标题：Latent developmental potential to form limb-like skeletal structures in zebrafish

期刊：cell

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.01.003

摘要

附肢结构的变化是脊椎动物进化中关键转变的基础。沿着近端-远端轴添加骨骼元素促进了关键转变，包括鳍到肢体的转变，允许产生不同的运动模式。在这里，我们确定了在胸鳍中形成额外长骨的斑马鱼突变体。这些新骨骼整合到肌肉组织中，形成关节，并与相邻元素连接。这种表型是由以前未被识别的附肢模式调节因子vav2和waslb的激活突变引起的，它们在一个共同的途径中起作用。这条途径是脊椎动物附肢发育所必需的，小鼠中Wasl的损失会导致类似于小鼠Hox突变体中看到的缺陷。一致的是，额外骨骼的形成需要Hox11功能，vav2/wasl途径的突变驱动hoxa11b的增强表达，表明与前臂的发育同源性。我们的研究结果揭示了一个潜在的，肢体样模式能力在鳍是由简单的遗传扰动激活。

图形摘要

引言

脊椎动物进化出了各种各样的附肢，表现出各种各样的形式和功能。四足动物的四肢通过在特殊的滑膜关节的促进下连接多个软骨内长骨来允许移动。基于这个框架，四肢通过手指减少、指骨增加、手腕和踝骨的转变、元素比例的改变和彻底的肢体缺失来进化出不同的结构（Owen，1849）。相比之下，硬骨胸肌附肢的骨骼模式几乎是不变的，在这个由30,000个物种组成的群体中，不同谱系之间显示出一致的排列。硬骨胸鳍由真皮鳍条组成，真皮鳍条在其底部由一个小型内骨骼支撑（图1A）。这种内骨骼通常由四块长骨组成，称为近端辐射，沿着前后（AP）轴并排排列，远端由小的结节远端辐射（Jessen，1972；Arraca，1999）。没有已知的硬骨鱼物种沿着近端-远端（PD）轴展示超过一个长骨（Starks，1930）硬骨鱼鳍和四足动物肢体的发散结构分别在每个支系内保持了2.50亿年（附近等人，2012； Betancur等人，2017）和3.50亿（Pardo等人，2017）年。

来自化石的证据表明，与现存的雷鳍鱼相似，硬骨鱼和四足动物的共同祖先有一系列沿着AP并排排列的长骨胸肌附肢的轴（朱和于，2009年）。该系列的最后部元素沿PD轴被分割，形成端对端的关节（图1A）。这种结构称为后翼状肉，不保留在硬骨鱼中，并且被假设是通过茎和冠组叶鳍鱼中附肢骨骼的PD轴元素的逐步获取和区域化而被详细阐述以形成肢体（Gegenbaur，1865年；Coates，1994年；Shubin等人，2006年；Shubin等人，2009年）（图1A和S1）。

由于它们不同的骨骼模式，识别鳍和四肢之间具有一对一对应关系的同源结构是困难的。然而，尽管鳍和四肢之间存在形态差异，但发育遗传学的比较方法已经揭示了这些附肢的正常图案所需的共享途径。Hox基因尤其是指定和加强附肢区域身份的关键参与者（Zakany和DuBoule，2007年）。在胚胎斑马鱼中hoxd13a的过表达导致幼虫胸鳍中软骨形成增加，但无图案（Freitas等人，2012年）。此外，后组13 HoxA和HoxD基因的缺失导致小鼠四肢（手腕/脚踝和手/脚）和斑马鱼鳍（真皮鳍条）中远端骨骼元素的丢失，这表明这些基因为不同附肢中的远端元素提供了区域地址（Nakamura等人，2016年）。虽然Hox基因的模式更多的近端肢体组件在四足动物中已被确定，但目前尚不清楚类似的机制是否指导着鳍非远端部分的模式形成。

本研究通过在斑马鱼中开展针对成体形态的无偏向前向遗传筛选（Haffter 等人，1996；Henke 等人，2017），鉴定出一类突变体，这类突变体以类肢体的方式在胸鳍的近-远轴上形成新的骨骼结构，从而打破了硬骨鱼鳍长期以来的形态模式。这些新结构是完全分化的长骨，可整合到鳍肌中并与鳍骨骼形成关节。与肢体长骨类似，这些结构源自共同前体的分节，并在分节部位形成关节。对相关突变的定位研究表明，vav2 和 waslb 信号通路的调控异常是导致这些异常表型的原因。通过上位性分析，我们证实这些基因在一个此前未被发现与肢体发育或胚胎模式建成相关的共同通路中协同发挥作用。条件性对小鼠中 Wasl 基因的敲除实验表明，该通路是四足动物正常附肢模式形成所必需的，其缺失会导致一系列骨骼表型，与 Hox 和 Gdf 小鼠突变体中观察到的表型相似。研究还发现，wasl 基因会影响发育中的鱼鳍内与 Hox13 阳性迁移细胞共定位的 F-肌动蛋白斑点的形成。通过 CRISPR-Cas9 基因编辑技术构建 hox11 斑马鱼三重功能缺失突变体，我们证实 waslb 需要 hox11 功能才能形成额外结构，且从更广泛的角度来看，该基因与 hox 基因相互作用以构建鱼鳍的前后轴模式。研究进一步表明，vav2 和 waslb 的功能获得性突变会导致发育中的鱼鳍内 hoxa11b 的表达水平升高。本研究结果证明，斑马鱼保留了形成由 hox11 旁系同源物指定的中间区域身份结构的能力，这与肢体的中间肢段类似。这种潜在能力可通过简单的遗传改变被激活。揭示了一种新的附肢模式形成通路，该通路可能在鳍到四肢的过渡以及整体骨骼发育中发挥了未被识别的作用。

图1. 功能获得性突变揭示鱼鳍具有类肢体发育的能力。（B和C）成体胸鳍骨骼分别展示为完整状态（左图）、鳍条和远端辐状骨移除状态（中图）以及模式化示意图（右图）（另见图S2）。（B）野生型胸鳍骨骼。（C）杂合子reph突变体胸鳍骨骼。（D）waslb和vav2等位基因引发突变表型；D+ reph（mh130）和D+ wan（mh138）可恢复野生型的附肢模式（另见图S3）。（E）上位性分析显示，waslb功能丧失后可抑制wan/vav2的表型（另见图S4）。（F）vav2、waslb与胸鳍形态发育的遗传通路。（G）48小时受精后（hpf）胸鳍芽中waslb和vav2的表达情况。前端朝左，远端朝上；比例尺：（B、C、E）为500微米，（G）为50微米。

结果

打破硬骨鱼鳍的基础构型

野生型斑马鱼胸鳍代表了硬骨鱼的祖先构型，由四块并列的近端辐状骨以及其后小型结节状远端辐状骨构成（图1B）。发育早期，四块近端辐状骨均与肩带直接接触，但成年后其中两块后位近端辐状骨会向远端移位（Grandel 与 Schulte-Merker, 1998）。为鉴定影响斑马鱼成体骨骼形态与模式的基因，我们开展了一项以显性突变为重点的正向诱变筛选（Henke 等人, 2017）。在筛选过程中，我们分离到一株突变体，其胸鳍内骨骼沿近-远轴形成额外的长骨，打破了硬骨鱼的基本构型（图1C）。我们将这些新形成的骨骼命名为“中间辐状骨”，它们位于后位近端辐状骨与远端辐状骨之间，且不与肩带直接连接。鳍条的整体模式与大小未发生显著改变。我们将该突变体命名为 rephaim（缩写 reph）。该突变体的表型具有不同的表达程度且对剂量敏感，纯合子斑马鱼的形态畸形极为严重（图S2）。鉴于纯合子表型的严重程度，我们的分析主要聚焦于杂合 reph 突变体（reph/+）。

揭示新的鳍模式形成基因

通过全外显子组测序，我们将reph突变定位到4号染色体上（图S3）（Bowen等人，2012）。对连锁区间的序列数据分析发现，维斯科特-奥尔德里奇综合征样b基因（waslb）存在一个错义突变，导致第265位氨基酸由丝氨酸变为脯氨酸（图1D）。Waslb是WAS蛋白家族的成员，属于肌动蛋白细胞骨架信号调节因子，其可与Cdc42和Arp2/3相互作用，启动丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）的形成，并在细胞迁移、细胞信号传导和细胞极性形成中发挥作用（Snapper和Rosen，1999）。此外，定位于细胞核的Wasl通过与核肌动蛋白、转录因子和RNA聚合酶相互作用，对特定基因的转录是必需的（Wu等人，2006；Ferrai等人，2009）。

为验证waslb突变是否导致reph表型，并确定显性reph等位基因的遗传本质，我们利用CRISPR-Cas9技术在野生型waslb以及与候选reph S265P突变顺式相连的区域中引入靶向移码突变，并检测其对鳍骨骼模式形成的影响（图1D和图S3）。野生型waslb的功能缺失对鳍的模式形成无明显影响（图S3和图S4）。然而，在reph错义突变上游顺式位置产生的移码突变可使突变表型逆转，恢复野生型的辐状模式。与该突变顺式相连的小片段框内缺失则无法恢复野生型表型。综上，这些结果证实waslb中已鉴定的S265P突变是导致reph表型的原因，其机制可能为功能获得效应。reph中改变的氨基酸残基在脊椎动物中高度保守，且位于一个铰链区域，该区域被认为可调控蛋白质的自抑制作用与亚细胞定位。（补充图S3）（Suetsugu和Takenawa，2003）。与此一致的是，将reph突变引入荧光标记的Wasl蛋白中，会导致融合蛋白在细胞培养中的核定位显著降低（补充图S3）。在Wasl构建体中，与reph突变位点相邻的酪氨酸残基发生磷酸化模拟替换时，也观察到了细胞定位的类似变化（Suetsugu和Takenawa，2003）。这种核定位的降低表明，reph突变体中细胞质waslb的功能可能有所增强。

Wasl 信号通路的遗传相互作用因子

由于As waslb是附肢发育中的一个新因子，我们试图以类似的方式鉴定其他影响鳍内骨骼模式形成的基因座。虽然在斑马鱼中大规模的显性筛选并不常见，但具有显性存活表型的突变体已作为隐性遗传筛选的副产物被鉴定出来。我们检索了已发表的筛选研究，发现了一个名为wanda（wan）的突变体，其具有与reph相似的外向表型（图S2）（Haffter等人，1996；van Eeden等人，1996）。我们获取了wan突变体，发现其呈现出与reph相似模式的中间辐鳍（图1E），这是一种此前未被报道的表型。与reph类似，wan表现出可变的表型表达度和剂量敏感性（图S2）。

出乎意料的是，测交实验表明wan与reph并非等位基因，而是位于一个非连锁位点上的突变。我们对wan进行了定位，并在21号染色体上的vav2基因的一个保守残基中发现了一个错义突变（S67A；图1D和图S3）。原癌基因Vav家族的蛋白可作为Rho GTP酶的鸟苷酸交换因子，在信号转导、细胞骨架调控、细胞运动和受体内吞等过程中发挥作用（Bustelo, 2001, 2014; Hornstein等人, 2004）。我们利用CRISPR-Cas9技术构建了vav2功能缺失突变体，发现vav2纯合无效斑马鱼可存活，且无骨骼表型（图S3和图S4），这与Vav2基因敲除小鼠的表型报道一致（Fujikawa等人, 2003）。此外，在S67A型wan突变体的顺式上游区域构建的截短突变可恢复wan的骨骼表型（图1D和图S3）。因此，与reph类似，wan通过功能获得性突变导致鳍的模式发生改变。

Vav2激活小G蛋白Cdc42（Abe等人，2000年），而Cdc42又调控Wasl的活性（Carlier等人，1999年）。因此，在reph和wan突变体中观察到的相似表型，很可能是由于它们对同一条信号通路的影响。为验证这一假设，我们将waslb功能缺失等位基因与wan/vav2突变体进行杂交，发现waslb功能是wan表型表达所必需的（图1E和图S4）。由此可见，waslb对vav2具有上位性，这些基因在同一条通路中共同作用，以构建鳍内骨骼的模式（图1F）。斑马鱼另一个wasl旁系同源物wasla的缺失不会影响鳍骨骼，也不会对reph和wan表型产生影响，这表明waslb是鳍模式构建中的关键旁系同源物（图S4）。整体原位杂交结果显示，这两个基因在鳍早期模式构建阶段均有表达（图1G），提示它们可能在发育中的鳍间充质中发挥作用。有趣的是，此前从未有研究将waslb或vav2与鳍或肢体发育、骨骼发生或整体胚胎模式构建相关联。

rephaim 突变体中鳍褶完整性未发生改变

在鳍向四肢的演化过渡中，真皮鳍条逐渐减少，同时内骨骼不断发育完善，最终冠群四足动物完全失去了鳍条（科茨，1994；舒宾等，2006；舒宾等，2009）。鳍条由幼体鳍褶发育而来（格朗德尔与舒尔特-默克，1998）。关于鳍向四肢过渡的机制假说认为，鳍的内骨骼与鳍褶之间存在发育上的权衡关系，即硬骨鱼类鳍褶的早期形成导致其内骨骼发育得较为短小（索罗德古德，1991）。  已有研究通过实验探究斑马鱼鳍发育过程中鳍褶缩减是否能产生类四肢特征。早期发育阶段切除鳍褶会使幼体斑马鱼的内骨骼盘增大，这表明鳍褶会抑制内骨骼盘的生长（矢野等，2012）。然而，与降低hox13旁系同源基因功能的效果类似（中村等，2016），在不同的实验操作中，成体鳍内骨骼后续的发育完善程度通常可忽略不计，或尚未得到评估。  为探究鳍褶动态变化是否是中间辐骨发育的基础，本研究检测了reph/+突变体的鳍褶形成情况。使用识别肌隔纤维的抗胶原蛋白抗体进行免疫标记（拉隆德与秋本，2018），这种纤维是支撑幼体鳍褶的结构。结果显示，受精后3天（dpf），野生型与reph/+胸鳍在形态上无本质差异（图2A）。受精后7天，二者的内骨骼盘大小和鳍褶大小也无差别（图2A、2B）。3周龄突变体鳍的内骨骼盘与鳍褶未出现变化，且其模式形成也无缺陷（图2C）。  因此，与此前假说相悖，reph/+突变体中内骨骼沿近远端（PD）发育完善，并不需要鳍褶与内骨骼盘之间存在发育权衡。

rephaim 中间辐状骨的形成

在硬骨鱼类中，鳍内骨骼最初形成为连续的软骨内骨骼盘，随后通过局部内陷和转分化分化为四个近端辐鳍原基，接着发生软骨内骨化（图2C）（Grandel和Schulte-Merker，1998；Dewit等人，2011）。这一过程在reph/+突变体中正常发生（图2C）。仅在初始模式形成和分化后，野生型和突变体鱼类的内骨骼才出现差异，此时reph/+突变体的后部软骨凝集物相较于野生型鱼类出现伸长（图2C-2E）。reph/+突变体中伸长的凝集物形成多个矿化位点，新生的中间辐鳍形成明显的骨领，而野生型同胞则存在单个连续的矿化区，从近端开始并向远端延伸（图2C和2D）。突变体中伸长的凝集物随后发生分节，最终形成由关节间隙分隔的两块独立骨骼。reph/+突变体的这种骨化和软骨分节模式在其他任何硬骨鱼类的胸鳍中均未见报道，但其与四足动物肢体发育相似——最初连续的凝集物沿近-远轴分节，形成由关节分隔的独立结构（Hall，2015）。

为了探究reph/+突变体中体节形成和关节形成的潜在机制，我们检测了体节前体区域利用共聚焦光学切片获得的辐状软骨。我们发现，每个软骨细胞团内的软骨细胞在软骨原基不同区域的大小存在差异。野生型和reph/+软骨细胞团均拥有一个由小型扁平软骨细胞构成的远端生长区，其下方为大型肥大软骨细胞（图2D）。我们未检测到突变型与野生型辐状软骨肥大区域的平均细胞大小存在差异（图2F）。然而，reph/+突变体存在一片独特的致密细胞区域，位于肥大软骨细胞之间。这些区域出现在骨领之间，是分节发生的位点。我们将其命名为间区，因其与肢体中同名的间区相似，后者同样负责确定新生关节的形成（Khan等人，2007年）。接下来我们探究了这些间区在突变型辐状软骨长度方向上的定位方式，并在受精后4周测量了野生型近端辐状软骨（PR4，编号(4^{th })）以及reph/+分节前辐状软骨（编号(4^{th })）的长度。如预期所示，reph/+软骨原基的平均长度显著长于野生型（图2E）。但reph/+动物体内新生PR4的长度显著短于野生型软骨原基，差距可达50%。通过将间区在辐状软骨上的位置以总长度的比例进行绘制，我们发现间区出现在不同的相对位置（图2G）。在两例中，reph/+的辐状软骨在首个间区的远端还存在额外的间区；但这些软骨原基并非我们采样中最长的。综上，这些结果表明分节的决定并非对软骨原基总大小的简单响应，且间区并非定位于辐状软骨上的特定位置。

图2. 新型中间辐射状元件由共同前体分裂形成。(A) reph/+ 突变体中的鳍褶正常形成。对3天胚胎（3 dpf）的肌隔纤维进行免疫标记，未发现鳍褶存在明显缺陷((n=10))。对7天胚胎（7 dpf）的软骨进行阿尔辛蓝染色，结果显示野生型和reph/+ 动物的鳍褶与内骨骼盘的相对比例相似。(B) 7天胚胎（7 dpf）时，野生型与reph/+ 个体的内骨骼盘面积无显著差异(= 18)（两种基因型均采用韦尔奇双样本t检验，(t=-1.7605)，(p 0.09)）。两种基因型的鳍褶面积也无显著差异((n=18)（韦尔奇双样本t检验，(t=1.8918)，(p>0.06)）。(C) 野生型和reph/+ 动物的鳍发育过程。3周龄（3 wpf）时，内骨骼盘开始分化为四个近端辐鳍原基。4周龄（4 wpf）时，辐鳍出现近端矿化，而reph/+ 突变体的后部辐鳍软骨呈伸长状（括号标注）。5周龄（5 wpf）时，野生型近端辐鳍呈现连续的矿化区，而reph/+ 突变体则形成次生骨领（星号标注），该骨领与近端骨化区之间由软骨分隔（箭头头标注）。(D) 伸长的辐鳍在未来分节的位置形成间区。5周龄（5 wpf）野生型和reph/+ 辐鳍的共聚焦切片，左下角插图为完整的共聚焦投影，其余插图为软骨区域的放大图。(E) 对5周龄（5 wpf）野生型和突变体的第4辐鳍元素长度进行定量分析。reph/+ 个体的总辐鳍长度显著长于野生型第4近端辐鳍（PR4）((n=7)（两种基因型均采用韦尔奇双样本t检验，(t=4.64)，(p=8 ×10^{-4})），而reph/+ 的PR4元素长度显著短于野生型对应元素(= 7)（两种基因型均采用韦尔奇双样本t检验，(t=-4.36)，(p=1 ×10^{-3})）。(F) 对5周龄（5 wpf）肥大软骨细胞的平均大小进行定量分析，结果显示野生型与reph/+ 个体的各类型软骨细胞大小无显著差异((n=7)（单因素方差分析，(F=0.319)，(p=0.732)）。(G) reph/+ 突变体中第4辐鳍的分节位置存在个体差异。每条鱼均标注了PR4的绝对尺寸。所有显微照片均为前方朝左、远端朝上；PR4：第4近端辐鳍；IR4：第4中间辐鳍；n.s.：无显著差异；比例尺：(A) 50微米，(C) 125微米，(D) 50微米。

扩展鳍骨的形态整合

对成年鳍进行的组织学分析显示，近端辐状骨仅在其远端具有骨骺，而reph杂合突变体的中间辐状骨则同时形成近端和远端骨骺（图3A和3B）。reph/+突变体中，远端和近端骨骺的软骨均表现出正常的分化特征。与野生型近端辐状骨的骨骺以及四足动物肢体的长骨类似，中间辐状骨新形成的骨骺会表达骨模式形成相关基因，例如印度豪猪蛋白a（ihha；图3C）（Kronenberg，2003）。中间辐状骨也出现了血管侵入的迹象（图3D），这表明reph/+突变体中软骨内骨化程序被激活，其机制与四足动物长骨以及大型鱼类骨骼中的软骨内骨化程序相似（Haines，1942）。在肢体中，长骨结构之间会形成滑膜关节（Hall，2015）。与之类似，在reph/+突变体中，近端和中间辐状骨之间形成了独特的关节囊，间充质细胞的特化分化塑造了两者的连接界面（图3E）。研究发现，关节末端标志物prg4b（Rhee等人，2005；Askary等人，2016）在骨骺的表层软骨细胞以及关节间隙的衬细胞中均有表达（图3F）。这些结果表明，肢体中存在的关节分化程序在reph中间辐状骨中也被激活了。

在四肢中，肌肉起源于肩部以及四肢骨骼，并附着在附肢更远端的位置（图3H）。相比之下，斑马鱼有七块肌肉起源于肩带结构，直接附着在真皮鳍条上，完全绕过了鳍的长骨（Diogo 等人，2018）。胸鳍肌肉的这种结构是大多数硬骨鱼的典型特征，仅在某些特化类群中哪些谱系的肌肉附着在胸鳍辐状骨上（温特伯顿，1973年）。令人意外的是，reph/+ 型中间辐状骨拥有源自肩部肌肉的附着点（图3B）。我们还发现有肌纤维起源于中间辐状骨并附着在远端真皮鳍条上（图3G）。因此，reph 突变不仅展现了形成全新、完全分化且具有特定模式长骨的能力，这些结构还在形态上整合形成了类肢关节和肌肉连接，这在其他硬骨鱼的鳍中从未被观察到。

图3.中间放射状是形态学上整合到鳍中的长骨前至左，远至顶；dr，远端桡骨；fr，鳍条；ir，中间桡骨；pr，近端桡骨；50毫米刻度条。（H）四足动物肢体与野生型和reph/+斑马鱼胸鳍的肌肉附着图。（G）源自中间桡骨（黑色箭头）上的过程并插入真皮鳍条（白色箭头）上的肌肉纤维。（F）prg4b在proximal-intermediate桡骨关节中的表达。（E）中间和近端桡骨之间的滑膜关节。（D）血管侵入中间桡骨（黑色箭头）。（C）中间桡骨中ihha的表达。（B）reph/+中间桡骨具有双骨痂（括号）、肌肉插入点（星号）和远端滑膜腔（箭头）。（A）野生型近端桡骨具有单个远端骨痂（括号）。（A-G）成人鳍的组织学。

硬骨鱼和四足动物的正常附肢图案需要Wasl

Wasl和vav2以前都没有参与发育模式的调节。小鼠中Wasl的生殖系缺失在胚胎上是致命的（Lommel et al.，2001； Snapper et al.，2001）。类似地，斑马鱼wasla；waslb双敲除是致命的，没有一个存活超过7 dpf。这些复合斑马鱼突变体显示胸鳍褶皱减少，并且，值得注意的是，未能形成放线性毛刺（图S4）。为了评估vav2/waslb信号的模式作用是否是斑马鱼特异性的，或者它们是否在硬骨鱼中保存，我们询问Wasl是否是正常四足动物肢体发育所必需的。我们通过将肢体侧板中胚层（LPM）中表达Cre的驱动系杂交到软化的WaslL2L背景中来产生Wasl功能有条件丧失的小鼠（Cotta-de-Almeida et al.，2007）。(WasL2L/+)和WaslL2L/L2L缺乏Cre驱动程序的Mals是表型野生型，每一行中携带Cre的WaslL2L/+杂合子也是如此。然而，携带Hoxb6-Cre（Hoxb6 cKO； Lowe等人，2000年）或Prrx1-Cre（Prrx1 cKO；Logan等人，2002年）驱动程序的WaslL2L/L2L小鼠在骨骼图案化方面表现出戏剧性的缺陷。由于Cre驱动程序之间的差异，与Prrx1 cKO小鼠相比，Hoxb6-Cre驱动程序导致类似但更温和的前肢表型，但后肢缺陷更严重。Prrx1和Hoxb6 cKO小鼠四肢的长骨比野生型兄弟姐妹的长骨短且宽（图4A和4E）。cKO动物的腕骨和踝骨表现出元素之间融合的各种模式（图4B和4F）。有趣的是，在cKO小鼠中，手的第五个手指经常缺少一个指骨（图4C），这表明Wasl在关节形成和鳍和四肢附属物图案化中的保守作用。耻骨和坐骨表现出异位融合，胫骨和腓骨在cKO动物中无法融合（表S1）。除了附属物，Prrx1 cKO和Hoxb6 cKO小鼠也有胸骨缺陷，其中相邻的胸骨无法形成关节，而是融合在一起（图4D）。在Prrx1和Hoxb6 cKO小鼠中观察到的表型让人想起在其他图案化基因突变的小鼠系中看到的表型。例如，HoxA11突变体未能融合胫骨和腓骨（Small and pot，1993），HoxD11突变体表现出踝骨融合和数字V中间指骨减少（Davis和Capecchi，1994），并且腕骨融合发生在任一突变体中。和Gdf6突变小鼠表现出类似的手腕和脚踝融合模式（Settle et al.，2003），而Gdf5显性阴性突变体具有类似的中间指骨损失（Masuya et al.，2007）。此外，在分裂的HoxD簇倒置突变体中可以看到胸骨融合（Tschopp et al.，2009）。这些相似性表明wasl/vav2信号对骨骼发育的影响可能是通过已知的肢体图案化途径（如Hox和Gdf基因）介导的。

图4正常骨骼需要小鼠Wasl的。条件敲除显示2； 3，远端距骨3；5，远端距骨5；AST，黄芪；A，自动足；CAL，跟骨；CEN，中央；c，腕骨中央；d#，腕骨远端数；IL，髂；Ma，柄；MC，掌骨；py，锥体；P#，指骨数；S，茎脚；SC，肩胛骨；sl，肩胛骨；S#，胸骨数；Xi，剑突；Z，左脚足；鳞片条2mm。（D）；（B）、（C）和（F）中的左前。2、（A）、（B）、（C）、（E）、（F）中的远端距骨远端到顶部；在敲除小鼠中的头侧到顶部。另见表S1。（F）条件Wasl腿中的踝骨融合。显示Wasl敲除小鼠的长骨缩短和增厚。Hoxb6和Prrx1 cKO小鼠掌骨（MC）和远端指骨（P2）之间的融合胸骨（星号），而不是具有单个指骨（星号）的动物缺乏可辨别的中间指骨（C）数字五的指骨。条件性敲除联盟。条件性Wasl失活导致腕骨缩短和增厚。Wasl敲除（cKO）小鼠。Prrx1 cKO小鼠表现出（A）成年野生型和条件性

Wasl介导的F-肌动蛋白点整合Hox依赖性细胞谱系与放线旋毛虫

鉴于Wasl在F-肌动蛋白成核中的已知作用，我们询问斑马鱼wasl突变体中的Factin形成是否以可能影响骨骼模式的方式进行了修改。使用荧光phalloidin缀合物，我们发现F-肌动蛋白聚合物在整个早期胸鳍褶皱中形成离散的斑点（图5）。这些斑点首先出现在56 hpf左右，并持续到至少14 dpf。在3 dpf时，F-肌动蛋白斑点在整个野生型胸鳍的鳍褶皱中被发现。虽然杂合的reph动物在这个年龄的F-肌动蛋白分布没有明显差异，但纯合子突变体在变形鳍褶皱中表现出大的F-肌动蛋白聚集体（图5A）。相比之下，wasla； waslb双突变体显示F-肌动蛋白斑点形成的减少（图5A）。因此，wasl功能与鳍中的F-肌动蛋白斑点形成正相关。

F-肌动蛋白点与细胞外基质和/或相邻细胞的细胞接触形成相关（Panza等人，2015）。鳍点的分布暗示了F-肌动蛋白和Hox13阳性游走鳍褶皱之间的关联细胞（MFFCs）。MFFCs表达hox13基因，并被认为从远端内骨骼盘区域产生以图案化远端鳍射线（Nakamura等人，2016；Lalond和Akimenko，2018）。Tg（2PDepi： eGFP）和Tg（mInta-11-b-珠蛋白：mCherry）转基因提供hoxa13a和hoxd13a表达的读数并标记MFFCs（Lalond等人，2016）。我们在Tg（mInta-11-b-珠蛋白：mCherry）行中进行phalloidin标记，发现F-肌动蛋白点与Hox13阳性MFFCs的延伸和过程共定位（图5B和5C）。这些过程从细胞体向远端鳍褶皱投射，呈类似于放线旋毛虫的弧形（图5D）。使用胶原蛋白的免疫标记来可视化放线旋毛虫纤维（Lalond和Akimenko，2018年）以及Tg（2PDepi： eGFP）线中的phalloidin标记，我们发现这些F-actin在放线旋毛虫和Hox13阳性MFFCs延伸重叠的区域进行点状定位（图5E）。Kuroda等人（2020年）最近的工作详细介绍了尾鳍间充质细胞富含肌动蛋白的伪足接触在定向和稳定放线旋毛虫中的必要性。Nakamuraet al.（2016年）报告hox13空突变体的受损迁移导致鳍折叠的减少和远端放射祖细胞的扩展。总之，Wasl依赖性F-actin点、放线旋毛虫和MFFCs之间的关联表明reph可能介导鳍中Hox阳性细胞的迁移行为。

图5. 早期鳍褶中的F-肌动蛋白形成在wasl突变体中受到影响，且与Hox13阳性细胞及肌隔棘相关。(A) 3天胚胎期（dpf）鬼笔环肽标记的胸鳍，显示reph纯合突变体和wasla；waslb双突变体中F-肌动蛋白的修饰情况。reph纯合子出现大量F-肌动蛋白聚集体和形态异常的鳍褶，而wasla；waslb双突变体则呈现出更分散的F-肌动蛋白网络。(B) F-肌动蛋白灶与Tg(2PDepi:eGFP)报告转基因标记的鳍褶中Hox13阳性细胞的延伸区域共定位。(C) 单个Tg(2PDepi:eGFP) Hox13阳性细胞显示F-肌动蛋白的共定位情况。(D) 三重标记证实了鳍褶中F-肌动蛋白灶、表达Tg(mInta-11:mCherry)转基因的Hox13阳性细胞与肌隔纤维的共定位。(E) 单个Tg(mInta-11:mCherry) Hox13阳性细胞显示其与肌隔纤维原丝及F-肌动蛋白的共定位。所有图像中前方为左侧，远端为上方；比例尺：(A) 100微米（插图25微米），(B、D) 50微米，(C、E) 10微米（插图2微米）。

Waslb通过hoxa11功能调节附属物图案

四肢有一个由一根长骨组成的三部分波普兰，该波普兰已经通过它们的进化历史（图1A）进行了通管上臂（肢杆）的肱骨、前臂（中间肢）的两根并排长骨（桡骨和尺骨），以及腕部和手部（末肢）的许多结节骨与长骨。这些区域表达不同组合的Hox基因，这些基因是骨骼生长和模式形成所必需的（Haack和Gruss, 1993; Nelson等人, 1996; Yokouchi等人, 1991; Zakany和Duboule, 2007）。例如，Hox旁系同源群13的A和D成员缺失会导致末肢无法形成（Fromental-Ramain等人, 1996），而11群的A和D成员被移除则会导致桡骨和尺骨显著退化，因为这些结构无法发育成长骨（Davis等人, 1995; Boulet和Capecchi, 2004）。最近研究发现，Hox同源群13的A和D成员也是斑马鱼鳍骨鳍条形成所必需的，这表明鳍和肢的远端区域存在深度同源性，且Hox编码功能在硬骨鱼类中具有保守性（Nakamura等人, 2016）。

我们探究了在reph突变体中观察到的中间腕骨是否具有由hox基因调控所界定的特定区域身份。基于中间腕骨沿近-远（PD）轴的位置，我们推测hox11旁系同源物可能增强reph 表型，因为这些基因的作用是调控肢体中的远侧肢体节段结构。我们构建了 hoxa11a、hoxa11b 和 hoxd11a 基因的无效等位基因，并探究了这些因子的缺失如何影响 reph 表型的表达。这三个 hox11 旁系同源基因的纯合无效突变体无论单独存在还是组合存在，均能存活且可育，其鳍骨骼的形成未表现出明显的表型异常（图 6C 和图 S5D）。然而，在 reph/+ 突变体中缺失这些 hox11 旁系同源基因后，中间辐鳍骨消失，使 reph/+ 的胸鳍骨骼恢复为野生型模式（图 6D 和图 S7A）。

为了进一步探究waslb如何影响hoxa11的功能，我们构建了一个报告基因系，该报告基因系在hoxa11b基因座的内源性调控下表达tdTomato（hox (a11bTghsp70:tdTomato)) (hoxa11b:tdTom)（图S6））。该品系中tdTomato的表达模式与已发表的通过整体原位杂交技术检测到的hoxa11b在鱼鳍和主体轴上的表达模式一致（Sordino等人, 1996; Thisse和Thisse, 2005; Ahn和Ho, 2008; Kherdjemil等人, 2016; Nakamura等人, 2016）。我们证实，hoxa11b与hox13报告基因标记的同一鳍褶细胞群共表达（图S6），且也在在内骨骼盘中。在受精后3天（3 dpf），我们观察到野生型、杂合子和纯合子reph突变体同胞之间的表达结构域或强度无明显差异（图6G）。然而，在受精后6天（6 dpf），我们发现reph突变体的内骨骼盘以及肌纤维形成细胞（MFFCs）中hoxa11b报告基因的表达水平升高（图6H）。这一趋势至少持续至受精后9天（9 dpf），在突变体鳍的远端内骨骼盘和鳍褶细胞中可观察到hoxa11b报告基因表达水平的升高。在wan突变体中也观察到了相同的表达升高模式（图S7C）。这些结果表明，waslb和vav2的功能获得性突变会提高发育中鳍内hoxa11b的表达水平，这与额外辐骨的形成相关，且hoxa11的功能对于这些新结构的形成是必需的。我们发现reph和wan会驱动鳍早期阶段hoxa11b表达的增加，这表明这些突变会导致鳍的模式形成出现差异，并最终形成成体表型。不过，已有研究表明Hoxa11是整个个体发育过程中肢间骨生长和稳态维持所必需的（Swinehart等人，2013；Pineault等人，2019），因此reph和wan可能还会调控鳍辐骨的后期发育，进而影响表型的相关特征。

接下来，我们探究了肢体发育特有的Hox基因相互作用是否也存在于正在形成的鳍中。除了区域特异性外，Hox基因在发育中的附肢中还表现出特有的遗传相互作用。Hox13组基因可在一种被称为后向优势的过程中抑制更近端Hox基因的活性（Duboule, 1991）。在肢体中，Hoxa13会抑制Hoxa11的活性，而这些基因共同构成在指/腕骨与掌/指骨边界处存在相互排斥的表达域（Kherdjemil 等人，2016）。然而，硬骨鱼及其他辐鳍鱼的胸鳍并未表现出类似的区域化Hox表达模式，因为hoxa11和hoxa13旁系同源物在整个腕骨盘和鳍褶中呈重叠域表达（Sordino 等人，1995；Metscher 等人，2005；Tulenko 等人，2017），且这些旁系同源物之间的相互作用机制尚不明确。令人意外的是，我们发现删除A和D簇的三个hox13旁系同源物会增强reph/+表型，并导致沿近侧-远侧轴发育出更多额外的长骨（图6F和图S7A）。鉴于reph和wan会提高hoxa11b的表达量，我们将这些结果解读为hoxa11旁系同源物去抑制的结果，并提出与附肢类似，hoxa13旁系同源物在鳍中对hoxa11b存在负调控作用。这种负调控很可能是相互的，因为我们发现去除hoxa11旁系同源物会使鳍褶中hox13阳性细胞的数量增加（图S7B）。

图6：reph突变体中hoxa11b的表达上调，且该基因对辐鳍中间结构的形成是必需的。(A–F) 斑马鱼鳍模式形成中waslb与hox基因的遗传相互作用。(A) 野生型胸鳍。(B) waslbreph/+突变体形成中间辐条（箭头；(n=9,89 %)）(C) (hoxa11a-1-) ;hoxa1 (1 b^{-1-}) : (hoxd11a-1-)突变体的鳍模式形成正常。(D) (was/b/cptv+) ; hoxa (11a-1-) : (hoxa11b) ; 突变体无法形成中间辐条（括号；(n=8)，88%）。(E) (hoxa13a) : (hoxa13b)突变体无法形成远端鳍条（星号）。(F) (was/b/opch/+) : (hoxa13a) : (hoxa13b) (hoxd13a+/-)突变体表现出增强的前后轴分化，出现多个中间辐条（箭头）。(G) 早期胸鳍中hoxa11b: tdTom表达的代表性共聚焦图像。(H) 像素强度箱线图显示突变体鳍中hoxa11b:tdTom表达水平更高。6天胚胎期（dpf）时，reph纯合子的表达强度显著升高（双星号，(n=5)，每种基因型，Welch两样本t检验，(t=5.51) (p=0.0015)）；9天胚胎期时，reph杂合子的表达强度也显著升高（单星号，(n=4)，每种基因型，Welch两样本t检验，(t=2.45) (p=0.035)）。另见图S5、S6和S7。比例尺：(E–J) 250微米，(G) 50微米。

hoxa11旁系同源基因对于reph/+中间辐状表型表达的必要性，揭示了发育中的硬骨鱼胸鳍内存在功能性Hox密码与调控网络（Woltering等人，2014），该网络能够特化出与四肢中相似的中间区域。这表明中间辐状骨具有hox11依赖性与身份特征，且与四足动物肢体的肢间骨结构存在发育同源性（图7）。然而，这种位置密码的表型在硬骨鱼中通常不会显现，而是通过reph和wan突变的作用得以揭示。

图7. 中间辐骨与肢体肢间骨具有共同的发育身份野生型和reph/+突变体斑马鱼胸鳍以及四足动物肢体骨骼的轮廓图。鳍和肢体均表现出对Hox同源群的区域依赖性，以正确形成骨骼。远端区域的形成依赖于Hox13基因（蓝色背景阴影）。在缺失Hoxa13旁系同源基因时，真皮鳍条（蓝色）会严重退化，而在缺失Hoxa13和Hoxd13时，肢体 autopod（指/趾区）无法形成。“中间”区域依赖于Hox11基因（红色背景阴影）。在Hoxa11和Hoxd11缺失时，肢体zeugopod（桡尺骨/胫腓骨段）无法形成长骨。同样，在reph/+突变体中，缺失Hoxa11旁系同源基因时，中间辐状骨（橙色）无法形成。野生型鳍中不存在这种中间区域的依赖性。

讨论

在repn和wan胸鳍中形成的新型长骨的整合与分化在硬骨鱼类中独一无二，这与四足动物四肢长骨的发育及解剖结构相似。包括人类在内的所有硬骨鱼的共同祖先拥有一套胸鳍骨骼，该骨骼由多根并排排列的长骨组成，每根长骨都与肩关节相连（图S1）（格根鲍尔，1865；朱敏与于小波，2009）。内骨骼的“多基型”结构表现为附肢中部和前部为未分节的骨块，后部为后翼骨，后翼骨沿近远轴分支并分节（图1A）。有假说认为，四足动物的四肢骨骼是通过丢失前部结构并特化后翼骨演化而来的。而硬骨鱼则被认为保留了多基型结构并丢失了后翼骨（格根鲍尔，1878；格兰德尔，2003；图伦科等人，2016）。值得注意的是，repn和wan中出现的骨骼特化仅局限于胸鳍骨骼的后部区域，其形态与基底辐鳍鱼和肉鳍鱼相似（杰森，1972；库茨，1994；朱敏与于小波，2009）。因此，本研究数据表明，硬骨鱼保留了一条隐秘的祖先生长轴，即后翼骨轴，这些突变体揭示了该轴的特化潜力。在非硬骨鱼辐鳍鱼（如保留了后关节后翼骨的弓鳍鱼或匙吻鲟）中，鳍的早期生长过程在桨状结构的初始模式形成之后，会对其内骨骼进行分节。该结构开始形成（希罗尼穆斯，1911年；戴维斯等人，2004年）。这些谱系均未表现出如雷氏鱼中所见的渐进式生长和关节形态发生过程。因此，内骨骼细化的整体时间进程与四足动物四肢发育中的情况更为相似，而非辐鳍鱼的基底类群。由于与四足动物相比，硬骨鱼的附肢骨骼存在形态差异，且其祖先组成部分的保留情况各不相同（图1A），我们无法确定中间辐状骨与四肢任何特定骨骼元素的同源关系。相反，我们提出这些附肢中部结构之间存在**“深层同源性”**（舒宾等人，2009年），即Hox11基因构建了一个可发育出长骨的中间区域（图7）。这凸显了发育程序跨越形态学边界的灵活性，以及模糊不同边界之间区别的可能性。

我们在 wasl 和 vav2 基因中鉴定出的特定突变并未在四足动物中发现。然而，这些突变揭示了一条此前未被探索的通路，该通路在附肢模式形成中具有未被重视的作用，其演化可能对附肢结构的历史变化产生了影响。本研究中鉴定出的突变不太能特异性地指导附肢的形成，而是允许鱼类中潜在的内源性类附肢发育程序得以表达。这些突变激活的程序中包含一个功能性的 Hox 密码，该密码在硬骨鱼中保留下来，并具有特定的中间（hoxa11）和远端（hoxa13）模式形成信号。我们已证实 Hox 基因与 Wasl 之间存在遗传相互作用。此外，我们进一步拓展研究发现，发育中的胸鳍中对 Hox 有响应的细胞对 Wasl 功能的变化十分敏感。这些细胞在鳍的发育过程中会表现出 hoxa11b 表达的上调，因此 reph 和 wan 突变体为成年鳍形成新的骨骼形态创造了条件。我们的研究结果揭示了脊椎动物附肢发育中潜在或新出现的特性，这些特性能够形成复杂的关节骨骼结构。这些模式形成过程在硬骨鱼和四足动物中均得以保留，表明它们存在于硬骨鱼的祖先中，并可能在肉鳍鱼向陆地过渡的演化过程中得到了进一步优化。

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