题目：NF-kB Signaling Negatively Regulates Osteoblast Dedifferentiation during Zebrafish Bone Regeneration

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31866203/

期刊：Developmental Cell

研究亮点

l l体内化学筛选识别出成骨细胞去分化的调控因子

l lNF-kB信号通路在成熟成骨细胞中处于激活状态，而在去分化过程中则处于失活状态

l ld NF-κB信号通路以细胞自主性方式抑制成骨细胞去分化

l ld NF-κB 作用于视黄酸信号通路的上游

摘要

成熟细胞的去分化是一种有趣的细胞过程，与多种器官的再生相关。在斑马鱼鳍再生过程中，成骨细胞去分化为成骨祖细胞，为骨修复提供来源细胞。我们开展了一项高内涵体内化学筛选，以寻找调控成骨细胞去分化和鳍再生生长的因子。核因子κB（NF-κB）信号通路被鉴定为去分化的特异性调控因子。该通路在成熟成骨细胞中具有活性，并在去分化前被下调。激活该通路会抑制成骨细胞去分化，而抑制NF-κB信号通路则会增强去分化。通过条件性Cre-lox系统介导的NF-κB信号通路在成骨细胞中的特异性操纵实验表明，该通路以细胞自主的方式干扰成骨细胞去分化。NF-κB信号通路作用于视黄酸（RA）信号通路的上游，它通过抑制视黄酸降解酶cyp26b1，使视黄酸信号通路也需被下调才能发生去分化。我们的研究结果为再生细胞可塑性的分子调控机制提供了新的见解。

图形摘要

引言

一些非哺乳类脊椎动物物种拥有惊人的再生能力，可在肢体或鳍被切除后实现完全再生（田中，2016）。再生过程中重新形成的细胞可源自干细胞或已分化细胞（田中与雷迪恩，2011）。由于已分化细胞通常处于有丝分裂后状态，若要作为再生的源细胞，它们必须经历去分化过程。我们将细胞去分化定义为丧失分化状态下的形态、功能和/或分子特征，这一过程通常还伴随着获得未成熟前体细胞的特征。遗传谱系追踪技术研究表明，蝾螈的肢体肌肉由去分化的成熟肌纤维再生而来（桑多瓦尔-古斯曼等人，2014），而成熟心肌细胞则是再生心肌的前体细胞在斑马鱼和新生小鼠心脏中（Porrello 等人，2011；Kikuchi 等人，2010），以及在斑马鱼鱼鳍和颅骨中，已分化的成骨细胞（OBs）去分化为成骨性祖细胞状态，并参与骨的再生与修复（Geurtzen 等人，2014；Knopf 等人，2011）。在这些情况下，发生去分化的细胞仍保持谱系限制性，这意味着它们不会去分化为多能状态，而仅能产生相同类型的细胞。因此，我们使用“去分化”这一术语来描述已分化细胞恢复为祖细胞状态的过程，无论这一过程是否与细胞潜能的改变相关。细胞去分化（部分还涉及细胞命运的扩展）最近也在哺乳动物损伤模型中被报道（Tata 和 Rajagopal，2016；Mills 和 Sansom，2015）。本研究中，我们采用无偏倚的高内涵筛选方法，鉴定斑马鱼鱼鳍再生过程中成骨细胞去分化的调控因子。

鱼鳍包含分节的骨鳍条（鳞鳍条），该结构由两个凹形半段（半鳍条）构成（图1A）。这些骨鳍条由覆盖在半鳍条内外表面的单层成骨细胞直接骨化形成，而斑马鱼鳍条中不存在被包裹在骨基质中的骨细胞（图1A）。与哺乳动物类似，已分化的斑马鱼成骨细胞以骨钙蛋白（骨γ-羧基谷氨酸蛋白，bglap）的表达为特征（Stewart和Stankunas，2012；Knopf等，2011；Sousa等，2011）。有趣的是，已知对鱼鳍截肢最早的细胞反应之一是成熟成骨细胞的去分化，这些成骨细胞会下调骨钙蛋白的表达，并上调前成骨细胞标志物runx2（Stewart和Stankunas，2012；Knopf等，2011；Sousa等，2011）。去分化发生在距离截肢平面约350微米的区域内，因此在被截肢的节段（0号节段）中最为显著，但在截肢平面近端的第二个节段（2号节段，图1B）中不会发生。去分化的成骨细胞开始增殖，越过截肢平面，并在再生芽基中形成前成骨细胞群（图1B）（Knopf等，2011）。在再生过程中，位于再生组织远端尖端的前成骨细胞不断增殖，而其子代则随时间逐渐成熟（Stewart等，2014；Brown等，2009）。从截肢后3天（dpa）开始，随着前成骨细胞进入定型状态，再生组织中会上调osterix（sp7）的表达；而从约截肢后4天开始，位于再生组织最古老、最近端节段（1号节段）的成骨细胞会重新分化为骨钙蛋白阳性的成骨细胞（图1B）。因此，分化的成骨细胞为斑马鱼鳍的骨再生提供来源细胞。在斑马鱼鳍和蝾螈肢体再生的背景下，骨骼展现出远高于哺乳动物骨折修复过程中的再生能力，而哺乳动物的骨折修复在缺损超过临界尺寸时便会失败（Garcia 等人，2013）。成骨细胞的去分化被认为对哺乳动物的骨折修复没有贡献，哺乳动物的骨折修复似乎仅由祖细胞驱动（Park 等人，2012）。因此，成熟成骨细胞作为骨修复来源细胞所发挥的作用，可能是非哺乳动物脊椎动物鳍和肢体再生过程中骨骼再生能力提升的原因之一。

鳍的芽基形成和/或再生生长需要多种信号通路（韦纳与魏丁格，2015）。然而，迄今为止，仅有视黄酸（RA）信号通路被确定为骨细胞去分化的调控因子（布卢姆与贝格曼，2015），而许多已知调控再生生长的其他通路似乎并未参与去分化过程（R.M. 与 G.W.，未发表数据）。可利用荧光转基因报告基因和体视显微镜对活鱼中的骨细胞分化状态进行监测。因此，我们开展了一项基于成像的高内涵筛选，旨在寻找在斑马鱼鳍再生过程中影响骨细胞体内去分化的、具有已知生物靶点的小分子化合物。

有趣的是，我们发现许多筛选出的基因要么影响成骨细胞的去分化，要么影响再生生长，这表明去分化和生长在很大程度上是独立调控的。我们证实，NF-κB信号通路对成骨细胞的去分化具有负调控作用。该通路在成熟成骨细胞中处于激活状态，而在鱼鳍被切除后其表达会下调。通过对该通路进行成骨细胞特异性条件基因操作，我们发现NF-κB信号通路在成骨细胞中以细胞自主方式发挥作用，抑制其去分化。NF-κB信号通路可维持视黄酸信号通路的活性，而视黄酸信号通路的下调同样是成骨细胞去分化所必需的。本研究为进一步研究细胞去分化的调控机制提供了资源，并揭示了NF-κB信号通路在维持成骨细胞分化状态中的意外作用。

结果

一项筛选影响成骨细胞去分化与再生性生长的化合物的体内筛选实验、

我们首先利用已建立的骨钙素（bglap）报告基因，开发了一种基于成像的体内筛选方法，用于筛选影响成骨细胞去分化和鳍再生生长的化合物。转基因品系Ola.Bglap:EGFPhu4008（bglap:GFP）可标记分化的成骨细胞（Knopf等人，2011年）。我们此前发现，在鱼鳍截肢后，内源性bglap基因的转录会在损伤后1天内于残端成骨细胞中被下调（Knopf等人，2011年）。在bglap:GFP转基因斑马鱼中，这种下调可通过损伤后3天荧光强度的减弱来追踪，因此该品系是研究成骨细胞去分化的理想活体报告工具（Knopf等人，2011年）。

为实现合理的筛选通量，我们选择使用标准体长（SSL）11.0毫米、5周龄的幼鱼进行实验。这类幼鱼体型足够小，可在24孔板中进行药物处理（图1C）。在该发育阶段，幼鱼鳍的整体结构与成鱼相似（图1A及图S1A）。Zns5抗体可识别所有分化阶段的骨细胞（OBs）表达的表位，因此能标记所有排列在骨节上的骨细胞，以及位于骨节间关节处的骨细胞（图1A）（Johnson和Weston，1995）。相比之下，表达bglap:GFP的分化骨细胞仅局限于每个骨节的中心区域，关节处则无此类细胞（图1A）。对幼鱼尾鳍进行截肢处理后，最远端残端鳍条节段（0号节段）的bglap:GFP表达出现下调，这一现象与成鱼中的观察结果一致（图1D及图S1B）。需注意，所有实验的样本量及其他统计信息详见表S1。幼鱼鳍与成鱼鳍在鳍再生的其他特征上也表现出一致性（图S1C–S1F）。综上，幼鱼是研究骨细胞去分化和鳍再生的合适模型。

在化合物筛选实验中，先将 bglap:GFP 转基因斑马鱼与化合物预孵育1小时，随后进行鳍切除术；截肢后立即（0天术后，dpa）拍摄GFP荧光图像（图1C、图1D）。采用每日更换培养液的处理方案培养3天后，再次分别在明场和GFP荧光模式下对斑马鱼成像，以量化再生生长情况和成骨细胞去分化水平（图1D）。研究发现，筛选条件——包括在0.1%二甲基亚砜（DMSO）中孵育、全程避光、小孵育体积（1毫升）以及3天不喂食——并未对我们量化成骨细胞去分化和再生生长的能力产生不利影响（图S1G–S1N）。候选化合物筛选的效应强度阈值，依据仅用溶剂处理的阴性对照斑马鱼在0至3天术后bglap:GFP荧光强度变化的变异性，以及3天术后再生长度的变异性确定（详细方法见STAR方法学）。我们对全部472种化合物进行了筛选恩佐筛孔ICCB已知生物活性文库的药物以及微源光谱库的1063种化合物（图1E）。所有化合物均以5毫摩尔的终浓度进行筛选。初筛后，我们开展了4次验证筛选，最终将28种化合物（占全部筛选化合物的1.8%）定为阳性命中物（图1E）。筛选标准详见《STAR实验方法》；阳性命中化合物的相关信息见表S2。其中68%的化合物影响去分化过程，21%影响再生性生长，11%同时影响这两个过程（图1F）。大多数影响再生性生长的化合物对其起到抑制作用，而我们发现的骨细胞去分化抑制剂与促进剂数量相近（图1F）。根据其主要标注的生物学靶点，我们将候选化合物分为多个类别（图1F），涵盖了广泛的生物学过程，包括潜在的免疫调节剂（影响白三烯生物合成和花生四烯酸通路的化合物）、糖皮质激素受体效应物、酪氨酸激酶抑制剂，以及靶向代谢的化合物。 

图1. 用于鉴定影响成骨细胞去分化及再生生长的化合物的体内化学筛选。(A) 左图：斑马鱼尾鳍的每一段骨条由两条凹形半骨条构成，半骨条内外表面均衬有单层已分化、表达bglap:GFP阳性的成骨细胞。右图：鳍条两个节段的 Z 轴投影。ZnS5 抗体（红色）标记所有成骨细胞谱系细胞，包括关节细胞（橙色箭头）。比例尺：10 μm。(B) 成骨细胞去分化与再分化示意图。成骨细胞在截肢平面近端区域发生去分化，迁移进入正在发育的芽基，形成前成骨细胞群体。截肢后 6 天（6 dpa），成骨细胞在再生组织的近端节段发生分化。(C) 化学筛选实验设计。(D) 伪彩色强度图像及原始积分密度测量结果显示：0 号节段的bglap:GFP信号强度下降（黄色箭头与曲线图），而1 号、2 号节段不受影响。红色箭头：截肢平面。红线：再生组织长度。图中曲线表示平均值 ±95% 置信区间。***p < 0.001。本实验及其余全部实验的样本量与其他统计信息详见表 S1。(E) 候选化合物筛选流程。(F) 左图：候选化合物中，仅影响去分化占 68%，仅影响再生生长占 21%，同时影响两种过程占 11%。中图：影响再生生长的候选化合物大多起抑制作用（抑制剂 78%，增强剂 22%）；而去分化的增强剂（45%）与抑制剂（55%）数量相近。右图：筛选得到的化合物主要靶向的已注释通路与生物学过程。

成骨细胞去分化的发生必须下调核因子κB信号通路

影响嗅囊去分化的首个命中化合物为氯磺丙脲，这是一种可刺激胰腺β细胞分泌胰岛素的药物（梅兰德，2004年），但研究也发现它能激活核因子κB信号通路（PubChem生物测定法AID 928）。用氯磺丙脲处理幼鱼后，在损伤后3天，0体节中的骨钙蛋白启动子驱动绿色荧光蛋白（bglap:GFP）表达水平升高，因此该药物似乎能抑制嗅囊去分化（图2A）。相比之下，甲苯磺丁脲与氯磺丙脲同属磺酰脲类药物，但目前未发现其可调控核因子κB信号通路，它既未影响bglap:GFP的表达水平，也未对再生生长产生作用（图S2A、S2B）。而佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）作为一种广泛使用的核因子κB信号通路激动剂（霍尔登等人，2008年），确实能同时提高幼鱼和成鱼体内的bglap:GFP水平（图S2C、S2D）。将PMA与氯磺丙脲联合处理后，鳍中核因子κB信号通路转录报告基因（((8xHs.NF kappa B:GFP,Luc ^{hdb5Tg })）（库里等人，2017年）的表达水平升高，这表明氯磺丙脲确实发挥了核因子κB信号通路激动剂的作用（图S2E）。在损伤后2天，PMA与氯磺丙脲的联合处理就已使bglap:GFP水平升高，而此时单独处理两种药物均未产生该效果。单独使用该药物未显示出显著效果（图2B）。相反，用NF-κB信号通路抑制剂Bay11-7085（Bay 11）或Jsh 23处理则产生了相反的效果，导致NF-κB信号报告基因8xHs.NFkB:GFP,Luc的表达量下降（图S2F），并且在幼鱼和成鱼中，截肢后3天的bglap:GFP水平也有所降低（图2C和图S2G）。通过截肢后1天的定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）检测发现，Bay 11还能显著增强0节段内内源性bglap表达的下调（图2D）。我们得出结论，干扰NF-κB信号通路上调会增强截肢诱导的bglap表达丢失，而激活NF-κB信号通路则会减少bglap的下调。有趣的是，氯磺丙脲和Bay 11均未影响再生组织的生长，而Jsh 23则对其产生了轻微的抑制作用（图S2H和图S2I）。因此，NF-κB信号通路似乎调控成骨细胞的去分化，但对再生生长几乎没有影响。

接下来，我们探究了仅抑制NF-κB信号通路（不进行截肢）是否足以诱导成骨细胞去分化。然而，用Bay 11或Jsh 23处理未受伤的斑马鱼3天后，对应于截肢鳍中分析节段的bglap:GFP表达并未下降（图S2J）。这些数据表明，NF-κB信号通路的缺失需与其他损伤诱导信号共同作用，才能促进成骨细胞去分化。

抑制NF-κB信号通路可增加去分化成骨细胞的数量

Bay 11处理并未改变0节段中Zns5阳性成骨细胞的总数（图2E），也未影响bglap:GFP阳性去分化成骨细胞中的5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）掺入情况（图2F和图S3A），这表明NF-κB信号通路抑制成骨细胞的去分化，而不影响其存活或增殖。我们此前的研究表明，去分化的成骨细胞会迁移至截肢平面之外，进入正在形成的再生组织中，为芽基补充成骨祖细胞（Geurtzen等人，2014；Knopf等人，2011）。在bglap:GFP转基因转录停止后，GFP蛋白会在部分去分化成骨细胞中持续存在3天，且在再生组织中成骨细胞开始重新分化的4天前（dpa），转基因不会发生转录（Knopf等人，2011）。因此，GFP蛋白表达可用于追踪去分化的成骨细胞。有趣的是，尽管Bay 11处理导致节段中bglap:GFP阳性成熟成骨细胞的数量减少在2天龄时，相同鳍的再生组织中GFP阳性细胞的数量显著高于二甲基亚砜处理的鳍（图2G）。Bay11并未改变0段和再生组织中GFP阳性细胞的总数（图S3B），而是将其分布从残端（0段）转移到了再生组织（图2H）。因此，我们得出结论，抑制核因子-κB信号通路可增强去分化成骨细胞向再生组织的募集。

斑马鱼鳍中已分化的成骨细胞不表达前成骨细胞标志物Runx2，但该标志物在去分化过程中会被上调（Knopf等人，2011）。因此，Runx2与持续存在的bglap:GFP蛋白的共表达标志着已获得祖细胞状态的去分化成骨细胞。有趣的是，Bay 11处理增加了0节段中同时表达Runx2的bglap:GFP+细胞的比例（图2I）。再生组织中GFP+ Runx2+细胞的比例也有所增加，这证实了抑制NF-κB信号通路可促进由成熟成骨细胞衍生的前成骨细胞向再生组织的募集（图2I）。Bay 11还增强了去分化的另一个检测指标分化、腱生蛋白C的表达情况，腱生蛋白C是一种参与组织重塑的糖蛋白，在截肢后残端成骨细胞和射线内成纤维细胞中该蛋白的表达会上调（图S3C）（克诺夫等人，2011年）。

综合这些结果可知，NF-kB 信号通路对成骨细胞去分化的多个方面具有负调控作用，具体包括分化标志物的丢失、前成骨细胞状态的获得以及前成骨细胞向正在形成的芽基的募集。

图2. NF-kB信号通路抑制成骨细胞去分化而不影响成骨细胞增殖。（A）用核因子-κB信号通路激活剂氯磺丙胺处理幼年斑马鱼，可减少0至3天损伤后骨钙素启动子驱动的绿色荧光蛋白表达水平的下调。图中为3天损伤后与同一条鱼0天损伤后相比的绿色荧光蛋白水平。比例尺，250微米。（B）佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）与氯磺丙脲联合处理，在损伤后2天即可使0节段的bglap:GFP水平升高，而单独使用这两种药物均无此效果。（C）用NF-κB信号通路抑制剂Bay 11或Jsh 23处理可增强bglap:GFP的下调。比例尺，250微米。(D) 定量逆转录聚合酶链反应分析显示，在损伤后1天，11号舱室增强了0段内源性骨钙素转录本的下调。图中为以损伤后0天二甲基亚砜组样本平均值为基准归一化的ΔΔCt值。每个数据点代表一次生物学重复。（E）成年斑马鱼在1天再生（1 dpa）时，0节段上半鳍条外表面存在的Zns5+成骨细胞总数，在通过腹腔注射（i.p.）Bay 11抑制核因子-κB（NF-κB）信号通路后并未发生变化。(F) 损伤后2天，通过对0节段中bglap:GFP+细胞（黄色箭头头）的EdU掺入检测，Bay 11不会改变去分化成骨细胞（OBs）的细胞周期活性。比例尺，20毫米。(G) 11号海湾导致去分化的成骨细胞向再生组织的募集增加。在截肢后2天，残段0中bglap:GFP阳性成骨细胞数量减少，同时再生组织中GFP阳性细胞数量增加。(H) 11号贝在2天损伤后（2 dpa）改变了bglap:GFP阳性细胞在0节段（seg 0，黄色箭头）和再生组织（reg，白色箭头）之间的分布，使再生组织中该细胞占比更高。比例尺，20毫米。（I）Bay 11 可使 2 dpa 时 0 节段和再生组织中上调 Runx2 的 bglap:GFP+ 细胞数量增加。展示的是z轴投影图。比例尺为20毫米。(A-l) 图中的线条代表平均值+置信区间（95%），除(D)图外，其线条代表平均值+标准误。无显著性差异，(p>0.05)：(p 0.05)：(^{prime prime} p<0.01)：(^{* *} p<0.001)。另参见图S2和图S3。

成骨细胞去分化与巨噬细胞无关

核因子-κB信号通路在巨噬细胞和中性粒细胞的炎症反应中作为重要介导因子发挥作用（Wu等人，2013；Ivashkiv，2011），且已有研究表明巨噬细胞对斑马鱼鳍的再生至关重要（Petrie等人，2014；Li等人，2012）。截肢后数小时内，巨噬细胞会被招募至截肢部位，这一时间点与成骨细胞去分化开始的时间大致相当。这一过程可通过coro (1a:EGFP ^{hkz04t })转基因品系进行可视化观察，该品系可同时标记巨噬细胞和中性粒细胞（Li等人，2012）。为验证核因子-κB为了探究信号通路是否通过巨噬细胞间接调控成骨细胞去分化，我们在成年斑马鱼鳍截肢前注射了氯膦酸脂质体，并证实巨噬细胞已被耗竭——因为在截肢后1天（1 dpa），招募至0节段和再生组织中的coro1a:EGFP阳性细胞数量减少（图3A）。与此前其他研究的结果一致（Petrie等人, 2014; Li等人, 2012），巨噬细胞耗竭会降低再生生长（图3B）。相比之下，巨噬细胞耗竭的斑马鱼在截肢后3天（3 dpa），其成骨细胞特异性标记物bglap:GFP的下调水平未发生改变（图3C）；在截肢后1天（1 dpa），内源性bglap的表达下调也未受影响（图3D）。使用PMA和氯磺丙脲联合处理可减少成骨细胞去分化（图2B），但该处理并未改变截肢后1天（1 dpa）coro1a:EGFP阳性白细胞向远端残端的募集（图S4）。综上，我们认为巨噬细胞并非成骨细胞去分化所必需的，这表明NF-κB信号通路在成骨细胞去分化中的作用独立于其在巨噬细胞中的功能。

图3. 巨噬细胞并非成骨细胞去分化所必需。(A)向成年鱼腹腔内注射氯膦酸脂质体，可减少在损伤后1天招募至远端残端或再生组织的coro1a:EGFP阳性细胞数量。虚线表示截肢平面。比例尺，40微米。(B) 巨噬细胞耗竭后，损伤后3天的再生组织绝对长度缩短。(C) 巨噬细胞耗竭不影响损伤后0至3天内bglap:GFP的表达消失。(D) 定量实时聚合酶链反应分析显示，巨噬细胞耗竭不影响损伤后1天0节段内内源性bglap转录的下调。图中为相对于损伤后0天未注射样本平均值标准化的ΔΔCt值。每个数据点代表一次生物学重复。(A-D) 图中线条表示平均值+置信区间（95%），(D)中线条表示平均值+标准误均值。n.s.，(p 0.05)：(p <0.05)：(^{* *} p<0.01)：(^{* *} p<0.001) 另见图S4。

NF-κB信号通路在分化的成骨细胞中具有活性，且在鳍截肢后会被下调

我们的研究结果表明，要发生损伤诱导的成骨细胞去分化，必须下调 NF-kB 信号通路。如果该通路该通路直接调控成骨细胞的去分化，因此在损伤前的成熟成骨细胞中应处于激活状态。通路调控因子IkB的表达受正反馈调控，且常被用作NF-κB通路活性的检测指标（Karra等人，2015；Bottero等人，2003）。通过RNAscope原位杂交技术，我们发现斑马鱼的两个IkB同源基因nfkbiaa和nfkbiab在未损伤的鳍条中均有表达（图S5A）。Bay 11处理下调了未损伤鳍以及截肢后0段中nfkbiaa的表达（图4A和图S5A）。因此，我们将nfkbiaa的表达作为鳍中该通路活性的检测指标。值得注意的是，2段中bglap:GFP阳性的成熟成骨细胞表达nfkbiaa，而成骨细胞发生去分化的0段中，该表达在截肢后一天内便有所降低（图4B）。同样，NF-κB信号转导的转基因报告基因8xHs.NFkB:GFP,Luc在未损伤鳍的Zns5阳性成骨细胞中表达，且当Bay 11抑制NF-κB信号转导时，成骨细胞中的转基因表达也随之下调（图4C）。不过，该表达较弱且呈现高度镶嵌性，这至少部分可能是由转基因沉默导致的，这种现象在成鱼中较为常见，且可通过鳍截肢操作逆转（Thummel等人，2006）。事实上，当我们进行截肢操作时8xHs.NFkB:GFP，Luc鳍的整体表达水平有所升高，并在数天内维持在较高水平（图S5B）。因此，在后续实验中，我们使用了通过先前一轮鳍再生使转基因去沉默的斑马鱼。然而，成骨细胞中的报告基因表达仍呈镶嵌分布，且仅在约30%的Zns5+细胞中被检测到（图S5C）。由此，我们无法排除未损伤鳍中存在不同成骨细胞亚群的可能性，仅有部分亚群表现出高NF-κB信号活性。尽管如此，在成骨细胞发生去分化的伤后2天，表达报告基因的成骨细胞（GFP+ Zns5+）数量减少了70%（图4D）。值得注意的是，在成骨细胞开始再分化的伤后4天，表达报告基因的成骨细胞数量回升至伤后0天的水平（图4D）。这些数据支持了成骨细胞中NF-κB信号通路的下调是其去分化所必需的这一假说。

图4. NF-κB信号通路在分化成骨细胞中具有活性。(A) 经 RNAscope 整体原位杂交检测，Bay 11 处理后，再生第1天的0节段中NF-κB信号通路反馈靶基因nfkbiaa的表达被下调。(B) 经 RNAscope 整体原位杂交检测，nfkbiaa在bglap:GFP+成骨细胞中表达。上图为Z轴堆叠投影；下图为定量分析，单个斑点被分配至单Z平面的特定成骨细胞中（白色箭头）。注意GFP在细胞核（n）中的聚集。比例尺为10微米。(C) Bay 11 对NF-κB信号通路的抑制作用，会使再生鳍最远端两个节段中，第8天Zns5+成骨细胞内NF-κB信号通路报告基因转基因8xHs.NF-κB:GFP,Luc的表达降低。图中为Z轴投影。Bay 11 处理组中的灰色圆点为Grubbs检验识别的异常值，已从统计分析中排除。比例尺为10微米。(D) 表达8xHs.NF-κB:GFP,Luc的0节段Zns5+成骨细胞数量（黄色箭头）在第2天时下降，并在第4天恢复至第0天的水平。注意：为促进转基因去沉默，分析前的二次截肢操作是在鳍被首次截肢8天后进行的。比例尺为50微米。(A-D) 图中的线条代表平均值+95%置信区间。n.s.表示无显著差异。另见图S5。 

核因子κB信号通路在成骨细胞中以细胞自主方式发挥作用并抑制去分化

我们接下来探究了核因子κB（NF-kB）信号通路是否在成骨细胞（OBs）中以细胞自主的方式调控成骨细胞的去分化。为验证这一问题，我们利用他莫昔芬诱导型Cre系OlSp7:CreERT2-p2a-mCherrytud8（osx:CreER）和泛表达的响应系actb2:LOXP-mCherry-STOP-LOXP-TagBFP-2A-IkBSRpd114Tg（actb2:R to BFP IkBSR，Karra等人, 2015），在成骨细胞中诱导NF-kB信号通路抑制剂（核因子κB抑制蛋白超抑制因子，IkBSR）（Van Antwerp等人, 1996）的表达，该响应系在重组后会表达IkBSR和蓝色荧光蛋白（BFP）（图S6A）。由Cre响应系hsp70l:loxP DsRed2 loxP (nlsEGFPtud9)（hs:R to G）驱动的绿色荧光蛋白（GFP）表达作为阴性对照（图S6B）。此外，我们构建了一个Cre响应系，该系在重组后通过表达人组成型激活的IκB激酶（IKK2）和核定位的蓝色荧光蛋白2（BFP2）来激活NF-kB信号通路，即hsp70l:loxP Luc-myc STOP loxP IKKca-t2a-nlsmTagBFP2-V5，(cryaa:AmCyan ulm12Tg)（hs:Luc to IKKca BFP，图S6C）。为简便起见，我们将osx:CreER与这些响应系组合的双转基因鱼分别称为“osx GFP”、“osx IkBSR”和“osx (IKKca")”。在osx IKKca与8xHs.NFkB:GFP,Luc组合的三转基因鱼中，重组后表达IKKca的成骨细胞（BFP+）更有可能表达NF-kB响应...

相较于BFPOB，其表达量更高（图S6D），表明转基因激活了NF-κB信号通路。由于osx:CreER的表达水平在鳍再生过程中最高，我们对鳍进行截肢，通过多次注射4-羟基他莫昔芬诱导重组，并让鳍再生8天，此时近端再生部位已形成新骨，且bglap水平恢复至截肢前水平（见图S6E的实验方案和图5A的时间线）。随后，我们穿过这一新的残端骨再次截肢，并在第二次截肢后2天（2 dpa），利用RNAscope原位杂交技术分析0段重组成骨细胞（OBs）中bglap的表达情况（图5A和图S6E）。在0 dpa时，osx GFP鱼中80%的重组GFP+成骨细胞表达bglap，说明通过该实验系统，osx:CreER可用于标记已分化的成骨细胞（图5A）。到2 dpa时，0段中仅40%的GFP+成骨细胞为bglap+，这表明许多重组细胞去分化为bglap-状态（图5A）。有趣的是，在2 dpa时，osx IkBSR鱼中仅有10%的BFP+成骨细胞为bglap+，提示成骨细胞中IkBSR的表达会促进其去分化（图5A）。相反，在osx IKKca鱼中，重组细胞表达bglap的比例与0 dpa时osx GFP鱼中GFP+细胞的比例相近，表明NF-κB信号通路的强制激活可完全抑制成骨细胞的去分化（图5A）。此外，IkBSR或IKKca表达导致bglap+成骨细胞数量改变，也可能是由于第一轮再生过程中成骨细胞分化存在缺陷（6 dpa至0 dpa，见图5A时间线和图S6E方案）。但在2 dpa时，去分化发生的0段中，表达IkBSR的BFP+成骨细胞仅10%为bglap+，而成骨细胞不发生去分化的未损伤2段中，81%的BFP+细胞为bglap+（图S6F）。这一比例与osx GFP鱼第一轮再生过程中（0段0 dpa，图5A）重组细胞分化为bglap+状态的比例非常相似。同样，IKKca表达未改变2段中bglap+细胞的比例（图S6F）。我们得出结论：调控NF-κB信号通路会改变鳍截肢后成骨细胞的去分化，但不影响再生后期前成骨细胞的（再）分化过程。

由于我们的重组系统并非特异性针对分化的成骨细胞，同时也标记了鳍切除前就已表达bglap的一群未成熟成骨细胞（osx GFP中20%的重组细胞，图5A），因此我们无法排除osx IkBSR或osx IKKca转基因鱼在伤后2天bglap阳性细胞数量的改变，分别是由这群细胞的扩增或减少导致的，尽管对NF-κB信号通路的药理学操作并未影响成骨细胞的增殖（图2H）。然而，为了验证IkBSR表达促进去分化、而IKKca表达抑制去分化，我们在伤后2天以细胞分辨率定量了bglap的mRNA水平。对乙醇处理的osx IkBSR转基因鱼进行RNAscope信号强度分析显示，在未发生去分化的2体节区域，大多数成骨细胞在伤后2天高表达bglap，仅有少数细胞呈低表达（图5B）。相反，在发生去分化的0体节区域，高表达该mRNA的bglap阳性细胞比例仅为5%，大多数bglap阳性细胞呈低表达（图5B）。因此，该实验可用于定量伤后2天尚未完全下调bglap表达的成骨细胞群的去分化水平。值得注意的是，osx IkBSR转基因鱼中表达IkBSR的BFP阳性成骨细胞，在伤后2天的bglap转录本含量甚至低于同鳍中非重组的BFP阳性成骨细胞（图5C）。反之，osx IKKca转基因鱼中表达IKKca的BFP阳性成骨细胞，其bglap转录本水平远高于0体节区域的BFP阳性成骨细胞（图5C）。这证实了NF-κB信号通路的抑制促进成骨细胞去分化，而强制激活NF-κB信号通路则细胞自主性地抑制去分化。在对应的2体节区域，BFP阳性与BFP阴性成骨细胞的bglap表达水平无差异（图S6G、S6H），这表明对NF-κB信号通路的操作不会干扰成骨细胞的分化。

接下来，我们探究了成骨细胞自主性核因子-κB信号通路抑制是否会影响成骨细胞去分化的另一个特征，即去分化细胞向再生组织的募集（图5D）。在osx GFP斑马鱼中，到损伤后2天，40%的绿色荧光蛋白阳性成骨细胞位于再生组织中，而60%仍保留在0节段（图5E和图5F）。相比之下，在osx IkBSR转基因鱼中，60%表达IkBSR和BFP的成骨细胞在损伤后2天出现在再生组织中，仅40%位于0节段（图5E和图5F）。相反，在osx IKKca转基因鱼中，仅有30%的IKKca+ BFP+成骨细胞分布在再生组织中（图5E和图5F）。我们得出结论：在成骨细胞中抑制NF-κB信号通路可促进其向再生组织募集，而激活NF-κB信号通路则产生相反效应。综上，这些数据有力表明NF-κB信号通路在成骨细胞中发挥负向调控其去分化的作用。

图5. NF-kB信号转导在成骨细胞去分化中的细胞自主作用。（A-C）根据实验方案，在成年osx： CreER、hs：R到G（"osx GFP"）中诱导重组；osx：CreER、actb2：R到BFP IkBSR（"osx IkBSR"），或osx：CreER、hs：Luc到IKKca BFP（"osx IKKca"）鱼中，所有鱼都受到热电击，bglp RNAsight与抗GFP或抗BFP联合

成骨细胞去分化增强会损害再生过程中成骨细胞的分化与骨形成

我们的研究结果证实，NF-κB信号通路是成骨细胞去分化的特异性调控因子。因此，通过调控NF-κB通路，我们能够探究成骨细胞去分化的改变对鳍骨再生的影响。如上所示，在成骨细胞去分化的时间窗口（损伤后0至3天）使用Bay 11抑制NF-κB信号，会增强成骨细胞的去分化能力（图2C）。然而，在损伤后5至2天进行3天的药物处理，且在截肢前2天停药，并未对去分化产生影响（图S7A），这表明该药物不会在体内持续存在，且短暂的Bay 11处理可用于探究去分化调控对再生的长期影响。在成骨细胞去分化阶段进行Bay 11处理，会使早期再生组织中Runx2阳性的前成骨细胞数量增加（图2I），这一现象也可通过再生组织中runx2:GFP阳性区域的扩张得以体现（图6A）。值得注意的是，在Bay 11停药后，再生过程后期阶段，runx2:GFP阳性的扩张区域依然持续存在（图6A）。从损伤后3天开始，随着前成骨细胞向定型状态转变，再生组织中的osterix（sp7）表达上调，但Runx2阳性Osx细胞群仍持续存在于生长鳍条的最远端（图1B）（Stewart等人，2014；Brown等人，2009）。在损伤后5天，短暂抑制成骨细胞去分化的斑马鱼中，该runx2:GFP阳性Osx前成骨细胞群的数量有所增加（图6B）。从损伤后4天开始，成骨细胞开始分化，在再生组织最古老、最近端的节段（第1节，Knopf等人，2011年）中，细胞变为bglap:GFP阳性。在损伤后3天（3 dpa）前短暂用Bay 11处理，会导致损伤后7天（7 dpa）时第1节段的bglap:GFP表达受损（图6C和图S7B）。损伤后7天，第1节段包含不同成熟水平的成骨细胞（Osx+ bglap:GFP、Osx+ bglap:GFP阳性和Osx bglap:GFP阳性）（图6D）。尽管短暂的Bay 11处理未改变第1节段中Osx阳性细胞的总数（图S7C），但它增加了未成熟细胞（Osx+ bglap:GFP阴性）的比例，降低了分化成熟成骨细胞（Osx bglap:GFP阳性）的比例（图6D）。相应地，再生骨的矿化程度降低（图6E）。

我们得出结论，鳍再生早期成骨细胞去分化能力增强，会导致定植于再生部位的Runx2阳性前体成骨细胞数量增加。其结果是，再生部位的成骨细胞群体长期向未成熟状态转变，表现为再生部位远端的前体成骨细胞群体增多，而更近端区域的成骨细胞分化受到损害（图6F）。因此，成骨细胞去分化能力增强会导致再生部位的骨成熟和矿化出现缺陷，这意味着要实现成功的骨再生，必须对去分化水平进行精细调节。

图6. 瞬时NF-κB信号抑制导致长期骨骼发育不成熟，且NF-κB信号作用于视黄酸信号的上游。(A) 成骨细胞去分化阶段使用 Bay 11 处理，会升高再生组织内 runx2:GFP 的表达量。图中绘制了沿截肢平面直线方向，再生组织中 runx2:GFP 阳性区域的占比。比例尺：100 μm。(B) 成骨细胞去分化阶段使用 Bay 11 处理，可使截肢后 5 天（5 dpa）再生组织顶端的 runx2:GFP⁺ Osx⁻ 前成骨细胞数量增多（箭头所示）。图片为 Z 轴投影图。比例尺：10 μm。(C) 成骨细胞去分化阶段使用 Bay 11 处理，会减弱再生组织 1 号节段内 bglap:GFP 信号的上调。图中为截肢后 7 天（7 dpa）的 GFP 信号强度，以同一条鱼2 号节段的信号作为参照进行归一化。(D) 截肢后 7 天，再生组织的 1 号节段包含多种成熟程度的成骨细胞（成熟度由低到高：bglap:GFP⁻ Osx⁺、bglap:GFP⁺ Osx⁺、bglap:GFP⁺ Osx⁻）。成骨细胞去分化阶段使用 Bay 11 处理，会改变细胞的分布，使细胞更多偏向低成熟状态。(E) 成骨细胞去分化阶段使用 Bay 11 处理，会降低截肢后 7 天的骨矿化水平。图中统计经茜素红 S 染色阳性的再生鳍条总面积。(F) 示意图展示截肢后 7 天，再生鳍条沿近远轴方向不同成熟度成骨细胞的分布。为便于读图，省略了同时表达多种标记物的细胞。红色虚线：截肢位点。(G) Bay 11 处理会加剧 03 dpa 期间 bglap:GFP 信号下调；而 cyp26 抑制剂 R118655 处理可减弱 bglap:GFP 的下调。Bay 11 与 R118655 联合处理同样能够减弱该下调。图中为 3 dpa 的 GFP 信号强度，以同一条鱼 0 dpa 的信号作为参照归一化。(H) 与野生型对照组相比，共表达 hs:cyp26a 的转基因鱼中 bglap:GFP 的下调程度加剧；而氯磺丙脲处理相比 DMSO 对照组，可减弱 bglap:GFP 的下调。但氯磺丙脲对 hs:cyp26a 表达鱼无作用（与野生型 + DMSO 组相比无统计学差异，n.s.）。图中为 3 dpa 的 GFP 信号强度，以同一条鱼 0 dpa 的信号作为参照归一化。(I) RNAscope 信号强度检测显示，Bay 11 处理会降低 cyp26b1 的表达；cyp26 抑制剂 R118655 处理不会改变 nfkbiaa 的表达。比例尺：10 μm。(AI) 图中曲线代表平均值 ±95% 置信区间。n.s.：p＞0.05；* p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001；**** p＜0.0001。 另见图 S7。

NF-κB信号通路作用于视黄酸信号通路的上游

此前研究表明，视黄酸（RA）信号通路在斑马鱼鳍再生过程中会抑制成骨细胞（OB）的去分化，而成骨细胞要实现去分化，需要上调降解视黄酸的酶cyp26b1的表达（Blum和Begemann，2015）。由于核因子κB（NF-kB）信号通路同样会损害成骨细胞的去分化，我们推测其可能通过维持视黄酸信号通路发挥作用，尤其是通过抑制cyp26b1的表达来实现。鳍被切除后，术后5小时内即可在切除平面检测到cyp26b1的上调，且经Bay11处理的斑马鱼中该基因的表达水平有所增强（图S7D）。为探究NF-kB与视黄酸信号通路之间的上位性关系，我们分析了以不同组合调控这两条通路后骨钙素启动子驱动的绿色荧光蛋白（bglap:GFP）表达水平的变化。Bay11对NF-kB信号通路的抑制会导致术后3天0节段中bglap:GFP的表达水平降低，而R118655对cyp26b1活性的抑制则会使该表达水平升高（图6G）。有趣的是，Bay11与R118655联合处理后，bglap:GFP的表达水平上调效果与单独使用R118655时相近（图6G）。由此我们得出结论，当通过抑制cyp26b1来增强视黄酸信号通路时，抑制NF-kB信号通路不再产生任何影响，这表明cyp26b1和视黄酸信号通路位于NF-kB信号通路的下游（图6G）。为进一步验证这一假说，我们利用热休克诱导的cyp26a转基因品系（hs:cyp26a，该品系可条件性表达cyp26a，其构建为hsp70l: (cyp26a1 ^{kn1Tg })）来抑制视黄酸信号通路（Blum和Begemann，2012）。在双转基因每天接受一次热激的鱼，在损伤后3天bglap:GFP的下调程度相较于热激的bglap:GFP单转基因同窝仔（hsp70l:cyp26a1野生型，图6H）有所升高。NF-κB激活剂氯磺丙脲可提高bglap:GFP的水平，但在cyp26a过表达时则无此效应（图6H，与野生型+二甲基亚砜组无显著差异）。这支持了我们的假设，即NF-κB信号通路的增强通过激活视黄酸信号通路来抑制去分化。然而，氯磺丙脲能够逆转cyp26a表达鱼体内bglap:GFP水平的下调（图6H），这表明NF-κB与视黄酸信号通路之间的关系并非严格的线性关系，视黄酸信号通路也可能对NF-κB信号通路上产生影响。不过，虽然Bay 11在损伤后1天的0体节中增强了cyp26b1的表达，但R118655对视黄酸信号通路的激活并未改变nfkbiaa的表达（图6I）。综合来看，这些数据支持了在成骨细胞去分化过程中，NF-κB信号通路上游于视黄酸信号通路的假设。具体而言，NF-κB信号通路似乎通过抑制cyp26b1的表达来维持视黄酸信号通路，从而干扰去分化过程（图7E）。

图7. 斑马鱼鳍再生过程中核因子-κB信号通路在成骨细胞去分化中的作用模型。（A）核因子κB（NF-κB）信号通路在已分化的骨钙素阳性（bglap+）残端成骨细胞中具有活性（绿色细胞），并在鳍被切除后，响应未知的损伤诱导信号而下调。（B）在未受干扰的鳍中（“正常情况”），核因子κB信号通路失活的成熟成骨细胞（白色细胞）能够去分化，并获得成骨前体细胞标志物Runx2（蓝色细胞）。核因子κB信号通路的缺失不足以诱导去分化，但使成骨细胞具备响应其他损伤诱导信号的能力，这些信号可诱导去分化（虚线）。去分化的成骨细胞迁移至切除平面之外，并参与再生组织的形成。（C）在实验性抑制核因子κB信号通路后，更多成骨细胞能够去分化，因此有更多细胞被招募至构成再生组织的成骨祖细胞库中。（D）在实验性过度激活核因子κB信号通路后，能够去分化的成骨细胞数量减少，因此被招募至再生组织的细胞也更少。（E）在未切除部位的成骨细胞中，核因子κB信号通路抑制视黄酸（RA）降解酶cyp26b1的表达；因此，视黄酸信号通路在成骨细胞中具有活性，并抑制去分化。鳍被切除后，核因子κB的下调解除了对cyp26b1的抑制，导致视黄酸降解，进而促使成骨细胞去分化。

讨论

针对幼体斑马鱼鳍再生修饰因子的化学筛选

在此，我们介绍幼年斑马鱼作为胚胎后过程的有效筛选模型。在体长约11毫米时，幼年斑马鱼已发育出成体的大部分形态和生理特征（帕里奇等人，2009），但仍可在24孔板中以较小体积（1毫升）饲养，这使得使用小分子化合物进行筛选时能保证合理的筛选通量并降低成本。此前已有多项针对斑马鱼鳍再生生长修饰因子的筛选研究（正向遗传筛选和化学筛选）开展（陈等人，2015；奥佩达尔与戈德史密斯，2010；马修等人，2007；牧野等人，2005），但据我们所知，目前尚未在脊椎动物系统中开展针对细胞去分化调控因子的无偏高内涵筛选。

成骨细胞去分化与再生生长的独立调控

我们筛选中鉴定出的大多数目标化合物会影响去分化或再生生长，而仅有少数药物（11%）能同时改变这两个过程。该筛选对去分化修饰因子的识别更为敏感，因为此过程的变异性更高，因此我们在筛选影响去分化的候选化合物时采用了比筛选影响再生生长的命中化合物更宽松的筛选标准。尽管如此，仅改变一个过程的化合物占比很高，这表明斑马鱼成骨细胞的去分化与再生生长是可独立调控的独立过程。我们对NF-κB信号通路作用的分析也证实了这一点，我们发现该通路仅参与去分化的调控，而不参与再生生长的调控。

核因子-κB信号通路在成骨细胞分化维持中的作用

我们证明了NF-kB信号通路抑制成骨细胞的去分化。我们的结果提出了以下模型（图7）：NF-kB信号通路在未受伤的成熟鳍条中，该物质活跃于分化的、bglap阳性的成骨细胞中（图7A）。在鳍被截肢后，未鉴定的损伤诱导信号会抑制核因子-κB（NF-κB）信号通路，导致许多成骨细胞中该通路的活性下调（图7A）。核因子-κB信号通路阴性的成骨细胞此时具备去分化能力，并上调前成骨细胞标志物Runx2。在未受伤的鳍中对核因子-κB信号通路进行实验性干扰，并不足以诱导成骨细胞去分化，因此我们推测其他损伤诱导信号与核因子-κB信号通路的缺失共同作用，诱导成骨细胞去分化（图7B）。去分化的成骨细胞被招募至再生芽基中，为骨再生提供源细胞（图7B）。当通过实验手段全局或特异性地抑制成骨细胞中的核因子-κB信号通路时，更多成骨细胞能够响应损伤诱导信号并发生去分化（图7C）。因此，也会有更多此类细胞定植于再生芽基中。相反，当通过实验激活核因子-κB信号通路时，去分化过程被阻断，仅有更少的前成骨细胞被招募至再生芽基中（图7D）。

我们的模型表明，核因子κB（NF-κB）信号通路在成骨细胞（OBs）中处于激活状态，且在成骨细胞去分化过程中需要被下调。鉴于已有研究显示，在小鼠的骨骼发育以及骨质疏松症发生过程中，NF-κB信号通路会以细胞自主的方式对成骨细胞分化产生负调控作用，这一模型令人意外（Swarnkar等人，2014；Chang等人，2009）。与之相反，我们的研究数据显示，至少在鳍再生过程中，NF-κB信号通路并非成骨细胞分化所必需的。为了明确这一差异是否反映了鱼类和哺乳动物成骨细胞中NF-κB信号通路功能的本质差异，有必要在斑马鱼胚胎发育和软骨内骨形成过程中，进一步研究NF-κB信号通路在成骨细胞分化中的作用。

值得注意的是，NF-kB信号通路已被证实参与其他细胞类型的去分化过程。该通路是斑马鱼心脏再生所必需的，在此过程中似乎能促进心肌细胞的去分化（Karra等人，2015）。此外，在肠道癌变过程中，NF-kB信号通路能促进有丝分裂后肠道上皮细胞去分化为肿瘤起始干细胞（Schwitalla等人，2013）。在这些案例中，NF-kB信号通路的激活会促进细胞去分化，而本研究发现该通路却能阻止成骨细胞的去分化。尽管如此，在多个系统中发现参与细胞去分化的通路，将为研究不同细胞类型间去分化的潜在机制在多大程度上具有共性提供契机。

此前仅另一条通路，即视黄酸（RA）信号通路，被证实可在斑马鱼鳍再生过程中调控成骨细胞（OB）的去分化（Blum和Begemann，2015）。成骨细胞要实现去分化，需关闭视黄酸信号通路；且成骨细胞在去分化过程中，会通过表达视黄酸降解酶cyp26b1来屏蔽自身的视黄酸信号（Blum和Begemann，2015）。我们发现核因子κB（NF-κB）信号通路可抑制cyp26b1的表达，实验结果支持核因子κB信号通路上游调控视黄酸信号通路的模型（图7E）。具体而言，我们认为当视黄酸信号通路处于高活性状态时，成骨细胞无法发生去分化，而这一效应至少部分是通过核因子κB信号通路抑制cyp26b1的表达来实现的（图7E）。鳍被切除后，由于核因子κB信号通路的下调以及其他尚未明确的损伤诱导信号的作用，成骨细胞中cyp26b1的表达被诱导（图7E）。这会导致视黄酸水平降低，从而使去分化得以发生发生（图7E）。然而，考虑到我们所依赖的利用功能减弱型干预进行上位性研究所存在的不确定性，该模型的进一步验证有待于能够实现非功能减弱型条件性遗传通路操控的技术发展。

值得注意的是，目前已知的两种调控成骨细胞去分化的通路（NF-κB和视黄酸信号通路）均需被下调，成骨细胞去分化才会发生。因此，成骨细胞去分化可能是一种默认状态，由维持分化状态的信号丢失引发，而非由主动诱导去分化的信号获得导致。对我们筛选中发现的其他通路展开研究，将有助于验证这一观点。

再生性成骨细胞的不同细胞来源

鳍截肢后数小时内便会发生成骨细胞的去分化，这一过程发生在芽基形成以及显著的再生性生长之前（Stewart 与 Stankunas，2012；Knopf 等人，2011）。如果去分化的成骨细胞是芽基中成骨细胞前体以及新再生骨的唯一或主要来源，那么对成骨细胞去分化的强烈干扰预计会导致骨鳍条再生生长出现缺陷。尽管视黄酸处理会抑制成骨细胞去分化，同时也会阻断再生性生长（Blum 与 Begemann，2015），但我们发现了多种能强烈干扰成骨细胞去分化，却对再生组织生长无明显影响的化合物。这表明在成骨细胞去分化缺失的情况下，再生性成骨细胞可由其他细胞来源形成。事实上，消除osterix阳性的成骨细胞并不会影响再生鳍中骨的形成，这说明至少在成熟成骨细胞无法发挥作用时，另一类osterix阴性的前体细胞群体参与了再生骨的形成（Singh 等人，2012）。近期研究发现，鳍节间关节处的未成熟成骨细胞在鳍截肢后会参与骨的形成，因此这些细胞可能是这类替代性成骨细胞群体（Ando 等人，2017）。未来需要通过定量谱系追踪来明确，在未受干扰和受刺激的条件下，去分化的成熟成骨细胞与其他细胞来源分别在鳍的骨再生过程中贡献了多少比例。无论如何，有理由认为鳍可通过多种细胞机制实现骨的再生，包括成骨细胞去分化以及前体细胞的募集。这种可塑性或许是附肢再生背景下的骨修复效率高于哺乳动物骨折修复的原因之一——在哺乳动物骨折修复中，成熟成骨细胞被认为不参与再生过程（Park 等人，2012）。

然而，我们发现通过短暂抑制NF-κB信号通路来增强成骨细胞去分化，会对再生骨的骨成熟产生长期负面影响，这表明为实现成功的骨再生，必须对去分化的程度进行精细调控。短暂抑制NF-κB信号通路不仅会招募更多Runx2阳性的前成骨细胞到再生部位，还会使再生部位的Runx2阳性细胞群体数量增加数天。令人意外的是，前成骨细胞数量的增加并未导致成熟成骨细胞的生成增多和骨形成增强，反而降低了成骨细胞的分化速率。值得注意的是，当前关于成骨细胞成熟的模型认为，Runx2阳性前成骨细胞会在再生组织生长端的远端尖端，且这些细胞会随时间过渡到Osx+状态，随后进入Bglap+状态，同时它们始终停留在再生组织内的初始位置（Stewart等人，2014；Brown等人，2009）。由于新细胞在远端不断添加，随着时间推移，单个成骨细胞会出现在更近端的位置。因此，在损伤后7天（7 dpa），最近端（最古老）节段的成骨细胞中bglap基因表达上调（图6F）。远端Runx2+细胞群的增加与近端Bglap+细胞群的减少相关，这一现象表明：（1）成骨细胞处于Osx+状态的时间是固定的；（2）再生鳍条特定区域所能容纳的成骨细胞数量也同样固定。因此，当远端Runx2+细胞群增加（但再生组织的整体长度未增加）时，这些新增细胞只能通过Osx+结构域向近端移动来容纳，进而导致最近端节段中分化细胞的数量减少（图6F）。

总之，我们的筛选鉴定出了调控成骨细胞去分化的候选通路，其范围之广前所未有，这为进一步研究细胞去分化的分子机制提供了宝贵资源。此外，我们发现核因子-κB信号通路是成骨细胞去分化的负调控因子，但并非成骨细胞分化所必需，这一发现引出了一些有趣的问题，涉及分化与去分化之间的关系，以及高再生能力脊椎动物与哺乳动物之间成骨细胞生物学的保守性。

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