标题：Radial astroglia cooperate with microglia to clear neuronal cell bodies during zebrafish optic tectum development

期刊：Cell Reports

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2025.116509

摘要

吞噬细胞清除死亡细胞是许多生物体内神经发育的重要环节。小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的主要吞噬细胞，但其他胶质细胞的参与程度尚不明确，尤其是在稳态条件下。在斑马鱼视顶盖（OT）发育过程中，我们观察到放射状星形胶质细胞从其基底突起形成动态的球形突起。我们将这类突起称为“蝎形头”，其出现与视顶盖中神经元细胞死亡的波状过程相吻合。研究发现，蝎形头会在磷脂酰丝氨酸暴露后迅速包围大部分濒死神经元。但与传统吞噬体不同，蝎形头可存活数小时，且极少发生酸化或被内化。相反，小胶质细胞会侵入蝎形头并清除其内容物以完成降解。本研究揭示了放射状星形胶质细胞在稳态细胞清除中的主动作用，以及斑马鱼视顶盖发育过程中小胶质细胞与放射状星形胶质细胞的协同作用。

图文摘要

引言

发育性程序性细胞死亡（PCD）最著名的例子之一发生在神经发生过程中，此时对神经环路功能非必需的神经元会发生程序性细胞死亡，并被中枢神经系统（CNS）的常驻吞噬细胞——小胶质细胞清除。在斑马鱼视顶盖（OT）——硬骨鱼的主要视觉处理中枢中，形成视神经的视网膜神经节细胞（RGC）轴突在受精后约60小时（hpf）开始与视顶盖靶区建立连接。在这一阶段，死亡和濒死的视顶盖神经元数量也会急剧增加。起源于中枢神经系统外的小胶质细胞开始侵入视顶盖大约在受精后60小时，且直到受精后72至96小时才达到稳定的幼虫种群数量。因此，在这一关键发育窗口期，专业吞噬细胞的数量远少于死亡细胞和细胞碎片的数量。此前我们的研究表明，在巨噬细胞和小胶质细胞定植斑马鱼躯干之前，神经嵴细胞会吞噬细胞碎片。 因此，我们推测在发育中的视顶盖中，还有另一群非专业吞噬细胞参与了胞葬作用。

在视神经束（OT）中，存在一类被称为放射状星形胶质细胞（或简称为星形胶质细胞）的胶质细胞群，这类细胞具备星形胶质细胞样特性，例如血脑屏障调控以及与突触的关联。星形胶质细胞和类星形胶质细胞可作为非专业吞噬细胞发挥作用。在小鼠模型中，当小胶质细胞的活性受损时，星形胶质细胞会协助小胶质细胞清除神经突碎片，并对凋亡细胞做出反应。因此，我们提出假设：在吞噬负荷较高、小胶质细胞活性较低的这一发育窗口期，视神经束中的星形胶质细胞参与了神经元的清除过程。

在本研究中，我们利用活体成像技术探究了视顶盖星形胶质细胞在清除凋亡细胞过程中的作用。我们发现，在斑马鱼的生理发育过程中，视顶盖星形胶质细胞通过其基底突起形成大型球形结构，这些结构会包裹并容纳细胞体，尤其是凋亡神经元的细胞体。我们将这类结构命名为“蝎形头”，它们具有高度动态性、通常持续时间较长且极少呈酸性，这与经典描述的吞噬体存在明显区别。小胶质细胞随后与星形胶质细胞头部相互作用以清除这些隔室中的内容物并完成降解过程。综上，我们的研究发现揭示了少突胶质祖细胞星形胶质细胞一个此前未被报道的功能，并阐明了胞葬过程中专业与非专业吞噬细胞之间高度协调的相互作用。

结果

在关键发育阶段，放射状星形胶质细胞形成镰刀状突起

在斑马鱼的视顶盖（OT）中，视网膜神经节细胞（RGC）轴突约在受精后60小时开始神经支配。与此同时，60至72小时期间视顶盖神经元的凋亡数量会增加。为了观察as为了探究神经胶质细胞在发育这一关键节点的行为，我们从矢状面对Tg（slc1a3b:myrGFP-P2A-H2AmCherry）斑马鱼幼虫的视顶盖（OT）进行成像，成像时间为受精后55至84小时，持续6至12小时（图1A和图S1A）。该转基因鱼利用slc1a3b的调控序列驱动膜结合型绿色荧光蛋白（GFP）和核定位的红色荧光蛋白（mCherry）的表达，而slc1a3b编码谷氨酸星形胶质细胞特异性转运蛋白（GLAST），这是一种公认的星形胶质细胞标志物。在这些延时成像实验中，我们观察到视顶盖的星形胶质细胞形成大型球形结构，这些结构从其基底突起的细小分支处萌发而来（图1A、图1B；视频S1）。在成像研究中，我们发现大量这类膜结构同时形成，它们通常在细长的颈状突起末端动态移动，随后逐渐消散。鉴于这些结构形态十分显著，且我们在几乎所有同阶段的延时成像中都能稳定观察到它们，我们进一步探究了这些星形胶质细胞结构的本质。

为确认这些结构的出现并非由转基因本身导致，我们构建了三株由 slc1a3b 驱动的稳定转基因品系：一株为肉豆蔻酰化膜结合型 Tg(slc1a3b: myrEGFP)、一株为 CAAX 定位的膜结合型 Tg(slc1a3b: TagRFP-CAAX)，还有一株为胞质型 Tg(slc1a3b:mCerulean)。我们随后我们在受精后55至84小时对每个转基因品系的幼虫进行了延时成像（图S1B）。在所有这些转基因品系中，我们观察到放射状星形胶质细胞形成了相似的结构。

在发育早期，放射状胶质细胞充当神经和胶质前体细胞，因此我们推测这些结构中可能含有新近产生的星形胶质前体细胞。Tg(slc1a3b:myrGFP-P2AH2AmCherry)可标记星形胶质细胞的细胞膜（myrGFP）和细胞核（H2AmCherry）。我们的延时成像中观察到的球形结构不含mCherry核标记，表明它们并非星形胶质细胞的胞体（图S1C）。此外，这些结构通常从视顶盖中部附近的基底突起处产生，而非星形胶质细胞胞体所在的脑室附近区域。最关键的是，我们在延时成像中未观察到星形胶质细胞核发生分裂。因此，我们得出结论，这些结构并非星形胶质细胞增殖的结果。

鉴于星形胶质细胞在血脑屏障调控中的已知作用， 我们还探究了这些结构与血管相互作用的可能性。我们对 Tg(slc1a3b:TagRFP-CAAX);Tg(fli1a:EGFP) 转基因幼虫从受精后55小时至67小时进行成像，以同时观察星形胶质细胞膜与血管。尽管星形胶质细胞膜确实以管状结构环绕着血管，但我们观察到的球形结构与血管并无关联（图S1D）。

经过这些初步研究以及对现有文献的全面梳理，我们得出结论：我们的观察结果代表了视上核星形胶质细胞一种此前未被报道过的行为。为了简洁地论述这些结构，同时避免对其进行错误命名，我们为其赋予了一个新名称。许多结构在颈状分支上形成口状杯状形态（图1B），因此我们以荷马史诗《奥德赛》中居住在悬崖、长有多个头颅的怪物斯库拉（Scylla）为其命名，称其为斯库拉状头部，这种怪物会吞噬过往船只上的水手。在本研究中，我们将斯库拉状头部定义为由星形胶质细胞膜构成的球形或半球形（杯状）结构。

除了视顶盖（OT）外，我们在半环状隆起、小脑和脊髓等区域也观察到了类似蝎鲆头部的结构（图S1E）。然而，这些结构在视顶盖之外的自发形成过程难以预测和研究。因此，我们将研究重点放在发育中的视顶盖（OT）上，该区域中蝎鲆头部结构的形成具有可重复性且模式固定。

图1. 星形胶质细胞在关键发育阶段从其基底突起形成蝎形头部。(A) 左侧示意图展示了成像区域、转基因标记以及单个放射状星形胶质细胞。右侧为Tg(slc1a3b:myrGFP-P2A-H2AmCherry)斑马鱼幼虫从受精后72小时（72 hpf）开始的延时成像电影的40微米投影静态图。星形胶质细胞膜（绿色）和细胞核（品红色）被标记。箭头头指示新近形成的蝎形头。(B) 来自(A)中单个蝎形头的放大单Z平面图像（橙色箭头头）。(C) 对Tg(slc1a3b:myrGFP-P2A-H2AmCherry)斑马鱼幼虫早期发育过程中蝎形头数量的定量分析，(n=24 fish) (D) 蝎形头直径的定量分析。(Average =5.73 pm 1.3 mu m) n = 42个蝎形头，3条斑马鱼。(E) 蝎形头持续时间的定量分析。(Average =173 pm 146 ~min) (median =130 ~min) 范围：0（单个时间点）至710（整个延时过程）分钟，(n=435) 99个蝎形头，9条斑马鱼。(F) 为slc1a3b:myrGFP-P2A-H2A-mCherry稀疏标记的单个星形胶质细胞从受精后57小时（57 hpf）开始的延时成像电影的20微米投影静态图。蝎形头的形成（箭头头）和消散（轮廓箭头头）均有标注。时间以成像开始后的小时:分钟表示。数据以平均值±标准差呈现。比例尺为10微米。参见图S1和视频S1、S2。

镰状头部的形成与消散过程具有动态性且高度可变

为了表征蝎形头部，我们分析了在54至86小时胚胎发育阶段（hpf）进行6小时或12小时延时拍摄的Tg(slc1a3b: myrGFP-P2A-H2AmCherry)幼虫。在大部分成像过程中，我们聚焦于视顶盖（OT）最外侧的40微米区域，外侧边缘是我们能清晰识别星形胶质细胞基底突起的第一个焦平面（图S1A）。然而，我们在视顶盖更深处也观察到了蝎形头部（图S1F），这表明该现象并非局限于视顶盖的特定层或区域。

在我们的成像观察中，发现了蝎形头部特征的变化。例如，蝎形头部的数量会随幼虫的龄期而改变。为了绘制蝎形头部形成的时间线，我们在受精后42至100小时的特定阶段统计了蝎形头部的数量（图1C）。我们从42小时开始我们首先在约40小时受精后（hpf）观察到Tg(slc1a3b: myrGFP-P2A-H2AmCherry)的OT表达。通过这项分析，我们发现蝎状头部形成的峰值出现在约68小时受精后，并在接下来的24小时内逐渐减少（图1C）。到100小时受精后时，我们几乎观察不到蝎状头部了。

从形态学角度来看，蝎形头部的平均直径为5.73±1.27微米（图1D）。这与细胞核的平均大小相近。我们还通过测定蝎形头部首次出现与消散之间的时间差，分析了其形成后维持的时长，我们将该时长称为持续时间。偶尔会观察到，在开始成像时蝎形头部已存在，或在成像结束时蝎形头部仍未消散，这意味着对于这些蝎形头部而言，测得的持续时间短于其实际持续时间。分析结果显示，蝎形头部的平均持续时间为172±146分钟（图1E），持续时间范围为0分钟（单时间点）至710分钟（整个延时成像时长），中位持续时间为130分钟。综上，蝎形头部的持续时间存在差异，且偏向较短的持续时间，但也可维持较长时间。

为了更清晰地观察蝎形头部的动态变化，我们通过向胚胎中注射 slc1a3b:myrGFPP2A-H2AmCherry 质粒，对星形胶质细胞进行了马赛克标记。随后，我们追踪了单个星形胶质细胞基底突起中蝎形头部的形成过程（图1F；视频S2）。在始于57小时受精后（hpf）的代表性延时成像中，我们观察到星形胶质细胞的主基底突起首先伸出细小突起，随后在62小时受精后（+4分30秒）形成蝎形头部。该蝎形头部持续存在320分钟，最终在67小时受精后（+9分50秒）突然消散。令人意外的是，蝎形头部似乎是先破裂，再重新融入基底突起，而非被转运至细胞体或被其他细胞清除。我们在其他蝎形头部的观测案例中（包括稳定品系）均观察到了这种消散方式。部分消散的蝎形头部看起来是缓慢张开并塌陷回细胞膜，而另一些则先突然膨大，随后以同样方式塌陷。

利用星形胶质细胞的马赛克标记技术，我们还分析了单个蝎形头的行为。我们观察到，一些蝎形头直接与基底突起接触（图1F），而另一些则形成于从基底突起伸出的细长颈状分支末端（图1B和图S1G；视频S2）。我们还对成像窗口内未形成任何蝎形头的星形胶质细胞进行了成像（数据未展示）。相比之下，部分星形胶质细胞会同时形成并维持多个蝎形头（图S1G）。这些发现表明，蝎形头的形成并非一对一的过程，且具有高度的动态性和变异性。个体行为的这种变异性与整体形成的时间一致性，使我们提出假设：蝎形头的形成是对外在信号的响应。

RGC轴突浸润与视觉输入对蝎形头部的形成并非必需

Scyllate 头部的形成发生在视顶盖（OT）中，此时视网膜神经节细胞（RGCs）正与视顶盖神经元建立突触连接。因此，我们考虑了视觉和/或视网膜神经节细胞轴突浸润的可能性可能在蝎形头部的形成中发挥作用。为了确定视网膜神经节细胞轴突的存在（以及后续的视觉输入）是否影响蝎形头部的形成，我们使用了拉克里茨（lak）突变体斑马鱼。拉克突变体在无调性bHLH转录因子7（atoh7，也称为ath5）中存在错义突变，该转录因子对视网膜神经节细胞的分化至关重要。29,30 缺乏atoh7功能时，视网膜神经节细胞轴突无法发育或无法浸润视顶盖。因此，(lak ^{-1-}) 幼虫完全失明。我们在51至67小时受精后（hpf）对Tg(atoh7:mRFP);Tg(slc1a3b: myrGFP-P2A-H2AmCherry)幼虫进行成像，以捕捉视网膜神经节细胞轴突浸润和蝎形头部开始形成的阶段。在(lak ^{+/-})和(lak ^{+/+})幼虫中，我们观察到视网膜神经节细胞轴突支配视顶盖（图2A；视频S3）。在(lak ^{-1-})幼虫中，尽管视网膜中表达mRFP，但我们未在视顶盖中观察到视网膜神经节细胞轴突（图2A；视频S3）。尽管缺乏视网膜神经节细胞轴突浸润和视觉功能，我们仍在(lak ^{-1-})幼虫中观察到蝎形头部的形成（图2A；视频S3），且(lak ^{+/ ?})与(lak ^{-1-})同窝幼虫在蝎形头部的形态、形成时间或数量上均无差异（图2Aʹ和2B）。因此，尽管视网膜神经节细胞轴突浸润和蝎形头部形成发生在同一发育阶段，我们得出结论：视网膜神经节细胞轴突浸润和视觉输入对于蝎形头部的形成并非必需。

图2. 视网膜神经节细胞轴突向视顶盖的输入对于形成鸢头状头部并非必需时间以孵化后52小时（hpf）Tg(slc1a3b:myrGFP-P2A-H2AmCherry);Tg(ath5:mRFP);lakritz(lak)杂合（上图）和纯合（下图）幼虫延时成像的(A) 40微米投影图像开始后的小时:分钟（h:min）标注。星形胶质细胞（绿色膜、品红色核）和视网膜神经节细胞轴突（品红色）均被标记。箭头头指示新近形成的蝎形头。(A′) 插图显示带有蝎形头的10微米投影图像（箭头）。(B) 对(A)中63 hpf（虚线框）蝎形头数量的定量分析。在早期发育过程中，对(lak ^{+7})（蓝色，(n=)）和(lak)（橙色，(n=9)）幼虫的蝎形头数量进行成像。比例尺，20微米。参见视频S3。

蝎形头部包含死亡神经元的细胞体在我们的成像观察中，我们发现盾状头部最初常以杯状结构的形式出现，最终会完全闭合，这与专职吞噬细胞形成的吞噬杯非常相似。因此，我们假设盾状头部会包围环境中的某些物质，甚至可能将其吞噬。由于盾状头部大到足以容纳细胞体（图1D），我们将其他细胞视为潜在的内含物。在受精后60至72小时，视顶盖（OT）中的主要细胞类型包括少突胶质前体细胞、神经元和小胶质细胞。受精后60小时，神经元的程序性细胞死亡（PCD）大幅增加， 这与盾状头部开始形成的阶段一致，且以往研究表明星形胶质细胞以多种方式与神经元相互作用。因此，我们假设盾状头部包含神经元。为探究这一可能性，我们构建了转基因品系Tg(elavl3:H2BGCaMP6s)，其中elavl3阳性神经元表达定位于细胞核的钙指示剂GCaMP6s，当钙浓度升高时，荧光强度会增强。GCaMP6s荧光强度的变化使我们能够识别单个神经元细胞核。我们还使用Tg(slc1a3b:TagRFP-CAAX)标记了星形胶质细胞膜，并在受精后60至84小时进行了6小时或12小时的延时成像。有趣的是，我们观察到盾状头部通常包含明亮的神经元细胞核（87.0%±8.4%，图3A、3B及图S2A）。因此，我们得出结论：盾状头部包裹并包含视顶盖神经元胞体。

在这些延时成像中，许多囊状头部最初围绕着荧光信号微弱的GCaMP神经元，在成像过程中这些神经元位于囊状头部内时荧光信号最终变强（图S2B）。囊状头部内55%±26%的神经元在被包围后从标识(GCaMPdim)转变为标识(GCaMP ^{bright })，而其余45%±26%的神经元在已处于标识(GCaMP ^{bright })状态时就被囊状头部包围（标识(( n=6 fish))）。由于这种变异性，仅钙活性不太可能诱导囊状头部的形成。相反，这些标识(GCaMP bright)的神经元可能代表与细胞死亡相关的钙内流。我们还观察到囊状头部包围了在成像窗口期内发生收缩的神经元细胞核（图S2C）。我们推测这可能是核固缩或染色质浓缩现象，即细胞死亡过程中细胞核内容物发生浓缩的过程。在视顶盖发育过程中，神经元的标识(PCD 2,16)相关指标出现增加这与蝎形头部形成的时期同时发生（图1C）。因此，我们假设蝎形头部所支撑的神经元已经死亡或正在死亡。

为确认我们观察到的细胞核缩小确实是凋亡细胞的核固缩，我们用DNA标记染料吖啶橙（AO）对72小时受精后（hpf）的(Tg)（slc1a3b:TagRFP-CAAX）幼虫进行活体染色，并在处理后立即对其进行成像（图S2D）。吖啶橙会标记早期凋亡细胞中浓缩的DNA，表现为吖啶橙荧光明亮。40在这些幼虫中，我们观察到41.9%±16.9%的蝎形头部含有(AO+)内容（(n=12 fish) 图S2D-S2E）。这与我们观察到的(GCaMP+)神经元在被蝎形头部包围后发生核缩小的现象一致（图S2C），并表明蝎形头部可能会响应早期凋亡信号来包围细胞。总体而言，这些数据表明蝎形头部可以包含凋亡细胞，但并未证实所有蝎形头部内的细胞均处于死亡状态。

为了直接证明类蝎肽阳性的头部细胞围绕着即将死亡的神经元，我们以6到12小时的延时成像方式，对Tg(slc1a3b:TagRFP-CAAX);Et(s1101:Gal4);Tg(UAS:secA5-YFP)斑马鱼幼虫在60至84小时胚胎发育阶段（hpf）进行了成像。s1101增强子捕获品系可标记大量神经元，其中包括60 hpf时的大部分视顶盖（OT）神经元41,42。该品系能驱动分泌型膜联蛋白V（secA5）的表达，这种蛋白会与暴露在细胞外膜上的磷脂酰丝氨酸（PS）结合死亡细胞，43 有效标记死亡或濒死的 s1101+ 神经元（secA5-YFP+）。在成像过程中，我们观察到蝎形头围绕着 secA5- (YFP+) 神经元胞体（图3C；视频S4）。在变为 secA5-YFP+ 的神经元中，75.7%±5.0% 的神经元在我们12小时的延时成像期间被蝎形头围绕（图3D）。这些数据表明，蝎形头会在大多数死亡神经元被清除前将其包围。

为了确定星形胶质细胞识别凋亡神经元的速度，我们量化了从神经元变为secA5-(-YFP+)到被蝎状突起头部接触的时间，我们将星形胶质细胞的杯状突起接触到其后续包裹的神经元的时刻定义为接触时间。通过成像观察，我们发现大多数情况下，神经元在变为secA5-YFP+后不到10分钟就被蝎状突起头部接触（47/94），且几乎所有情况（93/94）都在1小时内被接触（来自8条斑马鱼的(n=94)个事件；图3E和3F）。综上，这些数据表明蝎状突起头部能够高效且快速地包裹凋亡神经元。放射状星形胶质细胞在损伤后形成蝎形突起蝎形头的形成与发育性细胞死亡的发生相吻合，且在碎片清除完成后，蝎形头的数量急剧减少。因此，我们推测细胞死亡发生在这种生理窗口会导致形成扇形头，并构建了一个损伤范式来验证这一假设。

图3 蝎形头包围垂死神经元。(A)77 hpf Tg(slc1a3b:TagRFP-CAAX);Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s)幼虫中，围绕elavl3+神经元细胞核（品红色）的蝎形头（绿色，箭头）的20微米投影。插图显示对应蝎形头的1微米z平面。(B) 对60至84 hpf的Tg(slc1a3b:TagRFP-CAAX);Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s)幼虫延时成像中，含有(GCaMP bright)内容的蝎形头百分比的定量分析。(Average =87.0 % pm 8.4 %)。(n=6 fish) (F) 神经元磷脂丝氨酸暴露的时间定量分析 (C) 63 hpf Tg(slc1a3b:TagRFP-CAAX);Et(s1101:Gal4);Tg(UAS:secA5-YFP)幼虫中，围绕secA5阳性死亡神经元（品红色）的蝎形头（绿色，箭头）的20微米投影。(YFP+) (D) 对55至83 hpf的Tg(slc1a3b:TagRFP-CAAX);Et(s1101:Gal4);Tg(UAS:secA5-YFP)幼虫延时成像中，被蝎形头包围的死亡视顶盖神经元（secA5-YFP+）百分比的定量分析。(Average =75.7 % pm 5.0 %)、(n=15)条鱼。(E) 来自(Tg)(slc1a3b:TagRFP-CAAX);Et(s1101:Gal4);Tg(UAS:secA5-YFP)幼虫延时成像的10微米投影静态图，显示蝎形头（绿色，箭头）与secA5阳性神经元（品红色）的相互作用。(YFP+)从58 hpf开始，每10分钟拍摄一次图像。时间以成像开始后的小时:分钟表示 (G) 对54至83 hpf的Tg(slc1a3b:TagRFP-CAAX);Et(s1101:Gal4);Tg(UAS:secA5-YFP)幼虫延时成像中，从神经元磷脂丝氨酸暴露到蝎形头相互作用的时间定量分析。(n=94)个神经元，9条鱼。数据以平均值±标准差表示。比例尺为10微米。参见图S2和视频S4。

我们在受精后96-100小时开始对Tg(slc1a3b:TagRFP-CAAX);Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s)幼虫进行30分钟成像，此时细胞死亡的生理性波已清除，且扇形头结构的形成较为罕见（图1C）。随后我们使用飞秒脉冲激光进行空化损伤。当激光烧蚀使组织中的液体蒸发时，会产生空化气泡，形成的气泡会损伤周围组织并导致细胞死亡。之后我们又进行了1小时的成像。损伤后，空化损伤周围的神经元通常会持续表达明亮的GCaMP6s荧光，这与之前描述的扇形头靶标相似（图4A）。在大多数受损伤的幼虫中，星形胶质细胞突起迅速在空化损伤部位延伸（图4A；视频S5）。我们观察到星形胶质细胞突起围绕扇形头样区室中的(GCaMP bright)神经元（图4B）。我们统计了损伤前后延时成像中视顶盖（OT）内含有(GCaMP ^{bright })神经元的扇形头数量，然后计算出扇形头数量的变化（图4C）。我们发现损伤后扇形头数量显著增加（增加了5.5±2.7），远高于未损伤对照组的稳定数量（增加0.5±1.6）（每种条件下(n=8)条鱼，(p=0.0009)，图4C）。这些数据表明，损伤会诱导视顶盖的星形胶质细胞在神经元胞体周围形成扇形头。

图4. 星形胶质细胞在空化损伤后形成蝎形头部。(A)96小时胚胎（hpf）时接受空化损伤（十字准线标记）的Tg(slc1a3b:TagRFP-CAAX);Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s)幼虫延时摄影的20微米投影静态图像，显示星形胶质细胞（绿色）对损伤产生反应，以及神经元细胞核（品红色）周围的翼状头部。(B) 来自(A)的单Z平面图像，分别为损伤前（−00:10）、损伤后（+00:00）和恢复后（+01:00）。翼状头部由箭头头标记。(C) 损伤组和对照组（未损伤）幼虫在损伤前后翼状头部的定量分析。损伤组幼虫翼状头部数量的平均变化为+5.5±2.7，显著高于对照组的+0.5±1.6（Welch t检验，每个条件(p=0.0009)和(n=8)条鱼）。时间以96 hpf损伤后的小时:分钟表示。数据以平均值±标准差表示。(^{* *} rho<0.001)。比例尺，20微米。参见视频S5。

蝎形头极少表现出吞噬体特征

我们的数据表明，蝎形头会对垂死的神经元做出反应并包围它们。因此，我们试图探究其在神经元的吞噬性清除中的作用。在多项研究中，吞噬性吞噬被定义为碎片内化到细胞体中。在60至84小时受精后（hpf）的Tg(slc1a3b: TagRFP-CAAX);Et(s1101:Gal4);Tg(UAS:secA5-YFP)幼虫的延时成像中，我们追踪了被蝎形头包围的secA5-(YFP+)神经元细胞体。当secA5-(YFP+)碎片与星形胶质细胞体接触且未被蝎形头形成边界包围时，我们将蝎形头内的内容物定义为“已内化”（图5A）。我们发现，蝎形头内仅有4.8%±5.9%的神经元碎片被转运至星形胶质细胞体并完成内化（(n=15 fish) 图5B）。大多数蝎形头仍与细胞体保持一定距离。

胞葬作用的另一个方面是通过吞噬溶酶体途径降解内容。为了确定噬藻体头部是否沿吞噬溶酶体途径转运，我们构建了Tg（slc1a3b:mCherry-2xFYVE）转基因品系。该品系驱动星形胶质细胞表达带有两个FYVE结构域的mCherry，这些结构域可与磷脂酰肌醇3-磷酸（PI(3)P）结合，PI(3)P是一种早期内体磷脂，通过融合事件转移至吞噬溶酶体。我们对75至87小时受精后（hpf）的Tg(slc1a3b:myrEGFP);Tg(slc1a3b: mCherry-2xFYVE)幼虫进行成像，并检测噬藻体头部是否被mCherry-2xFYVE标记。在这些研究中，仅有一小部分噬藻体头部呈mCherry-2xFYVE阳性（16.4% ± 12.6%，(n=20) 条鱼，图5C和图5D）。

降解的另一个特征是吞噬溶酶体的酸化。为了确定蝎石藻头部是否发生酸化，我们在54或72小时受精后（hpf）处理了Tg(slc1a3b:TagRFP-CAAX);Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s)或Tg(slc1a3b:myrGFP-P2A-H2AmCherry)斑马鱼幼体使用10微摩尔的LysoTracker深红色染料（一种用于标记溶酶体和吞噬溶酶体的pH指示剂）处理1小时，随后对其进行6或12小时的成像。与我们的PI(3)P实验数据一致，我们观察到仅有17.7%±7.2%的scyllate头部呈现LysoTracker阳性（(n=12 fish)，图5E和图5F）。综上，这些实验数据表明scyllate头部虽具备形成吞噬溶酶体特征的能力，但极少出现该情况。

图5. 盾形头部可在保留神经元胞体的同时酸化，但这种情况极少发生由于星形胶质细胞可以吞噬神经突和其他神经元小碎片，26,50 我们推测 LysoTracker 阳性的蝎形突起头部可能围绕着更易降解的非胞体碎片。与该假设相反，在我们对经 LysoTracker 处理的 Tg(slc1a3b:TagRFP-CAAX);Tg(elavl3:H2BGCaMP6s) 幼虫进行的延时成像中，所有变为 LysoTracker 阳性的蝎形突起头部均包含(GCaMP+) 细胞核（来自3条鱼的7个蝎形突起头部，图5G）。我们得出结论，蝎形突起头部在包裹神经元胞体时能够发生酸化。

为了更好地理解酸化的蝎形头部的动态变化和最终状态，我们进一步分析了延时成像数据。大多数酸化的蝎形头部在远离细胞体的状态下保持酸性（图5E）。在这些酸化的蝎形头部中，仅有少数（来自12条鱼的54个蝎形头部中有9个）移动至星形胶质细胞胞体并被内化。平均而言，蝎形头部在被观察到形成后的113±97分钟内呈现LysoTracker阳性，酸化时间范围为0至490分钟（来自12条鱼的(n=54)个蝎形头部，图5H）。此外，我们还观察到了持续时间较长的未酸化蝎形头部，最长可达690分钟（图5I）。这表明酸化过程不一定取决于蝎形头部内含物的保留时间。平均来看，在同一条鱼中，LysoTracker阳性蝎形头部（((n=54))）的总持续时间为279±146分钟，而LysoTracker阴性蝎形头部（((n=226))）的总持续时间为134±105分钟（图5I）。此外，在延时成像结束时，酸化蝎形头部的占比高于未酸化蝎形头部（分别为48%和18%，对应来自12条鱼的(n=54)个和266个蝎形头部）。总体而言，在我们的延时成像中，酸化蝎形头部的持续时间更长、消散频率更低，这表明蝎形头部无法有效降解内含物，且通常不会通过该机制发生消散。

小胶质细胞与蝎形头相互作用并清除其内容物

我们观察到尾头细胞很少呈酸性、极少被内化，且通常以“爆裂”或“塌陷”的方式消散，因此我们试图进一步探究其结局关于镰刀状头部及其内容物。根据现有文献，大多数中枢神经系统发育过程中的胞葬作用由小胶质细胞完成。 在受精后60小时镰刀状头部大量形成时，仅有相对少量的小胶质细胞浸润了视顶盖。因此，我们试图探究在这一发育窗口期，小胶质细胞和星形胶质细胞是否以及如何在碎片清除过程中发生相互作用。

小胶质细胞在应对细胞碎片时具有极强的运动性，因此为捕捉小胶质细胞的动态变化，我们以110秒为时间步长，对Tg(slc1a3b:myrGFPP2A-H2AmCherry);Tg(mfap4:mTurquoise)斑马鱼幼虫在77至79小时受精后（hpf）阶段进行了成像。在我们的延时摄影中，观察到小胶质细胞与scyllate头部发生相互作用的多个实例。在展示的代表性延时影像中，一个小胶质细胞突起接触到一个scyllate头部，随后进入该头部并在其内部形成自身的吞噬腔室（图6A和图6A′）。之后小胶质细胞突起发生回缩，scyllate头部也随之迅速消散。我们推测小胶质细胞会清除scyllate头部内的物质，进而导致scyllate头部消散。

为了直接观察小胶质细胞从蝎状头部清除神经元碎片，我们使用 Tg(slc1a3b:TagRFP-CAAX);Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s);Tg(mfap4:mTurquoise) 斑马鱼幼虫同时标记星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元。我们在受精后73至78小时对幼虫进行2小时的延时成像，时间步长为90至120秒。在这些延时成像中，我们观察到神经元从蝎状头部转移到小胶质细胞的现象，我们将其称为“转移事件”。在展示的代表性延时成像中，一个小胶质细胞与含有表达GCaMP神经元的蝎状头部接触（图6B）。随后，该小胶质细胞侵入蝎状头部，并用自身的膜突起包裹该神经元。接着，小胶质细胞撤离蝎状头部并将神经元一同带走。在此转移过程中，蝎状头部迅速消散（图6B）。视频S6展示的另一个代表性转移事件遵循类似过程。平均而言，在2小时的延时成像期间，我们每条斑马鱼观察到3.6±1.1次转移事件(( n=5 fish))。我们对胶质细胞间碎片转移事件的观察得到了近期一项斑马鱼视网膜研究的支持，该研究发现被穆勒胶质细胞吞噬的死细胞通常会被转移到小胶质细胞中降解。

为了表征我们观察到的转移事件，我们在整个延时成像过程中追踪了小胶质细胞接触的单个蝎形头（图6C）。从蝎形头形成到小胶质细胞首次接触该蝎形头的时间（我们称之为小胶质细胞结合）差异很大，时间范围为0至146分钟，涉及(|median =21 ~min)、(average =35 pm)这两个样本。39分钟，(n=18)（来自5条鱼的scyllate头部）。在大多数情况下，从小胶质细胞接触到神经元被吞噬以及随后scyllate头部消散的时间很短((median =6 ~min)、(average =14 pm 19 ~min))，但有几个显著例外（图6C）。在我们的延时成像中追踪并观察到消散的19个scyllate头部中，有18个是在小胶质细胞浸润并清除神经元内容物后消散的。综合这些结果，我们得出结论，大多数scyllate头部会在小胶质细胞侵入并清除其内容物后消散。

图6. 小胶质细胞与蝎形头相互作用以清除内容物并进行降解。(A)单z平面延时成像截图，显示74 hpf时Tg(slc1a3b:TagRFP-CAAX); Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s);Tg(mfap4:mTurquoise)幼虫中，小胶质突起（白色）侵入蝎形头（绿色，箭头头）的过程。(A′) 为(A)中虚线框的放大图，展示了分离的通道。(B) 80 hpf开始的Tg(slc1a3b:TagRFP-CAAX);Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s); Tg(mfap4:mTurquoise)幼虫中，蝎形头-小胶质转移事件的10微米投影延时成像截图。彩色框对应放大图。放大图分别展示：(i) 持有神经元的蝎形头、(ii) 小胶质侵入蝎形头并包围神经元、(iii) 小胶质从消散的蝎形头中移除神经元的等轴测视图。(C) 神经元细胞核从蝎形头转移至小胶质细胞，以及蝎形头形成到消散的代表性转移事件的时间轨迹。轨迹来自76至81 hpf期间Tg(slc1a3b:myrGFP-P2A-H2AmCherry); Tg(elavl3:H2B-GcaMP6s);Tg(mfap4:mTurquoise)幼虫2小时延时成像的测量结果。共(n=18)次转移事件，涉及5条斑马鱼。成像开始后的时间以小时:分钟:秒(A)或小时:分钟(B)标注，详见视频S6。比例尺为10微米。

我们进一步研究了转移事件后剑状突起头部消散的方式。在成像过程中，小胶质细胞腔室似乎在剑状突起头部内部形成，且仅包围其中所含的神经元碎片，而非围绕整个剑状突起头部形成（图6A′和6Bii）。转移的神经元被移除后，我们未在包含该神经元的小胶质细胞腔室内观察到剑状突起头部碎片（图6Biii）。我们注意到，在对单个星形胶质细胞的延时成像中，正在消散的剑状突起头部似乎发生破裂，并被重吸收至基底突起中（图1F；视频S2）。若该延时成像中的剑状突起头部是被小胶质细胞修剪的，我们本应能观察到剑状突起头部碎片脱落并远离基底突起，但实际并未观察到这一现象。我们的研究数据与以下假说一致：小胶质细胞侵入剑状突起头部以清除其内部物质，而非对整个剑状突起头部结构进行修剪。

有趣的是，在我们对 55–84 小时受精后（hpf）的 Tg(slc1a3b:myrGFP-P2A-H2AmCherry);Tg(mfap4:mTurquoise) 品系斑马鱼进行的 6–12 小时延时拍摄中在用LysoTracker处理的幼虫中，我们未观察到小胶质细胞与LysoTracker阳性蝎状头之间存在任何转移事件。这与我们的观察结果一致，即在延时成像过程中，酸化的蝎状头持续时间更长且消散频率更低（图5H和图5I）。然而，这些延时成像的时间分辨率以及蝎状头酸化事件的罕见性，限制了我们对这些事件进行检测的能力。未来还需进一步研究来确定小胶质细胞是否会与酸化的蝎状头发生相互作用。综合这些结果，我们得出结论：大多数蝎状头会与小胶质细胞接触，小胶质细胞会侵入蝎状头并清除神经元碎片以进行最终降解，最终导致蝎状头的消散。这些数据揭示了在发育过程中，视上核星形胶质细胞与小胶质细胞在清除死亡神经元过程中存在协同作用。

小胶质细胞耗竭会导致棘突头存在时间更长

我们提出假设：小胶质细胞会清除星形胶质细胞中无法被有效降解的物质，且这种转移过程对于水螅头部的消散和死细胞的清除具有重要作用。基于这一假设，我们预测小胶质细胞的缺失会导致水螅头部的存在时间延长。因此，我们旨在耗尽小胶质细胞，并观察其对水螅头部持续时间的影响。

为了耗竭小胶质细胞，我们采用了硝基还原酶-罗硝唑（NTR-RDZ）消融系统，在该系统中，用罗硝唑（RDZ）处理斑马鱼，该药物单独使用不会导致细胞死亡，但与驱动硝基还原酶（NTR）表达的转基因品系结合使用时，会诱导细胞死亡。我们处理了Tg(slc1a3b:TagRFP-CAAX);Tg（mpeg1：Gal4）；Tg（UAS：YFP-NTR2.0）幼虫与100μM RDZ 24小时之前和整个成像，导致mpeg1+细胞枯竭（图7A）。Mpeg1是巨噬细胞和小胶质细胞的标记，因此我们将RDZ处理的条件称为“小胶质细胞枯竭”。然后，我们在小胶质细胞枯竭后对RDZ处理和未处理的幼虫进行75至87 hpf的成像，并跟踪单个scyllate头以确定其持续时间。在小胶质细胞枯竭的幼虫中，平均scyllate头持续时间明显长于未处理的幼虫（RDZ处理的幼虫为286±91分钟，对照幼虫为135±27分钟，每个条件(n=11)鱼，(p=0.0002)图7B）。此外，持续时间的分布在对照和小胶质细胞枯竭的条件之间显着不同，揭示了种群向更长持续时间的转变（图7C）。我们的数据表明小胶质细胞是重要的scyllate头耗散和当小胶质细胞耗尽，scyllate头继续保持其内容这是符合我们的假设，小胶质细胞和星形胶质细胞合作清除神经碎片在OT发展。

图7.小胶质细胞的消耗导致scyllate头部耗散和计时的缺陷为了确定NTR-RDZ系统无炎症的长时间小胶质细胞枯竭的影响，我们利用了csf1ra突变斑马鱼。Csf1r（集落刺激因子1受体）是小胶质细胞增殖和迁移到中枢神经系统所必需的，55与csf1ra是斑马鱼早期发育阶段的主要paralog。55,56我们成像(csf1ra)Tg（slc1a3b：myrGFP-P2A-H2AmCherry）；Tg（mfap4：mTurquoise）幼虫及其杂合或野生型((csf 1 ra^{+/ 2}))兄弟姐妹在6至12小时的时间推移，并创建了56至108 hpf的OT中存在的scyllate头数量的时间线（图7D-7F）。我们观察到在所有基因型中从56到64 hpf的scyllate头的初始出现没有显著差异（图7F）。然而，从76 hpf开始，(csf1ra ^{-1-})幼虫与它们的(csf1ra ^{+/ ?})兄弟姐妹相比有明显更多的scyllate头（图7E和7F）。此外，在(csf1ra ^{+/ ?})幼虫中，100 hpf时存在很少的scyllate头（图7F）。然而，在(csf1ra)幼虫中，scyllate头的数量仍然很高（图7E和7F）。这与Casano等人的结论一致，即死细胞在72 hpf后积累在小胶质细胞枯竭幼虫的OT中。16

为了验证这一假设，我们如上所述用LysoTracker处理幼虫，发现(csf1ra)幼虫与76岁之间的(csf1ra ^{+/ ?})兄弟姐妹相比，LysoTracker+scyllate头没有显著增加和84 hpf（图7G）。我们还发现，100至108 hpf之间的(csf1ra)幼虫中LysoTracker scyllate头的比例与75至87 hpf之间的(csf1ra ^{+/ 2})兄弟姐妹中的比例没有显著差异（数据未显示）。这表明当小胶质细胞受损时，星形胶质细胞不会显著增加其吞噬能力，尽管存在于发育的后期阶段。

最后，我们假设scyllate头持续时间更长，因为它们未能在不与小胶质细胞发生交易事件的情况下消散。因此，我们计算了(csf1ra ^{-1-})幼虫与(csf1ra ^{+/ ?})兄弟姐妹在75至87 hpf的时间流逝中的scyllate头持续时间。出乎意料的是，虽然持续时间平均anddistributionobservedin(csf1ra ^{-1-})larvaewerecomparableRDZ处理的幼虫（图7B、7C、7H-7I），但我们发现(csf1ra ^{-1-})幼虫与(csf1ra ^{+/ ?})兄弟姐妹（图S3B和S3C）相比，scyllate头持续时间无显著增加。我们注意到，与我们之前的控制持续时间结果（图1E）相比，(csf1ra ^{+/ ?})幼虫的平均持续时间增加，持续时间分布偏移（图S3B）。Oosterhof等人报告说，(csf1ra)幼虫与(csf1ra ^{+/+})和(csf1ra ^{-1-})幼虫相比，具有5 dpf的OT小胶质细胞的中间数量。55因此，我们按(csf 1 ra^{+/+})和(csf1ra)基因型对我们的数据进行了排序。当我们以这种方式分析我们的数据时，我们观察到(csf1ra ^{+/+})的持续时间分布与(csf1ra)和(csf1ra ^{-1-})兄弟姐妹相比有显著差异，但与(csf1ra ^{+/-})和(csf1ra)兄弟姐妹相比没有显著差异（图7I）。基因型的平均持续时间没有显著差异，但随着csf1ra突变体拷贝数的增加，持续时间趋于更长（图7H）。值得注意的是，(csf1ra)幼虫在以后的时间点没有升高的scyllate头数，因此任何潜在的表型似乎都可以通过100 hpf解决，不像在(csf1ra ^{-1-})幼虫。

总体而言，我们的数据显示，小胶质细胞缺失幼虫中的镰刀状头部无法及时消散，也无法显著增强自身的吞噬能力。这导致镰刀状头部在视叶（OT）中积累，并持续超出镰刀状头部活动的生理窗口期。

讨论

本研究借助(in)体内延时成像技术发现，在斑马鱼视顶盖发育过程中，放射状星形胶质细胞会在神经元程序性细胞死亡波期对凋亡神经元做出集体响应，它们会围绕并包裹神经元胞体，形成我们称之为“蝎状结构”的特化结构。头部，揭示了视神经束（OT）中一种此前未被描述过的发育现象。我们发现，镰状头部通常会与小胶质细胞接触，进而导致镰状头部的内容物被转移到小胶质细胞中。我们的研究表明，在应对视神经束发育过程中神经元细胞死亡的反应时，星形胶质细胞会主动参与并与小胶质细胞协同作用。

OT放射状星形胶质细胞作为“第一响应者”

先前的研究将星形胶质细胞和类星形胶质细胞描述为非专业吞噬细胞，在小胶质细胞缺失的情况下，它们会增强吞噬能力以进行部分补偿。在稳态下，小鼠星形胶质细胞会修剪突触50并吞噬死亡神经元的神经突碎片。 然而，在稳态条件下类星形胶质细胞是否参与全细胞清除仍不明确。在本研究中，我们观察到即使存在小胶质细胞，OT 星形胶质细胞也能在生理发育过程中识别并包围神经元胞体。我们偶尔观察到凋亡小体酸化并/或被星形胶质细胞胞体内化，这表明 OT 星形胶质细胞能够吞噬神经元胞体。不过，尽管对大多数死亡神经元做出了反应，大多数凋亡小体并未最终降解其内容物，这让我们好奇星形胶质细胞为何会对神经元死亡产生如此强烈的反应。

大多数关于胞葬作用的研究都聚焦于能最终降解凋亡细胞的细胞。这种研究方法对于识别非专业吞噬细胞在稳态细胞清除中的作用，可能存在一定的局限性。例如，有一项关于非专业吞噬作用的研究简要描述了小鼠BHK细胞在体外通过形成“细长突起”并“移动凋亡细胞”来包围凋亡细胞。这一描述类似于蝎形头部结构。然而，该研究直到数小时后细胞被内化，才将BHK细胞视为“具有吞噬能力的细胞”，也未对这种吞噬前行为进行详细阐述。随着我们对细胞清除参与机制的认知不断拓展，本研究及其他研究逐渐将非专业吞噬细胞视为细胞死亡的第一响应者，而非仅在专业吞噬细胞失效后才做出反应的旁观者。

在此，我们提出视顶盖（OT）星形胶质细胞会形成蝎形头作为中间隔室来容纳神经元，直至小胶质细胞将其清除。这种中间隔室的作用，尤其是像蝎形头这样具有动态性且可能代谢成本高昂的隔室，其存在的意义仍未得到解答。我们推测，在视顶盖发育的这一阶段，蝎形头数量众多且持续时间长，是因为此时存在的小胶质细胞无法有效清除大量正在发生程序性细胞死亡（PCD）的神经元。由于放射状星形胶质细胞突起贯穿视顶盖，它们与神经元距离很近，因此能够迅速对神经元死亡做出反应。蝎形头的形成在受精后4天（4 dpf）后减少，原因可能是能够有效清除数量减少的凋亡神经元的小胶质细胞增多了。如果死细胞未被有效清除，它们会开始分泌促炎和细胞毒性信号。尤其是神经元，若未得到及时处理，可能会发生兴奋性毒性损伤，进而导致继发性细胞死亡。因此，我们假设蝎形头的形成是为了隔离即将死亡的神经元，在小胶质细胞清除并降解细胞碎片之前，防止死细胞损伤附近的健康神经元。

除了清除碎片外，星形胶质细胞参与细胞清除还可能带来其他益处。小鼠乳腺作为非专业吞噬细胞的上皮细胞吞噬凋亡细胞后会分泌抗炎细胞因子转化生长因子β（TGF-β），而体外实验中星形胶质细胞的吞噬作用会导致促炎细胞因子分泌减少。星形胶质细胞可影响小胶质细胞的活性，例如通过钙信号活动，或是在阿尔茨海默病小鼠模型中通过分泌C3实现。因此，凋亡细胞被包裹于蝎形头结构内这一过程，有可能通过星形胶质细胞引发类似效应。此外，蝎形头结构的形成与程序性细胞死亡（PCD）增强同步发生，而小胶质细胞向视顶盖（OT）的浸润程度取决于该时间点的细胞死亡数量，故蝎形头结构可能对小胶质细胞的浸润起到促进作用。

对本研究数据的另一种解读是，蝎形头结构的包裹过程可能如吞噬性细胞死亡（phagoptosis）中那样，参与了细胞凋亡的启动或进展。我们的研究数据显示，大多数蝎形头结构内的内容物处于暴露磷脂酰丝氨酸（PS，secA5-YFP阳性）但尚未发生染色质浓缩（AO阳性）的阶段，这表明蝎形头结构可能对凋亡细胞甚至凋亡前体细胞的早期信号产生反应。星形胶质细胞的吞噬性细胞死亡此前已有相关研究报道，但在本研究的背景下仍需进一步探究。

本研究证实蝎形头结构的形成是对损伤的应激反应，但未来仍需开展针对性研究，通过靶向干预原本健康的神经元，明确细胞死亡与星形胶质细胞反应之间的关联。此外，还需开展研究以阐明蝎形头结构是否能保护邻近神经元、具体的保护机制，以及其缺失是否会导致神经活动异常、细胞死亡和炎症加剧，或是引起小胶质细胞活性改变。为解答这些问题，该领域需进一步探索蝎形头结构的形成机制，并开发出能够特异性调控该结构、同时不损害视顶盖和星形胶质细胞功能的研究工具。

放射状星形胶质细胞的细胞碎片向小胶质细胞的转移

近日，针对星形胶质细胞与小胶质细胞之间相互作用的研究揭示了这两种细胞类型间的密切交流。在小鼠和恒河猴的发育大脑中，小胶质细胞会紧密接触并监测放射状胶质细胞的投射，不过这种相互作用的目的尚不明确。63,64 在小鼠下丘脑内，星形胶质细胞和小胶质细胞会通过分工清除神经元碎片的类型来协同清除被消融的神经元，其中星形胶质细胞主要吞噬神经突碎片。

在本研究中，我们利用斑马鱼体内延时成像技术，探究了视顶盖星形胶质细胞棘状头与小胶质细胞之间的相互作用。我们发现，在发育过程中凋亡细胞的清除阶段，视顶盖放射状星形胶质细胞与小胶质细胞会协同作用，将神经元碎片从棘状头转移至小胶质细胞的吞噬体。据我们所知，仅有另一项研究发现了非专职吞噬细胞与专职吞噬细胞之间存在类似的碎片转移现象。在该研究中，Morales 等人观察到在发育中的斑马鱼视网膜凋亡波期间，凋亡碎片从米勒胶质细胞转移至小胶质细胞。在我们的研究中，我们证实这种转移事件也发生在斑马鱼视顶盖中，且并非米勒胶质细胞与小胶质细胞之间相互作用所特有。我们的成像研究进一步阐明了转移事件中涉及的细胞相互作用，例如棘状头与小胶质细胞的初始接触以及后续蝎状突起头部的“开放”状态，以及所涉及的特定类型碎片（例如神经元细胞体）。我们的高速成像研究显示，蝎状突起头部会被小胶质细胞浸润，而非如 Morales 等人所述的那样与其内含物一同被修剪，这表明小胶质细胞-蝎状突起头部的转移过程具有高度协调性，且可能需要复杂的细胞间通讯。鉴于在大脑和视网膜这两种不同的生理环境中均存在类似现象，我们推测在发育过程中的细胞清除阶段，专职吞噬细胞与非专职吞噬细胞之间的转移事件可能是一种普遍现象。

专业吞噬细胞与非专业吞噬细胞的协作模型

基于我们的观察，我们提出了一种在视神经束（OT）发育过程中体内胞葬作用的模型：星形胶质细胞最初会在一个临时的膜性容纳结构（我们称之为“蝎形头”）中包围发生凋亡的神经元靶细胞。蝎形头偶尔会发生降解转化，最终由星形胶质细胞完成对神经元的胞葬作用。然而在大多数情况下，小胶质细胞会接触、侵入蝎形头并从中移除内容物，以供其最终降解。蝎形头的动态变化与小胶质细胞的活性密切相关，耗竭小胶质细胞会导致蝎形头的存在时间延长。结合我们在中枢神经系统其他区域对蝎形头的观察，以及在斑马鱼米勒胶质细胞46和小鼠幼仓鼠肾细胞8等其他非专业吞噬细胞中的研究发现，我们推测，这种由非专业吞噬细胞先对凋亡细胞进行初步分隔、随后将其转移给专业吞噬细胞的过程，可能适用于其他生物学场景。

为了更好地理解星形胶质细胞在细胞清除中的作用，未来需要开展研究并开发相关工具，以明确参与蝎形头部形成、靶标识别以及与小胶质细胞相互作用的细胞机制。可能参与蝎形头部靶标识别的已知星形胶质细胞吞噬受体包括Mertk/Axl和MEGF10。 作为细胞体周围的中间区室，蝎形头部所利用的受体和信号可能与吞噬突触和神经突的星形胶质细胞吞噬体不同。小胶质细胞拥有多种吞噬受体，能够对损伤后诱导的瞬时ATP和钙梯度产生反应。有研究表明，小胶质细胞会暂时包围高活性的神经元以调节其活性。 尽管星形胶质细胞不一定对与小胶质细胞相同的信号作出反应，但蝎形头部的靶标通常会出现钙水平升高的情况，损伤后也会出现这一现象。这种与钙活性的潜在关联有待进一步研究。更为复杂的是蝎形头部与小胶质细胞突起之间的细胞间通讯，包括小胶质细胞如何在蝎形头部内找到并清除凋亡碎片。我们观察到转移事件动态存在差异，例如小胶质细胞与蝎形头部的接触时间延长，这表明二者之间存在复杂的相互作用。最后，许多研究致力于探究是什么信号促使非专业吞噬细胞主动吞噬并降解碎片。Parnaik等人认为这一转变具有时间依赖性，而Magnus等人则认为取决于碎片的数量，但这种变化究竟发生在凋亡细胞还是非专业吞噬细胞中，仍有待探究。这一问题仍存在争议。我们的研究结果表明，蝎状头部酸化并非完全依赖于蝎状头部的作用时长。然而，我们观察到星形胶质细胞发生终末降解的情况极为罕见，因此无法得出明确结论。此外，溶酶体追踪剂标记的蝎状头部并未因小胶质细胞的相互作用而消散。这可能意味着蝎状头部从中间储存区向酸化降解区发生了内在转变，从而阻止了与小胶质细胞的相互作用。我们的研究为探索非专职吞噬细胞在特定条件下如何从第一响应者转变为活跃的吞噬细胞，以及何种信号可能引发这一转变提供了方向。

本研究的局限性

在此，我们重点描述蝎形头部及其显著特征。这种宽泛的研究方法使得诸多细节未被深入探究。我们关注蝎形头部与神经元活动之间的关联。由于我们的GCaMP成像未针对荧光定量分析进行优化，因此在结论上保持了审慎态度。有必要开展另一项针对神经元活动的研究。尽管我们发现蝎形头部的形成与神经元死亡相关，且可由损伤诱导产生，但并未证实其由细胞死亡直接引发，对于二者间的这种关联仍有诸多疑问有待解答。关于我们的csf1ra数据，实验设计时并未预期会出现杂合表型。进一步分析发现，尽管样本量较小且结果无统计学意义，但拆分后的基因型数据与既往研究及我们自身的敲除数据更为一致。因此，我们纳入了这两组数据。希望我们的研究能为这些方向及其他相关领域的进一步探索提供启发。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。