题目：Tgf- β receptor signaling cell-intrinsically controls conserved microglia homeostatic maturation during zebrafish development

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42574224/

期刊：Cell Reports

研究亮点

l 斑马鱼小胶质细胞个体发育中转化生长因子-β信号通路的需求具有保守性

l 该信号通路直接作用于祖细胞以驱动小胶质细胞分化

l 斑马鱼的胚胎小胶质细胞和成年小胶质细胞的分化均依赖于转化生长因子-β信号通路

l 斑马鱼的转化生长因子-β1b旁系同源基因调控这一过程

摘要

小胶质细胞是胚胎起源的中枢神经系统组织驻留巨噬细胞，对大脑发育、稳态维持和疾病发生至关重要。尽管转化生长因子β（TGF-β）信号通路是哺乳动物小胶质细胞发育所必需的，但其具体作用及进化保守性仍不明确。本研究以斑马鱼为脊椎动物体内模型，发现TGF-β受体信号是调控小胶质细胞分化的保守细胞内源性因子。TGF-β受体功能的药理学或遗传学阻断会在祖细胞迁移至胚胎神经上皮后阻断小胶质细胞的发育，从而阻止小胶质细胞基因表达程序的激活。遗传拯救实验表明，髓系谱系中对TGF-β受体信号存在直接需求。研究人员鉴定出TGF-β1是驱动这一过程的关键配体，并证实持续的信号传导是维持小胶质细胞身份的必要条件。成年斑马鱼小胶质细胞的起源与小鼠不同，在缺乏TGF-β信号的情况下同样无法完成分化。综上，本研究证实了一条进化保守的TGF-β信号轴，该信号轴可在体内指导并维持小胶质细胞的身份特征。

图形摘要

引言

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）的常驻巨噬细胞，在塑造大脑发育、维持内环境稳态以及调节神经炎症方面发挥着关键作用。 在哺乳动物中，小胶质细胞与其他中枢神经系统和外周髓系细胞相比具有独特的特性。其一个核心特征是胚胎起源：小胶质细胞源自原始造血过程中产生的卵黄囊祖细胞， 原始造血是一种早期且短暂的发育波。这些祖细胞在血脑屏障形成前进入脑实质，在脑实质内进行局部增殖，逐渐定植于整个中枢神经系统，并获得小胶质细胞特异性的转录组特征。小胶质细胞网络形成后，主要通过自我更新得以维持，在很大程度上不依赖骨髓来源的祖细胞。细胞的谱系定型和分化依赖于PU.1和IRF8等转录因子。此外，通过集落刺激因子1受体((CSF1R))及其配体集落刺激因子1（((CSF1))）和白介素-34 ((IL-34))进行的信号传导，对于前体细胞募集、小胶质细胞存活和功能至关重要。

小胶质细胞的特性和行为深受大脑微环境的深刻影响，当细胞在体外培养时观察到的快速转录变化就凸显了这一点。 在关键的环境信号中，转化生长因子β1（TGF-β1）是发育过程中小胶质细胞特化的核心调控因子。以及维持其成熟的分子特征。中枢神经系统特异性缺失TGF (-beta 1)的小鼠在出生后早期发育过程中无法获得典型的小胶质细胞基因特征，而巨噬细胞谱系中TGF (-beta)信号通路的破坏同样会损害小胶质细胞的成熟，包括包括P2ry12等标志性标志物的缺失。在人类中，同样需要激活 TGF-β 通路才能产生功能性小胶质细胞从人诱导多能干细胞中生成功能性小胶质细胞。

小胶质细胞成熟受损会破坏中枢神经系统的发育以及在小鼠模型中发挥作用。 然而，在成年小鼠中，条件性敲除转化生长因子-β信号通路对小胶质细胞的核心身份或存活仅有轻微影响，反而会促使其向激活状态转变，疾病相关表型。这些观察结果表明解析转化生长因子-β信号通路在小胶质细胞生物学中复杂且发育阶段特异性的功能。尽管已取得实质性进展，但关键问题仍未解决：虽然转化生长因子-β被认为在祖细胞水平发挥作用，但仍缺乏直接的体内证据。目前尚不清楚转化生长因子-β的活性是仅需短暂诱导小胶质细胞程序，还是必须在特定的发育窗口期内持续存在，同时也不清楚转化生长因子-β信号通路在多大程度上支持小胶质细胞的早期存活。虽然已知转化生长因子-β促进小胶质细胞成熟，其潜在的贡献其他 TGF-β 家族成员在体内的相关研究仍有待深入。此外，TGF-β 信号通路的需求是否在哺乳动物之外也具有保守性，这一点尚待确定。

为解决这些研究空白，我们选择了斑马鱼作为研究对象，它能够实现对小胶质细胞早期发育的高分辨率体内分析。与哺乳动物一样，斑马鱼中的小胶质细胞个体发育也是由原始巨噬细胞启动的，这些原始巨噬细胞会迁移至正在发育的大脑中。定植于神经组织并分化为小胶质细胞。我们及其他研究团队已证实，这些早期发育阶段依赖pu.1、irf8和csf1r信号通路，且小胶质细胞的成熟伴随着保守性小胶质细胞标志物的上调，包括载脂蛋白E（apoeb）和嘌呤能受体P2y12（p2ry12）。尽管有研究提示转化生长因子-β（Tgf-β）信号通路在斑马鱼小胶质细胞中发挥作用，但该通路在小胶质细胞个体发育过程中的必要性尚未得到直接验证。此外，在斑马鱼中，胚胎期小胶质细胞群后续会被源自造血干细胞祖细胞的成年细胞群取代，因此目前尚不清楚Tgf-β信号通路是否对这两类不同的细胞群存在差异性调控作用。本研究首先证实Tgf-β通路是斑马鱼早期胚胎中小胶质细胞个体发育的关键通路，并以此为模型，进一步阐明该信号通路在脊椎动物发育过程中如何调控小胶质细胞的稳态成熟。

结果

斑马鱼胚胎小胶质细胞的个体发育依赖于转化生长因子-β信号通路

为了探究(Tgf- beta)信号传导是否是斑马鱼小胶质细胞发育所必需的，我们首先采用了药理学方法来阻断转化生长因子-β（Tgf-β）受体的活性。我们使用了Repsox，这是一种强效且具有选择性的转化生长因子-β1型受体（Tgf-βr1）/活化素样激酶5（Alk5）抑制剂，此前已在斑马鱼的功能研究中得到验证。在斑马鱼中，受精后约20小时（hpf），在吻侧血岛（RBI）中产生的原始巨噬细胞会在卵黄球上迁移，并在受精后约36小时开始进入脑部，在受精后60小时启动向小胶质细胞的表型转化。因此，我们在受精后6至72小时期间用该抑制剂处理斑马鱼胚胎，这一时间窗口涵盖了小胶质细胞发育的全过程，从祖细胞的特化和出现到其逐步分化为小胶质细胞。我们用Repsox或作为溶剂对照的二甲基亚砜（DMSO）处理胚胎，在受精后72小时用多聚甲醛（PFA）固定，并通过整体实验进行分析。

采用全胚胎原位杂交（WISH）技术检测小胶质细胞早期标志物apoeb的表达（图1A）。对视顶盖中apoeb阳性细胞的定量分析显示，与对照组胚胎（28.7±5.6个，(n=25)）相比，经Repsox处理后小胶质细胞数量显著减少（0.6±0.9个，(n=19)）（图1B、1C）。这些结果表明，斑马鱼小胶质细胞的发育受转化生长因子-β（Tgf-β）信号全局缺失的显著影响。为验证Repsox处理胚胎中观察到的表型是由抑制Tgf-β受体通路导致的，我们利用激活素受体样激酶5（Alk5）受体的两个斑马鱼旁系同源物alk5a和alk5b的已建立突变品系。72小时胚胎期（hpf）的WISH分析显示，单突变体(alk5a)和(alk5b ^{-1-})的apoeb阳性小胶质细胞数量虽有减少但未完全消失，这提示存在功能冗余（野生型：31.6±5.5个，(n=)；18；(alk5a)：21.6±5.3个，(n=52)；(alk5b)：24.1±5.7个，(n=19)）（图1D、1E）。为验证这一结论，我们将两个品系杂交获得双突变体(alk5a ^{-1-})；(alk5b)（以下简称(alk5DM)突变体），发现alk5的缺失会导致72 hpf时小胶质细胞apoeb表达完全消失（((alk5 ^{DM})：0.9±1个，(n=14)）（图1D、1E）。由此可见，要重现抑制剂诱导的小胶质细胞表型，必须完全阻断Alk5信号通路。进一步研究证实，Repsox可同时靶向Alk5a和Alk5b，抑制剂处理后各纯合突变体脑部apoeb表达均消失（图S1），进一步支持了上述结论。综上，这些结果表明Tgf-β信号通路对斑马鱼胚胎早期小胶质细胞的建立至关重要。

图1. 转化生长因子-β受体1/激活素受体样激酶5信号通路的干扰会阻碍斑马鱼胚胎中小胶质细胞的发。(A)药物处理方案的示意图。(B) 从受精后6小时至72小时用二甲基亚砜（DMSO）或1μM Repsox处理的72小时胚胎（受精后小时数，hpf）中，apoeb表达的全胚原位杂交（WISH）分析图，呈背侧视图（前方朝上）。黑色箭头头指示视顶盖（OT）中的细胞。比例尺为100微米。(C) 各条件下apoeb阳性细胞的定量分析。每个符号代表一个胚胎；数据以平均值±标准差（SD）表示。采用曼-惠特尼检验评估统计学显著性（*** ((^{* *} p<0.001))）。(D) 72小时野生型（wt）、纯合alk5a突变体（((alk5a ^{-1-} ))）、纯合alk5b突变体（((alk5b-i-))）和双突变体（((alk5 ^{DM} ))）胚胎中apoeb的全胚原位杂交（WISH）图，呈背侧视图。黑色箭头头指示实质小胶质细胞。比例尺为100微米。(E) 所示基因型中apoeb阳性小胶质细胞的定量分析。每个符号代表一个胚胎；数据以平均值±标准差（SD）表示。采用克鲁斯卡尔-沃利斯检验，随后进行邓恩多重比较检验分析统计学差异（*** ((^{* *} p<0.001))）。hpf为受精后小时数。参见图S1。

转化生长因子-β抑制可阻止原始巨噬细胞向小胶质细胞的早期分化

在证实小胶质细胞发生过程中Tgf-βr信号通路的关键作用在斑马鱼中具有保守性后，我们着手利用本模型追踪这些缺陷的起源。通过药物抑制实现对Tgf-β受体沉默的时间调控（图2A），我们首先探究观察到的表型是否源于小胶质细胞前体的特化异常。然而，在24小时胚胎期（hpf）用Repsox处理胚胎后检测mfap4的表达——该阶段该基因可标记卵黄球上的原始巨噬细胞——结果显示，Tgf-β抑制后细胞数量并无差异（79.6±26.8个细胞 vs 73.6±22.9个细胞；图2B、2C）。这表明Tgf-β信号通路对原始巨噬细胞的发育并非必需。与这些发现一致，将Repsox处理的起始时间推迟至原始巨噬细胞从RBI出现后的24 hpf，足以导致72 hpf时无载脂蛋白Eb（apoeb）阳性小胶质细胞（27.4±3.8个细胞 vs 0.3±0.8个细胞；图2D、2E）。

接下来，我们在两个特定的时间窗口（24–48小时胚胎期或48–72小时胚胎期）应用Repsox，这两个时间窗口分别涵盖了小胶质细胞前体在脑实质中的迁移以及它们在局部分化为小胶质细胞的过程。针对每种处理条件，我们通过全胚胎原位杂交技术在72小时胚胎期检测了载脂蛋白Eb阳性小胶质细胞的存在情况。在24至48小时胚胎期用抑制剂处理斑马鱼胚胎，对72小时胚胎期载脂蛋白Eb阳性小胶质细胞的数量无影响（24.1±6.3个细胞，24–48小时处理组；21.9±6.7个细胞，对照组）。相比之下，在受精后48至72小时期间Tgf-β信号传导被破坏的胚胎中，不存在(apoeb)细胞（23.4±6.3个细胞，(n=14)，而对照组为1±1.4个细胞，cbeaef95-2ecf-450f-90eb-51a4f32ab7f，图2D和2E）。因此，在小胶质细胞个体发育后期破坏Tgf-β信号传导会干扰apoeb的表达。总体而言，这表明原始巨噬细胞的脑定植不受Tgf-β抑制的影响，且其在局部维持或分化为小胶质细胞的能力存在功能缺陷。 

图2. 转化生长因子-β受体1信号传导在小胶质细胞个体发育的最后阶段是必需的。(A) 药物处理方案的示意图。(B) 24小时受精后（hpf）胚胎中mfap4的整体原位杂交（WISH）结果，呈侧视图（前方朝左），胚胎从受精后6小时至24小时分别用二甲基亚砜（DMSO）或1μM Respsox处理。黑色箭头头指示卵黄球上的细胞。(C) mfap4阳性原始巨噬细胞的定量分析。每个符号代表一个胚胎；数据以平均值±标准差（SD）表示。组间差异采用t检验并结合韦尔奇校正进行分析。比例尺为250微米。(D) 72小时受精后（hpf）胚胎中apoeb的整体原位杂交（WISH）结果，呈背视图（前方朝上），胚胎在以下时间窗口内用二甲基亚砜（DMSO）或1μM Respsox处理：24–72 hpf、24–48 hpf和48–72 hpf。黑色箭头头指示apoeb阳性小胶质细胞。(E) 视顶盖中apoeb阳性小胶质细胞的定量分析。每个符号代表一个胚胎；数据以平均值±标准差（SD）表示。组间差异采用多重t检验结合错误发现率（FDR）多重比较检验进行分析（*** ((^{* * *} p<0.001))）。比例尺为100微米。hpf，受精后小时数

为直接验证这一点，我们评估了原始巨噬细胞侵袭的空间模式。我们进行了另一轮处理，时间为受精后24至72小时，随后对全白细胞标志物L-塑性蛋白进行了整体免疫染色分析（图3A）。由于在该发育阶段，小胶质谱系细胞是头部间充质中唯一存在的白细胞， 因此在本实验中，L-塑性蛋白染色可作为巨噬细胞存在的检测指标。与我们的假设一致，我们发现处理胚胎的视顶盖中L-塑性蛋白阳性细胞数量正常（23.4±7.1个，(n=14)  vs. 21.4±5.7个，(n=14)；图3B和3C），这表明阻断转化生长因子-β信号通路不会改变原始巨噬细胞的迁移能力。为了补充这些观察结果，接下来我们使用了Tg(mpeg1:GFP)报告基因，实现对体内巨噬细胞(GFP+)的直接可视化。共聚焦显微镜分析确实证实，经瑞普索克斯处理后，视顶盖中mpeg1阳性细胞数量无显著差异（28.5±6.5个，((28.5 pm)  vs. 25.6±6.8个，(n=19)）（图3D-3F）。细胞活细胞成像进一步验证了这一点，(GFP+) 显示原始巨噬细胞侵袭二甲基亚砜或瑞普索克斯处理的胚胎大脑时，其行为无差异。（图3；视频S1和S2）。因此，在抑制转化生长因子-β信号通路后，原始巨噬细胞成功定植于发育中的大脑。有趣的是，一旦在神经组织中定植，经Repsox处理的胚胎中(mрeg 1^{+})细胞的数量保持稳定，如在受精后6天观察到的情况（46.3±7.6个细胞，(n=33)；对比42.4±9个细胞，(n=35)；图3E和3F），因此排除了细胞死亡加剧是该表型可能成因的可能性。总而言之，这表明阻断(Tgf- beta)信号通路后，载脂蛋白E b转录本的缺失可能是由于无法诱导该小胶质细胞标志物的表达，这与小胶质细胞表型转化过程中正常发生的情况相反。

基于这些观察结果，我们试图探究经Repsox处理的胚胎中其他小胶质细胞标志物的表达是否也受到了损害。我们首先关注嘌呤能受体相关的研究受体p2ry12，这是斑马鱼中一种小胶质细胞特征基因以及哺乳动物。 我们将 Tg(p2ry12:p2ry12-GFP) 报告基因与 Tg(mpeg1:mCherry) 斑马鱼进行杂交，并在抑制剂处理 1 至 6 天胚胎期（dpf）后对双转基因胚胎进行活体成像，该时间点便于清晰观察小胶质细胞中的绿色荧光蛋白（GFP）信号。视顶盖的共聚焦活体成像结果显示，与二甲基亚砜（DMSO）处理的胚胎（0.6±0.89 个细胞，(n=5) 对比 38.6±7.5 个细胞，(n=7)）（图 3G 和 3H）相比，mpeg1:mCherry+ 细胞完全不表达任何 GFP。通过 4C4 抗体进行免疫染色检测发现，半乳凝素相关蛋白 3 结合蛋白前体 b（Lgals3bpb）也呈现出类似结果32（图 3I）；Tg(ccl34b.1:GFP) 转基因同样如此（图 3J），这两种标志物均被认为是斑马鱼特有的稳态相关分子在经Repsox处理的胚胎中，转化生长因子-β（Tgf-β）信号通路的抑制不仅会消除小胶质细胞中载脂蛋白E B（apoeb）的表达，还会破坏嘌呤能受体P2Y12（p2ry12）、趋化因子配体34B亚家族成员1（ccl34b.1）和半乳凝素3结合蛋白（Lgals3bpb）的上调。综合来看，这些研究结果表明，抑制剂处理会全面破坏原始巨噬细胞的小胶质细胞分化潜能。

图3. 转化生长因子-β受体抑制会损害原始巨噬细胞的小胶质细胞分化潜能。（A）药物处理方案的示意图。（B和C）从受精后1天至3天（3 dpf）用二甲基亚砜（DMSO，左图）或1μM瑞普索昔（Repsox，右图）处理后，用抗Lcp1（L-质体素）抗体进行免疫染色的3 dpf野生型胚胎视顶盖（OT）背侧视图（B），以及各条件下的定量分析（C）。白色箭头头指示Lcp1阳性细胞。比例尺为50微米。每个符号代表一个胚胎；数据以平均值±标准差（SD）表示。采用t检验并随后进行韦尔奇校正进行统计学分析。（D–F）从1 dpf至3 dpf（D）或从1 dpf至6 dpf（E）用DMSO（左图）或(1 mu M)瑞普索昔（右图）处理后，3 dpf（D）或6 dpf（E）Tg(mpeg1:GFP)胚胎视顶盖背侧视图，以及各条件下的定量分析（F）。白色箭头头指示mpeg1阳性细胞。比例尺为50微米。每个符号代表一个胚胎或幼体；数据以(mean pm SD)表示。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）并随后进行图基多重比较检验对mpeg1阳性细胞数量进行比较（***((^{++*} p<0.001))）。（G和H）从1 dpf至6 dpf用DMSO（左图）或1μM瑞普索昔（右图）处理的6 dpf Tg(mpeg1:mcherry; p2yr12:p2yr12-GFP)幼体视顶盖共聚焦活体成像（G）。展示了mCherry通道（上图）、GFP通道（中图）和合并通道（下图）。白色箭头头指示细胞。比例尺为50微米。各条件下mCherry阳性(GFP+)双阳性细胞的定量分析（H）。每个符号代表一个幼体；数据以平均值±标准差表示。采用曼-惠特尼检验进行统计学分析（***((^{* * *} rho<0.001))）。（I和J）从1 dpf至3 dpf用DMSO（左图）或1μM瑞普索昔（右图）处理后，3 dpf野生型胚胎经4C4抗体（Lgals3bpb）免疫染色的视顶盖（I），以及3 dpf Tg(ccl34b.1:GFP)胚胎的视顶盖（J）。图像代表9只（4C4组）或12只（Tg(ccl34b.1:GFP)组）经DMSO处理的鱼，以及12只（4C4组）或15只（Tg(ccl34b.1:GFP)组）经瑞普索昔处理的鱼。白色箭头头指示细胞。比例尺为50微米。图像采用25倍（B、D、E、I和J）或32倍（G）水浸物镜拍摄，为正交投影（背侧视图，前方朝上）。dpf指受精后天数。另参见视频S1和S2。

转化生长因子-β受体信号通路在小胶质细胞个体发育过程中发挥细胞自主性作用

由于我们目前的研究结果涉及Tgf (-beta)信号通路的全局调控或系统性丧失，接下来我们想探究小胶质细胞谱系或组织环境中是否需要该信号通路的活性传导。首先，我们发现斑马鱼胚胎中的小胶质细胞表达两种alk5旁系同源物的转录本（图S2A和S2B）。这表明这些细胞可对Tgf-β配体产生反应，且提示与哺乳动物类似，斑马鱼中小胶质细胞的个体发育可能需要Tgf-β受体信号的细胞自主性作用。为验证这一点，我们最初采用Tol2介导的瞬时拯救方法，即在单细胞阶段向alk5缺陷型胚胎中注射编码alk5b旁系同源物的质粒构建体，该构建体受巨噬细胞特异性mpeg1.1启动子调控。然而，这些实验中强烈的嵌合性使得我们的表型拯救分析无法获得有效信息，因此我们转而使用稳定的转基因品系（图4A）。我们构建了Tg(mpeg1.1:alk5b-myl7:GFP)品系，其中心脏GFP表达作为转基因标记。同时，我们还利用泛神经元elavl3（elav样神经元特异性RNA结合蛋白3）或内皮细胞特异性kdrl（激酶插入域受体样）启动子构建了另外两个品系，以驱动alk5b的表达。转基因所有救援品系中的表达均通过qPCR得到了验证，因为在纯合alk5b突变体中仍能检测到残留的alk5b转录本，这使得整体原位杂交（WISH）不适用于此目的。值得注意的是，尽管我们在内皮细胞和巨噬细胞救援品系中均检测到alk5b表达的显著上调，从而证实了转基因的高效表达，但在神经元救援品系中，这种上调则相对温和（图S2C）。尽管如此，我们将每个转基因品系与(alk5a):(alk5b+/-)背景品系进行了杂交（因为(alk5 ^{DM})基因型的动物无法存活至成年）。在分析中，我们将alk5a突变纯合、alk5b突变杂合且谱系特异性alk5b-myl7:GFP转基因半合子的成鱼进行互交，并在3天胚胎期（3 dpf）通过整体原位杂交（WISH）检测其后代的载脂蛋白E b（apoeb）表达。正如我们之前所证实的，alk5两个旁系同源基因中任意一个的存在都会导致小胶质细胞呈现中间表型（图1E），因此我们的实验策略是：若alk5b成功实现救援，应能将(alk5 ^{DM})背景下胚胎中载脂蛋白E b阳性（apoeb+）细胞的数量从零恢复至(alk5a)背景下胚胎中观察到的中间水平。

对apoeb⁺细胞数量进行定量分析，随后通过基因分型鉴定纯合突变体，结果显示在巨噬细胞特异性mpeg1:alk5b驱动下，(alk5 ^{DM})胚胎中的apoeb表达得以恢复（0.6±1.2个细胞，(n=22) 对比 19.7±8.4个细胞，(n=24)），其水平接近单个(alk5a)突变体中的水平（21.4±11个细胞，(n=15) 图4B）。相比之下，神经元或内皮细胞靶向的alk5b过表达的(alk5DM)胚胎未得到挽救（分别为0.4±1个细胞，(n=11) 和 0±0个细胞，(n=12)），且与其(alk5 5^{DM})的同窝对照一样，缺乏apoeb细胞（图4B）。因此，小胶质细胞谱系中需要Alk5b活性来诱导apoeb表达。此外，完整的在ALK5A突变体中，通过巨噬细胞特异性ALK5B表达来挽救小胶质细胞分化，这表明其他细胞类型中的ALK5B活性对于小胶质细胞发育的这一过程并非必需。综合来看，这些结果表明，转化生长因子-β（TGF-β）信号通路通过直接作用于原始巨噬细胞促进其分化，从而调控小胶质细胞的个体发育。

图4. 转化生长因子β受体信号通路在小胶质细胞发育过程中具有细胞自主性。(A)实验挽救策略的示意图。(B) 在受精后3天（dpf），对(a/k5a-1-)和(alk5DM)突变体中，以及在由mpeg1、kdrl或elavl3特异性调控元件驱动alk5b编码序列稳定表达的(alk5)胚胎中，表达apoeb的小胶质细胞进行定量分析。每个符号代表一个胚胎；数据以平均值±标准差表示。组间差异采用Kruskal-Wallis检验，随后进行Dunn多重比较检验（*** ((^{* * *} p<0.001))）。dpf，受精后天数。另见图S2。

转化生长因子-β1（而非转化生长因子-β2或转化生长因子-β3）在体内调控小胶质细胞的发育

鉴定介导小胶质细胞分化的特定转化生长因子-β（TGF-β）配体，对于理解TGF-β信号通路如何调控这一过程至关重要。已知在小鼠中，TGF-β1的缺失会损害小胶质细胞的成熟，但其他TGF-β配体的潜在作用仍不明确。在斑马鱼中，Tgf-β配体由四个基因编码：tgfβ1a、tgfβ1b、tgfβ2和tgfβ3。值得注意的是，发育中斑马鱼大脑的小胶质细胞同时表达两种tgfβ1旁系同源物，而tgfβ2和tgfβ3的转录本在该细胞群体中几乎检测不到，反而局限于神经元区室（图S2B）。我们此前已建立(tg beta 1 b^{-1-})品系斑马鱼，本次又构建了新型利用CRISPR/Cas9技术获得了转化生长因子β1a（tgfβ1a）、转化生长因子β2（tgfβ2）和转化生长因子β3（tgfβ3）的突变等位基因（图S3A）。在所有案例中，一种移码突变（tgfβ1a和tgfβ3的突变位于外显子1，tgfβ2的突变位于外显子2）会引入一个提前终止密码子，导致截短型、且可能无功能的蛋白按预期产生。所有单突变体均为纯合存活且可育，整体外观正常，唯有(tgt beta 3^{-1-})号斑马鱼出现进行性体轴缺陷，存活率和育性也有所降低（图S3B）。对纯合单突变体胚胎进行分析并与对照组同胞胚胎对比后发现，转化生长因子β1b（tgfβ1b）突变体胚胎在受精后3天（3 dpf）时，载脂蛋白E B（apoeb）阳性细胞的数量显著减少（1.2±2.1个细胞，(n=67)，而对照组为20.1±4.9个细胞，(n=68)）。

相比之下，(tgf beta 1 a^{-1-})、(tgf beta 2^{-1-})和(tgt beta 3^{-1-})号突变体胚胎的apoeb阳性细胞数量正常（分别为18.1±6.6个细胞，(n=) (77) 7；22.5±5.2个细胞，(n=15)；以及24.4±3.2个细胞，(n=8)），不过转化生长因子β1a（tgfβ1a）突变体的细胞数量变异性更大（图5A和图5B）。与(alk5 ^{DM})号表型一致，(tgf beta 1 b^{-1-})号胚胎脑实质中的白细胞弹性蛋白（L-plastin）阳性细胞也不表达半乳凝素相关蛋白3b结合蛋白（Lgals3bpb）（双阳性细胞数量为0.2±0.6个，(n=40)，而对照组为25.4±6.5个双阳性细胞）野生型（(n=32)，图5C和图5D）。重要的是，这一表型未在(tgf beta 1 a^{-1-})突变体中观察到，该突变体中有18.2±7.4个细胞呈双阳性（((n=22))，图5C和图5D）。综上，这些结果表明斑马鱼小胶质细胞的成熟由Tgf-β1信号通路介导，未检测到Tgf-β2或Tgf-β3的参与。具体而言，斑马鱼的Tgf-β1b旁系同源物在此过程中发挥独特作用。

图5. 转化生长因子-β1配体是斑马鱼小胶质细胞发育的关键因子。（A和B）对3天受精后（dpf）的(tgtp1a)、(tg beta 1 b^{-1-})、(tgt beta 2^{-1-})和(tgt beta 3^{-1-})突变体以及野生型同窝幼鱼的视顶盖（OT）中apoeb表达的全原位杂交（WISH）分析（背侧视图，前方朝上）。黑色箭头指示细胞。比例尺，100微米。（B）对每种基因型的apoeb阳性小胶质细胞进行定量分析。每个符号代表一个胚胎；数据以平均值±标准差（SD）表示。组间差异采用Kruskal-Wallis检验，随后进行Dunn多重比较检验（*** ((^{++*} rho<0.001))）。（C）对3天受精后（dpf）的野生型（上图）、(tgtp1a)（中图）和(tgtp1b)（下图）幼鱼的视顶盖（OT）进行共聚焦成像，使用抗Lcp1（L-质体，左）和4C4（中）抗体进行免疫染色。显示了两个通道的合并图像（右）以及框选区域的高倍放大图。白色箭头指示细胞。比例尺，50微米。背侧视图，前方朝上。（D）对每种基因型的整个视顶盖（OT）中L-质体阳性；4C4阳性双阳性细胞进行定量分析。每个符号代表一个胚胎；数据以平均值±标准差（SD）表示。组间统计学差异采用Kruskal-Wallis检验，随后进行Dunn多重比较检验（*** ((^{* *} rho<0.001))）。dpf，受精后天数。另参见图S2和图S3。

在小胶质细胞完成初始分化后，需要持续的转化生长因子-β信号传导来维持其细胞身份

接下来，我们旨在明确转化生长因子-β（Tgf-β）信号通路在小胶质细胞发育中的时间依赖性要求。我们通过抑制转化生长因子-β受体活性的药理学方法开展了一系列实验。在其中一组实验中，我们从受精后1天（1 dpf）开始，向胚胎施加抑制剂，直至不同时间节点（受精后3、4、5或6天，即3、4、5、6 dpf），随后洗脱抑制剂。此后，让幼体在无抑制剂的环境中生长至受精后6天（6 dpf），对其进行固定处理，并检测载脂蛋白E b（apoeb）的表达情况。

通过WISH检测的表达情况（图6A）。如图6B所示，仅当持续抑制(Tgf- beta)信号通路时，才会在受精后6天（6 dpf）出现apoeb表达的缺失（1.2±1.4个细胞，(n=19) 对比 28.9±4.6个细胞，(n=34)）。相反，当至少在表型分析前一天移除抑制剂时，apoeb阳性细胞的数量与二甲基亚砜（DMSO）处理的对照组幼虫相当（1-3 dpf：23±6.9个细胞，(n=24) 对比 26±7.9个细胞，(n=23)；1-4 dpf：23.7±5个细胞，(n=27) 对比 21.9±8.6个细胞，(n=) 13；1-5 dpf：20.8±4.2个细胞，(n=13) 对比 20.8±4.6个细胞，(n=6)）。移除抑制剂后apoeb表达的快速恢复表明，在受精后3至6天（3-6 dpf）期间，持续的转化生长因子-β（Tgf-β）活性不仅是小胶质细胞基因表达诱导所必需的，也是其维持所必需的。与此一致的是，当所有小胶质细胞均已表达apoeb时，从受精后3天（3 dpf）开始进行抑制处理，也会在6 dpf时导致apoeb表达的缺失（2.8±2.6个细胞，(n=15) 对比 32±5.3个细胞，(n=14)）（图6A和6B）。接下来，我们将幼虫暴露于Repsox中6、7或8日龄受精后（dpf）至10日龄受精后（图6C）。尽管延长Tgf-β信号抑制会导致发育延迟，使得大小匹配的动物之间的比较变得复杂（图S4），但从这些起始时间点中的任意一个开始处理，均会导致10日龄受精后斑马鱼脑部apoeb表达完全消失（6–10日龄：39±6.7个细胞，(n=25) 对比 0±0个细胞，(n=14)；7–10日龄：44.4±9.3个细胞，(n=22) 对比 0.1±0.2个细胞，(n=40)；8–10日龄：38.9±8.5个细胞，(n=24) 对比 0.3±0.7个细胞，(n=26)）（图6D；图S4）。为进一步评估小胶质细胞的分化，我们使用Tg(nacre; p2ry12:P2ry12-GFP; mpeg1.1:mCherry)双转基因幼鱼，通过活体成像检测mCherry+细胞中p2ry12-GFP小胶质细胞标志物的表达。如图6E和6F所示，从6日龄受精后至10日龄受精后用Repsox处理，会消除P2ry12转基因的表达（35.5±7.1个细胞，(n=20) 对比 0.1±0.5个细胞，(n=14)），这证实即使经过6天的发育，小胶质细胞仍依赖Tgf-β信号通路。

为探究转化生长因子-β（Tgf-β）信号通路在发育后期的作用需求，我们在每个时间点用抑制剂处理两天后，对解剖出的脑组织进行了整体原位杂交（WISH）分析（图6G）。在受精后14天和20天（dpf）进行抑制处理，显著降低了载脂蛋白E-B（apoeb）的表达（图6H、6I），这表明小胶质细胞在这些阶段仍对Tgf-β信号通路敏感。为进一步探究该表型，我们分析了携带巨噬细胞增强子绿色荧光蛋白（mpeg1:GFP）转基因的(tg beta 1 b^{-1-})突变体斑马鱼。共聚焦成像结果显示，在受精后20天，纯合突变体与其野生型对照兄弟姐妹的mpeg1:GFP阳性细胞数量相当（纯合突变体：80.2±15.6个，(n=4)；对照组：74.2±13.8个，(n=5)）（图6J、6K），但这些突变体的apoeb转录本表达缺失（图6L）。综合来看，这些研究结果表明，Tgf-β1b的缺失不会损害小胶质细胞的存活，因此经Repsox处理的斑马鱼在受精后20天以及(tgf beta 1 b^{-1-})突变体中出现的apoeb信号缺失，并非由细胞数量减少导致。我们由此得出结论：Tgf-β信号通路不仅参与小胶质细胞相关基因的初始诱导，还需要在斑马鱼发育的至少前三周持续发挥活性，以维持小胶质细胞的转录特征。

图6. 分化后小胶质细胞的身份维持需要持续的Tgf-β信号传导。(A)药物处理方案的示意图。(B) 在不同发育时间窗口用二甲基亚砜（DMSO）或1μM雷索司他（Repsox）处理的6天胚胎（dpf）视顶盖（OT）中载脂蛋白E阳性（apoeb+）小胶质细胞的定量分析。每个符号代表一个胚胎；数据以平均值±标准差（SD）表示。使用多重t检验，随后进行错误发现率（FDR）多重比较检验分析统计学差异（*** ((^{* *} rho<0.001))）（C）药物处理方案的示意图。(D) 对在不同发育阶段（6–10 天龄、7–10 天龄或 8–10 天龄）用 DMSO 或 1μM Repsox 处理的 10 天龄斑马鱼幼鱼视顶盖中 apoeb+ 小胶质细胞的定量分析。每个符号代表一个胚胎；数据以平均值±标准差表示。使用多重 t 检验随后进行错误发现率多重比较检验分析统计学差异（*** ((^{* * *} p<0.001))（E）从受精后第6天至第10天用二甲基亚砜（上图）或1μM雷帕霉素（下图）处理的Tg(mpeg1:mcherry; p2yr12:p2yr12-GFP)转基因斑马鱼幼虫在受精后第10天的共聚焦活成像图。展示了mCherry通道（左）、GFP通道（中）和合并通道（右）。插图为框选区域的放大图。比例尺为50微米。(F) 各条件下 p2yr12-GFP；mpeg1:mcherry 双阳性细胞的定量分析。每个符号代表一个胚胎；数据以平均值±标准差表示。使用曼-惠特尼检验分析差异（*** ((^{* *} rho<0.001))(G) 药物处理方案的示意图。（H和I）对分析前经DMSO或1μM Repsox处理2天的16天龄（dpf）和20天龄（dpf）野生型斑马鱼解剖的大脑中apoeb的免疫荧光染色（WISH）结果。黑色箭头指示视顶盖（OT）中apoeb阳性的小胶质细胞。图像分别代表14条（16天龄）或19条（20天龄）DMSO处理鱼，以及14条（16天龄）或20条（20天龄）Repsox处理鱼。比例尺为50微米。（J和K）基于共聚焦成像，对从20天pf（受精后天数）的(20 dpf tgf beta 1 b^{-1-})突变体和(tg beta 1 b^{+/+})野生型同胞鱼大脑的OT区域中绿色荧光蛋白阳性（GFP+）细胞进行定量（J）。白色箭头头指示mpeg阳性（mpeg+）细胞。比例尺为50微米。(L) 针对从(20 dpf tgfb 1 beta^{+/+})和(tg beta 1 b^{-1})号鱼解剖的大脑中apoeb的WISH染色结果。黑色箭头指示视顶盖（OT）中apoeb阳性的小胶质细胞。图像为每种基因型3条鱼的代表性结果。比例尺为50微米。E、H-K图为背侧视图；前方朝上。dpf指受精后天数。另见图S4。 

成年小胶质细胞个体发育中Tgf-β1b信号的必要性

与小鼠中原始巨噬细胞建立常驻群体不同，斑马鱼的胚胎小胶质细胞并非如此,在整个生命周期中持续存在。相反，它们会被源自造血干细胞（HSC）来源的胎儿单核细胞的成年小胶质细胞逐渐完全取代。由于这一波成年小胶质细胞在大脑中的定植大约始于发育三周左右， 因此在受精后20天观察到小胶质细胞仍对转化生长因子-β（Tgf-β）信号抑制敏感，这表明胚胎小胶质细胞在其整个生命周期中都依赖这一通路。这一发现也提出了一个问题，即转化生长因子-β（Tgf-β）信号传导是否在成年小胶质细胞谱系的建立中发挥作用。

为解决这一问题，我们分析了携带 Tg(kdrl:Cre; actb2:loxP-STOP-loxP-DsRed; mpeg1:GFP) 三重转基因的成年 (tg beta 1 b^{-1-}) 突变斑马鱼，该转基因可通过胚胎小胶质细胞（((GFP ^{low } DsRed ^{-}))）和成年小胶质细胞（((GFPlow)，dsRed+）不同的发育起源对二者进行区分²⁴。对脑细胞悬液的流式细胞术分析显示，(tg beta 1 b^{-1-}) 个体的小胶质细胞数量正常，且与野生型斑马鱼一样，均均匀表达 dsRed（图7A、7B）。对完整成年斑马鱼大脑的三维荧光成像证实了这些结果，显示 (GFP+) 与 dsRed 双阳性的小胶质细胞均匀分布于脑实质中（图7C）。这些结果表明，在缺乏 Tgf-β1b 信号传导的情况下，造血干细胞来源的成年小胶质细胞的产生和脑定植过程正常发生。然而，与原始巨噬细胞来源的小胶质细胞一样，(tg beta 1 b^{-1-}) 个体的成年小胶质细胞未能表达成熟小胶质细胞标志物 P2ry12（图7D、7E）和 apoeb（图7F），这一点分别通过流式细胞术和整体原位杂交技术得到了证实。

值得注意的是，这些分析还显示，在(tg beta 1 b^{-1-})的大脑中完全不存在树突状样细胞。我们此前已将这些细胞鉴定为一种独特的实质细胞群，其特征为高表达mpeg1:GFP、依赖转录因子batf3，同时具有星状形态和定型的解剖学定位。34 与其缺失一致，通过流式细胞术（图7A和7B）以及完整成年大脑的三维荧光成像（图S5）结果显示，在Tg(kdrl:Cre; actb2:loxP-STOP-loxP-DsRed; mpeg1:GFP)转基因突变体动物中，不再能检测到对应树突状样细胞的(mрeg1:GFP ^{high })细胞群。综上，这些研究结果表明，tgfβ1b对于成年小胶质细胞群的产生和大脑定植并非必需，但对于成熟小胶质细胞的获得是必不可少的。标志物载脂蛋白Eb（apoeb）和P2Y12受体，以及脑树突状样细胞的建立。

图7.(tgfb1b)突变体中成年小胶质细胞分化受损。（A和B）流式细胞术分析从成年野生型（左图）和tgfβ1b突变体（右图）动物携带的Tg（kdrl：Cre；actb2：loxP-STOP-loxP-DsRed；mpeg1：GFP）记者的脑细胞悬浮液。（A）代表性流式细胞术图显示(GFP)；dsRed+人口对应的小胶质细胞（红门）和(GFP)；dsRed+人口包含树突状细胞（DC）样细胞（蓝门）。（B）每个基因型的小胶质细胞（左）和DC样细胞（右）的量化，作为总活脑人口的百分比。条代表来自2个独立实验汇集的8个个体的平均±SD。***(^{* *} p<0.001)（双尾未配对t测试）。（C）组织清除的成人大脑的三维成像来自野生型（顶部图像）和tgfβ1b突变体（底部图像）Tg（kdrl：Cre；actb2：loxP-STOP-loxP-DsRed；mpeg1显示背侧视图（顶部前部）。显示GFP（左）、dsRed（以品红色显示，中间）和合并通道（右）（刻度条，400μm），以及视顶盖的higher-magnification视图（刻度条，50μm）。小胶质细胞在所有大脑区域都被鉴定为(GFP+)：(dsRed)细胞，而血管(GFP)；dsRed+（D和E）流式细胞术分析来自成年野生型（左图）和(tg beta 1 b^{-1-})（右图）携带Tg的鱼的脑细胞悬浮液（kdrl：Cre；actb2：loxP-STOP-loxP-DsRed；p2ry12：p2ry12-GFP）记者。（D）代表性流式细胞术图显示p2ry12-(GFP+)细胞（黑圈）在预门控pactn：Switch-(DsRed)群体中。（E）量化p2ry12-GFP+细胞占总dsRed+脑细胞群体（包括免疫和血管细胞）的百分比。条代表来自2个独立实验的7至9个个体的平均值±SD。***(^{*+*} p<0.001)（双尾不成对t检验）。

转化生长因子-β1b 缺乏会损害胚胎来源和成年来源小胶质细胞的小胶质细胞转录程序获取，同时促进巨噬细胞相关基因的表达

为了更精确地定义与 tgfβ1b 缺陷相关的小胶质细胞转录组改变，我们接下来开展了单细胞 RNA 测序实验。我们从 20 天胚胎期（dpf）的 Tg(kdrl:Cre; actb2:loxP-STOP-loxP-DsRed; mpeg1:GFP) 对照组和突变体斑马鱼中制备脑细胞悬液，这一发育阶段正是胚胎来源和成年来源的小胶质细胞群共存。该方法实现了同时进行转录组分析(GFP+) 对应：(DsRed) 胚胎小胶质细胞（eMG）和 (GFP+)；dsRed成年小胶质细胞（aMG）（图S6）。这也最大限度减少了因缺乏实质树突状细胞而产生的潜在混杂效应，这类细胞仅在此阶段开始出现（未发表观察结果）。与预期一致，对照组胚胎来源小胶质细胞（eMG）和成年来源小胶质细胞（aMG）群体均稳定表达经典小胶质细胞标志物，包括apoeb、apoc1、p2ry12、havcr2、lgals3bpb、lgals9l1、ccl34b.1和itgam（图7G和7H）。相比之下，胚胎来源和成年来源的Tgf-β1b缺陷型小胶质细胞均显著降低了这些小胶质细胞身份基因的表达。同时，这些细胞上调了一组巨噬细胞相关标志物的表达，包括marco、mfap4.4、f13a1b、fgl2a、lygl1、mrc1a、mfge8b和icn，这表明其转录状态向巨噬细胞样转变（图7G和7H）。值得注意的是，不同基因型之间mpeg1.1、csf1ra和csf1rb的表达未发生变化，这表明尽管Tgf-β1b缺陷型细胞无法获得成熟的小胶质细胞身份，但仍保留了核心的巨噬细胞基因表达程序。综上，这些结果证实，Tgf-β1b信号通路是胚胎来源和成年来源小胶质细胞建立成熟小胶质细胞转录程序所必需的。在缺乏该信号通路的情况下，这些细胞始终处于未完全分化的巨噬细胞样状态。

讨论

本研究证实，TGF-β信号通路在小胶质细胞个体发育中的关键作用在斑马鱼胚胎这一非哺乳类脊椎动物模型中具有保守性。通过互补的药理学和遗传学方法，我们发现胚胎发育早期阻断TGF-β受体活性会消除发育中脑内小胶质细胞特异性标志物的表达。这些发现与TGF-β信号通路在小胶质细胞成熟过程中不可或缺的既有结论一致。在人类和小鼠中均存在此现象，并且这一研究首次提供了证据，表明这种依赖关系在整个脊椎动物进化过程中一直保持不变。

研究证实，转化生长因子-β（Tgf-β）信号通路可驱动斑马鱼小胶质细胞的成熟，这为在体内解析调控这一过程的早期机制提供了前所未有的契机。我们首先聚焦于小胶质细胞个体发育的初始发育窗口，这一阶段在哺乳动物中一直难以开展深入研究。我们利用斑马鱼胚胎的光学透明特性，以及时间可控的Tgf-β受体抑制策略，在体内检测了Tgf-β信号通路对小胶质细胞发育各早期阶段的作用。综合来看，我们的研究结果支持这样一种模型：原始巨噬细胞进入脑实质后，会接收到Tgf-β信号，该信号通过诱导包括p2ry12和apoE在内的核心转录特征，启动其向小胶质细胞的转化。这与小鼠研究的结论一致，即转化生长因子-β（TGF-β）受体信号通路在小胶质细胞及其/或其前体细胞中发挥细胞自主性作用促进成熟。重要的是，我们的数据完善了这一模型通过提供直接的体内证据，证明 Tgf (- beta) 对于原始巨噬细胞的特化和脑定植并非必需，但对于小胶质细胞特异性转录特征的建立至关重要。

在哺乳动物中，TGF (-beta 1) 亚型是小胶质细胞的关键驱动因子成熟。我们的研究结果将这一原理拓展至斑马鱼，研究表明小胶质细胞的发育同样依赖于Tgf- (beta 1)配体，这进一步凸显了TGF (- beta R)信号轴在小胶质细胞个体发育中的进化保守性。值得注意的是，尽管斑马鱼基因组包含两个TGFβ1旁系同源物TGFβ1a和TGFβ1b，但只有TGFβ1b是小胶质细胞分化所必需的，因为TGFβ1a缺失的胚胎能正常发育出小胶质细胞。这表明在该基因家族中，TGFβ1旁系同源物发生了亚功能化。相比之下，我们观察到斑马鱼受体旁系同源物TGFβR1a（ALK5a）和TGFβR1b（ALK5b）之间存在功能冗余，这二者是哺乳动物TGF-βR1的两个功能性直系同源物。只有当这两个受体旁系同源物均被破坏时，小胶质细胞的分化才会完全受阻。在单个ALK5突变体胚胎中观察到的小胶质细胞数量部分减少现象，提示存在一种剂量共享机制，即两个旁系同源物均参与在小胶质细胞发育过程中维持足够的受体水平。

我们的研究还提供了证据，反驳了其他转化生长因子-β（Tgf-β）家族成员——Tgf-β2和Tgf-β3在小胶质细胞早期发育中发挥作用的观点。在哺乳动物中，这些亚型的小胶质细胞功能在很大程度上仍未被探索，部分原因是任一基因的全身敲除小鼠都会因严重的发育缺陷（包括呼吸衰竭）在出生后不久死亡。 相比之下，缺乏tgfβ2或tgfβ3的斑马鱼能存活至成年，这使得我们可以直接在体内评估小胶质细胞的发育。我们的研究表明两种突变体在发育早期均能正常表达经典小胶质细胞标志物，这表明两种配体都不是小胶质细胞分化所必需的。这些结果支持了转化生长因子-β（TGF-β）亚型具有非冗余、情境特异性功能的观点，也与近期研究结果一致——即成年小鼠小胶质细胞稳态维持过程中，TGF-β3 无法弥补TGF-β1缺失造成的影响。本研究进一步拓展了这些发现，强调了不同发育阶段和生理环境下，各TGF-β亚型的功能需求具有情境依赖性。值得注意的是，斑马鱼与小鼠突变体的表型严重程度存在差异，这可能是由于斑马鱼没有肺部结构，从而避免了因TGF-β2或TGF-β3缺乏而导致的小鼠早期致死现象。

在此，下一步的重要研究方向是确定驱动斑马鱼小胶质细胞个体发育的 tgfb1b 旁系同源物的细胞来源。近期在小鼠中的研究揭示了一种自分泌机制：小胶质细胞来源的 TGF-β1 由放射状胶质细胞上表达的 ITGB8 局部激活，这凸显了体内调控小胶质细胞发育的复杂细胞相互作用。探究斑马鱼中是否存在类似机制将是未来研究的重要方向。然而，要解答这一问题，还需开发更多的遗传工具。

除了在小胶质细胞祖细胞中的作用外，我们的研究结果表明，分化的小胶质细胞需要持续的转化生长因子-β（TGF-β）信号传导来维持其核心分子特征，药理学抑制后关键特征转录本的缺失或减少也证实了这一点。转化生长因子-β（TGF-β）在维持小胶质细胞特征方面的重要性在出生后早期已得到充分证实小鼠，且被认为在人类小胶质细胞中具有保守性。值得注意的是，TGF-β信号通路在调控小胶质细胞特异性基因表达中的作用具有时间依赖性：在成年小胶质细胞中破坏该通路产生的影响微乎其微,对其稳态特征几乎无影响，但反而可能促进一种反应性表型。反应性表型。 这表明转化生长因子-β（TGF-β）的功能在出生后小胶质细胞与成年小胶质细胞之间存在发育转换。因此，有研究提出，转化生长因子-β（TGF-β）信号传导可能在特定的发育窗口期内发挥作用，通过表观遗传机制稳定小胶质细胞的身份。 尽管普遍认为在小胶质细胞成熟过程中转化生长因子-β（TGF-β）的活性持续存在需求，但关于其持续必要性的直接证据仍然研究范围有限。通过我们具有时间灵活性的药理学方法，我们发现，即便在小胶质细胞特异性基因表达建立后，持续的(Tgf- beta)信号传导仍是维持小胶质细胞身份所必需的，这表明该通路在细胞分化和身份维持过程中均发挥作用。我们进一步证实，斑马鱼小胶质细胞在发育的至少前三周内仍依赖Tgf-β信号传导。由于斑马鱼胚胎小胶质细胞具有瞬时性，在此期间会被定型的细胞群逐步取代时期，这些研究结果表明胚胎小胶质细胞在整个生命周期中都依赖Tgf-β信号通路。

将这些观察结果延伸至成年阶段，我们发现转化生长因子-β（Tgf-β）信号通路对于斑马鱼中定型小胶质细胞群的建立同样至关重要。尽管小胶质细胞的第二批能够成功定植于成年tgfb1b突变体的脑区并呈现正常的空间分布，但这些细胞未能激活小胶质细胞分化程序，这一点可由未检测到载脂蛋白Eb（apoeb）和嘌呤能受体P2Y12（p2ry12）的表达得到证实。转录组学分析进一步证实，胚胎和成体群体中的小胶质细胞均丧失了细胞身份，表明这些持续存在的细胞保留了未分化巨噬细胞的特征。尽管该表型与小鼠产前的相关观察结果一致，但与成体中的报道存在差异——在成体中，转化生长因子-β受体（Tgf-βR）信号通路的破坏对核心小胶质细胞转录程序几乎没有影响。我们的研究结果并非表明转化生长因子-β（Tgf-β）的作用存在本质差异，而是支持斑马鱼中胚胎小胶质细胞和定型小胶质细胞均依赖于共同的发育框架这一观点。此前已有研究证实干扰素调节因子8（irf8）、转录因子SPI1/PU.1（spi1/pu.1）以及集落刺激因子1受体（csf1r）具有类似的作用，而本研究进一步将Tgf-β信号通路鉴定为两种小胶质细胞群体共有的另一保守决定因素

值得注意的是，我们发现斑马鱼发育不成熟的Tgf-β缺陷小胶质细胞会持续存在于脑实质中。这与Butovsky及其团队的最初研究结果形成对比，后者报道了中枢神经系统特异性TGF-β (beta 1)基因缺失的新生小鼠中，小胶质细胞会进行性丢失。然而，与我们的观察一致的是，其他研究表明，小鼠小胶质细胞中TGF-β (cdot beta R)信号通路的缺失并不会损害细胞存活，TGF-β信号通路缺陷的小胶质细胞仍会持续存在直至成年。

总之，本研究证实，小胶质细胞发育过程中对TGF-β信号通路的需求在斑马鱼中是保守的，这为哺乳动物相关研究提供了一种互补模型。特别是，(alk5 ^{DM})和tgfb1b突变体斑马鱼品系是研究小胶质细胞成熟受损如何在稳态和病理条件下影响小胶质细胞功能及中枢神经系统发育的宝贵体内工具。鉴于TGF-β相关的f(beta 1)缺陷、其他TGF-β信号通路异常疾病与严重中枢神经系统功能障碍之间存在密切关联，人类，这些研究也可能有助于阐明其贡献小胶质细胞功能障碍与疾病发病机制的关系

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苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。