标题：High-throughput functional analysis of autism genes in zebrafish identifies convergence in dopaminergic and neuroimmune pathways

期刊：Cell Reports

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.112243

摘要

从自闭症谱系障碍（ASDs）的基因发现推进到识别生物学相关机制，始终是一项核心挑战。本研究对斑马鱼突变体中10个ASD相关基因在行为、结构和神经环路层面开展平行体内功能分析，揭示了基因功能缺失所产生的独特与重叠效应。全脑图谱分析发现，前脑和小脑是造成脑体积差异的最主要区域，而感觉运动调控相关区域（尤其是多巴胺能区域）则与基础脑活动的改变相关。最后，研究证实部分突变体中ASD基因功能缺失会导致小胶质细胞整体数量增加，这表明神经免疫功能障碍是与ASD生物学相关的关键通路。

图形摘要

引言

近年来，我们识别与孤独症谱系障碍（ASDs）密切相关基因的能力取得了显著进展，已鉴定出超过100个风险基因。这些具有显著效应的基因，是通过全外显子组测序在患者体内发现反复出现的新发致病性突变而确定的，它们有望为揭示相关病理生理机制提供线索。尽管这些基因的分子功能看似各不相同，但一些共同的生物学通路正逐渐显现，例如基因表达调控和神经元通信通路。然而，孤独症谱系障碍相关基因具有高度多效性，这进一步增加了识别统一病理生理机制的难度。为解决这一问题，相关研究聚焦于识别趋同的机制跨基因的机制，其基本原理是阐明共同的通路或许能揭示具有治疗潜力的分子靶点。

近期研究发现了风险基因存在生物学趋同的证据。共表达网络和整合基因组学分析发现，在发育中期，自闭症谱系障碍基因在兴奋性和抑制性神经元中的表达存在显著富集至胎儿晚期，为兴奋性-抑制性发育中大脑的兴奋/抑制（E/I）失衡是自闭症谱系障碍（ASDs）的核心致病通路。体外研究为这一机制提供了额外支持，研究表明，在人类大脑类器官中破坏三个自闭症谱系障碍基因，会导致兴奋性和抑制性神经元群体发育不同步11 此外，有研究指出自闭症谱系障碍基因功能缺失会引起神经增殖和分化异常。 体内研究在非洲爪蟾中的研究证实了10个自闭症谱系障碍基因在神经发生过程中的关键作用，而在小鼠皮层中针对35个与自闭症谱系障碍及神经发育障碍相关的基因进行靶向研究，则揭示了其关键作用这些基因在神经元和胶质细胞谱系中均发挥关键功能，凸显了神经发生和神经胶质生成在自闭症谱系障碍生物学中的作用。

与此同时，人们越来越认识到，自闭症谱系障碍（ASD）相关基因具有独特的神经发育效应，这对于界定具有生物学意义的亚群以及开发针对性治疗方法同样至关重要。例如，对16个携带自闭症谱系障碍相关突变的小鼠突变体进行的功能性磁共振成像分析，识别出了大脑连接性亚型尽管存在表型差异，但这些突变体仍存在脑连接亚型。同样，尽管26个自闭症谱系障碍基因的小鼠突变体表现出异质性神经解剖学表型，但对这些突变体进行聚类通过共同特征对这些突变体进行聚类，从而确定了基因亚群。因此，尽管存在异质性，但基于共同的生物学特征对基因进行分类，可能是自闭症谱系障碍精准医疗的一条途径，能弥合基因发现与可操作的生物学机制之间的差距。

在本研究中，我们旨在利用斑马鱼的独特特征，明确10个自闭症谱系障碍基因的神经发育效应，以期在风险基因中识别出具有功能意义的表型。斑马鱼在这方面具有重要优势，包括可直接观察透明胚胎中发育中的脊椎动物大脑，且适用于大规模基于行为的筛选，以及基因操作的便捷性。我们团队及其他研究团队已证实该系统在药物行为学筛选和遗传筛选方面的优势与ASD及其他神经精神疾病相关的研究。还有充分证据表明，斑马鱼与哺乳动物在基因表达、神经递质系统、药理学通路以及基本神经环路层面的神经机制具有保守性，这凸显了斑马鱼在阐明与自闭症谱系障碍相关的生物学机制方面的转化潜力。

本研究建立了一套在斑马鱼体内开展自闭症谱系障碍（ASD）基因功能分析的实验流程。我们结合高通量自动化行为学检测、全脑结构与环路分析以及转录组测序（RNA-seq）技术，从多个层面解析了10个ASD基因斑马鱼突变体所特有的及共有的表型。尽管各突变体在不同检测维度下均无完全一致的表型，但我们明确发现ASD基因的剂量变化会影响脊椎动物发育过程中的基础觉醒与感觉加工行为、脑体积以及脑部活动。研究表明，ASD基因广泛影响脑体积，且证实前脑（端脑）是导致脑体积表型差异的最主要区域。全脑活动图谱分析显示，丘脑与后结节的基础活动存在显著差异，同时发现感觉-运动调控相关的多巴胺能区域是各类表型的关键汇聚点。此外，我们对表型最显著的两个ASD基因突变体DYRK1A和SCN1A/SCN2A开展转录组测序，结果有力证明了ASD基因下游的分子通路在斑马鱼与哺乳动物中具有保守性，并揭示了发育中大脑内多巴胺能系统与神经免疫功能异常与ASD发病机制相关的证据。

结果

斑马鱼ASD基因突变体的产生

我们选择了10个与斑马鱼ASD密切相关的基因进行功能分析（图1A）。除了我们之前研究的综合征ASD基因CNTNAP2之外，21我们还针对另外9个由全外显子组确定的基因测序，，根据证据选择8这些基因跨越一系列生物学功能，代表与自闭症相关的通路，包括基因表达调控（CHD8、CUL3、KDM5B、POGZ和TBR1）、神经元通讯（CNTNAP2、SCN1A/SCN2A和GRIN2B）和细胞骨架（DYRK1A和KATNAL2）。

为了分析基因功能丧失（LoF）在发育大脑中的影响，我们使用CRISPR-Cas9、TALENs或锌指核酸酶靶向斑马鱼每个ASD基因的同源基因，并为每个携带早期移码突变的基因生成两个稳定的突变系，这些突变被预测会导致截断（图1A和S1A-S1I，表S1，STAR方法）。对于在斑马鱼中重复的基因，两个同源基因都被靶向。斑马鱼同源物显示与人类基因高度保守，在氨基酸水平上平均显示约70%的同一性（表S1）。大多数纯合子和所有杂合子突变体缺乏大体形态表型，并存活到成年期，但纯合子cul3和scn1lab突变体除外，它们显示作为幼虫的大体形态表型（图S1J-S1K）。在所有基因的纯合子和杂合子突变体中进行表型分析，除了cul3，其中中间使用基因型（例如(cul 3 a^{Delta 7 / Delta T} cul 3 b^{Delta 20 /+})）是因为纯合子的严重形态异常。

图1. 自闭症谱系障碍基因在斑马鱼中的表达及突变体构建。(A) 斑马鱼突变体品系。突变体序列参见表S1和图S1A–S1I。(B) 24和48小时受精后（hpf）斑马鱼中自闭症谱系障碍（ASD）基因直系同源物的全胚RNA原位杂交结果。cntnap2a和cntnap2b的相关结果参见Hoffman等人（2016）的研究²¹。左侧三幅图为侧视图，右侧图为背视图；前方朝左；端脑（tel）、间脑（di）、中脑-后脑边界（MHB）、视顶盖（OT）、后脑（HB）。比例尺为0.1毫米。(C) 利用主成分分析¹³将斑马鱼RNA测序（RNA-seq）数据集³⁰映射至人类BrainSpan发育转录组RNA测序数据集³¹，展示了主成分1（PC1）。条带代表人类发育阶段平均PC1值的95%置信区间，斑马鱼样本的生物学重复以点表示。受孕后周数（pcw）、受精后小时数（hpf）、受精后天数（dpf）。完整主成分分析结果参见图S1L。

斑马鱼ASD基因表达的发育轨迹

为了表征ASD基因在发育中的斑马鱼大脑中的表达，我们进行了全坐骑原位杂交。我们发现ASD基因的同源体在受精后24至48小时在斑马鱼中枢神经系统中广泛表达，许多基因在端脑和中脑后脑边界（图1B）表现出强烈的表达，这是神经源性区域。33为了研究斑马鱼中ASD基因表达与人脑的比较，我们使用主成分分析将斑马鱼胚胎和幼体阶段30的转录组数据映射到人类大脑发育转录组31上。我们的分析显示斑马鱼的发育遵循清晰的时间轨迹，可以映射到人脑发育的相关阶段（图1C和S1L）。有趣的是，我们表明，当ASD基因在斑马鱼中枢神经系统中表达时，胚胎阶段（图1B）与人类产前中期最接近，符合它们在人类大脑中的表达模式，而幼虫我们进行表型测定的阶段（受精后5-6天[dpf]）映射到人类产前晚期（图1C）。因此，我们在斑马鱼中研究的时间点对于理解人类大脑发育相关阶段中自闭症谱系障碍（ASD）基因的功能，这些内容很可能具有高度相关性。

趋异与趋同决定了基本的行为表型

我们首先旨在确定ASD基因LoF影响斑马鱼的基本觉醒和感觉加工行为，以获得基因中断导致的电路水平效应的读数。我们使用高通量、自动的睡眠-觉醒活动和视觉-惊吓反应（图2A和2B，STAR方法）进行定量行为分析，并在所有20个突变系中测量了24个睡眠-觉醒和惊吓参数（表S2）。总的来说，我们使用每个基因的两个突变系，在6 dpf处从杂合体中(tested >7,500)背景匹配的幼虫（图1A）。我们定义了独特的行为每个ASD基因突变体的ioral指纹（图2C），揭示了ASD基因LoF对这些行为基础电路的差异影响。使用分层聚类，我们发现相同基因共簇的独立突变系的行为特征（图2C），表明每个基因的突变导致相似的行为特征。

我们在突变体中发现了一系列收敛和发散的行为表型（图2C）。例如，scn1lab和dyrk1a的突变体表现出最稳健的行为表型，包括scn1lab突变体对开灯刺激的反应增加，dyrk1a突变体对关灯刺激的反应减少（图2D和2E）。两种突变体都表现出白天活动减少，而只有scn1lab突变体表现出夜间多动（图2D和2E）。鉴于关联，这些行为可能反映了这些基因的保守作用在DYRK1A基因突变导致人类视觉障碍以及SCN1A基因突变使人类对视觉刺激敏感度升高36的相关研究中，这两个基因均与人类睡眠障碍存在关联。chd8突变体表现出白天睡眠时间缩短的高度特异性表型（图2F），这与该基因在果蝇和人类体内调控睡眠结构的保守作用一致；而tbr1突变体则表现出白天活动亢进（图2G）。携带自闭症谱系障碍（ASD）相关新发突变的Tbr1小鼠突变体，其运动活性也出现轻度升高40。杂合突变体呈现出反映基因剂量效应的中间表型（图S2A–S2J）。cntnap2突变体夜间活动亢进等其他行为表型，也在图S2F–S2J中有所展示。

图2. 斑马鱼自闭症谱系障碍基因突变体的行为表型（A和B）实验设置与行为检测。视觉惊跳反应：5日龄幼体以29秒的间隔接受5次1秒的灯光熄灭或开启刺激。睡眠-觉醒周期：5至7日龄幼体置于14小时光照:10小时黑暗的白光环境中。展示了视觉惊跳反应和睡眠-觉醒周期的相关参数（详见STAR实验方法）。

大脑大小差异集中在神经发生区域

鉴于自闭症谱系障碍（ASDs）中已观察到大脑发育异常的情况⁴¹，我们接下来探究了自闭症谱系障碍基因功能丧失（LoF）对大脑体积的影响。我们旨在确定不同风险基因之间可能受影响的相似脑区范围，以揭示共同的易感机制。为此，我们将对6天龄（dpf）幼虫全脑进行总细胞外信号相关激酶（tERK）免疫染色的共聚焦图像配准到标准斑马鱼参考脑上（图3A，STAR方法学）。我们对8个主要脑区的体积区域差异进行了量化，分析了来自10个突变品系的背景匹配的纯合子、杂合子和野生型斑马鱼（图3）。分析发现，大多数影响多个脑区的纯合突变体均表现出独特的脑体积表型（图3C，表S3）。纯合dyrk1a突变体在所有脑区均表现出最显著的脑体积减小表型，其中前脑的影响最为显著（线性混合模型）（图3D-3F）。dyrk1a杂合子也表现出中等程度的表型。这表明存在基因剂量效应（图S3A–S3C）。纯合幼虫的脑容量下降约20%，但体长并未出现相应的下降（仅约5%）（图S3D），这说明dyrk1a功能缺失对脑容量具有特异性影响。这与DYRK1A在果蝇、非洲爪蟾和哺乳动物中调控脑容量的保守作用相一致。scn1lab、chd8、tbr1、kdm5b和cul3突变体中也观察到了脑容量表型异常，这些突变体主要影响前脑（端脑）和中脑-后脑边界区域（图3C、3G），而这些区域正是这些基因高表达的神经发生区域（图1B）。

为了表征共有表型，我们通过计算纯合子每个脑区的组合p值，确定了与体积差异关联最密切的脑区使用Fisher方法对突变体和(cui3a ^{Delta 7 / Delta 7} cui3b ^{Delta 20 /+})进行分析。最初鉴于dyrk1a的表型强度，本分析将其排除在外。分析显示，前脑（端脑）是导致脑尺寸差异的最主要因素((p=8.32 ×10^{-6})（费希尔联合概率检验），其次是小脑((p=1.35 ×10^{-4}))（图3H和图S3E）。前脑和小脑的体积变化百分比也最大（分别为4.46%和5.39%；对应编号(1.15 ×10^{5} mu m^{3})和(9.74 ×10^{4} mu m^{3})）。这与我们观察到的表型尺寸影响前脑和中脑-后脑边界的结果一致（图3G），表明神经发生区对自闭症谱系障碍（ASD）基因功能丧失（LoF）具有易感性。当分析纳入dyrk1a时，前脑仍是导致脑尺寸（((p=4.9 times)、(10-13)）和体积差异（-6.36%，(1.64 ×10^{5} mu m^{3})）的最主要因素（图S3F）。总体而言，我们的研究结果表明，自闭症谱系障碍基因在神经发生区（尤其是前脑）的脑尺寸调控中发挥着作用。

图3. 自闭症谱系障碍基因的斑马鱼突变体表现出脑尺寸表型。(A) 全脑体积测绘流程（STAR 方法学）。(B) 源自 Thyme 等人（2019）和 Randlett 等人（2015）的八区域斑马鱼脑图谱²²·⁴²。(C) 对比突变体与背景匹配野生型鱼的区域脑体积测量值的层次聚类。聚类热图中的每个矩形代表线性混合模型（LMM）的经 -(log10) 转换的 p 值（红色，突变体中体积增加；蓝色，突变体中体积降低）。经 LMM 检测存在显著体积差异的区域以 ((p <0.05)) 黄色标出。纯合和杂合突变体的 p 值见图 S3A。所有鱼的区域原始体积定量数据见表 S3。(D) 6 天龄（dpf）的 (dyrk1aa ^{Delta 77 / Delta 77} dyrk1ab) 品系与野生型幼体的 tERK 免疫染色脑标本。可见突变体前脑体积减小（箭头所示）。背侧视图。FB，前脑；OT，视顶盖；CB，小脑。比例尺，50 微米。(E) (tyrk1aa ^{lrcorner 77 / Delta 77} dyrk1ab ^{lrcorner 8 / Delta 8}(n=18)) 品系与野生型 ((n=18)) 相比，相对于标准斑马鱼参考脑 2 的区域脑体积差异（虚线）²²。(^{* * *} p<0.0001)、(^{* *} p<0.001)、(p 0.05)（单因素方差分析）。(F) 体素水平 Z 评分值，代表 (dyrk1aa ^{lrcorner 77 / Delta 77} dyrk1ab) 品系与背景匹配野生型幼体的脑体积差异。图像从左至右依次为连续切片：轴状视图，第一行，背侧至腹侧；矢状视图，第二行，外侧至内侧。比例尺，Z 评分（红/黄色，突变体中体积增加；青/紫色，突变体中体积降低）。(G) 体素水平 Z 评分值，代表以下品系的脑体积差异：scn1labD44/D44、(chd8 Delta 5 / Delta 5)、(tbr 1 a^{-554 / Delta 64} tbr 1 b^{-10 / Delta 10})、(k d m 5 b a^{lrcorner 17 / Delta 17} k d m 5 b b^{lrcorner 14 / Delta 1}) 以及 (cui3a a^{lrcorner 7 / Delta 7} cui3b ^{lrcorner 20 / 4})。轴状视图，第一行；矢状视图，第二行。矢状视图中的绿色水平线

自闭症谱系障碍基因突变体表现出异质性的大脑活动表型

我们推断，由于自闭症谱系障碍（ASD）基因突变体表现出行为和大脑尺寸相关表型，它们可能也存在基础脑活动的差异，这反映出基因功能丧失（LoF）在神经环路层面的共同效应。为探究这一问题，我们在6天龄（dpf）自由游动的幼鱼中进行了全脑活动图谱绘制，通过对大脑进行磷酸化细胞外信号调节激酶（pERK）和总细胞外信号调节激酶（tERK）免疫染色来标记活性神经元。我们采用定制分析流程，以(>600)为遗传背景匹配的对照，对10个突变品系的纯合子、杂合子和野生型斑马鱼的pERK/tERK比值进行逐体素比较，以此作为活性神经元的检测指标（图4A和图S4A）。总体而言，我们发现更多突变体在基础脑活动上存在显著差异（图4B）与体积（图3C）相比，且活动表型通常比体积表型更具稳定性，这表明ASD基因功能丧失对大脑活动的影响大于对体积的影响。此外，八个主要脑区的活动和体积测量值（图3B）在不同突变体之间相关性不高（图S4B），说明这些效应彼此独立。

我们在ASD基因突变体中鉴定出了独特的大脑活动表型（图4B，表S4）。与我们对突变体行为的分析一致，我们发现ASD基因的功能丧失会导致多种大脑活动表型，没有任何两个突变体表现出相同的基线活动改变模式。纯合型scn1lab突变体表现出最强的表型，其特征是全脑活动显著降低，在前脑（端脑）和缰核中表现得最为明显（图4C-4E）。scn1lab杂合子在这些区域的活动呈中等程度降低（图S4C、S4D），表明存在基因剂量效应。dyrk1a和chd8突变体在丘脑和后结节等多个区域的基线活动均显著降低，而cntnap2突变体在丘脑和下丘脑等多个区域的活动出现显著升高（图4F）。杂合子则表现出中间表型（图S4A、S4E、S4F）。其他显著的表型还包括kdm5b突变体的丘脑活动升高，以及tbr1突变体的双侧缰核活动降低（图4F）。

尽管在大脑活动中观察到了异质性，但我们推断重叠的表型可能代表了在环路水平上的趋同。为了识别在突变体中基础活动存在差异的共有区域，我们计算了野生型和突变体八个主要脑区的组合p值纯合突变体与 (cul 3 a^{Delta 7 / Delta 7} cul 3 b^{Delta 20 /+}) 采用费希尔法方法。由于其表型的严重程度，scn1lab 被排除在本分析之外，否则其表型会单独概括 scn1lab 突变体的表型（图4D和图S4G）。我们对剩余突变体的分析确定，丘脑（((p=9.55 ×10^{-9}))，费希尔联合概率检验）是全脑活动差异的最主要贡献因素，其次是后结节（((p=7.08 ×10^{-7}))）（图4G和图S4H）。这表明，与脑体积不同——在前脑（端脑）中，体积差异对其影响最为显著（图3H）——丘脑尤其容易受到ASD基因功能丧失导致的基础活动改变的影响。综上，ASD基因突变体的脑活动图谱揭示了一系列独特且共有的表型，并指出丘脑是神经环路水平差异的主要贡献者。

图4. 斑马鱼自闭症基因突变体的基础脑活动改变。(A) 全脑活动图谱流程（STAR 方法学）。(B) 利用线性混合模型（LMM）对突变体与背景匹配的野生型斑马鱼的脑区活动（pERK/tERK）进行层次聚类。聚类热图中的每个矩形代表经 LMM 转换后的带符号 p 值（红色表示在突变体中升高；蓝色表示在突变体中降低）。经 LMM 检测存在显著活动差异的脑区以黄色轮廓标出。所有纯合和杂合突变体的 ρ 值见图 S4A。所有斑马鱼各脑区的 pERK/tERK 比值详见表 S4。(C) scn1labD44/D44 突变体和野生型斑马鱼幼鱼在受精后6天（dpf）的 pERK 免疫染色脑（上图）及 pERK 和 tERK 联合免疫染色脑（下图）。注意突变体前脑的 pERK 染色减弱（箭头所示）。背侧视图。FB=前脑；OT=视顶盖；CB=小脑。比例尺=50 微米。(D) scn1labD44/D44 突变体与背景匹配的野生型斑马鱼的标准化脑区活动（pERK/tERK）。（单因素方差分析）。(E) 体素水平的 Z 评分 pERK/tERK 值，代表 scn1labD44/D44 突变体与背景匹配的野生型斑马鱼幼鱼的脑活动差异。从左至右的图像依次为连续切片：轴状位视图，上排为从背侧到腹侧；矢状位视图，下排为从外侧到内侧。比例尺代表 Z 评分（红色/黄色表示在突变体中升高；青色/紫色表示在突变体中降低）。结果经全脑族wise 误差（FWE）校正，初始 p 阈值为 0.0001。(F) 体素水平的 Z 评分 pERK/tERK 值，代表以下品系斑马鱼的脑活动差异：、、和。轴状位视图，上排；矢状位视图，下排。矢状位视图中的绿色水平线对应轴状位视图所示的切片。比例尺代表 Z 评分（红色/黄色表示在突变体中升高；青色/紫色表示在突变体中降低）。除 tbrf 突变体外，所有突变体的结果均经全脑 FWE 校正，初始 p 阈值为 0.05；tbrf 突变体因显著性未达到聚类校正标准，未进行 FWE 校正。tbr1 突变体的缰核（HB）活动显著降低

大脑活动表型在22个神经解剖区域上趋同

为了更精准地表征大脑活动表型，我们对全脑活动（pERK/tERK）数据集进行了映射我们将纯合和杂合突变体以及背景匹配的野生型斑马鱼的全脑活动数据映射到包含149个神经解剖区域和神经细胞类型簇的斑马鱼大脑图谱上（图5A）。我们为每个自闭症谱系障碍（ASD）基因突变体在这149个区域中定义了全脑活动指纹，发现这些指纹大致按大脑主要亚区（端脑、间脑、中脑和后脑）聚类（图S5A），反映出这些区域内相似的活动模式。接下来，我们探究149个区域中哪些在大多数突变体中表现出显著的基线活动差异，这代表了活动模式的趋同现象。为此，我们根据区域在最多数量突变体中呈现显著差异的显著性进行排序，而非依据其在单个突变体中的相对强度。分析发现，149个区域中有22个在至少5个突变体中存在显著差异（线性混合模型，图(p<0.05)）（图5B、5C及表S5）。在这22个区域中，16个（73%）位于间脑，涵盖了广泛参与感觉运动控制和睡眠调节的区域，如背侧丘脑、腹侧丘脑、后结节、顶盖前区和视前区（图5C），凸显出这些区域对ASD基因功能丧失（LoF）的易感性。此外，前22个区域中有7个（包括背侧丘脑）在至少6个突变体中表现出基线活动的显著差异（线性混合模型，图(p<0.05)）（图5C中标星号处，图S5B、S5C及表S5）。scn1lab和dyrk1a突变体中这些区域的基线活动显著降低（图5D、5E），而这两种突变体也表现出最显著的感觉反应性和睡眠-觉醒表型（图2D、2E）。此外，大多数杂合突变体表现出中间表型（图S5D-S5I），这为ASD基因剂量影响这七个区域的基线活动提供了有力证据。

我们接下来研究了排名前22的区域中存在的神经细胞类型。有趣的是，我们发现22个区域中有5个与多巴胺能神经元的发育相关，包括顶盖前多巴胺能簇、otpb和vmat2神经元。簇45,46，以及包含后结节的区域与哺乳动物腹侧被盖区（VTA）47的中脑多巴胺能神经元功能相关的多巴胺能神经元（图5C[斜体]）。此外，在六个突变体中表现出显著活性差异的前七个区域中，有两个是多巴胺能区域：vmat2神经元的顶盖前多巴胺能簇和前顶盖前簇（图S5B和S5C）。因此，我们的分析表明，自闭症谱系障碍（ASD）基因的破坏会影响22个广泛与感觉运动调节相关的神经解剖区域的基础活性，并为多巴胺能区域的趋同性提供了证据。

图5. 突变体的活性表型集中于22个脑区。(A) 兰德莱特等人（2015年）绘制的149个区域斑马鱼大脑图谱⁴²。(B) 至少五种突变体中基础脑活动存在显著差异的22个区域。区域名称见(C)。从左至右展示的图像代表连续切片：轴状视图，第一行由背侧向腹侧；矢状视图，第二行由外侧向内侧。(C) 通过线性混合模型（LMM）对至少五种突变体中基础脑活动存在显著差异的22个区域进行层次聚类（((p<0.05))）。其中五个区域涉及多巴胺能信号传导（斜体）：后结节、顶盖前多巴胺能簇、vmat2簇2、vmat2神经元的前顶盖簇、otpb簇1。每个区域名称旁标注的颜色对应(B)。*至少六种突变体中基础活动存在显著差异的七个区域（图S5B和S5C）。图S5A展示了通过LMM分析得到的至少两种突变体中活动存在显著差异的131个区域的层次聚类。各突变体的显著区域列表见表S5。(D和E) 在至少六种突变体中表现出显著差异的七个脑区中，scn1labD44/D44突变体(D)和dyrk1aa (Delta 77 / Delta 77 dyrk1ab ^{lrcorner 8 / Delta 8})突变体(E)的标准化脑活动（pERK/tERK）与背景匹配的野生型斑马鱼对比。杂合子表型见图S5 (cdots+p<0.0001)、(^{++} p<0.001)、(^{*} p<0.01)、(p 0.05)（单因素方差分析）。

scn1lab 和 dyrk1a 突变体中失调的通路高度保守

为了确定大脑大小、活动和行为表型背后的分子机制，我们进行了全脑RNA测序在两个在各实验中表现出最强表型的突变体中：scn1lab 和 dyrk1a。在受精后6天，从背景匹配的纯合子、杂合子和野生型幼虫的全脑中分离出RNA。通过PANTHER基因本体论（GO）分析以及使用分子特征数据库的基因集富集分析（GSEA）确定了显著失调的通路数据库。我们的分析鉴定出多个趋同的SCN1LAB 和 DYRK1A 突变体中的通路，表明尽管它们具有独特的大脑和行为表型，但存在共同的机制。具体而言，在两种突变体中均显著下调的 GO 通路包括神经发生和神经元分化、突触信号传导以及 GABA 能和谷氨酸能突触（图 6A 和 6B），这些通路存在重叠与之前研究中与自闭症谱系障碍相关的通路一致。细胞周期且dyrk1a突变体中有丝分裂纺锤体组织通路被上调（图6B），这与DYRK1A在细胞周期调控中的已知作用一致⁵²。此外，我们发现scn1lab和dyrk1a突变体中上调的((p=1.12 ×10^{-23})（费希尔精确检验）和下调的((p=4.34 ×10^{-49}))基因集富集分析（GSEA）通路均存在显著重叠（图6C和6E）。共有上调的GSEA通路包括翻译和线粒体氧化磷酸化，这些通路已被证实与与自闭症谱系障碍相关，同时还有细胞周期检查点，这与神经发生发生改变（图6D）。有趣的是，雌激素代谢也显著上调（图6D），这与近期研究表明的雌激素调节功能相符与自闭症谱系障碍（ASD）相关的基因。出乎意料的是，我们发现两种突变体中的补体系统均显著上调（图6D），这提示存在神经免疫功能障碍，我们将在下一节进一步探讨这一问题。两种突变体中显著下调的GSEA通路包括突触信号传导、细胞粘附分子、神经递质释放等基础神经发育过程，以及多巴胺能神经发生过程（图6F），这与我们的大脑活性研究结果（图5C）存在重合之处。在杂合子中也发现了类似的失调通路（图S6A、表S6），这表明存在中度的基因剂量效应。

接下来，我们试图通过假设驱动的GSEA来评估斑马鱼和哺乳动物中失调通路的保守性。56 我们的分析显示，在斑马鱼突变体的失调基因中，与自闭症谱系障碍（ASD）基因相关的哺乳动物转录组数据集显著富集（图6G，STAR方法）。通过将scn1lab和dyrk1a突变体中的差异表达（DE）基因与BrainSpan数据集31中的人类共表达网络模块8,9进行比较，我们发现Willsey等人（2013年）8的早胎期和中胎期模块，以及Parikshak等人（2013年）9的共表达模块M13、M16和M17是差异表达基因富集程度最高的模块（图6G）。有趣的是，这些模块在人类中是自闭症谱系障碍基因表达富集最强的模块，8,9这揭示了在斑马鱼和哺乳动物中，自闭症谱系障碍基因下游的通路具有极高的保守性。该共表达模块，与免疫激活相关的M11模块57是dyrk1a突变体大脑中上调基因里富集程度最高的模块（图6G），这为神经免疫失调提供了进一步证据。此外，我们发现脆性X智力低下蛋白（FMRP）的靶标在两种突变体的下调基因中均显著富集，进一步证明脆性X综合征相关通路在孤独症谱系障碍中受到破坏4。SFARI数据库32中的其他孤独症谱系障碍相关基因在scn1lab突变体中也显著下调（图6G）。在杂合子中观察到了多种中间表型（图S6B和S6C）。综合来看，我们的RNA测序分析确定了scn1lab和dyrk1a突变体中共享的分子通路，并证明斑马鱼与哺乳动物中的孤独症谱系障碍基因相关通路具有高度保守性。

图6. 全脑RNA测序鉴定scn1lab和dyrk1a突变体中共同的失调通路。(A和B) scn1labD44/D44（A）和(dyrk1aa ^{lrcorner 77 / Delta 77} dyrk1ab)（B）突变体中失调的GO通路。虚线代表错误发现率（FDR）小于0.05。图中展示了上调基因（红色）或下调基因（蓝色）富集的通路。显著GO通路的完整列表参见表S6。（C–F）两种突变体中均上调（C和D）或下调（E和F）的GSEA通路。虚线代表错误发现率（FDR）小于0.25。指示显著重叠的p值通过费希尔精确检验计算得出。显著GSEA通路的完整列表参见表S6。（G）基于假设，对scn1lab 444/344和(dyrk1aa ^{Delta 77 / Delta 77} dyrk1ab ^{Delta 8 / Delta 8})突变体中差异表达基因((p<0.1)和(fold-change >1.5)进行GSEA分析，使用的数据集包括：SFARI自闭症谱系障碍（ASD）风险基因、脆性X智力低下蛋白（FMRP）靶标以及人脑共表达网络模块。图中展示了Parikshak等人（2013年）基于费希尔法对纯合突变体组合p值筛选出的前四个模块。图中展示了上调基因（红色）或下调基因（蓝色）富集的基因集。仅展示具有显著富集的基因集((p <0.05))的气泡图。每个气泡的颜色深浅和大小代表比值比。每个气泡中标注了通过费希尔精确检验计算得出的p值。纯合子和杂合子中包含所有共表达网络模块的完整GSEA分析结果参见图S6B和S6C。

scn1lab和dyrk1a突变体表现出多巴胺能和小胶质细胞异常

为了确定导致 scn1lab 和 dyrk1a 突变体中通路失调的细胞机制，我们使用来自小鼠大脑的细胞类型特异性数据集，开展了基于假设的 GSEA56 分析。我们发现，在 scn1lab 和 dyrk1a 突变体的神经元数据集中，下调基因均显著富集；而在 scn1lab 突变体的星形胶质细胞特异性数据集58中，上调基因显著富集（图7A），这表明神经发生和/或神经胶质生成过程发生了改变。随后，我们发现有一个包含95个候选基因的数据集被用于单细胞研究，这些基因包括在哺乳动物中脑中表达的基因、帕金森病相关基因以及已知的多巴胺能神经元标志物。小鼠脑中多巴胺能神经元的谱系分析在两种突变体中，该通路均显著富集于下调基因（图7A）。这与我们的脑活性图谱研究结果高度一致，后者也揭示了多巴胺能信号传导的改变。有趣的是，来自小鼠皮层和海马体单细胞RNA测序的小胶质细胞相关基因，在scn1lab和dyrk1a两种突变体的大脑上调基因中均显著富集（图7A），这进一步证实了神经免疫通路的失调。此外，中间神经元数据集中的下调基因在两种突变体中均显著富集（图7A），这与GABA相关通路的下调现象相符（图6A、6B和6F）。锥体细胞数据集在scn1lab突变体中也呈现上调状态（图7A），与兴奋/抑制失衡的结论一致。与我们的RNA-seq通路分析结果一致，我们在杂合子中也观察到了多种中间表型（图S7A）。

为验证细胞类型特异性表型，我们在突变体幼虫中进行了全脑免疫标记。首先，基于观察到的细胞周期通路失调（图6B和6D），我们假设神经发生和/或胶质发生的差异可能是由于发育中大脑的细胞异常增殖所致。为验证这一假设，我们通过对细胞进行标记来开展全脑免疫组化分析磷酸化组蛋白H3（pH3）是增殖细胞的标志物。我们的分析显示，两种突变体的(pH3+)细胞在整个大脑中均显著增加（图7B-7D），包括存在体积差异的区域，如前脑以及视顶盖/中脑-后脑交界处（图S7B-S7E）。这表明神经细胞增殖的早期差异可能易导致脑尺寸表型的出现。其次，基于我们发现多巴胺能神经发生相关基因的下调（图6F）以及中脑多巴胺能神经元在图7A中，我们使用酪氨酸羟化酶（TH）抗体对多巴胺能神经元进行了标记。我们发现，scn1lab突变体和dyrk1a突变体在前脑（端脑）中的(TH^{+})细胞均存在显著缺失，前脑包含嗅球和腹侧纹状体（图7E-7G和图S7F-S7J）。这些差异在scn1lab突变体中更为明显，其前脑多巴胺能神经元数量减少了近50%（图7E和7F）。后结节中的(TH^{+})细胞数量则无显著差异（图7G和图S7J）。总体而言，这些研究结果表明，发育中大脑早期细胞增殖的异常可能会导致前脑内多巴胺能神经元群体发生改变。

为了确定ASD基因功能丧失对小胶质细胞群体的影响，我们使用以下方法对突变幼虫进行了体内染色中性红，它通过标记溶酶体来作为小胶质细胞的替代标志物。我们发现dyrk1a和scn1lab突变体中中性红阳性细胞均显著增多（图7H-7J），这与观察到的小胶质细胞相关基因上调结果一致。为验证这些发现，我们使用小胶质细胞特异性抗体进行了全脑免疫染色。两种突变体的大脑中小胶质细胞数量均显著增加（图7K-7M及图S7K-S7M）。值得注意的是，这种差异在dyrk1a突变体中最为显著，其全脑（包括前脑）的小胶质细胞数量几乎增加了一倍（图7K-7M）。这表明在脑发育早期，自闭症谱系障碍基因功能丧失导致的细胞增殖变化可能与小胶质细胞数量改变相关。综合来看，我们的细胞类型富集和全脑标记研究确定了多巴胺能神经通路和神经免疫通路是细胞层面的关键汇聚点，并揭示在部分自闭症谱系障碍基因突变体中，神经发生失调与神经免疫失调协同发生发挥了重要作用。

图7. scn1lab和dyrk1a突变体中的多巴胺能与小胶质细胞表型。(A) 针对(scn1lab triangle 44 / Delta 44)和(dyrk1aa ^{477 / Delta 77} dyrk1ab)突变体中ffe a6950-c7dd-4085-b19e-cad0739762bb和(fold-change >1.5)差异表达基因的假设驱动GSEA分析，使用细胞类型特异性数据集。58-60 展示了在上调（红色）或下调（蓝色）基因中富集的细胞类型标志物。仅显示具有显著富集的细胞类型标志物的气泡((p <0.05))。每个气泡的颜色深度和大小代表比值比。每个气泡中标出了使用费希尔精确检验计算的P值。纯合子和杂合子的完整GSEA分析见图S7A。(B) 3天龄（3 dpf）scn1labD44/D44突变体、(dyrk 1 a a^{Delta 77 / Delta 77} dyrk 1 a b^{Delta 8 / Delta 8})突变体与野生型斑马鱼全脑的磷酸化组蛋白H3（pH3，绿色）和乙酰化微管蛋白（AcTub，品红色）免疫染色结果。背侧视图。FB：前脑；OT：视顶盖；MHB：中脑-后脑边界。比例尺：50微米。按脑区定量分析见图S7B–S7E。(D) (****p <0.0001)，单因素方差分析。(E) 4天龄（4 dpf）野生型、scn1labD44/D44突变体和(dyrk1aa ^{Delta 77 / Delta 77} dyrk1ab)突变体斑马鱼全脑的酪氨酸羟化酶（TH，绿色）和乙酰化微管蛋白（AcTub，品红色）免疫染色结果。比例尺：50微米。腹侧视图。FB：前脑；PT：后结节。(C和D) scn1labD44/D44突变体((n=18))与scn1labt+突变体((n=16))（C）以及(dyrk1aa ^{lrcorner 77 / Delta 77} dyrk1ab ^{lrcorner 8 / Delta 8}(n=14))突变体与野生型斑马鱼((n=19))中pH3阳性细胞总数。(F和G) 前脑（F）和后结节（G）（图[E]中的方框区域）中scn1labD44/D44突变体((n = 20))与(scn1lab+/+)突变体（n=19）的TH阳性细胞总数。(^{* * *} p<0.0001)，单因素方差分析。杂合子表型见图S7F-S7G。(H) 4天龄（4 dpf）(scn1labd44/4444)突变体、(dyrk1aa ^{lrcorner 77 / Delta 77} dyrk1ab ^{lrcorner 8 / Delta 8})突变体与野生型斑马鱼活体的中性红染色结果。比例尺：0.1毫米。

讨论

本研究从行为、结构和神经环路层面，对斑马鱼中10个自闭症谱系障碍（ASD）基因开展了体内功能表征。整体而言，本研究的分析结果充分证实了ASD基因之间既存在趋同性也存在差异性。具体而言，研究发现每个ASD基因突变体均表现出独特的行为、脑体积和神经活动特征，且不同突变体的表型均不相同（图2C、图3C和图4B）。这表明ASD基因的功能缺失（LoF）会广泛影响基础的觉醒状态、感觉处理行为、脑体积以及基础脑活动，尽管影响的方向和程度各不相同。此外，研究还明确发现不同维度下存在基因剂量效应，提示ASD基因的单倍型不足很可能对多种表型产生渐进且可量化的影响。本研究结果凸显了自闭症谱系障碍相关的显著异质性，这与近期对小鼠模型的平行分析结果一致。ASD基因和基因组区域确定了一系列大脑大小和功能连接表型，尚未定义具有相关表型的基因亚群确定了具有高度相关行为表型的ASD基因亚组（图2H），这不能仅仅根据它们已知的分子功能来预测。因此，我们的研究支持神经亚型分析作为一种方法来解析ASD基因之间共享的生物学相关特征，63这可能代表了开发靶向疗法作为精确医学方法的一部分的前进道路。与此同时，我们的研究为多层次的收敛提供了证据。例如，我们确定前脑（端脑）和小脑是突变体大脑大小表型的最重要贡献者（图3H），这表明ASD基因高度表达的神经源性区域特别容易受到ASD基因LoF的影响。与这一发现一致，我们表明dyrk1a和scn1lab突变体的细胞周期和神经发生途径失调，这两种突变体都显示脑容量减少和pH3+有丝分裂细胞增加。我们的结果与最近的研究一致，这些研究强调了发育中大脑中神经增殖和分化的不平衡，导致神经发生和端粒的改变ASD基因破坏导致的头颅大小此外，我们发现斑马鱼和哺乳动物ASD基因下游分子机制的保护的明确证据，揭示了ASD基因相关的失调斑马鱼的共表达网络8,9和途径，包括突触功能、FMRP靶点和E/I信号突变体，支持我们的结果对哺乳动物的可翻译性。总之，我们的研究支持ASD基因在控制神经增殖和神经源性区域生长中的核心作用，这可能容易改变发育中大脑的连接性。

我们还发现了回路水平趋同的证据，表明丘脑是大多数ASD基因突变体大脑活动表型的最重要贡献者。我们确定了至少一半突变体基线活动存在显著差异的22个区域，这强烈暗示了包括背侧丘脑在内的感觉运动调节区域。有趣的是，最近一项关于斑马鱼社会从属关系的研究确定了背侧丘脑在控制集体社会行为的丘脑回路中的核心作用，这表明ASD基因LoF导致的该区域基线活动的改变可能导致社会赤字。因此，我们的研究结果为ASDs66的丘脑功能障碍提供了额外的支持，并强调了ASD基因LoF导致的端脑生长中断与间脑区域连接改变之间的潜在联系，这反过来可能会影响社会发展。此外，三行证据表明突变体中多巴胺能信号被破坏，代表了生物学收敛点。首先，多巴胺能区域，如后结核，是显示突变体基线活性差异的顶级区域之一。其次，哺乳动物多巴胺能神经元数据集显着丰富了scn1lab和dyrk1a突变体中下调基因。第三，这两种突变体在端脑多巴胺能神经元中都有缺陷。有趣的是，因为中脑多巴胺能系统，如VTA，参与奖励和动机，这些区域的功能障碍已被提议为导致社会赤字的机制因此，我们的研究为研究ASD中神经调节系统的作用提供了额外的支持。

最后，我们报告了神经免疫途径中一个意想不到的收敛点。我们显示补体系统和microglia-associated基因在scn1lab和dyrk1a突变体大脑中的上调基因中富集，并确定两个突变体中的小胶质细胞增加，包括dyrk1a突变体大脑中几乎两倍的增加，这也显示出最显著的尺寸缩小。有趣的是，对患有自闭症的个体的死后大脑的研究显示了小胶质细胞基因的富集和激活小胶质细胞的增加，揭示了自闭症和神经免疫功能障碍的关联。在这里，我们展示了与胎儿中期发育相对应的小胶质细胞的全球增加，为ASD基因LoF背景下的早期神经免疫功能障碍提供了证据。此外，小胶质细胞已被证明通过吞噬神经前体细胞73在神经发生中发挥作用，并在大脑发育期间在突触修剪中发挥作用。ASD基因在兴奋性和抑制性神经元中强烈表达，并在细胞周期中发挥作用这表明增加dyrk1a和scn1lab中的小胶质细胞突变可能是由于基因LoF导致的神经发生和/或突触信号改变而产生的，尽管需要额外的研究来确定小胶质细胞表型在多大程度上代表基因破坏的直接或间接影响，并直接导致大脑大小和/或活动表型。总的来说，我们的发现突出了发育中大脑中的神经免疫功能障碍作为选定ASD基因下游的汇聚点。综上所述，我们的研究确定了ASD基因LoF在多个神经发育水平上的收敛和发散效应，并揭示了多巴胺能和神经免疫途径与ASD生物学高度相关。

研究的局限性

虽然我们确定了ASD基因的趋同和分歧，并在多个神经发育水平上定义了基因亚组，但需要额外的研究来调查这些发现（例如，行为指纹）在多大程度上可以利用精确医学方法开发有针对性的药物治疗。我们的研究结果强调了丘脑和多巴胺能区域在ASD基因突变体基线大脑活动差异中的核心作用，尽管这些区域的活动变化倾向于行为改变的机制仍有待理解。这可以通过在行为任务期间对这些回路进行体内成像来解决。此外，需要未来的研究来确定dyrk1a和scn1lab突变体中小胶质细胞数量改变的机制，以及小胶质细胞数量和/或激活在ASD基因突变体中受到影响的程度。最后，检查我们在屏幕中与小鼠和人类诱导的多能干细胞模型并行确定的大脑区域和细胞类型对于将这些发现转化为哺乳动物和照亮跨系统的收敛非常重要。

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