题目：Zebrafish harbor diverse intestinal macrophage populations including a subset intimately associated with enteric neural processes

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34142024/

期刊：iScience

研究亮点

l 斑马鱼拥有与哺乳动物相似的肠道肌层巨噬细胞和黏膜巨噬细胞

l 肌层和黏膜巨噬细胞与肠道神经过程密切相关

l 斑马鱼中单个肌层巨噬细胞跨越肠道多个层

l 通过敲除irf8选择性消除肌层巨噬细胞会影响肠道运输

摘要

肠道巨噬细胞对肠道健康至关重要，但在人类和小鼠系统之外，对其的研究仍较为匮乏。本研究确立斑马鱼为一种强大的模型，该模型具备全肠道多维度（前后轴和中心-外周轴）分析的优异成像能力，可用于解析肠道健康与疾病中的巨噬细胞生物学特性。我们借助高分辨率成像技术证实，斑马鱼肠道中存在真正的肌层巨噬细胞和黏膜巨噬细胞，同时还发现了大量与肠神经过程密切相关的巨噬细胞亚群，这一发现令人意外。有趣的是，大多数斑马鱼肌层巨噬细胞会跨越肠道多个层，这与通常仅局限于单一肌层的哺乳动物肌层巨噬细胞形成鲜明对比。通过巨噬细胞缺陷的irf8斑马鱼模型，我们发现肌层巨噬细胞数量会减少，而黏膜巨噬细胞则不受影响；此外，成年斑马鱼的肠道整体运输功能或许无需肌层巨噬细胞参与，但在发育阶段则不可或缺。这些特征首次揭示了硬骨鱼从发育到成年阶段肠道巨噬细胞的特性，以及其与肠神经系统的关联。

图片摘要

引言

巨噬细胞会适应组织特异性微环境

埃利·梅奇尼科夫100多年前对吞噬细胞的描述开启了免疫学的新纪元，这门学科在很大程度上植根于这些高度移动的哨兵的先天识别与免疫应答。越来越多的证据表明，巨噬细胞（mɸ）在抗原加工、呈递以及适应性免疫的协调中发挥作用，这进一步强化了这些细胞的免疫核心地位。巨噬细胞密集分布于大多数组织中，凸显了其在维持细胞和机体稳态方面的普遍重要性。近年来，研究愈发证实了巨噬细胞在不同组织中的物理关联，并明确了其在组织稳态发育、维持、重塑、炎症反应和再生过程中的作用。巨噬细胞的这些互补功能并非彼此孤立，而是体现了其作为一种本体论和功能上多样、异质且高度可塑性的细胞类型的本质。

曾一度认为巨噬细胞完全源自循环单核细胞，但如今学界已普遍认可，大多数组织中都存在由发育早期定植、寿命长的固有巨噬细胞池。这些固有巨噬细胞似乎已适应局部组织微环境，且处于能快速应对组织损伤的独特位置，不过其完整的发育起源和自我更新能力尚未被完全阐明。支持巨噬细胞存在组织特异性微环境与功能的证据，来自对小胶质细胞（脑组织中的固有巨噬细胞）的研究——小胶质细胞是组织特异性研究中特征最明确的巨噬细胞类型之一。小胶质细胞除了作为“第一道防线”外，还参与细胞清除、突触修剪、神经元存活、损伤后神经环路重塑，并且能根据局部环境快速发生表型转化。其他研究也发现，固有巨噬细胞群已适应宿主组织的独特需求，例如皮肤中的朗格汉斯细胞、肝脏中的库普弗细胞、肺中的肺泡巨噬细胞，以及肠道中的固有巨噬细胞。但关于它们在发育、健康和疾病中功能的详细机制及全面理解仍有待实现。

哺乳动物肠道巨噬细胞在解剖结构和功能上具有异质性

对肠道驻留型m4功能和起源的研究兴趣不断增加，使人们对哺乳动物肠道m4的多样性有了更深入的认识。已知肠道m4在功能、形态和起源上构成了一个多样化的群体。在稳态状态下，肠道m4分布于肠道的所有区域（小肠、胃、大肠和结肠）以及肠壁的所有层（黏膜层、黏膜下层和肌层）；它们还针对每个微环境表现出功能特化性。大多数肠道m4研究集中于黏膜群体。与肠腔相邻的上皮相关黏膜巨噬细胞（m4）似乎在清除和吞噬潜在病原体以及凋亡的上皮细胞方面发挥特化功能。在其下方的固有层（肠上皮下方富含免疫细胞的区域）中，m4通过抗原呈递和细胞因子产生来调节局部免疫反应。在神经密集分布且其他方面免疫细胞稀少的肠道肌层（外层肌）中，也存在解剖学上独特的肠道m4群体，这类细胞被称为肌层巨噬细胞（MMɸ）。

人类及其他哺乳动物（包括小鼠、猫、豚鼠、兔子）体内均已发现黏膜肌层巨噬细胞，鸡等非哺乳动物体内也存在这类细胞，这表明它们在脊椎动物中具有进化保守性。黏膜肌层巨噬细胞的部分特征可通过典型的远距离分布模式（与其他组织驻留巨噬细胞类似）以及与肠相关神经元和神经突起的紧密毗邻来识别。鉴于这类细胞在解剖学上还与卡哈尔间质细胞（肠道蠕动的“起搏器”）相关，其参与调节肠道蠕动和运动功能也就不足为奇了。近期针对小鼠的研究揭示了黏膜肌层巨噬细胞β2-肾上腺素能受体的功能，包括限制感染相关肠神经元损失的能力。黏膜肌层巨噬细胞还与肠道运动功能显著受损的多种疾病相关，如1型糖尿病和胃轻瘫。综合来看，这些研究为哺乳动物系统中肠道黏膜肌层巨噬细胞的运动调节及神经保护作用奠定了基础。

斑马鱼是研究黏膜免疫学和神经免疫相互作用的新兴模式生物

斑马鱼（斑马拟丽鱼）是一种极具价值的模式生物系统，这归因于其遗传可操作性、繁殖力强，以及胚胎期和幼体早期阶段的光学透明性。近年来，斑马鱼已成为研究肠道稳态生理与疾病的高可操作模式生物。斑马鱼的优势还使其能够直接探究发育过程中以先天免疫为核心的神经免疫相互作用，并对整个肠道长度进行监测；相较于小鼠等大型哺乳动物，斑马鱼肠道组织更薄，这也让肠道的成像深度得以提升。

我们近期在斑马鱼中的研究揭示了肠道巨噬细胞在塑造肠道微生物群方面的关键作用。我们发现干扰素调节因子8（irf-8）在斑马鱼巨噬细胞（包括肠道巨噬细胞）的发育和维持中存在条件性需求。尽管我们已对斑马鱼肠道M4巨噬细胞的发育和功能的某些方面进行了表征，但斑马鱼是否具备哺乳动物系统中描述的完整解剖学M4巨噬细胞多样性，这一问题至今尚未得到探索。鉴于斑马鱼一直是研究多种人类相关疾病病理生理学和揭示基本细胞原理的强大模型系统，我们预计在斑马鱼肠道巨噬细胞多样性研究中取得的进展（如本文所述），将显著推动我们对黏膜免疫学、肠道健康以及神经免疫相互作用的理解。具体而言，明确肠道M4巨噬细胞的形态和解剖学异质性程度，对于进一步阐明先天免疫在胃肠道稳态与健康中的作用具有至关重要的意义。本研究确立了斑马鱼作为模式生物的地位。用于探究这些问题，并为进一步探索巨噬细胞在正常和患病肠道生理中的多样性与功能奠定了基础。

结果

成年斑马鱼远端肠道中m4密度的增加

胃肠道沿从前到后的前后轴（A-P轴）从食管到肛门形成有序结构，该轴也被称为近远轴。更具体地说，肠道前端为小肠，后端为结肠。肠道沿前后轴的区域化特征体现在分子、细胞、功能及免疫层面的差异。基于这些差异，我们首先探究健康成年肠道沿前后轴的区域差异是否与肠道驻留巨噬细胞的明显差异相关。我们采用将斑马鱼肠道长度划分为七个连续节段S1-S7的区域化划分方案，该方案与其他研究的划分方式一致，对成年斑马鱼肠道各节段巨噬细胞的形态和密度进行了细致检测我们通过对解剖后的完整肠道进行高分辨率体外共聚焦成像，对斑马鱼肠道的这七个区段进行了观察（图1）。我们使用m4特异性转基因斑马鱼品系Tg(mpeg1:GFP)来标记巨噬细胞（图1）。有趣的是，我们发现成年斑马鱼肠道中巨噬细胞的数量从前到后呈递增梯度分布：从S1-S4区段相对均匀的密度，到最靠后的S7区段密度最高，而斑马鱼的S7区段与哺乳动物的结肠同源（图1）。尽管在所有肠道区域中巨噬细胞呈现出多样的形态，但我们未观察到不同区段间巨噬细胞的整体形态存在明显差异。与人类和啮齿类动物的研究结果一致，我们的分析表明斑马鱼肠道类结肠区域的组织驻留巨噬细胞密度最高。这些结果提示，结肠中肠道巨噬细胞的高丰度与肠道微生物群的最高含量之间可能存在一种保守的关联关系。

图1. 成年斑马鱼后部（远端）肠道中巨噬细胞密度增加(A)(左图) 透射光显微照片显示体外解剖的斑马鱼成年肠道管（比例尺500微米）。(右图) 从前到后的组织结构，突出了小肠样（S1-S4，红色）、过渡区（S5，橙色）和大肠样（S6-S7，蓝色）解剖区域。(B) (左图) 成年小鼠肠道从前到后的组织结构，显示对应的小肠（红色）和大肠（蓝色）区域，(右图) 对应的m4相对密度。(C) 成年Tg(mpeg1: GFP)体外完整解剖肠道的代表性共聚焦显微照片，该肠道沿纵向剖开，从腔侧在指定区域（S1-S7）成像，同时展示了每个肠道区域的m4密度（图表）。S5区域同时叠加了异硫氰酸荧光素（FITC）和四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）通道，以增强(mpec 1 GFP+)信号在S5区域高组织自发荧光（橙色信号）上的可视化效果。显微照片数据代表>20个样本(of >4)次独立实验。所示数据为每个实验个体的2个独立区域的平均值，对应(n=8-9)（S1-4和S6-7）或(n=4)（S5）。(^{*} p=0.0156)的显著性通过单因素非参数方差分析（Kruskal-Wallis检验）确定。比例尺按图示标注。

斑马鱼拥有与黏膜层和肌层相关的不同肠道巨噬细胞

尽管肠道巨噬细胞的整体细胞形态差异在前后轴上总体相似，我们接下来探究了从管腔中心侧到外侧纵肌层的肠道不同同心层中，巨噬细胞是否存在形态差异。与哺乳动物相比，斑马鱼的肠道组织结构相对简化。斑马鱼没有哺乳动物的指状绒毛，而是拥有细长且连续的“绒毛脊”，这些绒毛脊突入管腔空间，表面覆盖着单层肠上皮细胞，构成肠道的环境界面。斑马鱼似乎缺乏结构完整的黏膜下层（及相关黏膜下神经网络）和肠腺，且组织的厚度与复杂程度相较于哺乳动物均有所降低。与哺乳动物类似，肠壁包含两层正交排列的肌层（环肌层和纵肌层），二者环绕着肌间神经丛，该神经丛中分布着肠神经系统的内在神经元及相关神经束；神经元胞体并非形成有序的肠神经节，而是以单个或小群体（1-4 个神经元）的形式散在分布（图2A）。为确定斑马鱼是否存在真正的与肠道肌层相关的m4巨噬细胞群，我们开发了一种全标本高分辨率共聚焦成像方法，通过对离体肠道的肌层进行研究来探究这些细胞：将肠道纵向剖开并展平，使其尽可能贴近显微镜物镜（图2B）。以该方式对Tg(mpeg1:GFP)成鱼的肠道进行成像，我们在肠黏膜/固有层以及肌层中均观察到了明确的mpeg1+细胞群（图2C、2D）。与哺乳动物类似，这些与肌层相关的细胞具有独特的形态，且以一种能最大化相邻细胞间距离的空间模式排列。

我们采用奈奎斯特采样的高分辨率共聚焦成像技术进一步观察发现，显著的mpeg1GFP+信号不仅出现在黏膜间隙，还分布在环肌、肌间神经丛和纵肌区域（图2E）。当在环肌或纵肌中观察到细胞突起时，发现其延伸方向与肌纤维一致（图2E，数据未展示）。

此外，我们的成像分析显示，斑马鱼肠道中大多数黏膜相关巨噬细胞分布于固有层内肠上皮细胞的基底外侧侧，且与肠褶内的神经突起紧密相邻（图2C、图2D及图S1）。目前，关于黏膜相关巨噬细胞神经免疫相互作用的详细研究尚属空白，但斑马鱼可作为揭示其功能作用的有力模型。

图2. 斑马鱼拥有独特的与黏膜和肌层相关的肠道巨噬细胞(A，右侧)。(B) 示意图展示了肌层位于成像物镜最近处的体外成像策略。(A) 示意图展示了斑马鱼(A，左侧)和小鼠(C、D)近端(小)肠的同心解剖层及相关巨噬细胞群(C) 通过按区域进行z轴投影，对每只动物多个视野中黏膜和肌层相关的(mneg1GFP+)巨噬细胞进行定量，数据汇总自(n=3) Tg(mpeg1:GFP)成年鱼的体外肠道，如图(D)所示(scale =50 mu m)(E) 代表性的奈奎斯特采样共聚焦成像显微照片（体素深度3毫米），突出了肠道同心层中黏膜或肌层相关的mpeg1GFP+荧光的区域多样性：固有层、环肌、肌间神经丛和纵肌。p值通过双尾t检验确定。比例尺如图所示。另见图S1。

肠道巨噬细胞形成了一个解剖学上独特的细胞群，它们分布在肠道的多个层面，并与肠道神经活动密切相关。

结合我们在图2中对同心层特征的观察，我们对成年双转基因（mpeg1:GFP/nbt:dsRed）离体肠道的高分辨率共聚焦z堆栈显微图像进行了深度编码分析，以可视化MM4细胞，并确定这些mpeg1-GFP+细胞在肌层内是否构成真正的空间分离且与神经元相关的群体。我们证实了这种解剖学上独特的区域划分（图3A，上图）及其与肠神经突起的邻近关系（图3A，下图）。通过以0.5微米的体素深度进行采样，我们能够进一步清晰地区分这两个群体显著的空间分离，还能更全面地评估神经突起相关的MM4细胞所呈现的组织驻留模式（图3B）。

值得注意的是，我们经常观察到单个 mpeg1GFP+ 巨噬细胞（MM4）与贯穿纵肌、肌间神经丛和环肌的神经突起相关联，并且发现它们并非栖息于在肌层（这一结构在哺乳动物中存在）内存在不同的解剖学微环境，MM4 细胞常延伸出跨越肠壁多层的突起（图3C）；研究观察到了六种 MM4 占据模式，其中2型是占比最高的两类之一，代表跨越整个肌层的 MM4（图3C和补充图S2）。可观察到单个 MM4 细胞跨越肌间神经丛，并在胞体两侧延伸与纵肌层和环肌层相贴合的突起（图3D、3E和补充图S2）。我们通过针对全免疫细胞靶点 L-塑性蛋白（L-plastin）的抗体介导方法，结合 mpeg1:GFP 标记，证实了巨噬细胞与神经突起的紧密相互作用（图3F）。与哺乳动物中的巨噬细胞类似，斑马鱼肠肌层除了存在 mpeg1 阳性的 MM4 细胞外，几乎无免疫细胞分布；而肠黏膜中则存在大量 L-塑性蛋白阳性但 mpeg1 阴性的细胞。 

为了确认 MM4 在肌层内的位置特异性，并确定 MM4 是否与密集排列的平滑肌紧密结合并延伸突起，我们采用了抗体回收介导的二次扩增方法，使用了 Tg(sm22:GFP)报告基因以及针对 GFP 和 L-质体素的一抗。尽管我们确实观察到MM4 存在于平滑肌层之间，但其形态与平滑肌层并不相似，也未显示出紧密接触；相反，MM4 似乎沿着肠内固有神经束延伸细胞突起，并与这些神经束发生特异性且紧密的关联（图3D及补充图S2）。这些基于抗体的抗原修复方法（针对绿色荧光蛋白GFP，以提高巨噬细胞转基因的信号质量和信噪比；以及针对乙酰化微管蛋白），结合我们针对肌层的固定离体肠道组织高分辨率共聚焦成像策略，使我们能够观察到MM4的突起延伸及其与肠内神经系统（ENS）固有神经束的复杂相互作用。我们观察到，(mpec 1^{GFP+}) MM4 经常延伸突起，且可观察到其桥接位于相对的环形和纵行肌层中的正交神经突起（图3E、图3F及补充图S2）。

图3. 斑马鱼肠道肌层巨噬细胞形成解剖学上独特的群体，并与神经突起紧密关联（A）对来自成年斑马鱼离体近端肠道的Tg(mpeg1:GFP;nbt:dsRed)品系40倍共聚焦显微图像进行体积深度编码分析（Imaris软件），突出显示了一个空间上独特的(mpec 1 GFP+) MM4细胞群（紫色，上图），该细胞群与密集的(nbt ^{DaRaD+ })神经突起（灰色，下图）共定位。数据来自至少(n=5)只实验动物的代表性结果。（B）2毫米共聚焦z系列显微图像（体素深度0.5毫米，采用奈奎斯特采样），显示了紧密的mpeg (1^{GFP+} MM varphi-nbt^{DsRed})神经突关联。(C–E) (C，左) 跨纵肌-肌间神经丛(L-M)、纵肌-环肌(L-C)、肌间神经丛-环肌(M-C)、肌间神经丛-绒毛脊基部(M-V)、环肌(C)或环肌-绒毛脊基部(C-V)区域的MM4占据频率图形表示。(C，右) 肠道各层间巨噬细胞端对端占据的图形表示，突出了桥接型MM4表型。对离体(D) Tg(mpeg1:GFP)成年肠道组织（a-GFP、a-乙酰化微管蛋白免疫标记）进行奈奎斯特采样的高分辨率共聚焦成像，显示了mpeg1 (GFP+) MM4突起的神经桥接；(E) 无Tg的野生型成年肠道组织（a-L-质体蛋白和a-乙酰化微管蛋白免疫标记）则证实了不依赖Tg的MM4-神经突起及相互作用的可视化。（F）对离体的 Tg(sm22:GFP)成年肠道组织进行固定，通过抗体介导的免疫标记对 sm22:GFP、L-质体蛋白和乙酰化微管蛋白进行可视化处理，以突出特定的 MM4 与神经突起的关联，而非与肌层外部平滑肌纤维的关联。所示比例尺：20 微米（A、F）；50 微米（B、E）；40 微米（D）。

结合体内和体外成像研究揭示斑马鱼幼体时期肠道发育过程中大量肠道巨噬细胞沿发育中的肠管出现

为进一步探究巨噬细胞与肠神经系统的关联，我们接下来检测了肠道巨噬细胞出现的发育时间进程。我们利用同时携带巨噬细胞和全神经元转基因（分别为mpeg1:GFP和nbt:dsRed）的双转基因斑马鱼，开展互补的体内整体成像和体外全肠道成像（图4）。这些研究策略得出了一致的结果，使我们能够可靠地了解肠道相关巨噬细胞在3天至30天胚胎发育日（dpf）期间于肠管中的时空分布特征，以及它们在肠管发育过程中与神经元细胞及神经突起的紧密关联（图4）。

在受精后3天开始的幼体早期发育阶段（dpf，对应标准体长3.5毫米[SL]），即卵黄尚未完全吸收的孵化前后，新生的后肠管开始显现（图4A，虚线）。尽管在这一未成熟阶段这种情况频率较低，但我们观察到肠道相关的巨噬细胞（mpeg1:GFP）与发育中的肠神经元（nbt:dsRed）紧密相邻（图4A，箭头）。在肠道区域之外，我们在发育中的身体中观察到了显著的巨噬细胞-神经束相互作用（图4B和4B'），包括与发育中的外周神经节的直接紧密接触（图4C）。

到受精后6天，幼虫的肠管已形成组织，卵黄也已完全吸收；这与外源摄食的开始、鱼鳔的发育以及自由游泳相关。肠道中存在大量表达神经丝蛋白的神经元，包括肠神经元及其神经突起（图4C）。肠外巨噬细胞分散于全身，与发育中的后侧线保持着显著的关联，后侧线是一种机械感觉器官，对检测水流变化和基于环境的运动至关重要（图4C’和4C''）。肠道相关巨噬细胞的数量增多，并与肠神经系统保持密切联系（图4C'''）。在这一发育阶段，可通过显微手术获得完整的离体肠道标本。该方法能对真正驻留肠道的巨噬细胞进行近距离且明确的评估（图4D），而传统的体内全身成像因皮肤相关巨噬细胞的覆盖，会难以区分其与位于肠道表层的肠巨噬细胞，导致结果不明确。值得注意的是，这些巨噬细胞呈现出完全成熟、形态清晰的特征，具有高度分支且通常延伸较远的突起，推测这使其能够监测较大的组织区域（图4E和4E'）。

受精后约9天，幼虫经历一段剧烈的生长和肠道发育时期。通过体内和体外成像可以观察到，此时肠道巨噬细胞的定植数量显著增加，同时神经元网络也更为庞大（图4F-4H）。这一时期同样是肠道S5节段产生的明亮自发荧光（如图1所示）开始显现的时间点（图4G）。

到受精后14天，离体肠道的正交视图显示，主要存在与肌层相关的细胞群，这类细胞群有可能向绒毛嵴间隙伸出突起（图4I），与此同时，肠道中mpeg1GFP+巨噬细胞以及nbt+肠道神经元的出现频率大幅上升（图4J和图4K）。在此期间，也出现了看似与肠道黏膜间隙相关的巨噬细胞，这些细胞会在上皮细胞周围及细胞之间伸出突起（图4L，箭头所示）。

在斑马鱼幼体向成体阶段转变的第30天受精后（dpf），幼体发育完成，此时鱼的标准体长（SL）通常为1.0厘米。在这一时间点，斑马鱼肠道已呈现出成熟成体肠道典型的S形结构，两个肠道弯曲处清晰可见（图4M）。这标志着一个重要的形态学事件。肠道m4群体开始与成鱼的高度相似（图4N），黏膜（绒毛脊）相关和肌层相关的m4之间存在明显的解剖分离以及可识别的形态差异（图S3）。在平滑肌层之间可清晰观察到黏膜巨噬细胞（MMɸ），它们与肠道内在神经过程密切相关。这些巨噬细胞呈细长形态，常呈桥状结构，与黏膜相关巨噬细胞截然不同（图S3）。肠道长度呈非线性增长，与胚胎后发育的两个主要阶段——早期幼体期（8-14天受精后）和晚期幼体期（18-30天受精后）相吻合（图4P）。值得注意的是，以对数尺度显示，幼体发育期间肠道m4数量呈指数级增长（图4Q），与肠道长度和体长（标准体长）的增长同步（图4R）。研究发现，在所评估的所有发育阶段中，m4细胞的平均大小保持不变（图4S），而随着生物体的发育，动物体长、肠道长度、组织厚度和组织复杂度均大幅增加（图4O-4R）。这表明，随着肠道随时间不断生长，巨噬细胞的局部增殖或定植数量增加，从而导致肠道内巨噬细胞密度上升（图4和图S4）。在幼体早期阶段，肠道巨噬细胞似乎在更长的肠道范围内分散分布，而在后期阶段则分布得更为密集（图4和图S4）。由于肠道巨噬细胞的总细胞大小随时间无显著变化（图4S），幼体早期肠道巨噬细胞分布范围较广的现象可能反映出它们所巡视的肠道相对长度大于后期幼体阶段的肠道巨噬细胞。综上，这些数据表明，斑马鱼幼体早在3天受精后就已存在肠道巨噬细胞，在整个发育过程中始终与肠道神经细胞及神经过程保持密切联系，且随着肠道的成熟，其密度不断增加。

图4. 斑马鱼从幼体早期到幼龄成虫阶段肠道巨噬细胞的时空形态与分布特征(A)3 dpf 时 Tg(mpeg1:GFP; nbt:dsRed) 斑马鱼的整体共聚焦成像（20倍，(z=14,5 mu m)体素深度），显示罕见的肠道相关mpeg1GFP+ 巨噬细胞（m4）靠近成熟的(nbt ^{DsRed+ })肠道神经束。虚线表示发育中肠管的边缘。(B) 肠道外，3 dpf 时m4常与外周神经系统（PNS）的神经突起相关联（20倍，Nyquist采样，(z=25,2 mu m)体素深度）。(B0) 插图显示m4与神经突起的连接（20倍，Nyquist采样，(z=10,2 mu m)体素深度）。(C) 5-6 dpf Tg(mpeg1:GFP;nbt:dsRed) 斑马鱼的整体活体成像显示，m4在全身分布更频繁，肠道相关m4的频率也有所增加（20倍拼接图像，(z=32)毫米体素深度）。(C0和C00) 该阶段的m4发育良好，常沿侧线神经分布，m4细胞体位于侧线本身，m4突起接触并连接相邻的(nbt ^{DsRed+ })神经突起。(C%) 5-6 dpf 时，肠道(mpec 1 GFP+)中的巨噬细胞（mo）(nbt ^{DaRed+ })与肠神经系统（ENS）相关联。(D–G) (D) 6 dpf 时离体完整肠外植体的共聚焦成像（20倍拼接图像，(z=30)毫米体素深度），显示巨噬细胞（mpeg1GFP+）和肠神经元（((nbt ^{D sRed +} ))）沿肠道（A=前端；P=后端）的分布和位置，且(E) 肠道相关巨噬细胞呈现复杂延伸的“成熟”分化形态（20倍，(z=8,3 mu m)体素深度）。9 dpf 时的(F) 整体活体全装成像（20倍，(z=18) 5微米体素深度）和(G) 离体肠外植体成像均显示，相较于肠道内和全身的神经元分布，肠道巨噬细胞密度有所增加（20倍拼接图像，(z=20)，5微米体素深度）。(H) 高倍活体成像显示肠道巨噬细胞与肠神经元细胞体及突起的接触（20倍，(z=16,5 mu m)体素深度）。(I) 12-14 dpf 离体完整肠外植体的三维体积重建显示，(mneg1GFP+) m4在肠道壁周围密度增加，提示肠道巨噬细胞可能存在“由外到内”的发育模式（20倍，(z=37)，1微米体素深度）。(J) 12-14 dpf Tg(mpeg1:GFP;nbt:dsRed) 斑马鱼的整体活体成像显示，全身及肠道相关的mpeg1:GFP+ 巨噬细胞密度增加（20倍拼接图像，(z=50)毫米体素深度）。虚线界定肠管范围。(K) 12-14 dpf 离体完整肠外植体的共聚焦成像显示，密集的mpeg1:GFP+ 细胞定位于肠道特异性区域（20倍拼接图像，(z=16,5 mu m)体素深度）。(L) 箭头所示的mpeg1 (GFP+)巨噬细胞可贴附含神经元的肌肉组织，并在肠上皮细胞周围插入突起（20倍，Nyquist采样，(z=15)，1微米体素深度）。(M) 透光成像显示，约30 dpf 时肠道呈现典型的“成体样”S形（20倍拼接图像，(z=13,5 mu m)体素深度）。(N) 发育成熟的肠道神经支配密集，且布满(mneg1GFP+) m4，表型呈现成熟状态（20倍拼接图像，(z=17,5 mu m)体素深度）。(O) 斑马鱼的标准体长（毫米）在幼体发育阶段呈线性增长。合并数据以平均值+/-(n=3-20 per)组表示。(P) 肠道长度随发育呈非线性增长，存在两个生长“激增期”，分别为6-9天（卵黄完全吸收后、外源摄食开始时）和幼体发育阶段开始时（受精后约3-4周）。(Q) 幼体发育关键阶段肠道总mpeg1 (GFP+) m4数量呈指数级增长，以10为底的对数尺度上表现为线性增长。代表性数据((n = 3/group))以平均值+标准误（S.E.M.）表示；数字为每肠道的平均巨噬细胞总数。(R) 肠道总(mpecg1GFP+) m4数量随肠道长度的变化呈现与(P)相似的发育模式，代表性数据（((n = 3/group))）以平均值±标准差（S.D.）表示。(S) 单个m4的面积（((mu m^{2}))）在幼体发育阶段保持恒定。图表显示了指定发育节点下从(n=3)个体中收集的(n=20-40)单个巨噬细胞的面积计算结果。以平均值±标准误（S.E.M.）绘制，通过单因素方差分析（one-way ANOVA）确定显著性。Q-S为对数线性图，纵轴为10为底的对数尺度。A=前端，P=后端。比例尺如图所示。另参见图S3和图S4。

转录因子irf8的基因敲除可显著消除巨噬细胞并影响发育过程中的肠道转运

鉴于肠道巨噬细胞与发育中肠道神经过程密切相关，我们接下来探究了这些巨噬细胞的扰动是否会导致肠道整体功能缺陷。已有研究表明，斑马鱼中irf8基因的缺失会导致肠道巨噬细胞（mφ）数量大幅减少，且无法区分肠道巨噬细胞亚型。我们进一步对成年irf8突变体的这种细胞损失进行了更详细的表征，结果确实发现黏膜相关巨噬细胞（mφ）数量显著减少（减少50%），其中肌层亚群的减少最为显著（减少95%）（图5）。我们还采用共标记策略（L-塑性蛋白[红色]和乙酰化微管蛋白[蓝色]）进一步评估了这种显著的肌层巨噬细胞（MM4）缺失情况，发现(irf8st95/st95)突变体中罕见残留的MM4缺乏细胞体突起（图S5），且不表现出典型的野生型肌层“桥接”表型——即MM4的细胞突起可跨越多个肠道层（图S2）。尽管存活的突变体成体表型正常，且未表现出任何明显的发育缺陷（图S6A），但在成年群体中，其出现频率始终低于孟德尔遗传预期（图S6B）。由于已有研究证实MM4与肠神经元的串扰可调节肠道蠕动，我们探究了irf8突变体中MM4的缺失是否与肠道整体转运的变化相关，结果发现，在禁食或进食稳态条件下，irf8突变体成体的进食能力和整体肠道转运均未受影响（图S6C）。进食48小时后，所有基因型的成年期匹配斑马鱼均已排出大部分摄入的食物；在所有时间点（进食前、进食中及进食48小时后），MM4缺失的irf8突变体与其拥有野生型MM4的杂合对照兄弟姐妹之间，肠道内容物水平无明显差异（图S6C）。

图5. 转录因子irf8的基因敲除会导致肌层巨噬细胞大幅减少(A)外植体 (irt8+/+) 和 (irt8-/-) Tg(mpeg1:GFP) 近端肠道组织的代表性共聚焦z-stack显微图像，显示黏膜（上图）和肌层（下图）中irf8介导的M4型巨噬细胞丢失（40倍放大，体素深度1微米）。(B) 外植体 (irf8+/+) 和 (irt8-/-) Tg(mpeg1:GFP) 近端肠道固定组织（抗乙酰化微管蛋白抗体修复）的代表性共聚焦z-stack显微图像，显示肌层中irf8介导的与神经突起相关的M4型巨噬细胞丢失（20倍放大，体素深度2微米，(z=16)）。(C) (irf8195/st95)突变体（mut）与野生型或杂合子同窝个体（sib）的黏膜（左图）和肌层（中图）中mpeg1:GFP+细胞的定量分析，结果显示黏膜巨噬细胞减少约50%，而肌层巨噬细胞减少95%（右图），数据来自合并的非重叠共聚焦z-stack显微图像（每组(= 3-4)个个体）。黏膜巨噬细胞的频率存在更大的个体间差异，部分原因可能是肠道微生物群的影响。图中数据为平均值±(****p<0.0001)，由非参数Mann-Whitney双侧T检验确定。数据代表每组至少(n=3)个成年个体和至少3次独立实验的结果。(Scale bar =100 mu m) 另见图S5和图S6。

由于肠道巨噬细胞可能对肠道不同部位产生不同影响，我们进一步研究了肠道巨噬细胞的耗竭是否会影响发育过程中的肠道动力。我们利用了本研究利用10-11日龄斑马鱼幼鱼的实验优势，通过高组织分辨率的活体成像对多个个体开展肠道转运和肠道动力的纵向研究（图6）。令人意外的是，与成年斑马鱼的分析结果相反，我们发现irf8突变体幼鱼的肠道转运时间显著缩短，而在喂食后1小时内进行的5分钟高速延时成像记录中，由蠕动波和直肠收缩定义的瞬时肠道动力并无显著差异（图6）。结合成年个体的分析结果，这些研究表明肠道巨噬细胞（尤其是MM4细胞）并非肠道常规肌肉运动所必需，但可能对肌间神经丛及其他调控和协调食物内容物通过胃肠道转运的组分发挥重要的调节作用。综上，这些结果证明irf8缺陷型突变体在发育阶段存在MM4细胞的特异性大量缺失，且肠道转运时间显著缩短，而成年个体则未出现可检测到的相关变化。

图6. irf8突变体中肠道巨噬细胞的严重耗竭导致幼体发育期间肠道转运加快（A）对喂食轮虫的10-11日龄（体长5.5毫米）斑马鱼幼鱼进行肠道转运的纵向分析显示，irf8突变体的肠道内容物排空速度更快，多数在喂食和禁食后3小时完成排空，而野生型和杂合型对照幼鱼则需要5-7小时。在指定时间点对每只幼鱼进行实时拍摄，获取肠道彩色图像（食物内容以黄色虚线区域清晰显示）。至喂食后7小时，所有幼鱼的肠道均被发现排空。（B）时间进程图展示了10-11日龄幼鱼肠道内容物中位数百分比及95%置信区间（CI）。多数irf8突变体在喂食后3小时肠道内容物百分比降至0%，而杂合型同胞则在5-7小时达到该水平。（C）肠道内容物初始水平表明不同基因型幼鱼的食物摄入量无显著差异。误差线代表标准差（S.D.）。（D）对喂食后3小时肠道排空的幼鱼比例分析显示，irf8突变体中肠道排空的幼鱼比例显著更高，达71.4%，而野生型为12.5%，杂合型为36.4%。野生型与杂合型之间无显著差异。误差线代表标准误（S.E.M.）。（E）从野生型斑马鱼幼鱼肠道运动的视频记录中提取的静态单色图像。各基因型的代表性记录参见视频S1、S2和S3。标注显示鱼鳔（sb）；三个主要肠道分区（虚线区域）：肠球近端、中肠和远端肠；以及两种主要的运动模式（直肠收缩和蠕动波，均存在顺行（口到肛门）和逆行（反流）方向）。较大的箭头表示肠道运动的主要方向。黑色箭头为主要肠道运动的位置。时间戳以分:秒表示。比例尺按标注显示。(F) 散点柱状图显示，尽管irf8突变体存在蠕动波减少的趋势但差异不显著，但其蠕动波数量与直肠收缩数量无显著差异。ns表示无显著差异。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验后进行多重比较来确定统计学显著性。误差棒代表均值标准误（S.E.M.）。图C、D和F中的每个数据点均代表单个实验动物。

讨论

斑马鱼肠道巨噬细胞的多样性

理解肠道巨噬细胞的多样性，是阐明肠道M4巨噬细胞在维持肠道稳态及疾病发生过程中作用的关键基础。斑马鱼肠道M4巨噬细胞是否具有与哺乳动物相似的多样性，目前仍不明确；而解析其异质性，仍是理解斑马鱼作为人类健康相关研究模式生物应用价值的核心要点。本研究为斑马鱼肠道相关M4巨噬细胞存在形态异质性提供了解剖学证据，并鉴定出斑马鱼肠道中一类真实存在的肌层相关M4巨噬细胞群。研究还发现这些巨噬细胞与肠道神经通路密切关联。研究借助M4巨噬细胞特异性Tg(mpeg1:GFP)斑马鱼品系，结合全肠道离体组织制备、免疫标记及高分辨率成像技术，详细解析了成年斑马鱼肠道从前到后轴及各同心层的肠道巨噬细胞特征（图1、图2、图3），同时也阐明了不同发育阶段肠道巨噬细胞的建立过程（图4）。研究还探究了肠道相关M4巨噬细胞在关键发育阶段的出现规律，发现早在3天胚胎期（dpf），肠神经系统神经分化尚处初期时，发育中的肠道管内就已存在肠道相关M4巨噬细胞。此外，在约27-30天胚胎期的幼鱼向稚鱼成年过渡阶段，研究也观察到形态上具有差异的黏膜巨噬细胞和肌层相关巨噬细胞。

斑马鱼肠壁中真正的巨噬细胞桥层

利用巨噬细胞和全神经元特异性报告基因系以及改进的整体免疫成像技术（图2B），我们证实，与哺乳动物一样，斑马鱼的一部分黏膜巨噬细胞（m4）占据肠壁（肠道肌层内），其形态独特，且在解剖上与黏膜相关的黏膜巨噬细胞（m4）相互分离（图2C-2E）。肠道肌层巨噬细胞（MM4）同样呈现典型的组织驻留分布模式（图2D），并与肠神经突起相伴分布（图3A），这表明其可能与肠神经网络存在功能性相互作用。在小鼠体内，肠道肌层巨噬细胞（MM4）还会进一步分布于各肌层（环层、纵层）以及肌间神经丛中，分别呈现双极或星状形态。起初，斑马鱼体内似乎也存在肠道肌层巨噬细胞（MM4）的这两种不同形态（双极型[环肌或纵肌]和星状型[肌间神经丛]）（图2E），但高分辨率成像显示，大多数肠道肌层巨噬细胞（MM4）具有桥接表型，可穿过肠壁的多个正交层（图3C-3F及补充图S2）。值得注意的是，多数肠道肌层巨噬细胞（MM4）定位于环肌与纵肌之间，其胞体延伸至各肌层，并紧密包裹神经突起延伸部分（图3C-3F及补充图S2），这提示肠道肌层巨噬细胞（MM4）可能在肠道蠕动及协调平滑肌收缩中发挥作用。斑马鱼肠道肌层巨噬细胞（MM4）跨越肌层的这一桥接表型的功能意义目前尚不明确，但这一结构可能使更少的肠道肌层巨噬细胞（MM4）就能完成肠道内关键的巨噬细胞功能，且每个巨噬细胞的多功能性或许超过其哺乳动物同源细胞。此外，这种桥接表型也可能仅仅反映了肠壁组织自身细胞复杂性的降低（图2A）。在小鼠体内，肠道肌层巨噬细胞（MM4）似乎聚集于肠神经节和神经元胞体周围，而本研究发现，稳态下斑马鱼的肠道肌层巨噬细胞（MM4）更常与神经突起相关联，极少与肠神经系统（ENS）神经元胞体结合。这可能是因为斑马鱼从发育到成年的整个生命过程中，肌间神经丛中缺乏有序的神经节结构（图2A）。尽管肠道肌层巨噬细胞（MM4）分子和功能多样性的广度尚未被完全阐明，且其与神经元相互作用的功能后果仍不明确，但解剖学和形态学上的相似性表明，斑马鱼与哺乳动物的肠道肌层巨噬细胞（MM4）之间可能存在功能同源性。

随着绒毛嵴形成，黏膜巨噬细胞出现，并与黏膜内的神经束相关联

本研究数据还证实了黏膜M4巨噬细胞与绒毛神经投射之间存在长期假设、直至近期才得到证实的关联，不过我们的解剖学数据显示，多数黏膜M4巨噬细胞可能与有曲张的绒毛神经投射相关，而非仅占少数的“神经支持”亚群（图S1）。我们仅观察到极少数mpeg1GFP阳性细胞的突起延伸至上皮全宽，这与树突细胞跨上皮树突延伸至管腔的现象相似（斑马鱼中尚未发现树突细胞）。此外，我们未发现任何mpeg1阳性突起完全延伸至管腔空间；我们的数据支持这一观点：稳态下的黏膜M4巨噬细胞可能通过间接方式取样管腔内容物，例如通过出芽上皮的内吞作用，而非直接接触。无论具体机制如何，未来研究应探究黏膜M4巨噬细胞在管腔和组织监测中所起的作用，且本研究数据表明斑马鱼可作为探索这些问题的模型。斑马鱼的肠道并非指状绒毛结构，而是具有类似鸟类胚胎的肠绒毛嵴，这类结构会随着机体生长代谢需求的增加而发育（Burgess，1975）。与我们的研究结果相似，鸟类肠道也存在两个生长阶段（Burgess，1975），这提示特异性的“黏膜”巨噬细胞可能是发育中肠道组织形态发生内陷的次级特征。

然而，这并不能完全解释肠道显著的表型变化——这种变化似乎出现在幼体发育末期，从27-30天受精后（dpf）的幼鱼阶段开始。对斑马鱼胚胎后发育关键阶段的m4进行时间分辨率更高的成像，结合转录组分析，或许能解答关于胚胎后斑马鱼肠道肌层和黏膜巨噬细胞表型生长及年龄相关特征的相关问题。此外，利用单细胞RNA测序技术对人类、小鼠和斑马鱼的肠道巨噬细胞进行直接比较，可能有助于深入理解调控肠道巨噬细胞个体身份与功能的重要保守分子通路。此类研究有望揭示巨噬细胞基于转录组的多样性，并指出影响巨噬细胞极化的解剖微环境，这与近期在人类中的研究结论相符。

微生物群、巨噬细胞与宿主肠道组织的相互作用

研究表明，微生物群可调控MM4表型。相反，我们此前的研究发现，斑马鱼肠道M4也能调控肠道微生物群的组成。综合来看，这些数据表明肠道微生物群、肠道M4与宿主肠道组织之间存在动态的三方相互作用。斑马鱼模型系统可作为揭示这些相互作用本质的重要工具。通过以10为底的半对数图分析，我们发现肠道M4总数在发育过程中呈指数级增长，且这一增长与肠道整体发育及动物体型相关（图4）。因此，在斑马鱼中进一步探究肠道M4的增加是组织发育的结果，还是仅由推测的微生物负荷导致，具有重要研究意义。尽管如此，成年斑马鱼肠道中M4在近远轴上的分布频率差异（图1），与哺乳动物中微生物含量最高的结肠区域肠道巨噬细胞丰度也最高这一保守关系相符。

MMɸ 对肠道的正常发育和生长似乎并非必需，但会影响发育过程中的胃肠道转运

研究表明，在成年动物体内，肠神经元会分泌维持 MM4 存活所必需的因子；然而，MM4 似乎在发育过程中能够正常定植和形成模式，并不依赖神经元。相反，长寿组织的耗竭小鼠中的MM4亚群最近被证实会对肠神经元的存活产生负面影响，并损害肠道功能与内环境稳态的维持。然而，目前尚不清楚小鼠中长寿的肠道巨噬细胞是否仅属于MM4亚群。我们通过共聚焦成像得到的初步观察结果（图5B）提供了初步数据，显示未出现明显的肠神经投射异常，但仍需进一步的详细分析，才能明确确定MM4在斑马鱼中是否参与肠神经元的维持、神经连接的维持，或同时参与两者。此外，其他相关方面，如可能受MM4影响的不同内在和外在肠神经元亚型的功能或频率，仍有待进一步评估。

在人类中，IRF8 功能丧失突变会导致免疫缺陷，表现为循环单核细胞和树突状细胞缺失；而 Irf8 缺陷小鼠的小胶质细胞无法在损伤刺激下启动反应性（炎症）表型。在斑马鱼中，irf8 对胚胎巨噬细胞和成体巨噬细胞的发育具有差异化需求。本研究进一步阐明了 irf8 在斑马鱼肠道黏膜巨噬细胞（m4）的建立、维持及形态形成中的作用。研究发现，尽管 irf8 缺陷会严重影响肠道巨噬细胞（图5及补充图S5），但它对黏膜巨噬细胞（MMɸ）具有优先耗竭效应：irf8 缺失会导致黏膜巨噬细胞几乎完全被清除（95%），而黏膜巨噬细胞的清除率仅为50%。不过，这一现象并未对 irf8 突变体的整体存活率产生影响（补充图S6）。尽管斑马鱼中存在大量与肠神经过程相关的黏膜巨噬细胞（MM4），但这些巨噬细胞的严重耗竭并未影响斑马鱼幼体肠道蠕动波和直肠收缩的瞬时频率（图6），这表明黏膜巨噬细胞（MM4）并非肠道常规蠕动所必需的。然而，在发育阶段，黏膜巨噬细胞耗竭的 irf8 突变体的肠道总转运时间更短，且存在蠕动减少的趋势（虽无统计学显著性）（图6），这提示黏膜巨噬细胞（MM4）在肠道蠕动的神经调控中发挥调节作用。肠道肌肉运动的多个参数（如运动方向、强度、持续时间、速度和协调性）部分受肠神经系统（ENS）调控，这些参数共同决定了消化食物在消化道中的推进速度。因此，肠道转运过程是多种高度复杂调控输入的综合结果。未来对调控肠道运动的不同输入因素的分析，将进一步明确黏膜巨噬细胞（MM4）影响发育阶段肠道转运的具体机制。

尽管在成年阶段未发现irf8突变体的肠道转运存在显著变化，但由于我们在每个时间点对不同个体进行的整体和横断面分析，可能无法检测到微小差异，而这目前是成年斑马鱼研究中最可行的方法。此外，MM4可能在发育阶段和成年期对肠道动力产生不同影响。此前在小鼠中的研究基于MM4缺乏症对总转运时间的影响，证实了MM4在调节肠道动力中的作用，但相关数据得出了相互矛盾的结果。有研究通过基于白喉毒素的方法耗竭肠道M4中的Cx3cr1+细胞，发现肠道总转运时间延长，而胃排空未受影响；另有研究使用阻断性抗CSF1R抗体选择性耗竭至少80%的MM4，且未影响黏膜M4，结果显示肠道总转运时间无显著变化，但胃排空加速且结肠转运时间延长。由于斑马鱼无胃且胃肠道结构更简单，总转运时间可能更能反映整体肠道动力或胃排空过程。本研究表明，MM4耗竭会导致发育中的斑马鱼肠道总转运时间显著变化，但对成年斑马鱼无此影响，这提示MM4可能在发育过程中对肠神经系统（ENS）调控的肠道动力协调发挥作用。不过，我们无法排除MM4在成年斑马鱼中以更精细的水平调控肠道运动功能的可能性，包括蠕动收缩和肠道运动模式。此外，MM4不仅对正常成年肠道的精细肌肉协调是否有影响，还对患病或处于其他应激状态的斑马鱼肠道动力产生何种作用，目前尚不清楚。

斑马鱼黏膜巨噬细胞和黏膜相关巨噬细胞的发育起源仍是一个尚未解决的问题

重要的是，本研究尚未阐明本文所描述的黏膜巨噬细胞或MM4的起源。如前所述，包括肠道巨噬细胞在内的组织巨噬细胞曾被认为完全源自循环单核细胞。近期的命运图谱研究表明，小鼠体内确实存在长寿的巨噬细胞库，但循环单核细胞与胚胎定植的长寿组织驻留巨噬细胞对黏膜和肌层群体的各自贡献目前仍不明确。需要借助巨噬细胞谱系追踪策略，才能明确黏膜巨噬细胞和MMɸ的发育起源，以及irf8依赖性是否与斑马鱼研究中所暗示的独特起源（原始型与定型型）相关。

结论

总之，本研究报告了在理解斑马鱼肠道巨噬细胞在发育过程和成体阶段的组织、分布及多样性方面取得的关键进展。研究表明，斑马鱼可被有效用于直接探究全肠道内以巨噬细胞为核心的神经免疫相互作用。与此一致的是，近年来支持斑马鱼在阐释胃肠道生物学、黏膜免疫学和神经免疫学相关病理生理学及细胞机制方面应用价值的研究不断增多。由于斑马鱼肠道组织较薄，全肠道可实现高分辨率观察，我们能够对肠道各维度的不同细胞进行详细成像，而这在其他脊椎动物模型中则更难实现。本研究的成像分析证实，斑马鱼体内存在与哺乳动物相似的多种肠道巨噬细胞亚群，即肌层巨噬细胞和黏膜巨噬细胞，同时揭示了跨越多层肠道并与肠神经过程密切接触的黏膜巨噬细胞（MMɸ）的特性。尽管单个跨越多层肠壁的黏膜巨噬细胞的功能意义尚不清楚，但它们的定殖意味着其可能发挥比通常局限于单层的哺乳动物巨噬细胞更广泛、更多样化的作用。这些研究结果为进一步探究肠道巨噬细胞的功能多样性、功能意义及其与肠神经系统（ENS）的相互作用提供了动力，而这些方面目前仍未被完全阐明。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。