顶盖神经元表现出混合选择性，对视觉特征（特征化合物）的组合敏感。其中包括方向选择性细胞，偏好大的、黑暗的、移动的斑点，我们发现这些斑点是诱发狩猎反应的最有效刺激之一。

非线性混合选择性神经元被调谐至最优类猎物视觉刺激

捕猎反应表现出混合的特征选择性，且对大型、深色、快速移动的光斑触发效果最为显著。基于这些行为学观察，我们开发了一种方法，专门用于寻找能够介导对偏好的类猎物视觉目标检测的神经元。此外，我们还试图定量描述神经活动与四种视觉特征的关系，以确定单个神经元是否以与整只动物行为相似的方式，对多种特征的组合具有选择性。

在我们方法的第一部分，我们设计了一组简单的二元“回归变量”，以寻找视觉调谐特征与行为调谐特征相似的细胞。所有回归变量均对大型黑暗刺激具有选择性。尽管行为反应率未表现出净方向选择性，但我们意识到这可能是由两类或多类方向选择性神经元的共同作用导致的，这些神经元介导对不同方向移动猎物的反应。重要的是，我们发现偏好大型暗斑的神经元簇具有方向选择性（见上文）。因此，我们纳入了包含或不包含该特性的回归变量。在根据刺激特征描述反应率的逻辑回归模型中，涉及速度的交互项系数最小。基于这一原因，以及无偏聚类未分离出速度调谐细胞的事实，我们设计了具有或不具有速度调谐特性的回归变量。这六个回归变量如下：非方向选择性、非速度选择性（nDS-nSp）；非方向选择性、速度选择性（nDS-Sp）；左向选择性、非速度选择性（R2L-nSp）；左向选择性、速度选择性（R2L-Sp）；右向选择性、非速度选择性（L2R-nSp）；以及右向选择性、速度选择性（L2R-Sp）（图5A）。

接下来，我们利用这些回归量来识别具有相似刺激调谐特性的感兴趣区（ROIs）。我们既考虑了顶盖神经纤维层中的感兴趣区，也纳入了室周层（SPV）中的胞体对应的感兴趣区以及与顶盖壳核（OTc）相邻的区域。对于每个感兴趣区，我们计算了一个向量与各回归量之间的相关系数，该向量描述了16种移动光斑刺激各自的峰值平均响应。当相关系数达到0.75或更高时，将感兴趣区与产生最高相关系数的回归量相关联。

图5A展示了十条鱼中与六个回归变量各自相关的所有感兴趣区域的体积响应变异性（VRV）。对体积响应变异性（VRV）的目视检查表明，孤立的细胞对大型、深色、移动的光点具有调谐特性。非速度选择性回归变量分离出了更多的感兴趣区域，其中数量最多的与非速度-非空间（nDS-nSp）回归变量相关。然而，相当数量的感兴趣区域表现出对快速运动的选择性，对大型、深色、快速移动的刺激反应最强。值得注意的是，这些对刺激具有高度选择性的调谐特征在这些感兴趣区域的单个体素上表现得十分明显（图S4）。

为了定量描述这些调谐曲线，我们使用广义线性回归将每个感兴趣区域（ROI）的响应建模为刺激特征的函数。我们通过交叉验证比较了两种模型：线性混合选择性模型和带有交互项的非线性混合选择性模型，这些交互项旨在捕捉对大型、黑暗、移动光斑调谐的神经元的响应，这些神经元可能也会表现出方向选择性。选择性和/或速度调谐（图5B）。对于大多数感兴趣区域（ROIs），非线性混合选择性模型能更好地描述刺激调谐特性（86%的感兴趣区域，交叉验证的(R^{2} nlin)大于(R^{2} lin)和(p ll 0.0001)，威尔科克森符号秩检验）。我们基于线性和非线性模型解释反应方差的相对能力，计算了一个指标SI (Sl nlin)来进一步量化这一结果（实验步骤）。非线性模型的优异表现适用于与六个回归变量中每一个相关的大多数感兴趣区域（图S4B），也适用于所有回归变量合并后的整体群体（图5F）。非线性模型预测的16种刺激的反应与实测值吻合良好（图S4A）。

图5C展示了为与每个回归变量相关的感兴趣区域（ROIs）获得的非线性模型系数。预期用于定义各组反应特性的模型项系数呈现出预期符号的非零值。例如，对大的暗斑具有选择性但既非速度选择性也非方向选择性的神经元，应能很好地用大小*极性交互项来描述。事实上，对于nDS-nSp细胞群，只有该系数呈现非零值。相比之下，对于同时偏好快速斑点的右左调谐细胞（R2L-Sp），速度*大小*极性项应具有正系数（这样细胞会对快速（1）、大（1）、暗（1）刺激产生反应，这些刺激在我们的二进制编码方案中被编码为1；图2E）。为了实现方向选择性，方向*速度*大小*极性项也必须为非零且具有负系数，以抑制对向右移动刺激的反应（向右运动被编码为1）。这正是我们观察到的结果。我们得出结论，我们的方法识别出了表现出非线性混合选择性（NLMS）的感兴趣区域，这些区域对多种特征值的组合具有调谐性。几乎所有这些感兴趣区域（99.6%）都位于顶盖细胞体层或神经纤维网中，仅有极少数位于相邻结构（缰核、TL）中（图5G）。

针对四种单独刺激特征的选择性指数证实，NLMS 感兴趣区优先对大而暗的移动光点产生反应（图5E），且与每个回归因子相关的感兴趣区呈现出预期的速度和方向选择性模式（图5D）。校正眼位后，我们估算了顶盖SPV中单个NLMS神经元的空间感受野（RFs），发现其覆盖了视觉空间的额叶区域，感受野中心在视觉线索诱发最高比例捕食反应的中央区域密度较高（图5H和5I）。

总之，OTc 中存在调谐高度精准的神经元，这些神经元对视觉特征的特定组合表现出非线性混合选择性。我们鉴定出了 NLMS 神经元，这类神经元优先对大而暗的快速移动光斑产生反应，而这些视觉刺激是诱发捕猎反应最有效的刺激。因此，这些神经元是介导对最优类猎物视觉物体感知识别的潜在候选者。

图5. 顶盖神经元对最佳类猎物刺激表现出非线性混合选择性(A)基于行为反应率刺激调谐设计的六个回归器分离出的感兴趣区（ROIs）的视觉反应向量（VRVs）。每个面板下方的符号表示在定义回归器的二进制向量中编码为1的刺激。编码为0的刺激以浅色阴影显示。当相关系数为0.75或更高时，感兴趣区与产生该最高相关系数的回归器相关联。(B) 用于拟合单个感兴趣区反应曲线的非线性模型和线性模型。y代表荧光反应（刺激呈现期间的峰值荧光变化率）。每个刺激均编码为一组四个二进制特征值，如图2E所示。(C) 将(B)中的非线性模型拟合至与每个回归器相关联的感兴趣区后得到的系数（b值）。阴影柱表示预期呈现显著非零值的系数。数据以平均值±标准差展示。

与捕猎行为启动相关的顶盖活动

将猎物样线索的感官感知与猎物捕捉行为的触发联系起来的神经底物是什么？

我们研究了顶盖核活动是否与定义捕猎行为起始的首个运动输出执行相关，即会聚扫视眼动。为此，我们选取了我们利用在线行为数据的优势，得以在双光子功能成像过程中追踪眼球运动（图6A）。我们对比了单个顶盖神经元在有反应试次与无反应试次中的活动，以识别出荧光信号因捕猎行为的释放而显著增强的细胞（图6B）。具体而言，我们设定了两个眼球会聚触发的时间窗口：“会聚前”窗口对比了眼球会聚扫视前1.65秒内的活动与无反应试次中对应时间的活动，该窗口用于识别具有运动前活动的顶盖神经元，这类神经元可能参与捕猎行为的启动。第二个窗口“会聚期”对比了以眼球会聚扫视为中心的2.75秒内的活动，借此可识别活动随眼球会聚发生变化的神经元。对于两个窗口，我们均采用t检验对比有反应与无反应试次中的活动（ΔF/F）。此外，我们还评估了同一窗口内细胞反应的最大信噪比（SNR）。当满足特定条件时，我们将细胞判定为表现出反应调制（注：原文此处UUID后内容缺失）。

顶盖集合代表与会聚扫视相关的活动基序

反应调节细胞的图谱显示，顶盖神经元在室周层（SPV）的不同区域存在空间聚集的簇群（即神经元集群），且这些集群仅局限于左侧或右侧顶盖半球。从预收敛分析中识别出的三个神经元集群示例如图6C至6H所示（另见图S6）。图6C和6D所示的集群由右顶盖皮层（OTc）中空间聚集的神经元群体组成，这些神经元在视觉刺激出现后、会聚性扫视执行前立即出现活动爆发。在无反应试次中，许多神经元对相同的视觉刺激未表现出可检测的活动（见图6D中的示例）。但所有组成细胞均被归为对视觉有反应的细胞，表明其对我们测试集中的至少18种刺激之一存在反应调节（实验步骤）。该集群内的细胞在反应试期中表现出相关的活动模式。我们通过计算每个细胞的荧光时间进程与集群平均值的平均相关性来量化这一特征，(r_{avg }=0.93) [0.89, 0.95]（中位数，四分位距）。

我们在1只幼虫的304个会聚事件中识别出30个会聚前集合。通过将椭圆拟合至反应调节细胞的空间分布来自动检测集合，这些集合被定义为单侧簇，其包含至少6个细胞，最小密度为(533 mu m^{2} / cell)（见实验步骤）。本分析仅考虑顶盖SPV中的细胞，以及神经纤维网中的感兴趣区域被排除在外。但需注意，响应调节的感兴趣区（ROIs）常在活跃神经集合体附近的神经纤维网中被观察到（图6C-6J）。在群体水平上，预惊厥神经集合体在会聚性扫视动作前平均提前1.65秒[中位数、四分位距）激活（图6O）。单个神经元与神经集合体平均响应的集合体内平均相关性为0.71（中位数、四分位距），被归类为视觉响应的组成细胞百分比为82%[71, 100]（中位数、四分位距）（图S5）。值得注意的是，预惊厥神经集合体几乎不含非侧向运动检测细胞（NLM细胞）（14个集合体中的(median =0)、(mean =0.6)、(n=223)个细胞），这表明在顶盖腔（OTc）中，猎物检测和捕食反应的启动由基本不重叠的神经元群体介导。

聚眼期分析识别出顶盖神经元，这些神经元在以会聚扫视为中心的时间窗内的反应试次中活动显著升高，且发现此类细胞也聚集成解剖学上独立的神经元集群（19条幼虫的304次会聚事件中形成88个集群）。图6I和6J中的示例展示了左侧视顶盖尾侧核（OTc）中的一个此类集群。该集群中的神经元主要在与会聚扫视相同的成像帧中活动增强，并在后续帧中达到活动峰值。事实上，这项聚眼期分析让我们发现了一些集群，其群体活动与会聚扫视同步或在其之后开始。通过人工检查单个成像电影，我们仔细确认这并非由配准流程遗漏的运动伪影导致。这种扫视后活动可能代表扫视运动指令的传出副本。对于聚眼期集群，其群体活动平均比会聚事件早0.55秒（中位数、四分位距），许多集群的活动起始与眼球会聚同步或出现在会聚后的第一个成像帧（图6O）。与会聚前集群类似，其组成神经元在反应过程中表现出高度相关的活动。集群内神经元与平均反应的平均相关系数为0.76（中位数、四分位距）。同样，大多数组成神经元被归类为视觉反应型：占比89%（中位数、四分位距）。

为了评估顶盖组件是否与会聚性扫视特异性相关，或者可能代表偶尔与捕猎反应重合的自发性持续活动，我们估算了错误发现率。为此，我们通过对荧光时间序列数据进行循环置换来构建人工反应和非反应时期，并使用与原始数据相同的标准检测组件。基于五次置换的平均值，我们估算错误发现率约为10%–20%（会聚前组件为18.7%、会聚期间组件为8.9%）（图6K）以及6M）。我们得出的结论是，我们检测到的绝大多数顶盖组件都与会聚性扫视眼动相关。

斑马鱼幼鱼在无明显视觉刺激的情况下，会以极低的频率（1.89±0.46次/小时，平均值±标准误，范围0-7.1次/小时）进行“自发性”会聚扫视。然而，在整个成像实验过程中，我们收集了多次自发性会聚事件的数据。这使我们能够探究这些事件是否也与顶盖前核（OTc）神经元集群的激活相关——如果集群活动是动眼输出上游的运动前活动，那么这种关联是合理的。我们采用相同的会聚触发时间窗（会聚前和会聚期），将该时间窗内单个细胞的荧光反应与32秒周期剩余时间内的平均信号进行对比。尽管该分析方法与视觉诱发会聚事件所用的方法不同（在视觉诱发实验中，我们可对比响应与非响应试验中对应时间窗内的活动），但我们发现自发性事件同样与顶盖神经元集群相关（19条幼鱼的278次自发性会聚事件中，共识别出20个会聚前集群和145个会聚期集群；图6K-6N）。这些集群的特性与视觉诱发捕猎行为中识别出的集群相似。对于自发性会聚事件，会聚前集群会在会聚扫视前1.1秒激活活动，其中81% 的细胞为视觉反应型，集群内活动的平均相关系数为0.68。对于自发性会聚期集群，其活动在眼球会聚前0秒开始增强，89%[]的细胞为视觉反应型，集群内活动的相关系数为0.72[0.65, 0.78]（另见图S5）。综上，这些数据表明，神经元集群的激活代表与运动相关的活动，其并非直接或必然地位于视觉输入的下游。

正如窗口设计所预期的那样，预收敛组件和围收敛组件往往会发生重叠。我们检测到更多具有更宽围收敛窗口的组件，且在我们识别出预收敛组件的大多数收敛事件中，这些事件也与围收敛组件相关联（视觉诱发和自发收敛的比例分别为77%和85%）。此外，对于视觉诱发的收敛事件，其组成神经元存在大量重叠：预收敛组件中66%的细胞同时也是围收敛组件的组成部分（图S5）。

图6. 顶盖神经元集合体表现出与会聚性扫视相关的运动前活动

顶盖集合的位置与辐辏眼跳的运动参数相关

在启动捕猎行为的会聚性扫视过程中，眼球运动通常具有不对称性，与刺激物对侧的眼睛平均表现出更大的鼻侧旋转（图图2D）。我们研究了顶盖集群的偏侧性是否与动眼参数的不对称性相关。对于惊厥前和惊厥期的顶盖集群，集群的偏侧性（左侧或右侧顶盖位置）均对应于表现出更鼻侧扫视后位置、眼位置变化更大（鼻侧旋转）以及眼峰速度更高的那只眼睛（图6P和6Q）。因此，左侧顶盖集群的激活与左眼（同侧眼）相比右眼（对侧眼）出现更大、更快的旋转且处于更鼻侧的眼位相关。这一结果与顶盖集群导致眼外运动神经元不对称激活的情况相符，从而使同侧眼产生更大的辐辏。

顶盖皮层（OTc）中感觉与运动图谱的对齐是所有已研究脊椎动物的共同特征，即激活顶盖的不同位点可引发朝向空间定位感觉信号的目标导向运动。顶盖皮层前后轴上的不同位点对应着不同的方位角位置，因此我们推测，对应外周目标位置的更靠后顶盖区域的神经元集群，可能与更不对称的会聚性扫视运动相关。具体而言，当左侧顶盖皮层的靠后区域（对应右侧外周视野）的神经元集群被激活时，左眼的会聚程度应达到最大，并遵循左靠后＞左嘴侧＞右嘴侧＞右靠后的顺序递减。右眼则呈现相反的关系。我们通过测量每个神经元集群的质心与后连合的距离来确定其位置，并观察到眼动参数随神经元集群位置变化的预期趋势（图S7）。对每个顶盖的数据进行独立直线拟合时，通常能得到预期的正斜率（右眼）或负斜率（左眼），但在大多数情况下未达到统计学显著性。这可能是由于个体间的差异带来了额外的无法解释的变异；我们未能检测到足够的神经元集群来评估单条斑马鱼体内的运动图谱。然而，这些趋势支持了神经元集群符合运动图谱的可能性，该图谱可引导会聚性扫视运动朝向目标位置。

总之，通过对行为过程中神经活动的成像，我们能够在背侧丘脑核团（OTc）中识别出一种可重复的群体活动模式，该模式与捕食行为的释放相关。

讨论

斑马鱼捕猎行为启动的模型

图7展示了控制斑马鱼捕猎行为启动的神经通路工作模型。我们提出（1）具有视觉特征结合特征的视觉物体会诱发捕猎反应。在我们的实验条件下，尺寸、速度和对比度极性共同作用触发了捕食行为。（2）视觉信息被传递至对侧半球间脑和中脑的视网膜神经节细胞分支区域]。（3）视顶盖（OTc）中的非线性混合选择性（NLMS）神经元充当介导猎物识别的特征分析细胞。NLMS 神经元可能接收来自视网膜神经节细胞、顶盖中间神经元以及顶盖外区域的传入输入。（4）我们提出单个或多个 NLMS 神经元的活动有助于激活小群运动前顶盖神经元（集合）。顶盖的调节性输入也可能影响集合的募集，从而为连接猎物识别与行为输出的感觉运动通路提供门控机制。顶盖集合的相关性爆发为释放捕猎反应提供了运动前指令。运动输出由控制眼球会聚扫视和定向转向/游动的下游回路介导。（5）运动前顶盖集合的关键传出靶点预计是中脑网状结构（MRF）中的扫视产生回路。顶盖对中脑网状结构的神经支配表现出同侧偏倚，这可能解释了集合活动与同侧眼球更大、更快的运动相关。（6）一条涉及前中脑网状结构以及动眼神经核内支配内侧直肌的动眼运动神经元（EOMNs）的回路会产生会聚性扫视。（7）从中脑网状结构到顶盖的双向投射可能是集合周围活动的基础，并在眼球运动的反馈控制或在眼动和运动反应过程中有助于稳定猎物感知的传出副本机制中发挥作用。（8）顶盖集合预计还将与网状脊髓（RS）神经元建立传出连接，而网状脊髓神经元反过来控制脊髓回路以产生定向的转向运动。

图7. 视觉猎物识别与狩猎反应释放的模型回路(1)类猎物视觉刺激的图像（本例中位于右侧视觉半侧野）投射在右侧颞侧视网膜上。(2) 视觉信息被传递至对侧（左侧）大脑半球的间脑和中脑内的视网膜神经节细胞树突野。(3) 对表征最优类猎物视觉刺激特征的视觉特征组合具有选择性的非线性混合选择性神经元（绿色），在（左侧）吻侧顶盖被激活。(4) NLMS 神经元募集顶盖神经元集群的活动（红色）。(5) 顶盖神经元集群的相关性爆发激活中脑网状结构（MRF）内的神经环路，该环路控制眼跳运动程序，涉及动眼神经核内眼外直肌内侧运动神经元（EOMNs）的激活。顶盖前核（OTc）的传出纤维以同侧（本例中为左侧）偏向投射至中脑网状结构。(6) 眼外直肌内侧运动神经元控制同侧眼内直肌，产生会聚性眼跳。与顶盖神经元集群同侧（图6）、且与视觉刺激对侧（图2）的眼睛（本例中为左眼）表现出更大的眼球旋转幅度和速度。(7) 从中脑网状结构到顶盖的双向连接可能是围惊厥活动的基础。(8) 顶盖神经元集群激活网状脊髓束（RS）神经元，后者进一步募集脊髓神经环路，使机体朝向视觉目标发生定向转向。

视觉特征复合物触发捕猎反应

我们利用一种可通过合成视觉线索诱使被束缚幼虫表现捕食行为的实验方法发现，尺寸、速度和对比度极性这些特征均会调节反应率，且这些特征之间似乎存在相互作用。我们的逻辑回归模型显示，与其他条件完全相同的小光斑相比，大尺寸刺激物引发反应的概率至少提高了3.8倍。这一尺寸效应出乎意料，因为我们此前的研究表明，对于自由游动的幼虫，(stimuli ≤5^{circ})会引发定向反应，而(≥10^{circ })则会触发躲避转向，这一结果随后在被束缚幼虫的实验中得到了证实。一种可能的解释与视觉线索呈现的绝对尺寸和距离有关。在上述两项先前的研究中，屏幕与实验动物的距离远得多，且厌恶性刺激物的绝对尺寸比本实验中所用的“大”光斑大2至8倍。尽管目前尚不清楚斑马鱼幼虫是否能评估视觉物体的绝对尺寸，但已有研究报道金鱼存在尺寸恒常性，包括在单眼观察条件下，而顶盖神经元（包括那些具有单眼感受野的神经元）对物体的绝对尺寸具有敏感性。在我们的实验中，视觉线索出现在双眼视野内或在双眼视野中移动，这可能使实验动物能够利用水平视差信息来估算目标的距离（进而估算其尺寸）。毫无疑问，在开始捕食行为后，持续的眼球会聚现象表明斑马鱼幼虫会利用一种简单的立体视觉来判断猎物的距离研究发现。值得注意的是，我们测试的两种角度大小均处于能够启动针对活体猎物的自然捕猎行为的范围内。

在我们测试的所有特征中，对比度极性对反应率的影响最大，暗斑使反应几率比亮斑至少增加6.5倍。此外，无偏聚类鉴定出了对暗斑具有高度选择性的顶盖神经元（且未检测到其因背景亮度变化产生的调节反应）。多年前，霍勒斯·巴洛提出，集中在青蛙视网膜后部的视网膜“给光负”神经元，非常适合提供苍蝇位置的精准信息；而对小型暗物体有反应（但对亮物体无反应）的视网膜神经节细胞则被认为可充当“猎物感知器”。在蜻蜓体内，小型目标运动检测器神经元仅对暗的负极性物体有反应，且有研究表明这种选择性与蜻蜓向上俯冲捕捉在明亮天空背景下会呈现暗色的猎物相契合。斑马鱼幼体在最终捕食游动时，也会通过背部弯曲从下方攻击猎物，因此对暗色目标的选择性或许是视觉系统的一种适应性特征，用于在相对明亮的背景下区分猎物。

斑马鱼幼体对大、深色且快速移动的斑点反应最为强烈。模型中的交互项表明，这三种特征的组合使产生反应的概率增加了一倍以上（提升至2.53倍）。因此，斑马鱼幼体的猎物识别对特征组合具有敏感性。在蟾蜍身上，由多种特征（尤其是大小、几何形状和运动方向朝向）组合定义的移动物体能最有效地诱发捕食行为（综述见）。这使得学界形成了一种观点，即关联视觉特征的计算是视觉系统从视觉输入中提取潜在猎物信号价值的核心能力。值得注意的是，我们在斑马鱼幼体中观察到的大小与速度之间的交互作用，与针对近距离猎物的自然捕食反应相符——这类猎物会呈现出相似的角大小和速度。一只体长135微米的草履虫位于0.5毫米处，以0.5毫米/秒的速度移动，其呈现出的视觉刺激为15角秒，移动速度为50度/秒，与我们设置的大尺寸（13.2角秒）、快速（30度/秒）条件基本吻合。

顶盖及邻近区域的视觉反应特性

为了研究顶盖回路如何表征视觉特征及特征复合物，我们采用双光子钙成像技术对神经活动进行成像，并开发了一种聚类方法，该方法可识别出具有多种视觉调谐特性的神经元集群。

多个神经簇对亮度变化表现出不同的反应模式，其中包括缰核和纵纹 torus longitudinalis（TL）中的大量细胞，这与近期的其他成像研究结果一致]。在亮度增加的刺激下，缰核细胞表现出持续性的兴奋性反应（16 簇）或持续性的抑制反应（20 簇）。与[37]的研究一致，这些神经簇存在侧偏性，左侧的视觉反应神经元数量更多。

在其他鱼类物种中，题叶（TL）的神经元主要被对侧半侧视野的变暗所激活。令人意外的是，幼鱼题叶（TL）吻端的主要视觉反应为斑马鱼在亮度增加后表现出正向调节。值得注意的是，此前对成年金鱼的记录未能在丘脑叶最前端的记录位点检测到视觉诱发的神经活动。因此，我们的观察结果可能反映了发育阶段或物种差异，或是丘脑叶前端的一种特化功能。

上丘/视顶盖的视觉反应特性已得到广泛研究，幼体斑马鱼也不例外。与以往研究一致，我们的功能集群表现出方向和大小选择性。此外，我们鉴定出了优先对亮斑或暗斑产生反应的神经元。尽管暗斑条件包含了背景亮度的增加，但偏好暗斑的神经元对全视野亮度变化的调制作用极小，且似乎仅对移动的暗斑产生特异性反应。这表明幼体斑马鱼顶盖神经元具有对比度-极性调谐特性。

通过系统地改变四种刺激特征，我们发现顶盖神经元对多种特征表现出混合选择性。我们鉴定出具有等效混合特征调谐的镜像对称集群对，包括四个对大而亮的斑点具有净偏好的方向选择性集群，以及六个[1-6]整体偏好大型暗刺激的方向选择性集群。我们的聚类过程对神经活动的时间敏感，因此根据细胞的空间感受野（以及视网膜拓扑顶盖图谱中的解剖位置）对细胞进行了区分。具有相同无尾-尾或尾-无调谐但定位于左、右顶盖的对称集群的存在，意味着动物对左右半侧视野中不同方向移动的刺激具有相似的感知敏感度。这与我们[13]及其他研究者]的观察结果一致，这些研究表明斑马鱼幼体对分布在正面视觉空间锥体内的活猎物有反应。值得注意的是，集群7（右侧视顶盖）和集群8（左侧视顶盖）构成了一对镜像对称的集群，偏好对侧半侧视野中尾-头方向移动的大而亮的斑点。这种对“进入”某一视觉半侧视野的刺激的偏侧化表征，与后视图顶盖的相关研究结果相似，已有研究报道后视图顶盖偏好头-尾方向移动的斑点。这些神经元可能参与调节视觉处理，以补偿动物向前游动时产生的再传入尾-头运动信号。

非线性混合选择性神经元可能是视觉猎物识别的基础

我们结合回归与建模方法，识别出六类对最佳类猎物刺激具有高度选择性的细胞。与具有相同数量自由参数的线性模型相比，由定义刺激特征特定组合的交互项构成的非线性模型能更好地描述这些细胞的反应。因此，我们将这类高度选择性细胞称为“非线性混合选择性”（NLMS）神经元。

我们认为NLMS神经元是特征分析细胞，它们可能是斑马鱼将视觉物体归类为猎物的能力的基础。不同类型的NLMS神经元如何参与控制捕猎反应？最大的群体是非方向选择性、非速度选择性（nDS-nSp）型神经元。这种反应特性非常适合研究人员检测到了体积大、颜色深且移动的斑点，但未能解释行为中表现出的对快速刺激的额外偏好。一种可能性是，多种类型的NLMS神经元的活动会被下游神经元读取，而下游神经元又会触发捕食反应。通过合适的突触权重，这些下游读取回路会拥有与行为反应速率相匹配的刺激调谐特性。或者，单个NLMS细胞或许足以触发捕食反应。在这种情况下，整体的行为调谐特性将代表NLMS群体在多次捕食过程中的总贡献。我们对具有方向选择性的NLMS细胞的观察与这第二种假设相符。这些神经元可能会对向相反方向移动的猎物引发捕食反应，但它们随时间累积的活动会产生出无净方向选择性的行为调谐特性。未来需要开展实验来验证NLMS细胞的激活是否足以触发捕食反应，以及不同细胞类型是否会引发不同的运动输出。

NLMS 细胞的响应特性表明，视觉系统会对视觉输入特征执行逻辑运算，但这些运算发生在何处？一种可能性是，视网膜神经节细胞（RGC）的传入纤维已表现出混合选择性，并将其传递给突触后的顶盖神经元。或者，NLMS 可能是顶盖局部处理过程中涌现出的一种特性（例如参见文献[41]）。我们无法区分这两种可能性，因为我们使用的转基因品系中，顶盖神经纤维网同时包含大量标记的 RGC 轴突和顶盖神经元的树突分支。为支持 NLMS 在顶盖中产生的可能性，长期以来人们已发现，不同特征选择性类别的 RGC 会在顶盖神经纤维网的不同层中形成分支[34]；而在斑马鱼幼体中，方向选择性、朝向选择性和大小选择性的 RGC 轴突会呈现层状分离[42,43]。顶盖脑室旁核（PVN）是位于 SPV 中的单极细胞，其树突穿过神经纤维网的各层延伸[44]，这使其能够整合来自不同特征选择性 RGC 的输入信号。锋电位产生机制所固有的非线性特性，可介导构成 NLMS 响应特征的视觉特征非线性整合。值得注意的是，顶盖神经纤维网中的感兴趣区域（ROIs）与全部六种 NLMS 类型均相关。尽管这可能仅反映了顶盖神经元神经突的活动，但我们并不排除混合选择性在视网膜中被部分或全部计算的可能性。

总之，顶盖NLMS神经元是特征检测器，对构成最佳类猎物视觉对象的视觉特征组合具有选择性。我们认为，NLMS细胞因此是介导猎物感知识别并触发捕猎反应启动的理想候选细胞。

顶盖神经元集群代表与捕猎启动相关的活动基序

通过对行为过程中的神经活动进行成像，并对比有反应与无反应的实验数据，我们能够将视觉诱发的高度一致反应与捕猎启动相关的特异性活动区分开来。

我们在10%的会聚事件中检测到了活跃的顶盖组件。这种检测率可能反映了我们的成像平面与顶盖活动位点重合的概率，不过我们无法排除仅存在……的可能性一部分反应与活跃的神经集合相关。尽管如此，有多条证据表明神经集合活动与扫视式眼球会聚的执行之间存在密切关联。（1）在刺激诱发和自发的眼球会聚反应中，均检测到了具有相似特征的神经集合。（2）顶盖神经集合的偏侧性及前后位置与会聚扫视的动眼参数相关。（3）当动物对同一视觉刺激做出高度相似的扫视反应，且我们对同一焦平面进行成像时，偶尔会观察到神经集合的重复激活（图S6）。（4）我们的错误发现率分析表明，神经集合不太可能是背景自发活动的结果。

顶盖集合体在会聚性眼跳发生前立即处于激活状态（会聚前），且在许多情况下，群体活动在行为发生前超过一秒就已启动。我们推测，这些集合体的协同爆发放电提供了释放捕食反应的运动前信号。为支持这一可能性，顶盖活动在控制目标导向行为和眼球扫视运动中具有公认的作用，且直接刺激鱼类的前内侧顶盖会引发眼球会聚和J型转向。顶盖核（OTc）向中脑网状结构（MRF）的投射构成了传出通路，顶盖活动可通过该通路控制眼球扫视运动（综述见）。值得注意的是，顶盖位点向中脑网状结构双侧投射，但在同侧形成的突触数量更多。这种不对称性可能为我们的发现提供解剖学基础——集合体位于产生更大、更快鼻侧眼球旋转的眼睛同侧。

顶盖集群的激活该如何调控？基于我们关于NLMS细胞介导猎物识别的假说，我们提出这些细胞会向运动前集群提供关键的传入输入。值得注意的是，集群本身几乎不含NLMS细胞（即便有也极少），这表明对猎物的感知以及捕食反应的触发是由顶盖神经元中不重叠的群体介导的。NLMS细胞可直接或间接向一个或多个集群神经元提供兴奋性输入，而集群内部的局部循环连接则有助于维持群体活动的持续性与同步性。一种推测性的可能是，集群网络的活动在目标注视过程中会“逐步增强”或累积，并在达到与感知阈值对应的特定活动水平时触发行为反应。这种机制会让人联想到LIP皮层区域的活动——该区域的神经元表现出逐步增强的活动，被认为反映了感知决策过程中证据的时间整合。半球间的通讯（例如通过顶盖连合）可能有助于集群的募集，因为有时在视觉提示处于相对于集群的同侧视觉半侧时，活动就已开始，而该区域的视觉信息主要在对侧顶盖中进行表征。除NLMS细胞外，其他传入输入可能会根据与觉醒和动机相关的内部状态变化，来调控集群的活动（进而影响反应概率）。

相当一部分围惊厥集合体的激活与会聚性扫视同时发生，或紧随其后。尽管我们无法排除眼动相关活动（视觉或本体感觉反馈）的可能性，（这可通过麻痹眼肌进行验证），这可能代表着扫视指令的运动效应副本，该副本可能源自顶盖核（OTc）与中脑网状结构（MRF）之间的相互连接。效应副本信号被认为介导了扫视抑制（眼球扫视过程中视敏度的降低），从而能将外部刺激引发的视网膜运动信号与眼球转向过程中产生的再传入信号区分开。在眼球和身体快速移动时，这种机制可通过抑制自身产生的运动信号，有助于动物在捕猎过程中精准感知猎物。对此的佐证是，斑马鱼在游动过程中对视觉刺激的敏感度似乎会降低。

结论

通过将功能性钙成像与束缚式虚拟捕猎行为相结合，我们在视顶盖后部（OTc）中功能性鉴定出了神经元群，这些神经元群很可能是支撑特定视觉引导行为的感觉运动转换过程中的关键组成部分。我们提出的捕猎启动神经回路工作模型给出了若干可验证的假设，这些假设可作为未来研究的基础。具体而言，阐明NLMS反应的产生机制以及NLMS神经元与运动前集合体的相互作用方式，将是令人振奋的挑战。高速体积成像技术为将神经活动分析从视顶盖后部（OTc）扩展至斑马鱼幼鱼全脑、并识别出与核心感觉运动通路相互作用及调控的其他脑区提供了可能。此外，虚拟现实捕猎实验将实现在捕猎流程后续阶段监测回路动态的需求，此时幼鱼会反复选择目标导向的运动输出，以追踪、接近并捕获猎物。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。