标题：A hydraulic feedback loop between mesendoderm cell migration and interstitial fluid relocalization promotes embryonic axis formation in zebrafish

期刊：Developmental Cell

原文链接： https://doi.org/10.1016/j.devcel.2023.02.016

摘要

胚胎细胞间隙液（IF）的积聚被认为对胚胎的模式形成和形态发生具有重要作用。本研究发现了细胞迁移与间隙液重新定位之间存在正向机械反馈环路，并证实该环路能够促进斑马鱼原肠胚形成过程中胚胎轴的形成。研究表明，前轴中胚层内胚层（脊索前板[ppl]）细胞会在卵黄细胞与深层细胞组织之间移动以延伸胚胎轴，它们会挤压上方的深层细胞层，从而使间隙液从深层细胞层流向卵黄细胞与深层细胞层之间的边界，且该流动方向直接位于脊索前板推进方向的前方。而这种间隙液的重新定位又会通过为脊索前板细胞的移动开辟空间，进而促进其突起的形成与迁移，同时也增强了脊索前板通过挤压上方深层细胞层来触发间隙液重新定位的能力。由此可见，胚胎轴的形成依赖于细胞迁移与间隙液重新定位之间的流体力学反馈环路。

图文摘要

引言

组织间隙液（IF）在胚胎早期组织中普遍存在积聚现象。在小鼠等部分物种中，这些积聚物最终会融合形成一个较大的中央腔隙，囊胚腔，在囊胚期，而在其他时期，如斑马鱼斑马鱼中，它们仍以微小的组织间隙分布在整个区域胚胎 间隙液积聚在胚胎发生过程中的功能这一过程才刚刚被阐明。最近在小鼠身上开展的研究表明，囊胚层内数百个微米级腔隙之间的长距离液体交换，会形成一个单一的优势腔隙——即正在形成的囊胚腔，并且这一过程对于胚胎最初的对称性打破至关重要。此外，在小鼠体内，由腔压力增加驱动的囊胚腔扩张被认为可促进构成囊胚壁的滋养层细胞之间的连接成熟囊胚腔，从而帮助滋养层细胞维持囊胚腔内增加的囊胚腔内部的压力。

小鼠囊胚腔也被认为可作为形态发生信号的来源，对周围细胞的细胞命运特化产生影响。成纤维细胞生长因子4（FGF4）释放到小鼠囊胚腔中，会影响内细胞团中上胚层向原始内胚层的谱系分化。在囊胚发育过程中，通过促进面向囊胚腔的内细胞团细胞向内胚层分化，从而增加细胞质量。同样，将骨形态发生蛋白（BMP）沉积到原羊膜腔——小鼠早期胚胎中形成的另一个大型充满液体的腔室——中，再加上其通过狭窄的间质通道扩散，在小鼠早期胚胎内形成稳定的BMP信号梯度过程中发挥着关键作用。

尽管这些研究结果表明中间丝（IF）的聚集及其融合成充满液体的大腔室在胚胎模式形成和分化中发挥着重要作用，但关于中间丝聚集体是否以及如何在胚胎形态发生过程中发挥作用，目前的了解还相对较少。原肠胚形成过程中，胚胎内会形成外胚层、中胚层和内胚层等不同胚层，这一过程通常伴随着中间丝聚集体特征性的大规模重组。中间丝聚集体的这些动态变化很可能对胚层形成至关重要，例如对鸡和海胆原肠胚形成的研究就证明了这一点——在这些研究中，囊胚腔似乎充当了单个中胚层细胞迁入的通道，从而促进了胚胎的分层。化。此外，在青蛙原肠胚形成过程中，囊胚腔内的静水压静压促进纤维连接素基质组装囊胚腔顶壁，构成中胚层迁移的底物。在青蛙原肠胚形成的后续阶段，第二个充满液体的腔——原肠腔出现，它通过积聚细胞间液（IF），同时以缩小囊胚腔为代价。细胞间液在这两个腔之间的重新分布，与囊胚腔顶部内陷的头部中胚层发生会聚运动相吻合，进而促使该组织变得致密且僵硬变硬，这一过程对神经嵴细胞的迁移至关重要。然而，尽管这些不同的研究结果提示了间质液（IF）积累在原肠胚形成过程中调控细胞迁移的潜在作用，但支持这一功能的直接证据仍然十分有限。

在斑马鱼中，早期囊胚阶段的中间纤维广泛分布于胚胎内部的深层细胞中然而，与其他脊椎动物不同，这些动物4有趣的是，最近的研究表明，缺乏卵黄细胞的培养斑马鱼胚芽胚外植体能够形成胚芽胚，这表明胚芽胚与卵黄细胞的结合干扰了胚芽胚的形成胚胎内的形成。然而，是否IF积累TES，及其动态再分布，在斑马鱼原肠胚形成中发挥任何作用仍然未知。

结果

IF重新定位与轴向中胚层内化和迁移一致

为了研究IF积累在斑马鱼原肠胚形成过程中的潜在作用，我们首先系统地确定了IF在这一时期的分布是如何变化的。在原肠胚前阶段（受精后4-6小时[hpf]），IF定位逐渐从最初均匀分布的DC之间充满液体的间隙转变为IF在胚芽表面包膜层（EVL）和下面的DC之间的边界处的优先积累（以下命名为“EVL-DC边界”；3.5-6 hpf；图S1A-S1D）。随后，IF从EVL-DC边界时空高度协调地重新定位到DC和下面的卵黄合胞层（YSL）之间的边界（以下命名为“YSL-DC边界”；6-8 hpf；图S1A-S1D）。值得注意的是，这种重新定位首先在胚芽/胚芽环变得明显当中胚层祖细胞开始在那里内化时的边缘（6 hpf，图1A-1B0；视频S1），然后从边缘扩散到胚层的动物极，伴随着中胚层祖细胞的动物极定向迁移（图1C和1C0；视频S1）。

为了测试IF从EVL-DC到YSL-DC边界的重新定位，以及伴随的内化和中胚层祖细胞的动物定向迁移之间是否存在相关性，我们分析了这些不同事件在时空上协调的程度。在YSL-DC边界的IF积累在空间和时间上与IF从EVL-DC边界消失和中胚层祖细胞沿YSL-DC边界向动物极迁移的外观密切相关（图1A-1C0；视频S1）。重要的是，这种高度编排的IF重新定位在原肠胚的背侧最明显（图1A-1C0；视频S1），其中一个紧凑的前轴向中胚层（前弦板[ppl]）祖细胞簇，紧随其后的是高度内聚的后轴向中胚层祖细胞，内化并以直线路径向动物极迁移。相比之下，在原肠胚的外侧和腹侧区域，中胚层祖细胞内化并迁移为更松散聚集的细胞，18 IF的重新定位不太明显（图S1E和S1E0）。此外，在胚皮重新定位期间分析胚皮内IF的总量并未显示IF体积的任何重大变化（图S1F-S1G0），这表明这种重新定位代表了胚皮内IF的重新分布，而不是YSL-DC边界的从头积累。集体，这些研究结果指出的可能性可能有重新定位的IF从EVL-DC到YSL-DC边界与内在化和动物定向迁移的ppl祖细胞在原肠胚形成的开始之间的功能联系。

图1.间质积液需要Na+/K+-ATP酶活性，并在轴向中胚层内化和迁移期间重新定位

细胞外渗透压控制胚芽内IF积累的量

为了解决在YSL-DC边界上的IF积累对ppl祖细胞迁移的功能相关性，我们试图干扰胚芽内的整体IF积累，并分析这如何影响ppl细胞迁移。在早期卵裂阶段（32细胞至64细胞阶段，图S2A–S2B0），中间丝（IF）在胚盘内的首次积累开始显现，此时卵裂方向发生改变，胚盘表面的细胞会沿其顶基轴发生极化（图S2C）。表面细胞的极化与中间丝（IF）的积累，伴随着Na⁺/K⁺-ATP酶的限制性定位酶，是其他生物中中间丝积累的关键调节因子指向表层细胞的基底外侧侧（图S2C0），这表明Na+/K+-ATP酶可能参与了囊胚层内IF的积累。为验证这一可能性，我们在IF形成开始时，通过将胚胎在1至3小时胚胎发育阶段（hpf）暴露于1毫摩尔的特异性(Na^{+} / K^{+}) -ATP酶抑制剂哇巴因1,5，瞬时阻断(Na^{+} / K^{+}) -ATP酶的活性（图1D）。从对照胚胎中IF形成开始的64至128细胞阶段（图S2D）到原肠胚形成结束（图S2J和S2K），经处理的胚胎在囊胚层内的IF积累均显著减少。IF积累的这种减少伴随着囊胚层细胞的暂时性肿胀（图S2E），但该肿胀在原肠胚运动开始前恢复正常（图S2F和S2G）。哇巴因处理的胚胎中IF积累的减少呈现出与对照胚胎相同的动态重新定位整体模式，首先定位于外层细胞层（EVL）与深层细胞（DCs）的边界，随后从该边界转移至卵黄合胞体层（YSL）与深层细胞（DCs）的边界，不过在受影响严重的胚胎中，这一过程往往几乎难以识别（图1E–1F0、S2J和S2K；视频S2）。这表明哇巴因处理主要干扰IF的积累本身，而不一定干扰其在囊胚层内重新定位的调控过程。

为了确定 (Na^{+} / K^{+}) 型 ATP 酶是否像在其他生物体中那样通过调节细胞内到细胞外的渗透压来参与中间丝（IF）的聚集， 我们在受精后3.5小时（hpf）向哇巴因处理过的胚胎的细胞外空间注射甘露醇（每枚胚胎36.4纳克），以提高细胞外渗透压。甘露醇注射部分恢复了哇巴因处理胚胎中中间丝的整体聚集，从而恢复了其特征性聚集在原肠胚形成之前（图1G-1H0、图S2L和图S2M；视频S2）。这表明哇巴因通过改变细胞外与细胞内的渗透压比值，抑制了中间丝在囊胚层中的积累。一致的是，向3.5小时受精后对照胚胎的细胞外空间注射甘露醇，使中间丝的总量高于对照胚胎的常规水平，但并未消除对照胚胎中观察到的中间丝重新定位的整体模式，仅在甘露醇注射胚胎中出现了少量中间丝过早定位于卵黄合胞体层-背侧中心边界的情况（图1I-1J0、图S2N和图S2O；视频S2）。综上，这些研究结果表明，调节细胞外渗透压是调控早期囊胚和原肠胚阶段胚胎中间丝积累量的有效手段。

中间纤维的聚集对于前体节细胞突起的形成和迁移是必需的

我们能够调控囊胚层内中间丝（IF）的积累后，接下来探究在向前推进的原条前体细胞前方的中间丝（IF）积累是否是其向原肠胚动物极迁移所必需的。从受精后1小时至3小时（hpf）短暂暴露于1 mM哇巴因以阻断囊胚层内中间丝（IF）积累的胚胎，在胚盾形成的位置出现了显著的背侧胚环增厚现象（图2A至2C及2C''；视频S2），而胚顶形成和外包运动则表现正常（图S3A及S3A'）。胚环/胚盾的这种局部增厚，是因为内吞的原条前体细胞无法从胚环边缘迁移开，最终在内吞发生的边缘处堆积所致（图2C、2C'及图S2P；视频S2）。与此相符的是，对哇巴因处理胚胎中的原条前体细胞进行追踪发现，与未处理的对照组胚胎相比，内吞的原条前体细胞向动物极的迁移运动速度更慢（图2D至2D''；视频S2）。相比之下，哇巴因处理胚胎中原条前体细胞的内吞运动未表现出任何可明确检测到的异常（图S3B及S3B'）。为验证原条前体细胞迁移失败是否由哇巴因阻断所导致在原始外胚层中中间丝（IF）积累的情况下，我们通过在哇巴因处理的胚胎的细胞外空间注射甘露醇，部分恢复了中间丝的积累。甘露醇注射不仅有效恢复了前移的前体前体（ppl）祖细胞前方的中间丝积累（图1G–1H0；视频S2），还恢复了它们从生殖环边缘向动物极的迁移（图2C–2C00；视频S2）。相比之下，在未处理的对照胚胎中通过注射甘露醇使原始外胚层内的中间丝积累量高于对照水平，对生殖环形态或前体前体祖细胞的迁移没有可识别的影响（图2C–2C00；视频S2）。最后，为了强化中间丝积累与前体前体细胞迁移之间的功能关联，我们试图通过哇巴因以外的药物阻断钠/(K^{+})-ATP酶的活性，来干扰原始外胚层内的中间丝积累，进而确定中间丝积累的这种减少是否也会导致前体前体细胞迁移的缺陷。我们发现用10毫摩尔浓度的洋地黄毒苷（一种Na⁺/K⁺-ATP酶活性的特异性抑制剂²²）处理胚胎，不仅显著减少了IF的积累，还削弱了向动物极方向迁移的原植物样细胞（ppl细胞）迁移行为（图S3F–S3J），从而在表型上高度模拟哇巴因处理后观察到的效应。综合来看，这些研究结果表明，内化的原植物样细胞前方的IF积累具有促进作用，助力原植物样细胞向动物极方向迁移。

图2. 间质液积聚对于索前板细胞迁移是必需的

为了理解为何在前行的原前体细胞前方积累细胞间黏附分子（IF）对于正常的原前体细胞迁移是必需的，我们分析了哇巴因处理组与对照组胚胎中原前体细胞的形态和运动。细胞内吞后，原条前缘的细胞以卵黄合胞体层（YSL）为迁移底物，向动物极迁移，并形成多种细胞突起，包括片状伪足、丝状伪足和泡状突起，这些突起通过钙黏蛋白-1（Cdh1）介导的方式黏附于卵黄合胞体层细胞间黏附（图3D和3F）。相比之下，YSL-DC边界处的细胞外基质积累仅在原肠胚形成的后期阶段才可检测到，因此不太可能直接参与原条前体细胞（ppl）的细胞迁移。原条前体细胞（ppl）的突起形成与内化的原条前体细胞（ppl）前方的中间丝（IF）积累密切相关（图3D-3G），而在哇巴因处理的胚胎中，由于胚层内中间丝（IF）积累被阻断，原条前体细胞（ppl）的突起形成显著减少（图3D-3G）。为了验证哇巴因处理的胚胎中原条前体细胞（ppl）突起形成减少是否是由于哇巴因阻断了中间丝（IF）的积累，而非哇巴因对原条前体细胞（ppl）迁移和/或突起形成产生的其他潜在更直接的影响，我们将诱导的前轴中胚层细胞接种在纤连蛋白包被的基质上，并分析哇巴因是否会影响突起驱动的中胚层细胞铺展。处理组与对照组细胞的铺展能力未检测到显著差异（图S3C-S3D），这表明哇巴因不会直接干扰前轴中胚层细胞的突起形成和铺展。最后，为了排除哇巴因处理通过影响原条前体细胞（ppl）的命运特化来干扰其迁移，我们分析了原条前体细胞（ppl）命运特化的特征标记基因——孵化腺基因（hgg）25在哇巴因处理组和对照组胚胎中的表达情况。哇巴因处理组胚胎中hgg的表达基本未发生改变（图S3E），说明哇巴因不会通过干扰原条前体细胞（ppl）的命运特化来影响其迁移。综上，这些结果表明，向前迁移的原条前体细胞（ppl）前方的中间丝（IF）积累通过促进细胞突起形成，助力原条前体细胞（ppl）的迁移。

图3. 高效的组织间隙液重定位需要轴中胚层的内吞作用边界（矢状面）；比例尺，100微米。（B0、C0、E0、F0、H0和I0）MZoep突变体中沿动物-植物（AV）轴的组织液（IF）分布图谱（B0和C0）；虚线蓝色轮廓显示EVL-DC边界处的组织液，虚线粉色轮廓显示YSL-DC边界处的组织液（S，矢状面）；虚线白色轮廓显示前体中胚层（ppl），由于该转基因报告基因存在渗漏特性，此处也标注出后轴中胚层（pam）；（A）受精后6小时（hpf，野生型[WT]胚胎前体中胚层[ppl]内化开始时）MZoep;gsc::caax-EGFP胚胎中组织液（IF）分布示意图；D为背面观，S为矢状面；EVL为外包层，DC为深层细胞，YSL为卵黄合胞体层。（B、C、E、F、H和I）6 hpf（B、E和H）和8 hpf（C、F和I）时MZoep（B和C）、cyc morphant（MO，4纳克）（E和F）以及slb/wnt11f2（H和I）gsc::caax-EGFP胚胎的最大强度投影（D，背面观）和单横截面（S，矢状面）；对照胚胎见图1B和1C；虚线橙色轮廓标注ppl/pam的位置，对应6 hpf（B0、E0和H0）和8 hpf（C'、F'和I'）时gsc::caax-EGFP的表达；多色曲线代表(n=3)个独立胚胎重复实验中ppl/pam位置（黑线）以及EVL-DC（蓝线）和YSL-DC（粉线）边界处组织液分布的平均值。（D）对照胚胎（绿色，n=5）、(n=4))胚胎和cyc MO胚胎（黄色，df1a038d-5253-4d03-b823-7a09387813e7）中组织液重新定位与前体中胚层厚度的相关性，显示皮尔逊相关系数（r）。（G）野生型（绿色，(n=10)）和slb/wnt11f2胚胎（粉色，(n=11)）中，随着发育时间（6 hpf对应0）的推移，前体中胚层移植前缘与胚环边缘的距离；均值±标准误。n为独立胚胎重复次数。另见图S4。

中间丝的重新定位依赖于原始条纹前体细胞的迁移

接下来，我们探究了中间丝（IF）的重新定位不仅能促进原肠前体细胞（ppl）的细胞迁移，原肠前体细胞的迁移是否也会反过来影响中间丝的重新定位。为验证这一假设，我们检测了当原肠前体细胞的内吞作用和动物极定向迁移受到抑制时，中间丝是否会发生重新定位。为此，我们首先研究了母源-合子型单眼突变胚胎（MZoep），该胚胎在中内胚层特化和胚层形成方面存在缺陷。在MZoep突变体中，中间丝主要停留在表皮层（EVL）与深层细胞（DC）的边界处，而在野生型胚胎中观察到中间丝重新定位的时间点（受精后6-7.5小时；图3A-3C'），突变体的深层细胞与卵黄合胞体层（YSL）边界仅出现少量中间丝片段。（野生型）胚胎或通过注射 oep mRNA 挽救的 MZoep 突变体（图1A–1C0和图S4A–S4B0）。在原肠胚形成的后期（受精后7–8小时），MZoep 突变体中也观察到了 IF 的重新定位；然而，与野生型胚胎不同，这种重新定位同时发生在大多数胚盘区域，除了胚盘边缘（图S4C）。这表明，在原肠胚形成开始时，IF 及时且空间协调的重新定位依赖于中胚层-内胚层的内吞作用和迁移。

为进一步探究内吞中胚层的数量及迁移活动是否决定IF重定位的程度，我们分析了两种胚胎中IF的重定位情况：一是cyclops（cyc） morphant胚胎，其ppl前体细胞的数量及由此导致的ppl体积会出现不同程度的减少；二是slb/wnt11突变体胚胎，其ppl细胞向动物极的前移过程会受到抑制。在cyc morphant胚胎中，仍能检测到IF在ppl前缘前方从EVL-DC向YSL-DC边界的重定位（受精后6-8小时；图3E-3F'）。但这种重定位的程度大幅降低，与cyc morphant胚胎中ppl体积的可变减少情况高度吻合（图3D），这表明ppl的体积决定了IF重定位的程度。此外，在slb/wnt11突变体胚胎中，ppl细胞向动物极的迁移减弱，同时IF从EVL-DC向YSL-DC边界的渐进式重定位程度降低，且在前移的ppl前方IF的积累也更不明显（图3G-3I'；对照组见图1B-1C'），这说明ppl细胞的迁移是IF实现渐进式重定位的必要条件。

前体原始内胚层细胞的内吞与迁移足以触发中间丝的重新定位

为了确定 ppl 细胞的内化和迁移不仅是 IF 从 EVL-DC 边界向 YSL-DC 边界重新定位所必需的，而且是充分条件，我们尝试通过在 5.7 小时受精后（hpf），将野生型（WT）供体胚胎中的一簇 ppl 细胞（15-20 个）移植到 MZoep 宿主胚胎靠近生殖缘的 YSL-DC 边界处，来挽救 MZoep 突变体胚胎中 IF 的重新定位（图4A）。在移植的 MZoep 胚胎中，6 hpf 时（野生型胚胎的盾状期），IF 在移植的 ppl 细胞簇周围的 YSL-DC 边界处积累，同时在移植簇正上方的 EVL-DC 边界处出现局部耗竭（图4D-4E0；视频S3）。这这与野生型胚胎中的情况不同，在野生型胚胎中，由于原始条带（PPL）后方存在更多的后部轴中胚层前体细胞，抑制因子（IF）主要在迁移的原始条带前方积累，阻碍了其在后方的积累（图4E和图4E'；视频S3）。值得注意的是，移植的原始条带细胞簇虽然在卵黄合胞体层-深层细胞（YSL-DC）边界被抑制因子均匀包围，但仍表现出从生殖缘向动物极的定向迁移（图4B；视频S3），并导致抑制因子沿其迁移路径从外层细胞-深层细胞（EVL-DC）边界向卵黄合胞体层-深层细胞边界逐渐重新定位（图4E和图4E'；视频S3）。当迁移缺陷的slb/wnt11原始条带细胞被移植到注射了slb/wnt11吗啉代寡核苷酸的MZoep宿主胚胎中时，这种逐渐重新定位过程会变慢（图S4H-S4L），这支持了原始条带细胞迁移触发该重新定位的观点。总体而言，这些发现表明，原始条带细胞的内吞和迁移足以触发抑制因子从外层细胞-深层细胞边界向卵黄合胞体层-深层细胞边界的重新定位，同时也说明这种重新定位并不提供定向原始条带细胞迁移所需的位置信号。

为了进一步验证如野生型胚胎中所发现的那样，动物极导向的植物极前体细胞迁移是否需要中间丝在细胞簇周围聚集，我们在中间丝形成期间（受精后1-3小时），通过短暂暴露于1毫摩尔哇巴因的方式，抑制了宿主MZoep胚胎中中间丝的聚集。当将未处理野生型胚胎的植物极前体细胞簇移植到哇巴因处理的MZoep胚胎的卵黄合胞体层-背侧边缘边界时，从盾状期到原肠中期（受精后6-8小时），未观察到中间丝明显重新定位于移植细胞簇周围的卵黄合胞体层-背侧边缘边界（图4F-4G'；视频S3）。这种中间丝未能正确重新定位的现象，伴随着移植的植物极前体细胞无法从胚缘有效向动物极迁移（图4B；视频S3）。为了排除哇巴因直接影响移植的植物极前体细胞迁移能力，导致其在哇巴因处理的MZoep胚胎中无法定向迁移的可能性，我们探究了将植物极前体细胞从哇巴因处理的野生型供体胚胎移植到未处理的MZoep宿主胚胎中时，其是否能进行定向迁移。我们发现，来自哇巴因处理供体的植物极前体细胞簇不仅能在其周围的卵黄合胞体层-背侧边缘边界正常聚集中间丝（图S4D-S4E'），还能像未处理的移植植物极前体细胞一样向动物极迁移（图4B）。相反，当将哇巴因处理供体的植物极前体细胞移植到哇巴因处理的MZoep宿主胚胎中时，中间丝的重新定位失败（图S4F-S4G'），且移植细胞也未表现出向动物极的定向迁移（图4B）。综上，这表明IF的重新定位是正常原条细胞向动物极迁移所必需的。

最后，为了确定哇巴因处理的MZoep宿主胚胎中移植的ppl细胞无法发生定向迁移，是否是由于中间丝（IF）未能重新定位于卵黄合胞体层-背侧中心（YSL-DC）边界，进而影响其突起形成（正如在哇巴因处理的野生型（WT）胚胎中所观察到的，图2E-2G），我们分析了移植细胞的突起形成情况。尽管移植到未处理MZoep宿主胚胎中的ppl细胞会沿YSL-DC边界形成片状伪足和丝状伪足，且优先朝着向动物极迁移的方向排列，但在移植到缺乏IF重新定位的哇巴因处理MZoep胚胎中的ppl细胞内，这类定向突起的形成受到了显著抑制（图4C和图4H-4I'）。这表明，与哇巴因处理的WT胚胎中的情况类似，哇巴因处理的MZoep宿主胚胎中IF重新定位的缺陷，会通过损害移植的ppl细胞的突起形成，干扰这些细胞的定向迁移。

图4. 脊索前板的迁移足以实现组织液的重新定位

Ppl 触发 IF 从 EVL-DC 向 YSL-DC 边界发生重新定位，具体方式是推挤上方的上胚层

我们的研究发现，ppl 会触发中间丝（IF）从 EVL-DC 边界向 YSL-DC 边界重新定位，这一发现引出了一个问题：这种高度协调的中间丝重新定位是通过何种机制实现的。一种可能性是，ppl 挤压在 DC 层和 YSL 之间，将上方的 DC 层（上胚层）向外推向 EVL，从而触发中间丝从 EVL-DC 边界经 DC 层向 YSL-DC 边界发生反向的向内流动。为验证这一假设，我们首先通过分析 ppl 附近上胚层沿径向轴的 DC 运动幅度，探究向前推进的 ppl 是否确实对上方的上胚层产生了推力（图5A–5H；视频S4）。我们观察到，ppl 上方的 DC 发生了显著的向外径向运动，这使得 ppl 上方的 DC 发生聚集，且随着 ppl 向同一方向移动，这种聚集现象会朝着动物极方向逐渐扩散（图5A–5C、5F、5H；视频S4）。DC 的这种渐进式向外径向运动和聚集现象，同时还伴随着向前推进的 ppl 正下方 YSL/卵黄细胞出现凹陷（图S5A–S5C），这与 ppl 挤压在 DC 层和 YSL 之间并使其发生变形的情况相符。为进一步验证这一假设，我们转而研究缺失 ppl 的 MZoep 突变体，以及由此导致的中间丝及时聚集现象在YSL-DC边界26处（图3A-3C0）。在MZoep胚胎中，未检测到胚外细胞团（DCs）明显可识别的径向运动、压缩以及卵黄细胞凹陷现象（图5D、5E、5G、5H及图S5A-S5C；视频S4），这进一步支持了以下观点：这些过程依赖于植物极前体细胞（ppl）在深层细胞层（上胚层）与卵黄合胞体层（YSL）之间向动物极移动。

对于由推进的 ppl 产生的推力，引发 IF 从 EVL-DC 边界以相反方向向内流经 DC 层到达 YSL-DC 边界，推进的 ppl 前方的 DC 层必须保持足够的多孔性，以允许此类流动发生。为解决这一根据要求，我们在前体细胞（ppl）细胞迁移过程中分析了前体细胞前方的皮质层（DC-layer）压实情况（图S5D和S5E）。我们发现，尽管前体细胞正上方的皮质层明显发生了压实，但前体细胞前方的皮质层仍保持松散排列，存在许多中间纤维（IF）聚集的小囊泡（图S5E），这与中间纤维可能穿过该层的可能性相符。

为了监测中间液（IF）是否从EVL-DC层向YSL-DC边界穿过DC层流动，我们向中间液（IF）中注射了一种光可激活染料（DMNB[二甲氧基硝基苄基]笼状荧光素），并用紫外线（UV）对其进行局部解笼在内化开始时，激光照射迁移中的前体原始内胚层细胞前方的表皮层-深层细胞边界（图5I）。随后，我们追踪了这些局部光激活荧光示踪剂在前体原始内胚层细胞向动物极迁移过程中的重新分布情况（图5J和扩展图5F；视频S5）。作为对照，我们在缺乏前体原始内胚层细胞特化/迁移以及正确中间丝重新定位的MZoep突变胚胎中进行了相同实验（图3A–3C0和扩展图5F0）。随着野生型胚胎中前体原始内胚层细胞开始内化并向动物极迁移，光激活荧光示踪剂从其在表皮层-深层细胞边界的产生处重新分布到迁移中的前体原始内胚层细胞正前方的卵黄合胞体层-深层细胞边界中间丝积累位置（图5J、5J0和5L；视频S5）。这种重新分布并非仅由未笼合染料从产生处简单扩散导致，因为与缺乏前体原始内胚层细胞和中间丝重新定位的MZoep突变体相比，野生型胚胎中未笼合染料在卵黄合胞体层-深层细胞边界的积累速率明显更高（图5K、5K0、5L–5M0、扩展图5C和扩展图5D；(a_{WT}=) (0.9367>a_{M Z oep }=0.5116) 视频S5）。综上，这些发现支持了中间丝因前体原始内胚层细胞的内化和迁移而从表皮层-深层细胞边界流向卵黄合胞体层-深层细胞边界的观点。

图5. 原索前板迁移通过挤压上方上胚层引发组织间隙液重新定位

最后，我们探究了原始层（ppl）对上方深层细胞层（上胚层）的推力是否足以触发中间纤维（IF）的重新定位。为此，我们将一个经过钝化处理且荧光标记的磁珠（大小与前部原始层大致相同，编号((d=40 mu m))）移植到MZoep突变胚胎的卵黄合胞体层-深层细胞（YSL-DC）边界，并检测沿该边界拉动磁珠时，是否会触发中间纤维从表皮层-深层细胞（EVL-DC）边界向卵黄合胞体层-深层细胞（YSL-DC）边界重新定位（图6A）。值得注意的是，我们发现无论是对照组（未拉动）磁珠，还是后续通过磁铁拉动的磁珠，其周围的卵黄合胞体层-深层细胞边界均出现了中间纤维的聚集；且卵黄合胞体层-深层细胞边界处移植磁珠周围的中间纤维聚集，伴随着表皮层-深层细胞边界磁珠上方中间纤维的减少（图6B-6J0；视频S6）。此外，沿卵黄合胞体层-深层细胞边界拉动磁珠后，中间纤维会沿磁珠移动路径从表皮层-深层细胞边界向卵黄合胞体层-深层细胞边界逐步重新定位，且这一过程持续数分钟（图6E-6J0；视频S6），这与机械推力作用于上方深层细胞层（上胚层）足以触发中间纤维从表皮层-深层细胞边界向卵黄合胞体层-深层细胞边界持续、逐步重新定位的观点相符。为进一步验证该模型，我们尝试通过外力对表皮层施加局部推力，在重新定位缺陷型MZoep突变胚胎中诱导异位的中间纤维重新定位。使用微量移液器对MZoep突变体的表皮层施加局部推力，可使中间纤维部分从表皮层-深层细胞边界向卵黄合胞体层-深层细胞边界重新定位（图S6A-S6D），表明此类推力足以触发这一重新定位过程。

总体而言，这些观察结果表明，原条前体（ppl）通过在原条（YSL）和上胚层之间移动，对上方的上胚层产生挤压，从而导致肌动蛋白丝（IF）从动物极-深层细胞（EVL-DC）流向原条前体正前方的原条-深层细胞（YSL-DC）边界，这反过来又促进了原条前体细胞的迁移。

图6. 磁珠牵拉在卵黄合胞体层-深层细胞边界诱导组织液积聚。(A) 示意图展示通过聚焦磁场对植入于MZoep胚胎卵黄合胞体层（YSL）-深层细胞（DC）边界的磁珠进行可控位移，机械诱导组织间隙液（IF）重新定位的过程；胚胎由钝头微量移液器固定（((d=80 mu m))）；EVL为包被层。(B、B0、E和E0) 实验开始时（B和E）及150单位时间后（B0和E0），未拉拔（B和B0）和拉拔（E和E0）磁珠的磁镊实验代表性横截面；白色虚线勾勒出YSL-DC边界处的IF聚集区域；比例尺为200微米。(C和F) YSL-DC边界处未拉拔（C）和拉拔（F）磁珠的代表性横截面图像，其中磁珠运动轨迹投影了150单位时间的过程；时间以颜色编码表示；白色虚线标记磁镊位置；比例尺为250微米。(D和G) 聚焦磁场作用下，未拉拔（D）和拉拔（G）磁珠的IF聚集量相对于磁珠位置的代表性时空图。(H) 示意图展示对植入MZoep胚胎YSL-DC边界的磁珠进行可控位移以诱导IF重新定位时的胚胎取向；AV为动物-植物轴。(I和J) 实验开始时（I）及拉拔150单位时间后（J），注射荧光葡聚糖以标记IF的MZoep;gsc::caax-EGFP胚胎的最大强度投影图和单横截面图（S为矢状面）；白色虚线圆圈勾勒出植入的磁珠；蓝色虚线勾勒出EVL-DC边界处的IF；粉色虚线勾勒出YSL-DC边界处的IF（矢状面S）；比例尺为100微米。(I0和J0) 实验开始时（I0）及拉拔150单位时间后（J0），沿磁珠可控位移轴的IF分布曲线；多色曲线代表(n=3)次独立胚胎实验中磁珠位置（黑线）、EVL-DC边界（蓝线）和YSL-DC边界（粉线）IF分布的平均值；粉色箭头头指示ppl前方的IF聚集区域。另参见视频S6。

讨论

最近对小鼠胚胎的研究表明，内细胞团/原羊膜腔形成过程中IF的积累可能中间纤维通过对周围组织施加机械力和/或充当信号中枢来影响细胞命运决定与分化。与之相反，我们在斑马鱼中的研究表明，在向前推进的胎盘前体细胞（ppl）前方，局部中间纤维的聚集主要发挥形态发生功能，为胎盘前体细胞无阻碍地形成细胞突起和定向迁移提供足够空间。这不仅揭示了中间纤维聚集在胚胎形态发生中一个尚未被发现的功能，也指出斑马鱼与小鼠中中间纤维聚集的发育功能存在显著差异。中间纤维聚集在小鼠中控制细胞命运决定、而在斑马鱼中调控细胞迁移的不同作用，可能源于小鼠胚胎（而非斑马鱼胚胎）会形成巨大的囊胚腔/原羊膜腔，这使得衬于囊胚腔的细胞暴露于大的流体界面，并通过生物化学信号传导和机械感觉影响其命运决定。未来需对其他形成和不形成囊胚腔的物种中的中间纤维聚集展开进一步研究，以阐明早期胚胎发生过程中中间纤维聚集功能多样化的起源。

从机制角度，我们提出，原始条带前体细胞（ppl）的细胞迁移与中间丝（IF）聚集之间存在一个水力反馈环路：迁移的原始条带前体细胞推挤上方的深层细胞层（上胚层），由此形成压力梯度，触发中间丝在向前迁移的原始条带前体细胞前方流动并重新定位。这种中间丝聚集又会通过开辟细胞无阻碍迁移所需的空间，进一步促进原始条带前体细胞的迁移。此前已有研究表明，原始条带前体细胞会在深层细胞层与卵黄合胞体层（YSL）之间迁移，并以卵黄合胞体层作为迁移的底物。此外，有研究发现与上方深层细胞层的摩擦会减缓原始条带前体细胞的定向迁移，这表明原始条带前体细胞与上方深层细胞层的接触会限制其迁移。因此，聚集在卵黄合胞体层-上胚层边界的中间丝很可能通过清除阻碍原始条带前体细胞迁移的物理障碍，对其迁移产生影响。我们的观察结果也支持这一观点：在中间丝聚集减少的胚胎中，仅通过提高渗透压进而增加中间丝聚集，就能完全挽救存在缺陷的原始条带前体细胞迁移，这说明中间丝并非通过提供生化信号来促进原始条带前体细胞突起的形成和迁移。

所提出的正向流体动力学反馈环路的一个重要组成部分，是原始内胚层（ppl）细胞迁移通过推挤上方未内陷的深层细胞（DC）层（上胚层）来触发中间丝（IF）重定位的功能。要实现这一点，前进中的原始内胚层（ppl）所产生的推力必须从原始内胚层（ppl）高效传递到表皮层（EVL）-深层细胞（DC）边界；同时，响应这一推力，中间丝（IF）需能够从表皮层（EVL）-深层细胞（DC）边界穿过深层细胞（DC）层流向卵黄囊层（YSL）-深层细胞（DC）边界。这要求原始内胚层（ppl）上方的上胚层具有足够的刚性，以确保力能从原始内胚层（ppl）高效传递至卵黄囊层（YSL）-深层细胞（DC）边界；同时，前进中的原始内胚层（ppl）前方的深层细胞（DC）层需足够疏松多孔，允许中间丝（IF）穿过。上胚层的这种双重特性，很可能是通过原始内胚层（ppl）触发上方深层细胞（DC）的致密化来实现的，从而提高原始内胚层（ppl）上方深层细胞（DC）组织的刚性；而原始内胚层（ppl）前方的深层细胞（DC）则保持足够的疏松多孔状态，让中间丝（IF）能够穿过（图5A–5C、5F、5H、补充图S5A、S5B；视频S4）。值得注意的是，此前研究已证实中间丝（IF）聚集的分布可反映细胞连接性，进而体现组织内的刚性程度斑马鱼囊胚层。因此可以推测，植物极前体上方深层细胞层的致密化会提高组织的连通性，进而提升其刚性，这又将有助于将推进的植物极前体所产生的力传递到表皮层-深层细胞边界。然而，深层细胞的致密化如何转化为组织刚性和孔隙率的具体变化，仍有待进一步研究。

非融合组织中的细胞迁移不仅涉及细胞-细胞与细胞-基质接触的动态变化，还包括组织内中间纤维（IF）聚集的重组。我们的研究发现，迁移细胞通过驱动胚胎内大规模的中间纤维流动与重新定位，自主构建出无阻碍迁移所需的物理空间，这揭示了一种简单且普适的机制——细胞可借助该机制在非融合组织的空间限制内完成迁移。

研究的局限性

在本研究中，我们发现前沿细胞前方的中间纤维（IF）聚集是伪足样突起（ppl）细胞突起形成和迁移的必要条件，这表明中间纤维通过促进细胞突起形成在伪足样突起细胞迁移中发挥作用。尽管考虑到细胞突起形成与迁移之间存在功能上的相互依存关系，这一情况很可能成立，但我们尚未探究中间纤维聚集促进伪足样突起细胞迁移的其他和/或额外机制的潜在作用，例如通过增加静水压力来调节组织硬度。我们还发现，伪足样突起产生的推力可促使中间纤维从表皮外层-深层细胞（EVL-DC）边界向蛋黄层-深层细胞（YSL-DC）边界流动，且位于伪足样突起前方。尽管从原理上讲，此类机制足以解释前沿细胞前方中间纤维的聚集，但可能还存在其他潜在机制，比如伪足样突起产生的推力导致中间纤维渗透压发生变化，进而调控邻近深层细胞（DC）中的机械敏感性离子通道，其作用仍需在未来借助中间纤维渗透压的体内传感器展开进一步研究。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

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