题目：Retinoic Acid Organizes the Zebrafish Vagus Motor Topographic Map via Spatiotemporal Coordination of Hgf/Met Signaling

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32302545/

期刊：Developmental Cell

研究亮点

l 视黄酸信号的差异水平决定迷走运动轴突的靶标选择

l Hgf-Met 趋化信号是迷走神经运动轴突导向所必需的

l 视黄酸驱动hgf和met表达的前后向协同波状分布

l Hgf-Met信号的时机决定迷走运动轴突的靶标选择

摘要

神经环路的信息传递通常需要构建拓扑映射图，使神经元胞体位置与突触靶位位置相互对应。为探究拓扑映射图的发育调控机制，本文研究斑马鱼迷走神经运动轴突向咽弓靶向投射的分子机制。研究发现，视黄酸通过赋予迷走运动神经元前后轴身份特征，构建神经拓扑结构；HgfMet 趋化信号是迷走神经支配咽弓所必需的信号通路。本研究证实：视黄酸调控 Hgf/Met 信号的时空动态变化，使轴突靶向投射与咽弓的发育进程协同匹配；实验人为改变 Hgf/Met 信号的激活时间，即可重定向轴突投射、破坏拓扑映射图。本研究揭示了一类拓扑映射图发育机制：依靠对趋化信号的时空调控，引导轴突完成靶向投射。

图形摘要

引言

神经系统由复杂细胞网络构成，要实现信息精准传递，网络必须具备高度有序的组织结构。许多神经环路会形成拓扑映射图：神经元胞体的相对位置，与其轴突在靶组织中的相对位置一一对应。拓扑结构在信号传递过程中保留空间信息，保障信息传递连贯、准确、高效。拓扑映射图一旦紊乱，会破坏信号的整合与处理，最终造成行为异常。尽管绝大多数神经环路都存在拓扑排布，但多数环路的拓扑图形成机制尚不明确。

拓扑式神经支配的发生，始于发育阶段生长的轴突被引导至对应的靶区。主流理论为空间信号模型：轴突识别空间分布的吸引、排斥信号分子，完成靶向定位。视网膜拓扑映射图是该模型的经典案例：Ephrin 配体与 Eph 受体形成浓度梯度，视网膜轴突通过匹配最优 EphEphrin 信号状态，在上丘中选择正确靶位点。

然而视网膜轴突靶向完全依赖空间信号，部分系统中，发育时序对拓扑映射图的形成同样至关重要。例如小鼠嗅觉感觉神经元的拓扑映射，由轴突的依次投射决定。在上述及其他案例中，投射时序差异被归因于神经元的诞生时间。但尚不明确：不依赖神经元诞生时序，拓扑结构如何受时间调控；神经元与靶组织之间的分子信号交流，又如何随时间协同变化。

我们前期研究发现，发育时序在斑马鱼迷走神经的拓扑结构形成中发挥关键作用，该调控作用独立于神经元的诞生时间。迷走神经（第十对脑神经）接收来自咽、喉、心脏以及内脏的感觉信息，同时输出相应的运动神经与副交感神经支配，以此调控发声、吞咽、心率和消化。在斑马鱼体内，迷走运动神经元（mX 神经元）会在受精后 2436 小时（hpf）形成一个由数百个细胞组成的独立神经核团。这些神经元的轴突聚集成粗大神经束，先向前生长，随后转向腹侧伸入咽弓（PA）区域（图 1A）。该神经随后分出 5 个分支：其中 4 个分支支配第 4、5、6、7 号咽弓（4、5、6、7 分支）；还有 1 个分支向后延伸支配内脏，即内脏分支（图 1A）。在受精后 2860 小时之间，每一个 mX 神经元都会伸出轴突投射至其中某一个分支。鱼类与哺乳动物的迷走运动神经拓扑结构高度保守：位置更靠前的神经元支配更靠前的神经分支，位置靠后的神经元支配更靠后的分支（图 1B）。位于不同前后（A-P）位置的mX神经元会在不同时间伸出轴突并支配其靶标，且实验性改变单个轴突生长的时间足以覆盖空间信号并改变轴突的靶标选择。因此，mX神经元必须整合空间和时间信号以协调拓扑学上的轴突靶向。然而，我们尚不清楚这些信号的本质、它们在空间和时间上的动态变化规律，也不了解mX神经元与其靶标之间如何协同这些信号以精准指导靶向过程。

在此，我们研究了mX神经元内部以及mX神经元与调控拓扑轴突靶向的腭突（PAs）之间的细胞信号传导动态。我们发现，后脑后部的视黄酸（RA）信号传导通过向mX神经元提供前后轴（A-P）位置信息来指导轴突靶标选择。随后我们发现，Met受体及其配体肝细胞生长因子（Hgf）是趋化性信号传导系统指导mX轴突靶向的tem。我们描述了mX核中Met表达与PAs中Hgf表达的RA调控Aa` P波前匹配情况。通过实验操控Hgf/Met信号通路的时序，我们揭示了化学吸引的时空调控如何调控拓扑性轴突靶向。本研究确立了一种“时间匹配”机制，即神经元及其靶标在空间和时间上协调化学吸引信号的表达，从而实现拓扑图谱的形成。 

结果

PA形成与神经支配的时空动态特征

我们先前已确定神经支配时机在迷走神经拓扑图谱形成过程中发挥关键作用。为了为阐明指导时间依赖性靶向的机制，我们首先构建了表达TgBAC(tcf21:mcherry- (NTR) ^{od108 })（咽弓肌肉前体细胞标志物）和(Tg(isl1:EGFPcaax) ^{th474 })（有丝分裂后脑运动神经元标志物）的胚胎中4-7号咽弓（PAs）形成及其接受迷走神经下支（mX）神经元神经支配的发育时间线（图1C）。咽弓从后方tcf21+原基样结构域依次出现，时间如下：4号咽弓：27小时；5号咽弓：30小时；6号咽弓：35小时（受精后小时数，图1C、1D）。7号咽弓的形成时间无法确定，因其源自6号咽弓出现后原基的剩余部分。迷走神经下支轴突依次支配各咽弓，时间如下：4号咽弓：34小时；5号咽弓：41小时；6号咽弓：49小时；7号咽弓：54小时（受精后小时数，图1C、1D）。这些结果为解读本研究中报道的事件时间提供了时间线依据。

图1. 迷走神经分支发育的时空动态。（A）斑马鱼迷走神经结构。（A0）框选区域的放大视图，标注了五条神经分支。（B）迷走神经的拓扑结构。前部细胞（黄色和绿色）支配前部分支，更靠后的细胞（蓝色）支配后部分支。（C）咽弓4-7（PA4-7）形成与神经支配的时间序列。咽弓（品红色）从前到后依次形成，并由迷走神经运动核轴突（绿色）依次进行神经支配。数字代表咽弓；P代表原基；箭头代表轴突分支。（D）（C）中咽弓形成与神经支配时间的定量分析。数据以平均值±标准误（SEM）表示。(n=5-16) 个胚胎/咽弓。所有图像均为左侧朝向前方的侧面视图。比例尺为50微米。

视黄酸是迷走神经运动神经元前后轴身份的潜在调控因子

mX 核内神经元的前后轴（A-P）位置决定其支配的分支，这表明沿前后轴存在分子身份差异。此外，改变有丝分裂后 mX 神经元的前后轴位置足以改变其靶标选择，这说明沿前后轴存在诱导信号。目前尚不清楚调控 mX 神经元身份的信号以及这些信号如何控制轴突靶向。我们推测，解析前部和后部 mX 神经元之间的基因表达差异，将有助于揭示它们如何选择轴突靶标。为此，我们在 Tg(isl1:Kaede)ch103 胚胎中利用 Kaede 光转化技术，在轴突形成开始后不久的 28–30 小时胚胎（hpf）阶段分离前部和后部的 mX 神经元（图 2A），并对这些细胞群进行了 RNA 测序（RNAseq）。前部和后部 mX 神经元的转录组极为相似；然而，我们鉴定出多个在其中一个细胞群中富集的基因（图 2B）。为验证该方法的有效性，我们发现有一个基因在后部显著富集其鉴定出的富集基因为hoxb5a，我们已知该基因仅在后侧mX神经元中表达（图2C）。

我们的研究结果揭示了决定A-P迷走神经（mX）神经元身份的外在信号。在剔除在某一神经元群体中无表达的基因后，五个差异表达最显著的基因（图2B中标注）均与视黄酸（RA）信号通路相关。五个基因中的四个——hoxb1b、hoxb5a、hoxb6b和dhrs3b，均在后部富集——均为视黄酸的转录靶标，这表明后部迷走神经元所接触的视黄酸水平高于前部迷走神经元。五个基因中的两个——crabp1b（前部富集）和dhrs3b——被认为可减弱视黄酸信号通路。我们通过RNA原位杂交技术（ISH）验证了dhrs3b和crabp1b的差异表达（图2D和2E）。尽管这些单个基因是否影响迷走神经发育仍有待确定，但它们的差异表达提示视黄酸可能在地形定位中发挥作用。

视黄酸（RA）是一种形态发生素，主要通过对Hox基因的转录调控来控制胚胎的前后轴（A-P）模式建成。在体节中胚层中合成的视黄酸在后脑模式建成以及脊髓运动神经元的发育过程中发挥关键作用。尽管视黄酸在某些情况下于发育后期（斑马鱼中为受精后24小时之后）发挥作用，但其在后脑特化前后轴身份的能力被限制在发育早期的关键窗口期（斑马鱼中为受精后14小时之前）。因此，目前尚不清楚视黄酸是否能影响成熟迷走神经元的前后轴身份。为解答这一问题，我们首先利用视黄酸信号的直接报告基因系（((Tg(12xrare-ef1a:EGFP) ^{sk71 })）进行了可视化观察。与视黄酸参与特化迷走神经背侧运动核（mX）前后轴身份的功能一致，视黄酸反应元件绿色荧光蛋白（RARE:GFP）可在迷走神经核的后部检测到，而前部则无信号（图2F）。需注意的是，由于对视黄酸具有不同敏感性的情况下，单个视黄酸反应性基因可能具有位于视黄酸反应元件绿色荧光蛋白边界前方或后方的表达边界。

图2. 视黄酸是前-后轴迷走运动神经元身份的推定调控因子用于（B）中的RNA测序分析收集。（B）RNA测序数据的火山图，显示富集于前部（左侧）或后部（右侧）mX神经元的mRNA。虚线表示错误发现率（FDR）为10%（y轴）和1.5倍变化（x轴）的显著性阈值。蓝色和红色圆点：显著差异表达的基因。红色圆点：与视黄酸信号通路相关的基因。（C-E）在mX细胞核（棕色）中对（B）中鉴定的选定基因（紫色）进行RNA原位杂交。hoxb5a（C）和dhrs3b（D）mRNA后部富集。crabp1b（E）mRNA前部富集。（F）视黄酸反应性视黄酸反应元件（RARE）：绿色荧光蛋白（GFP）转基因（绿色）在后部mX神经元中表达，而在前部mX神经元中不表达（品红色）。所有图像均为侧视图，左侧为前方。比例尺，50微米。光转化的（品红色）mX细胞核区域（A）代表性的前部（A）和后部（A'）前部和后部mX神经元。（A和B）之间的差异基因表达 

视黄酸调控成熟迷走运动神经元的轴突靶标选择

我们提出假设，即视黄酸（RA）定义了后外侧迷走神经（mX）神经元身份的一个方面，该方面促进轴突向后侧分支靶向并/或阻止其向前侧分支靶向。因此，我们检测了改变视黄酸（RA）信号是否能改变mX轴突的靶标选择。我们首先在(cyp26a1 1^{nw716 })突变胚胎中检测了mX轴突的靶向情况，该胚胎存在视黄酸（RA）降解缺陷，因此会出现视黄酸（RA）信号的前侧扩张。我们通过两项互补实验验证这一假设：在此条件下，前侧神经元所经历的升高的视黄酸（RA）水平是否会使其轴突偏向更多的后侧分支。

首先，我们使用 Tg(isl1:Kaede)ch103 品系，对野生型胚胎以及 (cyp26a1 ^{rw716 }) 胚胎中支配 PA4 或 PA7 的轴突进行光转换；待光转换蛋白经逆向运输后，我们测定了这些轴突在 mX 核中支配神经元的位置（图3A）。正如预期，我们观察到突变体中 PA7 支配区域发生了显著的前移（图3A、3B）。我们还发现 PA4 支配区域出现了幅度更小但出乎意料的后移（图3A、3C）。因此，在突变体中，我们观察到 PA7 支配区域与 PA4 支配区域的重叠范围大幅增加（对照组为 22.9%，突变体为 74.7%）。cy (p26a1 1^{nw716 }) 也会使 mX 核略微缩短（图S1A）。

其次，我们开展了反向实验：对mX运动核最前端10%的区域进行光转化，待光转化蛋白完成顺向运输后，通过测量各分支中的红色荧光信号（以总荧光归一化），定量该蛋白在mX轴突中的分布（图S1B和S1B）。在这些实验条件下，光转化的mX神经元数量、光转化细胞比例以及光转化的核区比例均未出现差异（图S1D–S1F）。我们观察到PA4区域的归一化红色荧光有所下降，这表明(cyp26a1 1^{r w 716})突变体中，支配该分支的前端mX神经元比例有所降低；同时PA7区域的归一化红色荧光有所上升，这说明在这些突变体中，部分无法靶向PA4的前端mX神经元会被重定向至PA7（图S1C）。综合这些顺行和逆行标记实验结果可以证明，过量视黄酸（RA）的存在会导致拓扑图谱出现紊乱。

尽管上述实验表明视黄酸（RA）调控小鼠轴突（mX）的靶向定位，但(cyp26a1 ^{nw716 })突变体具有组成型特性这一方法无法让我们确定视黄酸（RA）信号的变化是作用于哪些组织，以及在哪个发育阶段发挥效应。因此，我们设计了一项实验，直接检测成熟mX神经元中改变RA信号是否足以自主影响轴突靶标选择。在该实验中，我们借助Tg(isl1: (Gal4) ^{ln 452}))驱动子，通过镶嵌表达上游激活序列（UAS）驱动的转基因，在单个或少数有丝分裂后mX神经元中操控RA信号转导。我们以这种方式表达了三种转基因构建体：（1）Tg(UAS-GFPcaax)，表达膜结合型绿色荧光蛋白（GFP）；（2）Tg(UAS:DN-hRARa-p2aGFPcaax)，同时表达显性负效视黄酸受体（DN-RAR）与膜结合型GFP；（3）Tg(UAS:CA-RARga-p2a-GFPcaax)，同时表达组成型活性视黄酸受体（CA-RAR）与膜结合型GFP。在斑马鱼中，DN-hRARa和CA-RARga转基因可分别细胞自主地降低和增强RA信号转导。RAR与GFPcaax基因通过p2a自切割肽连接在同一转录本上共表达，以确保GFP信号能准确反映RAR的表达情况。随后，我们通过量化每个GFP阳性细胞体在mX核内（以(Tgfisl1:mRFP))标记）的前后轴（A-P）位置，以及其轴突所支配的鳃弓分支，检测了这些转基因的靶向效应（图3D-3I）。该实验揭示了RA信号对mX轴突靶标选择具有显著的细胞自主调控作用。通过DN-hRARa降低信号转导，会使mX神经元投射到与其前后轴位置不匹配的更前位咽弓（图3F、3G）；反之，通过CA-RARga增强信号转导，则会使mX神经元投射到与其前后轴位置不匹配的更后位咽弓（图3H、3I）。这些数据证实，RA参与调控mX核内成熟神经元的轴突靶向决策，低RA水平促进前位靶标选择，高RA水平则促进后位靶标选择。

图3. 视黄酸控制迷走运动神经元的轴突靶标选择另见图S1。(A) 通过逆行标记确定的mX核的PA4和PA7神经支配区域。(A) 方法：在单个胚胎中勾勒出红色和绿色区域，叠加并平均所有轮廓，再叠加平均值以进行比较。(A0) 对照组和(cyp26a1 ^{nw716 })胚胎中PA4和PA7神经支配区域的单个轮廓叠加图。(A00) 平均轮廓叠加图。(cyp26a1 ^{rw716 })会导致mX核的PA4和PA7神经支配区域之间的分界消失（对照组重叠率为22.9%，(cyp26a1 1^{nw716 })胚胎重叠率为74.7%）。每个条件下的胚胎数为(n=12-14)。(B) (cyp26a1 ^{nw716 })胚胎中，PA4神经支配区域向后延伸得更远。(C) cyp26a1rw716胚胎中，PA7神经支配区域向前延伸得更远。(B和C) 数据为平均值±标准误。每个条件下的胚胎数为(n=12-14)。

视黄酸通过Hgf/Met信号通路调控mX化学吸引

视黄酸（RA）如何调控轴突靶标选择？轴突发生的时机由迷走神经运动核（mX）神经元的位置决定，而轴突发生延迟足以促使轴突向后侧靶向投射。因此，我们假设RA通过延迟轴突发生来促进轴突向后侧靶向投射。为验证这一假设，我们检测了经两种处理的胚胎中轴突向前侧和后侧发生的时机：一种是50纳摩尔浓度的RA，该浓度可在整个mX核内诱导高水平的RA信号传导（图S2A和S2B）；另一种是1毫摩尔浓度的RA合成抑制剂4-二乙氨基苯甲醛（DEAB），该试剂可降低整个mX核内的RA信号传导。细胞核（图S2C）。我们在受精后24小时（hpf）开始处理，此时迷走神经运动神经元大多已退出细胞分裂周期，以避免视黄酸（RA）信号通路紊乱对后脑模式形成产生早期不良影响。我们对Tg(isl1:Kae (de) ^{ch103 }))胚胎进行了活体成像，该胚胎的mX细胞核后半部分已被光转化，以此对比前部（绿色Kaede）和后部（红色Kaede）轴突的出现时间。尽管促进神经元分化的RA略微增加了运动神经元核内的神经元总数（图S2D–S2G），但我们意外地发现，RA和DEAB均对轴突发生的时间无任何影响（图4A及图S2H–S2J；视频S1）。

上述研究结果表明，视黄酸（RA）通过一种尚未明确的机制调控轴突的靶标选择。为了揭示这一机制，我们利用RNA测序（RNA-seq）技术筛选出那些在迷走神经运动神经元（mX神经元）中表达受RA调控的候选基因。我们从24小时受精后（hpf）开始，用二甲基亚砜（DMSO，对照组）或50纳摩尔浓度的RA处理(Tg(is/1:Kaede) ^{ch103 })胚胎，在38 hpf时解剖后脑后部（此时前部而非后部的mX轴突已开始支配其靶组织），并通过流式细胞术分离出绿色荧光蛋白Kaede阳性细胞，用于RNA测序。由于轴突靶向过程由趋化吸引和趋化排斥信号介导，我们对这类基因的筛选尤为关注。在经RA处理后表达发生显著变化的基因中（397个基因上调，364个基因下调），met基因的变化最为显著（表达下调3.1倍，错误发现率((F D R)=5.90 E-10))，图4B）。met基因在小鼠迷走运动神经元中表达，其编码的受体酪氨酸激酶是目前已知的肝细胞生长因子（Hgf）的唯一受体。Hgf是脊髓运动神经元的趋化吸引因子，也能吸引后脑外植体培养物中的颅运动神经元，但Hgf和Met在拓扑图谱形成或迷走神经发育过程中的作用尚未得到证实。我们首先检测了met和hgfa（斑马鱼中两个Hgf基因之一，hgfb不在咽弓（PAs）中表达，且似乎不调控mX轴突靶向[数据未展示]）的表达。在38 hpf时，met在mX核的前部表达（图4C）。为验证RNA测序结果，我们发现RA处理的胚胎中met表达区域显著向前端缩减，而DEAB处理的胚胎中该区域则明显向后端扩展（图4C–4E和4I）。相应地，hgfa在36 hpf时表达于咽弓4-7区（PA4和PA5）的前部（图4F）。hgfa的表达同样受RA调控：RA处理的胚胎中，hgfa的表达位点大幅前移，几乎完全从咽弓4-7区消失；而DEAB处理的胚胎中，其表达向后端扩展，覆盖整个咽弓4-7区，包括原基区域（图4F–4H和4J）。由此可见，RA分别协同抑制mX核和咽弓中met与hgfa的表达。

Hox5基因在尾部的mX神经元中表达，能够调控mX神经元的轴突靶向；我们推测它们可能通过介导视黄酸对met的抑制作用来实现这一功能。然而，我们构建了缺失所有在迷走区域表达的hox5基因的hoxa5afh510;hoxb5afh477;和(hoxb5b ^{m 478})突变胚胎，并未观察到对met表达的影响（图S2K–S2M）。

Met和Hgf是否介导mX轴突的化学趋化作用？为验证这一点，我们构建了met ((met ^{In533 } ))）和hgfa ((hafa ^{th528 })及(hafa ^{th529 })）的移码等位基因，并检测其对mX轴突靶向的影响。我们还检测了此前报道的met^s908低活性等位基因。在这些突变体中，尽管咽弓（PA）形成和mX神经元分化正常（图S3A、S3B；视频S2、S3），但咽弓的神经支配却受到严重破坏。我们观察到的表型严重程度不一；除(met ^{s 908})外，所有等位基因均出现最强表型，即咽弓和内脏的所有迷走神经运动神经支配完全缺失。在此类情况下，mX轴突向前延伸至听泡，但无法向腹侧转向咽弓（图4K-4M、S3C-S3E）。所有等位基因还偶尔表现出较轻的神经支配缺陷，即轴突在分支点处停滞时间延长（直至56小时后受精或更晚），但最终实现部分神经支配（图4N-4O、S3C、S3F、S3G）。在此类情况下，分支形成不完全——第4分支从未形成，第5、6、7分支有时也无法形成——且已形成的分支出现时间较晚，且通常比正常更细。这些结果表明，通过Met信号传导的Hgf是引导mX轴突至咽弓靶标的化学趋化因子。

图4. RA通过Hgf/Met信号控制mX化学吸引另见图S2和S3以及视频S1、S2和S3。(A) RA和DEAB处理不影响前部和后部mX神经元之间轴突发生时间的差异。数据以平均值±标准误表示。t检验：ns，无显著差异。每个条件下胚胎数：(n=15-35)。(B) RNA测序数据的火山图，显示与对照组相比，RA处理的胚胎mX神经元中被耗竭（左侧）或富集（右侧）的mRNA。虚线：错误发现率（FDR）为5%（y轴）和倍数变化为1.5（x轴）的显著性阈值。蓝点：显著差异表达的基因。红点：met基因。(C–E) 对照组(D)、RA处理组(E)和DEAB处理组(F)胚胎mX核（棕色）中met RNA的原位杂交（紫色）结果。(F–H) 对照组(F)、RA处理组(G)和DEAB处理组(H)胚胎咽弓（PAs，棕色）中hgfa RNA的原位杂交（紫色）结果。箭头头：咽弓中hgfa的表达。数字代表咽弓（Pas）；P代表原基。() 38小时胚胎受精后（hpf）met表达结构域的定量分析，如图(C-E)所示。数据以平均值+标准误表示。t检验：(cdots+p<0.0001)。每个条件下胚胎数：(n=11-33)。

hgfa与Met表达的时空协调调控迷走运动神经元轴突靶标选择

尽管mX轴突需要Hgf/Met信号才能正常支配咽弓（PAs），但目前尚不清楚它们是否以及如何指导构成地形组织基础的差异化靶向决策。一种假设是，Met和Hgf的空间梯度表达促进了差异化的靶标选择。然而，这与轴突发生的时间可在靶标选择中覆盖空间身份这一事实相矛盾（Barsh等人，2017年）。因此，我们认为地形轴突靶标选择可能源于沿前-后（A-P）轴化学吸引信号的时间差异，而非水平差异。为验证这一假设，我们通过原位杂交（ISH）观察了轴突靶向过程中Met和Hgfa的表达。Hgfa的表达从约30小时胚胎发育阶段（hpf）起从前向后在咽弓区域扩展，并在每个咽弓形成后不久出现在其中（图5A-5C和5G）。同样，最初仅在最前端的mX神经元中表达的Met，在32至48小时胚胎发育阶段之间向后扩展（图5D-5F和5H）。Hgf和Met表达区域的扩展与抑制性视黄酸（RA）信号区域的退缩相吻合，我们从24至32小时胚胎发育阶段hoxb5a表达的退缩中推断出这一点（图S4A-S4D）。Met和Hgf表达扩展相较于hoxb5a退缩的延迟，可能表明它们受视黄酸的调控不如hoxb5a直接，且需要其他因子的产生和/或降解。我们未能检测到视黄酸使用123RARE:GFP报告基因检测到的衰退情况，该报告基因对视黄酸（RA）的敏感性低于hoxb5a基因，因此从未在前迷走神经区域（图2F）或咽弓（图S4E）中表达。

图5. hgf与met表达的时空动态 参见补充图S4。(A–C) 32小时胚胎期（A）、38小时胚胎期（B）和48小时胚胎期（C）下的hgfa RNA原位杂交（紫色）实验，显示其在咽弓（棕色）中的时序性表达。箭头指示hgfa在咽弓的表达；数字标注咽弓；P代表原基。(D–F) 32小时胚胎期（D）、38小时胚胎期（E）和48小时胚胎期（F）下的met RNA原位杂交（紫色）实验，显示其在中轴核（棕色）中随时间从前到后的扩展。(G) 图(A-C)中所示的hgfa表达模式在不同时间点的出现频率。每个胚胎阶段对应(n=7-28)个胚胎。(H) 图(D-F)中所示的met表达区域大小随时间的量化分析。数据以平均值±标准误表示。t检验结果：(^{* * *} p<0.0001)、("p <0.005)，ns表示无显著差异。每个胚胎阶段对应(n=15-26)个胚胎。所有图像均为左侧朝前的侧面观。比例尺为50微米。

上述研究结果表明，迷走运动核中Hgf/Met信号通路的作用域受时间调控，并为拓扑靶向的调控机制提出了一种模型，我们将其称为“时间匹配”。咽弓中hgfa表达的依次启动与其神经支配的先后顺序相关，这表明hgfa表达的作用是建立不同的发育窗口期，每个咽弓在此期间均可吸引迷走神经运动背核（mX）的轴突。同样，mX核中met表达域的扩展则决定了每个神经元具备响应Hgf能力的特定发育时间点。因此，最早表达met的mX神经元（最前端的神经元）会与最早表达hgfa的咽弓（咽弓4）相匹配。随着Hgf和Met的表达波峰依次在各自组织中扩散，更靠后的神经元会依次与更靠后的咽弓匹配，最终实现迷走神经的依次神经支配，进而形成迷走神经的拓扑结构。我们推测，视黄酸（RA）信号通过协同调控这两个表达波峰的启动时间，来控制轴突的靶标选择。

为验证时间匹配假说，我们检测了该模型提出的两个关键预测。首先，该模型预测过早激活Hgf/Met信号通路将推动咽弓后部的早期神经支配。我们的DEAB处理恰好创造了这样的条件（图4E和图4H）。正如预期的那样，在该条件下38小时受精后（hpf），轴突异常延伸至所有tcf21:mcherry+阳性的咽部区域，包括咽弓原基（图6A和图6B）。我们还观察到该条件下咽弓5-7（PA5–7）的发育存在缺陷（图6B）。其次，该模型预测延迟Hgf/Met信号通路会导致前部颌下神经（mX）神经元的轴突向更靠后的分支移位，且这种后移的程度与延迟时长成正比。我们使用克唑替尼（Crizotinib）延迟Met信号转导，克唑替尼是一种可逆的Met激酶活性小分子抑制剂。从24hpf开始的克唑替尼处理稳定重现了弱表型突变体(met ^{th533 })和(hgfa ^{th528 })的表型：颌下神经轴突在分支点处停滞时间延长，且咽弓神经支配不完全（图6C–6E）。然而，与突变体不同的是，通过洗脱药物可快速恢复Met的功能，这使我们能够控制信号通路的启动时间。我们在两个时间点洗脱药物——38hpf（咽弓5神经支配的正常起始时间）和48hpf（咽弓6神经支配的正常起始时间），随后在72hpf评估迷走神经的结构。延迟Met信号转导导致前部咽弓分支进行性丢失。较短的延迟（持续至受精后38小时）会阻止咽弓4分支的形成，而较长的延迟（持续至受精后48小时）还会频繁阻止咽弓5分支的形成（图6E至6I）；这些表型均弱于我们不洗脱药物时的情况（图6E）。

克唑替尼处理后前侧mX分支的消失，可能是因为前侧mX神经元无法支配任何咽弓（PAs），也可能是它们转向了更靠后的咽弓，后一种情况与时间匹配模型的一致性更高。对最前端10%的mX神经元进行光转化的顺行轴突标记显示，这些神经元确实会转向下一个最前端的可用分支：38小时清洗组的咽弓5（PA5）或48小时清洗组的咽弓6（PA6）（图6F-6I）。同样，对48小时清洗组中支配咽弓6（PA6）的mX神经元进行逆行标记发现，支配咽弓6（PA6）的区域向前移位，涵盖了通常会支配咽弓4（PA4）的大部分区域（图6J和6K）。这些结果表明，调控Hgf/Met信号通路的时间足以决定mX轴突的靶标选择，并证实了我们的模型：mX轴突的靶标选择是通过协调mX细胞核中met表达与咽弓中hgfa表达的时空动态来实现的，从而建立了迷走神经的拓扑神经支配模式（图7）。

图6. hgfa与met表达的时空协调控制迷走运动轴突靶标选择（A和B）对照组（A）和DEAB处理组（B）中38小时受精后（hpf）迷走神经的神经支配模式。箭头：异常向前部咽弓（PA）区域（包括原基）发出的早熟神经分支。数字：咽弓（PAs）。P：原基。（C和D）对照组（C）和克唑替尼处理组（D）胚胎中的mX神经结构。在52小时胚胎（hpf）时，克唑替尼处理组胚胎中的mX轴突在背侧选择点停滞（箭头所示）（D）。在72小时胚胎（hpf）时，部分mX轴突脱离并支配后部咽弓（D00）。数字：被支配的咽弓。（E）在（C、D 以及 G–I）中呈现的所观察到的神经支配模式频率。克唑替尼治疗时间越长，前肢分支的缺失程度越严重。每个条件下有 (n=11-17) 个胚胎。（F–I）延迟的Met信号转导导致前部mX轴突靶标选择出现时间依赖性的后移。数字代表体节（PAs）。（F）用于（L-N）中顺行标记的代表性前mX神经元光转化实验（G）对照组胚胎中的mX分支。前部mX神经元主要以PA4为靶标。（H）24至38小时受精后用克唑替尼处理的胚胎中的mX神经分支。PA4分支缺失，前部mX神经元主要靶向PA5。（I）在24至48小时胚胎阶段经克唑替尼处理后的mX神经分支。PA4和PA5神经分支缺失，且前部mX神经元主要以PA6为靶标。（J）对照组胚胎中支配PA4和PA6的区域，以及在crizotinib处理的胚胎中最前端分支位于PA6的区域。（J00）叠加的单个轮廓。（J00）叠加的平均轮廓。在crizotinib处理的胚胎中，原本支配PA4的区域转而支配PA6（与对照组PA6区域的重叠度为47.8%，与crizotinib处理组PA6区域的重叠度为89.2%）。(n=12-22) 胚胎/处理组。（K）克唑替尼处理的胚胎中，PA6 神经支配区域向前移位。数据表示为平均值±标准误。t 检验 (cdots+p<0.0001)。每个条件下有 (n=12-14) 个胚胎。所有图像均为侧视图，左侧为前方。比例尺为 50 微米。

图 7. 迷走运动轴突靶向投射的时间匹配模型早期支配阶段（左图）：最靠前的咽弓（PA4、PA5）已经形成。大范围、来源于后部的视黄酸（RA）信号域，会抑制除最前端咽弓之外所有咽弓的hgf表达，同时抑制除最前端神经元之外所有神经元的met表达，由此实现前部神经元与前部咽弓的配对匹配。后期（右图）：更多靠后的咽弓发育形成，起抑制作用的视黄酸信号域向后消退。于是，hgf在更靠后的 6 号咽弓（PA6）中被激活，met在位置更靠后的神经元中被激活，使这些后部神经元与 PA6 形成配对匹配。

讨论

轴突导向的经典化学亲和模型认为，神经元与其靶标之间的空间差异信号指导轴突生长。该模型虽能充分解释部分系统中的拓扑图谱发育（如视网膜拓扑图谱），但在某些情况下，仅靠空间信号不足以指导必要的靶向决策。本研究提出了一种整合空间和时间信号动态的轴突靶向“时间匹配”机制。我们首先报道了mX分支形成的前后时间模式，随后发现视黄酸（RA）信号在后侧mX神经元中活跃，而在前侧mX神经元中不活跃，且该信号能促进后侧轴突靶向。接着，我们发现肝细胞生长因子（Hgf）及其受体Met构成了趋化信号通路，可指导mX轴突靶向。最后，我们揭示RA可协同调控hgf和met表达的时空动态，从而指导轴突的拓扑靶向决策。

我们发现了视黄酸（RA）信号通路在迷走神经下核（mX）轴突靶向定位中的关键作用。视黄酸是早后脑菱节前后轴（A-P）模式形成的公认调控因子，后续还参与脊髓运动神经元亚型的特化。也有研究提出视黄酸可为嗅觉和视网膜拓扑图谱的拓扑轴突靶向定位提供位置信息。在这些情况下，视黄酸被认为以稳定的形态发生原梯度形式发挥作用，在不同信号水平下建立不同的细胞身份。而视黄酸在迷走神经下核中的作用则截然不同——它并非以形态发生原梯度的形式发挥作用，而是逐渐减弱的视黄酸信号充当了一个确定前沿，在此前沿之后的迷走神经下核神经元才能对腭帆张肌（PA）来源的化学引诱剂做出反应。这些发现凸显了在推断发育过程中信号功能时，不仅要考虑空间特性，还需重视时间特性的重要性。

这项研究也代表了我们对Hgf/Met信号传导发育作用的理解取得的重要进展。Hgf/Met是最早被鉴定出的轴突化学引诱剂之一。自其被发现以来，其他几种主要轴突导向信号的详细发育机制已被阐明，而我们对Hgf/Met如何调节轴突靶向的理解却相对进展甚微。这可能部分是因为在Hgf/Met研究最为深入的肢体中，它具有多种连续的功能，包括参与肌肉前体细胞向肢体的迁移，以及运动神经元的特化、吸引和存活。mX神经元的特化或存活并不需要Hgf/Met，尽管有研究报道在小鼠中，咽弓来源的肌肉祖细胞迁移形成食管肌肉存在这一需求，但在我们研究的阶段，并未在斑马鱼hgfa或met突变体中观察到咽弓后部肌肉祖细胞的任何异常。因此，我们得以专门研究其在运动轴突导向中的功能，并且发现Hgf/Met信号传导的精确发育调控在引导迷走运动轴突的拓扑靶向过程中发挥着关键且直接的作用。

顶叶mX神经形成的一个关键特征是前部PAs的神经支配早于后部PAs。在此，我们提出时机Hgf/Met信号传导是造成这一延迟的原因，并表明延迟信号传导足以将轴突转移至更后部咽弓。我们此前也有报道称，后部迷走神经运动核神经元的轴突发生比前部迷走神经运动核神经元晚数小时，且这一过程不依赖肝细胞生长因子/间质上皮转化因子（本研究）。这一现象也可能导致必要的神经支配延迟；为支持这一观点，我们已证实延迟轴突发生足以引导轴突朝向更靠后的咽弓生长。因此，有两个事件——肝细胞生长因子/间质上皮转化因子信号的启动与轴突形成的起始——受到独立调控，共同控制迷走神经运动核神经元轴突的靶向投射。为何会存在这种看似冗余的调控机制？或许二者均为实现后部靶向所需的完整延迟所必需，但单独其一又不足以达成这一目标。事实上，咽弓4与咽弓7的神经支配在时间上相差20小时，这一差值大于轴突发生的前后时间差，也大于间质上皮转化因子表达的时间差。此外，仅延迟轴突发生或仅延迟肝细胞生长因子/间质上皮转化因子信号传导（本研究），都无法完全破坏迷走神经的拓扑结构。因此，这两种机制可能共同作用，实现迷走神经中时间上的精准匹配。

我们的研究结果为未来的研究提出了几个问题。（1）视黄酸（RA）如何抑制met和hgfa的表达？视黄酸通常被认为能激活转录，但也能直接抑制基因表达。如果它通过诱导抑制因子间接作用于met和hgfa，那么该基因很可能会出现在我们经视黄酸处理的RNA测序数据集中的视黄酸上调转录本中。（2）抑制met和hgf的视黄酸（RA）来源是什么？体节旁中胚层产生的视黄酸是早期胚胎中视黄酸的主要来源，它可能同时影响后脑（met）和咽弓（hgfa）。然而，视黄酸生物合成酶aldh1a2也在咽弓原基中表达，这使得met和hgfa被来自不同来源的视黄酸抑制的可能性增加。（3）是什么决定了咽弓的神经支配窗口期？hgfa表达的启动决定了每个咽弓神经支配开始的时间，但目前尚不清楚是什么导致轴突停止对一个咽弓的神经支配，转而支配其后方的咽弓。在其他情境中，轴突之间的竞争会随着时间推移导致靶标选择发生转变，例如通过神经支配诱导产生一种化学排斥因子；然而，我们在克唑替尼（Crizotinib）实验中未能对前部咽弓进行神经支配，这表明咽弓靶标之间的切换与神经支配无关。尽管hgfa在咽弓中不会随时间下调，但所需加工因子的下调或排斥性/抑制性信号的延迟表达可能会导致轴突切换靶标。或者，驱动咽弓持续发生的形态发生过程相对于大脑位于前方（视频S2和S3）可能会使后方的垂体腺随着时间推移更容易被触及。

发育生物学中的一个重大挑战是，如何在有限的分子工具库下，于狭小空间内精准构建出多样且复杂的结构。这一挑战在神经系统中尤为突出，复杂的神经支配模式形成过程中，需要各类模式化信号通过嘈杂的胚胎环境进行传递。发育复杂性的诸多创新都建立在信号复杂性提升的基础之上——即沿着更多胚胎轴、以更高空间分辨率解读更多样化和组合化信号的能力。大多数拓扑映射事件也正是在这一背景下被解读的。本研究表明，沿时间轴的信息传递对于产生拓扑轴突靶向所需的信号复杂性也至关重要，这也凸显了发育时间作为提升信号分辨率的额外维度的重要性。在其他情境中，结合空间与时间信息以构建神经系统复杂性的重要性也显而易见。例如，神经前体细胞中的时间转录因子级联反应能够产生比仅靠空间线索更多样的细胞类型。同样，神经元诞生时间的差异也能指导不同的轴突靶向决策。然而，据我们所知，迷走神经是目前已知唯一一种独立于细胞诞生时间的时间依赖性轴突靶向机制实例。尽管时间信号动态相较于空间信号动态更难识别和研究，但时间轴很可能是神经系统乃至整个胚胎组织构建中一个主要且被低估的影响因素。

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