题目：Algorithmic dissection of optic flow memory in larval zebrafish

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40961930/

期刊：Current Biology

研究亮点

l 幼体斑马鱼利用数秒前的外部光流进行稳定游动

l 基于记忆的稳定化行为涉及多个时间尺度

l 多个脑区均发现具有再传入消除特征的神经元

l 一个模型将类记忆的橄榄核活动与行为时间尺度联系起来

摘要

斑马鱼幼体的视觉稳定行为反映了其近期经历的光流历史。这一整合过程作为一种简化且易处理的工作记忆与决策模型，近年来受到广泛关注。然而，其算法基础仍知之甚少。本研究首先证实，只有外部产生的光流而非自身产生的光流会影响未来依赖历史的稳定行为。这一发现表明，稳定行为中的滞后现象反映的是感觉低通滤波过程，而非通过路径整合实现的自身位置记忆。其次，通过反向相关和基于延迟的范式，我们揭示了光流整合过程中涉及的多个时间尺度。结合定量建模研究，我们发现斑马鱼在视觉环境变化更剧烈的情况下，对过往光流的遗忘程度会加剧。随后，借助全脑光片钙成像技术，我们在多个脑区发现了对光流具有选择性且表现出运动效应拷贝特征的神经元，这与行为学研究结果相呼应。最后，通过双光子钙成像技术，我们证实下橄榄核神经元会分别整合正向和反向光流，为光流整合多时间尺度的实现机制提供了线索。总体而言，本研究结果完善了我们对斑马鱼幼体视觉稳定行为历史依赖性的算法与功能认知，为解析其神经环路实现机制奠定了基础。

图形摘要

引言

动物的行为不仅反映传入的感觉输入，还反映感觉事件的过往经历。由以毫秒级时间尺度运作的神经元组成的大脑，如何在数秒的更长时间尺度上保留信息，这一问题并非易事，一直吸引着研究人员的关注。这种依赖过往经历的行为有一个相对简单的例子，即斑马鱼幼体的视动反应（OMR）——斑马鱼幼体是现代神经科学中体型最小的脊椎动物模式生物之一。当呈现出表明观察者运动的广视野视觉运动模式（即光流4）时，包括斑马鱼幼体在内的多种动物会做出身体运动以稳定其航向和位置，这种行为被称为视动反应。 近期研究表明，斑马鱼幼体的视动反应会受到数秒前发生的光流的影响。 这些研究还就光流整合的潜在神经位点得出了一致的发现，包括脚间核、延髓和下橄榄核（IO）。

相比之下，这一整合过程具体估算什么仍不明确。一些研究认为，鱼类会整合光流信息，以更准确地估算自身运动的方向和速度。面对感官噪声时的环境光流。 另有研究表明，鱼类通过视觉路径整合估算自身位置，这与哺乳动物海马体所实现的机制类似。 前者的光流估算理论预测，自产生的光流不会计入光流记忆，因为自产生的光流无法直接反映环境中的光流情况。另一方面，后者的自身位置记忆理论则预测，外源光流和自产生的光流均应对光流记忆有贡献。截至目前，这两种可能性尚未得到实验验证。

本研究的主要目标是剖析参与光流秒级整合的算法，以更好地理解其功能。首先，通过操控视觉反馈的增益，我们证明了光流定向反应（OMR）中依赖历史的成分仅取决于外部产生的（即外传入的）光流，而非自身产生的（即内传入的）光流。这一模式在位置稳定和航向稳定的光流定向反应中均成立，且与光流估计理论的一致性更高。其次，我们利用反向相关和基于延迟的范式，对光流定向反应中依赖历史现象的动态特征进行了表征。出乎意料的是，这两种方法揭示了不同的时间尺度，这表明在更动态的环境中，鱼的记忆力会变得更差。通过光片显微镜进行的全脑钙成像研究，我们发现了光流选择性神经元，这些神经元接收运动效应拷贝信号，可抵消 across 多个脑区的再传入视觉输入。最后，借助双光子钙成像技术，我们证实下橄榄核（IO）中的神经元以较长的时间常数分别整合正向和反向光流，这为如何实现依赖历史的视动反射（OMR）的多时间尺度机制提供了线索。

结果

正向光运动反射依赖于感官历史

为探究斑马鱼幼体的光运动反应及其对历史的依赖性，我们采用了头部固定的闭环行为学（实验方法），按照之前的方法进行分析（详见补充材料与方法部分）。简要来说，将6至8日龄的幼鱼头固定在低熔点琼脂糖中，使其尾部可自由活动，通过一台小型投影仪将视觉刺激投射至下方（图1A）。利用高速摄像机监测尾部的运动，随后通过该运动推断幼鱼的预期游泳模式，并提供实时视觉反馈。在第一组实验中，我们重点研究幼鱼对正向光流的正向游泳反应。向前流动的视觉图案会给观察者造成相对于环境向后漂移的印象，并能在斑马鱼幼鱼身上引发强烈的视动反射。在本研究中，我们将从鱼类的视角，依据视觉图案的运动方向来描述光流，而非依据观察者的隐含运动方向。

在初始实验中，我们开展了一项光流记忆检测实验，实验方法与Yang等人所使用的方法类似（图1B）。在每次试验中，斑马鱼首先观察3秒的视觉流，该视觉流以5毫米/秒的速度向前或向后移动，且在过程中可能中途改变方向（此为“启动阶段”）。该启动阶段处于开环状态，即鱼的尾部运动不会影响正在进行的视觉刺激。在经历0秒或5秒的无视觉运动开环延迟期后，斑马鱼进入探测阶段，此阶段会以5毫米/秒的速度呈现10秒的向前视觉流。在探测阶段，幼鱼的尾部摆动会转化为视觉图案的向后运动（即闭环状态）（图1C）（详细步骤见STAR方法）。我们观察到启动阶段的方向会对探测阶段的游泳速度产生影响（图1D及图S1A），这揭示了正向光运动反射（OMR）的历史依赖性。具体而言，无论是等待0秒还是5秒的条件，在前向启动条件下，斑马鱼的瞬时游泳速度均高于后向启动条件，且这种差异在探测阶段的数秒内都存在（Cohen’s d的中等效应量为2800430-4f70-4f49-ada5-ddc743c1a202）（图1D）。方向切换的启动条件则使斑马鱼表现出介于两者之间的行为。这些结果本质上重复了Yang等人的观测结果，但实验对象为未瘫痪的斑马鱼。

图1. 向前光动反射依赖于光流的历史。(A)行为实验装置示意图。(B) 启动-延迟检测实验示意图。启动阶段分为四种条件：前向-前向（ff）、前向-后向（fb）、后向-前向（bf）和后向-后向。(C) 单条斑马鱼的单次实验示例。水平虚线表示0。绿色阴影区域代表闭环检测阶段。(D) 上图：检测阶段的平均游泳速度，按启动条件用颜色编码表示。水平虚线分别表示0毫米/秒和5毫米/秒的零化速度（即外感受刺激被完全抵消的速度）。下图：前向与后向启动条件之间的科恩d值，基于群体计算得出。分别绘制了有5秒延迟期和无5秒延迟期的实验次数。实线和阴影区域分别代表斑马鱼的平均值及其标准误。(N=30 fish) 另见图S1和表S1。

自我产生的光流不计入未来的光流定向运动反应

光流既可能由观察者的主动运动产生（即**再afference**），也可能由环境扰动导致观察者的被动运动产生（即**外afference**），例如水流或风。如果整合光流的目的是对感觉输入进行低通滤波，并更准确地估算环境流的速度（即“流估算”“投射”假说），则仅涉及外传入而非内传入的光流流动应被整合。如果鱼类试图通过整合光流（“自我定位记忆”假说）回到原始位置，那么它们应当同时整合传入和传出光流。

为了区分这两种可能性，我们接下来在保持外感受刺激不变的情况下，对再传入光流进行了显式操控（图2A）。每次试次均以5秒的启动阶段开始，在此阶段呈现5毫米/秒的向前光流。经过2秒的延迟后，再次呈现5毫米/秒的向前光流，持续10秒（“探测阶段”）。与之前的实验（图1）不同，此处的启动阶段处于闭合环路中，而探测阶段则处于开放环路中。此外，闭合环路的增益在部分试验中，反馈要么增加到1.5，要么减少到0.5。因此，在每个启动阶段，鱼始终会接收到固定量的外源性光流，而传入光流量则取决于其行为和闭环增益。我们通过对比游动持续时间，确保鱼能感知到这种增益调整（图S1B）。

图2B展示了鱼类随时间变化的游动努力程度。虽然长期暴露于增益调控已被证明会影响其未来的光动反射驱动力¹⁶，但这种效应在平均水平上并不明显，这可能是因为我们的启动阶段持续时间较短。图2C展示了一条代表性单条鱼的逐次试验数据。在这条鱼中，启动阶段的游动次数越多，探测阶段的游动次数也越多。这种启动阶段与探测阶段游动行为之间的正相关在所有测试的鱼群中均一致（图2C）。需要注意的是，上述两种功能学解释均无法预测这种启动-探测正相关关系：流场估计模型认为，启动阶段接收到的再传入光流会被未来的光动反射所忽略（即无相关性）；路径积分模型则认为，启动阶段游动次数越多，探测阶段的游动次数会越少（即负相关）。

这种正相关关系很容易由鱼类行为概率（即行为状态）中的任何时间自相关现象导致。例如，在某些试验中，鱼类整体可能更警觉，在两个阶段都会游动得更多；而在其他时候，它们可能在整个试验过程中都处于睡眠状态。为了从行为状态的影响中分离出再传入光流的作用，我们根据启动阶段的游动次数对试验进行了排序（图2D）。即使在启动阶段游动次数相同的试验中，我们仍未观察到再传入量（以启动阶段闭环增益为指标）对探测阶段游动的影响。换言之，依赖于过往经历的光动反射并不取决于再传入光流。这一观察结果与光流估计假说的一致性高于自我位置记忆假说。我们还确认了观察到的再传入效应缺失并非由开环探测阶段导致（图S1C–S1G）。

图2. 向前光运动反射取决于外传入光流的历史。(A)实验方案示意图。(B) 整个实验过程中群体平均游动活力（即尾部角度的滚动标准差）随时间的变化。对活力进行了缩放，假设增益为1.0，该数值也可视为以毫米/秒为单位的速度。阴影区域代表平均值的标准误差。水平虚线表示若存在1.0增益的闭环反馈，外感受刺激将被抵消时的活力值。(C) 单条示例鱼的逐次实验数据。探测阶段（假设1.0增益）随时间平均的游动速度与启动阶段游动距离的关系如图所示。每个点代表一次实验。水平虚线表示若存在1.0增益，可抵消外感受刺激的游动活力；垂直虚线表示可抵消外感受刺激位移的启动阶段游动距离。(D) 所有鱼的探测速度与启动游动距离的皮尔逊相关系数。(N=30 fish)。ρ值来自针对0的符号秩检验。(E) 以启动增益和启动期间的游动次数为函数的实验平均探测游动速度。柱状图表示 across鱼，以及代表单条鱼的点。来自同一条鱼的数据被连接起来。对于任意给定的启动次数，通过弗里德曼卡方检验未检测到不同启动阶段增益下的探测游泳速度存在显著差异（((p>0.05))、(N=30,30,29) 对应 15，(# bouts =0,1,2) 对应 3）。在某些条件下，样本量N小于30，这是因为部分鱼在三种增益条件下并非都进行了相同次数的试验。

旋转性光运动反应也仅取决于外传入光流

到目前为止，实验已证实正向光动反射（OMR）依赖于外传入光流的历史，而非内传入光流。我们接下来想探究其他类型的光动反射是否也存在同样的规律。偏航方向的旋转光流会触发整体多种硬骨鱼的身体旋转，我们将其称为旋转式OMR。首先，我们证实了头部固定的斑马鱼幼虫表现出稳定的旋转式OMR，其幅度与刺激角速度大致成正比，尽管增益较低（图S2A–S2C）。接下来，我们在实验中进行了与图1B类似的启动延迟测定旋转维度（图S2D）。我们发现，当启动刺激与探测刺激沿相同方向旋转（即同向）时，斑马鱼会表现出旋转性光学运动反应与探头沿相反方向（即反向）移动时相比（图S2E）。即使等待5秒后，这种效应依然显著，从而证实了旋转性光运动反应（OMR）的历史依赖性。

随后我们通过与图2类似的增益调控实验，探究斑马鱼在旋转光动反射（OMR）中是否仅整合外源性光流或总旋转光流。这一探究具有特殊意义，因为斑马鱼幼鱼的大脑拥有头部方向神经元，这类神经元原则上适用于在角度维度实现视觉路径整合。每次实验均以5秒长的闭环启动阶段为开端，在此阶段会向斑马鱼呈现任一方向30度/秒的旋转光流。随后经过2秒等待期，再以开环（探测）模式呈现10秒30度/秒的旋转刺激（图3A）。启动阶段闭环反馈的增益设定为低（0.5）或高（1.5）。与前期实验结果一致（图S2D、S2E），同向启动会使探测阶段的旋转光动反射增强（图3B），而反馈增益的影响在定性上并不显著。我们逐次分析了启动阶段的行为如何影响探测阶段的游动，重点聚焦于同向启动条件。图3C展示了单条斑马鱼的示例数据，与图2B类似。在该个体中，启动阶段同向转向的幅度越大，探测阶段的旋转光动反射就越强。这种正相关关系在所有测试样本中均具有统计学显著性（图3D）。光流估算或自定位记忆机制均无法解释这一效应，但可通过斑马鱼行为概率的任意自相关形式简洁地予以说明。为分离增益所表征的再传入效应，我们忽略增益因素，将斑马鱼在启动阶段的转向角度按四分位数对实验进行分层。每个四分位中，斑马鱼的偏侧摆尾次数相近，但因增益不同，其接收到的再传入信号差异达三倍之多。然而在任一四分位中，再传入信号的增强均未如自定位记忆机制所预测的那样导致探测光动反射减弱（图3E）。反向启动条件下的结果因斑马鱼存在连续同向转向的倾向¹¹而更为复杂，但类似地，我们未检测到增益的任何影响（图S3）。总体而言，与平移光动反射类似，旋转光动反射似乎依赖于外源性光流的历史信息。

图3 旋转光运动反射依赖于外源性光流的历史。(A)实验方案示意图。(B) 上图：探测阶段的平均转向偏向性。下图：各增益条件下，同向与反向条件间的科恩d值随时间变化。实线为各斑马鱼的平均值，阴影区域表示均值的标准误。(C) 同向启动条件下单条示例斑马鱼的数据。探测期的游动偏向性（即平滑后的单次游动偏向性）与启动期的转向角度的关系图。每个点代表一次实验。垂直虚线表示抵消传入启动旋转的角度。水平虚线表示若探测阶段反馈增益为1.0时，能抵消视觉旋转的转向偏向性。(D) 所有斑马鱼的探测速度与启动游动距离的皮尔逊相关系数。柱状图表示各斑马鱼的平均值，点代表单条斑马鱼。ρ值来自对0的符号秩检验。(N=36 fish) (E) 不考虑增益，根据启动期转向角度分为四位数，各四位数的实验平均探测转向偏向性。同一条斑马鱼的数据用线连接。仅绘制同向条件的数据。反向数据参见图S3。成对符号秩检验仅在第四四分位数（Q4）中检测到显著的增益效应，但效应方向与自我位置记忆理论的预期相反。(N=35) Q1、Q2、Q3和Q4的样本量分别为25、29、27和27。* (p 0.05) 另参见图S2、图S3和表S1。

反向相关分析揭示了持续数秒的光流记忆

到目前为止的实验已证实，前向和旋转光运动反射均依赖于外传入光流的历史。接下来，我们旨在以无偏的方式表征与历史相关的光运动反射的运动学特征技术。 我们向头部固定的斑马鱼呈现了一种视觉刺激以15毫米/秒的速度向前或向后以开环方式呈现视觉模式。运动方向按照速率为0.5赫兹的泊松点过程随机翻转（图4A）。随后，我们计算了向前游动动作发生前的刺激速度时间轨迹的平均值，并以各动作的峰值速度进行加权（详见STAR方法）。我们将这种加权后的速度平均轨迹称为动作触发平均（BTA）刺激，其可被解读为对幼鱼大脑中发生的过滤过程的估算。

图4B和图4C展示了单条斑马鱼的BTA刺激信号以及群体平均后的BTA刺激信号。群体平均的BTA信号可通过时间常数为2.7秒的衰减指数函数很好地拟合（图4D）。我们对旋转OMR开展了等效实验，得到了相近的时间常数（图S4A-S4D）。通过模拟我们证实，该时间常数并非仅由刺激的自相关作用产生（图S4E）。总体而言，正向和旋转OMR均包含时间常数约为3秒的历史依赖性成分。

 图4. 历史依赖的多个时间尺度依赖的视动反射。(A) 反向相关实验中（上图）刺激速度和（下图）尾部角度的示例轨迹。引发游动爆发的事件及对应的速度轨迹用根据游动爆发速度着色的圆点和方框标注。(B) 图(A)中鱼的尾部角度-速度轨迹（黑色）及指数拟合曲线（品红色）。(C) 单条鱼的尾部角度-速度刺激（灰色）及其群体平均值（黑色）。对群体平均值拟合衰减指数曲线（品红色），得到时间常数为2.7秒。(D) 单条鱼尾部角度-速度轨迹指数拟合的时间常数（紫色），以及群体平均值指数拟合的时间常数（品红色线，与2.7秒衰减常数对应）。(E) 长延迟实验的示意图。(F和G) 探测阶段群体平均游动速度随时间变化（F），以及时间平均值（G），按启动刺激方向着色并按等待时长排序。(H) 不同条件刺激方向下探测阶段游动速度的分数差异随等待时长的变化（黑色），同时标注指数拟合曲线。(C和D) (N=21 fish)。(F-H) (N=35 fish)。散点图中每个圆点代表单条鱼，柱状图表示鱼群平均值，误差棒为均值标准误。实线和阴影区域表示鱼群平均值及其标准误。另见图S4和表S1。

条件泄漏模型捕捉了光流整合的两个时间尺度

虽然约3秒的时间常数与之前的一些报告相符，但也有其他研究观察到长达数十秒的更长历史依赖性。 为了确保这种时间尺度上的巨大差异并非由以下差异导致：在实验设置中，我们参照图1重复了启动延迟实验，延迟时长设置为1至16秒不等（图4E和4F）。随后，我们将正向启动与反向启动条件下探针游动速度的差值作为延迟时长的函数进行绘图（图4G和4H）。我们发现，经过16秒的延迟后，仅由启动方向导致的探针速度差值从12%降至6%，其运动学特征远慢于基于反向相关的BTA。

这两个实验（图4A和图4E）之间的什么差异导致了所观察到的OMR时间尺度出现如此显著的不同？在逆相关实验中，斑马鱼持续观察光流方向的变化，而在启动延迟检测实验中，斑马鱼在延迟阶段没有看到任何视觉运动。因此，我们假设同时存在的光流会以某种方式让斑马鱼对过去的光流更易遗忘。为了更定量地表达这一假设，我们构建了一个简单的动力学模型，我们称之为条件泄漏模型（图5A）（STAR方法）。类似于与以往的模型不同，我们的模型单元接收的是光的速度以流作为输入，并以泄漏的方式对其进行整合。模型单元的活动受限于一个静态、有界的非线性函数，以生成随机生成的游动回合的速率。此外，若输入速度超过某一特定阈值，泄漏程度会增大，使系统在不同情况下拥有不同的时间常数，光流的有无。尽管该模型主要旨在唯象化，但实现这种对泄漏性的刺激依赖性调节在生物物理上也具有可行性，例如通过配体门控氯离子通道（例如，γ-氨基丁酸 ((GABA_{A})) 22）。通过适当选择模型参数，条件泄漏模型能够复制基于反向相关的具有相对较短时间尺度的BTA（图5B和5C），以及在模拟的启动延迟实验中具有更长历史依赖性的BTA（图5D和5E），这与构建预期一致。

条件泄漏模型得出的一个重要且可验证的预测是，即便是一系列净位移为零的光流序列，也会通过让斑马鱼变得更健忘来影响其未来的光流定向运动反应（OMR）。例如，若在启动-延迟实验的等待阶段向条件泄漏模型注入均值为零的正弦振荡速度输入模式（图5F），则由启动方向导致的探测游动次数差异会遵循更短的时间常数，衰减速度显著加快（图5G）。在真实斑马鱼身上，我们也观察到在等待阶段来回振荡视觉模式会使斑马鱼更健忘（图5H和5I）。例如，当延迟阶段超过6秒时，斑马鱼的正向光流定向运动反应几乎不受启动方向的影响。在另一项实验中，我们测试了不同类型的动态视觉模式对光流记忆衰减的影响（图S5）。综上，我们发现斑马幼体的光流整合涉及多个时间尺度，而这些时间尺度由同步光流的有无所调控。

图5. 条件泄漏模型统一了视动反射的两个时间尺度。(A)条件泄漏模型的示意图。(B) 该模型对随机方向翻转刺激的响应示例，如图4A所示。黄色线代表模型神经元的响应，绿色线代表非线性变换后的游动爆发率。绿色圆点代表模拟的游动爆发事件。(C) 基于反向相关分析的模型刺激BTA。(D) 模型对启动方案的响应所计算出的游动爆发率 (About)。(E) 探测阶段内平均(lambda_{bout })的差值随等待时间的变化，按启动方向划分，如图4所示。(F和G) 与(D)和(E)相同，但在等待阶段加入了净位移为零的“波动”。该波动在模型中打开“门控”，并降低积分器的有效时间常数。(H) 真实斑马鱼在探测阶段的时间平均游动速度随等待时长的变化，按启动时长和波动条件进行分类。(I) 按启动方向划分的探测阶段游动速度的分数差值，随等待时长的变化，按波动条件进行分类。散点图中的每个圆点代表单条斑马鱼，柱状条代表斑马鱼的平均值，误差棒代表均值的标准误。实线和阴影区域代表斑马鱼的平均值及其标准误。(N=34 fish)，n.s.，不显著((p >0.05))，(^{circ} p<0.05) (^{prime prime} rho<0.01)。P值来自符号秩检验。另见图S5和表S1。 

全脑各处的方向选择性细胞接收效应拷贝信号

上述行为学实验的关键发现之一是，光动反射（OMR）的滞后成分取决于外源性光流（图2和图3）。这意味着，在产生光动反射的通路上，光流调谐神经元对预期再传入的反应会被运动传出拷贝信号所抵消。为了在大脑中识别出此类传出拷贝信号，我们开展了全脑钙成像实验。在此实验中，我们使用光片显微镜对核定位方式广泛表达钙指示剂（elavl3:H2B-GCaMP6s）的幼鱼大脑进行成像（图6A）。在每次实验开始时，我们向鱼反复呈现向四个方向（向前、向后、向左和向右）移动的视觉图案，并筛选出以方向选择性方式对这些图案做出可靠反应的神经元（图S6A和图S6B；详细筛选标准见STAR方法）。这一操作揭示了在顶盖前区、前后脑和下橄榄核等区域存在定型的方向选择性神经元簇，这与此前的研究观察结果一致（图6B）。 在实验的其余阶段，鱼体经历缓慢（5毫米/秒）、持续的向前光流。每当鱼体完成一次游动，它会随机接收到视觉反馈（即向后光流）或无反馈。无论游动动作的特性如何，反馈光流的动力学特性和峰值速度均保持固定（STAR方法）。此外，我们还会在开环模式下呈现与固定反馈具有相同动力学特性的向后光流，此时鱼体不会产生任何游动。随后，我们计算了三种事件（即有反馈或无反馈的游动，以及不伴随游动的反向流动）发生后每个细胞的荧光变化（图6C）。

图6D展示了全脑范围内正向选择性神经元的触发活动平均值（另见图S6C和图S6D）。无游动的反向流导致正向选择性细胞的活动出现短暂下降，这与其对正向流的调谐特性预期一致。有趣的是，无反馈的游动平均产生了正向活动。鉴于这些细胞仅基于其视觉反应特性被筛选出来，这一观察结果并非无关紧要。在有反馈的游动之后，运动驱动的正向活动与感觉再传入驱动的活动下降相互抵消，且运动成分在大多数细胞中对该下降产生了过度补偿（图S6D）。当我们将分析限定于特定脑区时，也观察到了一致的模式，包括那些与视动反射生成相关的脑区，如顶盖前区和下橄榄核（图6E、图S6E和图S6F）。我们还发现了反向调谐神经元，其活动在游动发作后受到抑制（图S6G至图S6L），这表明传出副本信号存在一定程度的方向特异性。总之，我们发现了经视流调谐的神经元，它们接收传出副本信号，这些信号会降低对再传入信号的反应。多个脑区域。这类神经元很可能是基于外感受光流历史完成向前光运动反射所必需的（图2），尽管现有数据尚未明确这类计算的具体实施位置与机制。

图6. 对向前光流敏感的神经元接收正向的传出副本信号。(A)光片显微镜示意图。一对激发物镜垂直投射激发光束片，该光束片与收集物镜同步沿Z轴移动，可实现快速体积成像。(B) (左)水平视图和(右)矢状视图中的方向选择性神经元。数据汇总自(N=)号的18条斑马鱼。识别这些细胞所用的轨迹见图S6A和S6B。实线和阴影区域分别表示各斑马鱼的平均值及其标准误。(E) 与(D)相同，但为触发事件后3秒窗口内的平均值。柱状图表示各斑马鱼的平均值。每个点代表一条斑马鱼，同一条斑马鱼的数据用线条连接。(F) 上图：与(D)相同，但限定于特定脑区的细胞，左侧图像中以颜色编码标注；下图：与(E)相同，但按不同脑区分别统计。PT、IO、Th、HB、OT组分别对应(N=17)号的15、18、18、18条斑马鱼。* 表示符号秩检验的结果，对应(p<0.05)、(" p<0.01)、(cdots p<0.001)、(cdots cdot rho<0.0001)。A=前侧；R=右侧；D=背侧；PT=顶盖前区；IO=下橄榄核；Th=丘脑；HB=后脑；aHB=前后脑；OT=视顶盖。另见图S6。(C) 实验示意图。在恒定前向光流存在的条件下，斑马鱼在开环中接收后向水流(V)、接收固定后向反馈(M + V)，或无反馈游动(M)。(D) 三种刺激触发的钙活动：三种刺激分别为三种类型的事件，对所有正向调谐细胞取平均值。实线和阴影区域分别表示各斑马鱼的平均值及其标准误。

振荡刺激在橄榄体记忆细胞中引发累加性基线偏移

在最后一项实验中，我们试图探究大脑中如何实现光流记忆的多个时间尺度。先前的一项研究发现，背侧延髓中的神经元集群能以较长的时间尺度整合正向和反向光流，并对依赖于历史的视动反射起到作用。此外，解剖示踪和消融实验表明，这些延髓神经元通过向下橄榄核的投射来影响视动反射。由于下橄榄核是一个解剖结构划分明确的区域，与延髓中的记忆细胞集群不同，我们决定将研究重点放在下橄榄核上，将其作为幼斑马鱼大脑中与行为相关的光流记忆过程的可观测指标。具体而言，我们探究了下橄榄核神经元是否呈现条件性泄漏模型中所假设的分流样特性（图5F）。本研究中，我们使用双光子显微镜记录了在vglut2a:Gal4启动子调控下表达GCaMP6s的下橄榄核神经元的活动（图7A）。在每次试验中，鱼群观察到一个视觉图案以5毫米/秒的速度向前或向后移动2秒（即启动脉冲）（图7B）。在部分试验中，启动脉冲之后，图案会进行6秒的正弦往复摆动（峰值速度5毫米/秒，频率0.5赫兹），如图5F所示。此后，视觉图案保持静止，直至启动脉冲开始后的17秒。

首先，我们观察到分别对正向和反向预刺激脉冲产生阳性反应的IO细胞倾向于分别位于前部和后部，这重复了近期报道的空间分布模式27（图7C）。接下来，我们利用无振荡试验中一半的数据，在IO区识别出了“记忆细胞”，其活动在启动脉冲偏移后超过6秒仍能可靠地反映脉冲方向（详细筛选标准见STAR方法）。正向调谐和反向调谐记忆细胞的分布呈现出与启动脉冲期间一致的拓扑模式（图7D）。随后，我们利用未用于筛选这些细胞的剩余数据部分，考察了记忆细胞反应的动态变化。与条件性泄漏模型的除法式调控行为相反（图5F），振荡式视觉运动以加法方式提高了IO区记忆细胞的活动，且与其方向偏好性无关。（图7E和7F）。正向和反向记忆细胞活性的增加整体呈现出近乎平行的趋势（图7G），因此即便在振荡输入结束后，仍能从记忆细胞活性中清晰分辨出启动脉冲方向的轨迹。

为什么在受到振荡刺激后，鱼似乎变得更健忘（图5I），尽管对于历史依赖的(OMR ^{14}) 所必需的IO记忆细胞，似乎能记住振荡发生前的光流信息？调和这些看似矛盾的行为学和生理学发现的一种方法是假设下游神经回路中存在非线性（图7H-7J和图S7）。例如，若假设IO记忆细胞的输出端存在饱和非线性，那么由于振荡刺激引发的平行基线偏移，正向调谐和反向调谐的下游细胞之间的活动差异会变小，这模拟了行为学上观察到的光动反射滞后现象的减弱（图7H-7J）。或者，正向调谐和反向调谐群体之间的活动标准化也会产生类似的效果（图S7）。

总之， inferior olive（IO）记忆细胞分别整合前向和后向细胞这一发现与最初基于分流的模型存在差异，且仅凭这一发现无法解释记忆依赖的光动反射（OMR）的多重时间尺度。不过，我们仍可通过推测inferior olive（IO）下游存在一种简单的非线性机制，使inferior olive（IO）的生理特性与动态视觉环境中行为层面观察到的光动反射（OMR）滞后现象缩短这一结果相吻合。

图7. 动态视觉环境下橄榄记忆细胞的基础活性增强。（E）（上方）正向调谐和（下方）反向调谐记忆细胞对（B）中刺激的响应时间轨迹。注意振荡刺激如何增强选择性记忆细胞的活性。（G）有无振荡刺激时，启动脉冲方向导致的记忆活性差异，对应（上方）正向和（下方）反向启动脉冲。数据汇总自15条斑马鱼的26次记录。右下角：启动脉冲期间ΔF/F的中位数随归一化Y（即前后）位置的变化。粗线和细线分别表示26次记录的平均值和单次记录。（D）左：具有可靠记忆活性的感兴趣区域（ROIs）的归一化位置，按其偏好的启动脉冲方向进行颜色编码（详细筛选标准见STAR方法）。右：按归一化Y位置统计的记忆细胞直方图，分别展示正向调谐和反向调谐细胞。该结果重现了早期模型（图5G）以及斑马鱼行为（图5I）的特征。n.s.，无显著差异；* 表示显著差异（具体统计量对应UUID：(p<0.05)、(^{*} p<0.01)、(^{*+*} p<0.001)）。（(****p<0.0001)）显示振荡刺激后，启动脉冲方向对(About)的影响减弱。（C）上：vglut2:Gal4标记的下橄榄核（IO）示例图像。左下：下橄榄核的感兴趣区域（ROIs）按其对正向和反向启动脉冲响应的差异进行颜色编码。每个点代表一条斑马鱼，同一条斑马鱼的数据用灰色线条连接。（H）基于下橄榄核生理特性解释行为的模型示意图，采用饱和非线性模型。刺激速度输入先经过半波整流，正向和反向速度分别以泄漏方式积分（((tau=15 ~s)) = 15秒），以此模拟下橄榄核的活性。积分后的速度各自经过饱和非线性处理，随后与刺激速度相加（并进行适当的符号反转）。合成信号再经过有界非线性处理，生成摆尾频率（(About)）。（I）（上方）刺激、（中间）正向和反向调谐单元的积分速度、（下方）摆尾频率的模拟时间轨迹（(About)）。（J）不同等待时长下，正向和反向启动条件在探测期内平均ΔF/F（(About)）的差异。模型实线和阴影区域分别代表斑马鱼数据的平均值（((N=15))）及其标准误。（F）按刺激类型划分的记忆活性（即启动脉冲开始后8至17秒内的平均ΔF/F），对应（上方）正向和（下方）反向调谐细胞。两种功能细胞类型的活性均显示出振荡刺激的增强效应。符号结果来自符号秩检验。另见图S7。

讨论

本研究的主要目的是更深入地了解幼斑马鱼光运动反应中秒级历史依赖性背后的算法。通过一系列行为实验，我们证实：（1）光运动反应依赖于近期的外源性光流历史，而非净光流历史；（2）在更动态的视觉环境中，光运动反应滞后的时间尺度会缩短。与这些行为观察结果相呼应，我们发现：（1）在多个脑区中，存在对光流有方向调谐特性的神经元，这些神经元还接收类似传出副本的信号，可抵消视觉再afference带来的反应；（2）我们还发现，下橄榄核中的神经元会分别整合正向和反向光流，通过假设存在下游非线性机制，这一发现能够解释动态环境中光流记忆时长缩短的现象。

正如引言中所讨论的，斑马鱼光动反应中依赖记忆的成分究竟反映了什么，这一问题一直存在争议。一种可能性是，该成分反映了对外部光流的时间平滑估计（光流估计假说）。 另一种可能是，这一成分反映了基于路径整合的自我定位记忆，其中既包含外源性光流也包含内源性光流（自我定位记忆假说）。 我们的增益调控实验表明，内源性视觉运动并不计入未来的光动反应驱动（图2和图3），这一现象与光流估计假说更为一致。从控制理论的角度来看，斑马鱼似乎是对外源性光流进行比例-积分控制以使其归零，而非对位置进行比例（或比例-微分）控制。基于研究结果，我们推测，与历史依赖的光运动反射存在因果连接的髓质和橄榄核神经元，更适合被描述为对速度具有低通滤波表征，而非对位置具有此类表征，这与其他类型的空间表征神经元不同。需要说明的是，这并非意味着斑马鱼从不利用再传入视觉流：正如我们自身所观察到的（图S1B），视觉再传入信号不仅用于在亚秒级时间尺度上控制当前游动行为的强度，还用于在更长时间尺度上调节光运动反射的感觉运动增益。

预期的再传入光学流是如何被抵消的？在全脑成像实验中，我们在不同脑区的光学流调谐细胞中观察到了类似传出副本的信号（图6）。一个简约的假设是，预期再传入信号的相减过程发生在相对外周的光学流探测器中（例如顶盖前区），随后这些探测器将计算出的外传入信号传递至其他脑区。这种结构在果蝇的视动神经回路和鸟类的顶盖前区中均已被发现。另一种可能性是，大脑中多个对光学流敏感的脑区可能会根据各自的功能需求，并行接收传出副本信号。另一个尚未解决的问题是传出副本信号的来源。小脑是主要的候选来源，它被认为可通过构建内部模型来预测运动指令的感觉结果（即前向模型）。事实上，在斑马鱼幼鱼视动反应（OMR）的特定情境中，我们此前已证实，小脑浦肯野细胞是斑马鱼学会其游泳动作与由此产生的视觉反馈之间新关联的必要条件。此外，近期一项研究表明，纵环核的输入会在视顶盖中抵消自身产生的视觉输入，这或许能解释顶盖神经元中由游泳动作触发的负向活动（图S6G-S6L）。

本研究的另一项主要行为学发现是，光流记忆的时间尺度取决于刺激动力学（图4和图5）。尽管行为学结果并未严格限定是哪些特定刺激参数导致了记忆时间尺度的缩短，但结合内侧膝状体（IO）生理数据构建的模型（图7H和图S7A）表明，相反方向光流的连续出现是这一现象的关键驱动因素。从光流估计的角度来看，在快速变化的环境中更容易遗忘是符合直觉的，因为过去的感官证据会更快地与动物试图估计的当前状态失去关联。事实上，关于决策规范模型的研究表明，理想观察者会根据环境波动性来丢弃旧的证据。同样，面对特定刺激时，视网膜神经节细胞的时间滤波机制也会变得更快、更高的方差。

为了更好地理解光流记忆的多个时间尺度是如何形成的，我们重点研究了下橄榄核神经元的生理特性。下橄榄核是一个高度保守的核团，其发出的轴突称为攀缘纤维，投射至小脑；通常认为，这些攀缘纤维会提供教学信号以修饰颗粒细胞至浦肯野细胞的突触，同时也会向浦肯野细胞提供节律性的时序输入。³⁵在斑马鱼幼体中，下橄榄核神经元具有高度的敏感性感觉，并对其表现出强烈的方向选择性反应视觉以及前庭刺激。除此之外，下橄榄核（IO）切除会导致光运动反射（OMR）滞后现象的消失；幼斑马鱼下橄榄核（IO）的活动如何对浦肯野细胞持续的运动相关输出以及光运动反射中小脑依赖性可塑性产生影响，这一问题仍存在争议。在我们对下橄榄核神经元的记录中，我们观察到往复摆动的视觉模式会增强正向和反向调谐记忆细胞的活性。面对更高方差的刺激时，平均活性的增加源于神经元的非线性特性（如图S7C所示），这在脊椎动物和昆虫的早期视觉神经元中已被广泛观测到。然而，在光流检测的背景下，这一现象却有些出人意料。不同类群中经光流调谐的神经元（例如灵长类的内侧颞上区、哺乳类和鸟类的顶盖前区以及果蝇的小叶板切线细胞）通常会被与其偏好方向相反的光流所抑制（即运动对抗性），从而以带符号、近似线性的方式表征自身运动。斑马鱼依赖历史的光运动反射算法模型（包括我们的初始模型，图5）也都隐含或明确地假设在整合之前存在运动对抗性。整合步骤，我们对这一现象的初步功能解读是下橄榄核记忆细胞中出人意料的运动对立性缺失在于，通过分别追踪正向和反向运动，它们使下游神经回路能够轻松构建环境波动性的估计值（如图S7E所示）。未来的研究方向将是探究小脑回路如何在下橄榄核中转换这些非线性记忆信号。

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