标题：Developing zebrafish utilize taste-signaling pathways for oxygen chemoreception

期刊：Current Biology

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cub.2024.08.015

摘要

所有动物的一项基本需求是感知并应对环境中(O_{2})的可用性变化。低(O_{2})（缺氧）通常会刺激呼吸，这一普遍且关键的反应被称为低氧通气反应（HVR）。本研究验证了味觉信号通路参与HVR感知与激活这一假说。研究发现，作为味蕾复合体组成部分的默克尔样细胞（MLCs）在斑马鱼幼体中充当(O_{2})化学感受器细胞，且(O_{2})信号的转导依赖味觉信号通路。具体而言，MLCs在体内对缺氧产生反应，其(Ca^{2+})活性增强可驱动低氧通气反应。此外，MLCs向第Ⅸ和第Ⅹ对颅神经（nIX/X）传入神经传递(O_{2})信号，这些神经投射至后脑的最后区，并与迷走运动神经元相接触的中间神经元形成突触。对nIX/X进行缺氧刺激或化学激活，会使最后区内的(Ca^{2+})活性升高，并引发过度通气。该研究首次证实了一条信号通路：以味觉感受器（MLCs）的激活为起始，最终产生关键的生理反射——低氧通气反应。

引言

所有动物都能感知并响应环境中(O_{2})的变化在脊椎动物中，低氧（hypoxia）通常会触发多种生理反射反应的激活，以最大限度降低低氧带来的有害影响。其中一种反射是低氧通气反应（HVR），即通气量增加，这源于呼吸频率（((f_{V}))）和/或呼吸幅度的提升，而该反应对生物在低氧环境中的生存至关重要。

HVR 在鱼类谱系中进化而来²，并作为一种对缺氧的保守且普遍的反应，保留在所有脊椎动物类群中。HVR 在鱼类中尤为重要由于水生环境易受(O_{2})水平波动的影响，间歇性或持续性的低氧对其生存能力构成了日益严峻的挑战。低氧通气反应（HVR）由此启动通过激活感觉(O_{2})化学感受器细胞实现，这类特化细胞位于哺乳动物的颈动脉体或鱼类的鳃上。7在成年鱼类中，鳃神经上皮细胞（((NECs) ^{8-10})）被认为会激活高碳酸通气反应。神经上皮细胞是内胚层来源的神经分泌细胞，与哺乳动物肺部的感觉神经上皮小体（(O_{2})）相似。尽管富含血清素的鳃神经上皮细胞表现出典型的特性，对应标识为(O_{2})体外的化学感受器细胞，但它们尚未被明确与体内的低氧通气反应（HVR）具体关联起来。

有趣的是，鱼类中最早被提出的 (O_{2}) 化学感受器细胞并非神经上皮细胞（NECs），而是在两种鲑科鱼类的口腔和鳃上发现的类味蕾细胞¹⁶。这些类味蕾受体由两种细胞类型组成，即味觉受体细胞本身，以及一种被称为默克尔样细胞（MLC）的单一基底血清素能细胞，味觉受体细胞呈环状附着于该细胞之上。共同形成味蕾复合体。微囊细胞（MLCs）与神经上皮细胞（NECs）具有多种共同的形态学特征，包括神经支配、突触囊泡蛋白（SV2）的存在以及神经递质5-羟色胺的表达。

在斑马鱼幼体中，(O_{2}) 化学感受作用与低氧通气反应（HVR）发育形成鳃的成熟以及神经内分泌细胞的神经支配，表明研究了另一种(O_{2})型化学感受器细胞的存在情况。鱼幼体在形态上表达与神经上皮细胞（NECs）相似的皮肤血清素能细胞²²，因此，研究重点一直集中在这些细胞作为鳃成熟前高通气反射（HVR）激活剂的作用上。然而，关于其(O_{2})敏感性的证据既稀少又存在矛盾。因此，本研究旨在确定这些感觉细胞负责(O_{2})的化学感受作用，并在鳃成熟和神经内分泌细胞神经支配之前激活呼吸换气反射。

最近有研究表明，MLCs 在体内会对氰化钠（NaCN）产生反应，氰化钠是一种化学性缺氧模拟剂。此外，颅部支配味蕾复合体27的神经（第七、第九和第十对脑神经）会对(CO_{2}^{28-31})和789c81b5-c768-4dc7-b6fa-5ba9445660f的变化做出反应，并且能够影响受刺激时会进行呼吸换气。因此，本研究验证这一假设：在斑马鱼幼体中，高通气反应（HVR）由迷走神经体（MLCs）激活，这些细胞在鳃发育成熟前充当化学感受器细胞。本研究选用斑马鱼（Danio rerio）幼体作为研究对象，原因在于其身体透明、便于进行基因操作操纵，以及显著的低氧通气反应。

结果

MLC 及其相关神经支配的免疫组织化学特征分析

我们首先试图通过免疫组织化学法表征MLC及其相关的神经支配（图1）。MLC根据色氨酸羟化酶1b（tph1b）的内源性表达进行了鉴定，36并且如前所述，被发现在一个味觉受体细胞环的基部，该环对spalt样转录因子4（sall4）和calretinin（图1A和1C）呈阳性（图1A和1C）。与NECs类似，MLCs表达5-羟色胺和SV2,18，这表明神经分泌特性（图1D）。由于这些相似之处，MLCs可能在以前的研究中无意中被误认为NECs。然而，MLCs可以很容易地与NECs区分开来，因为后者缺乏tph1b的表达（图1E）。对这项研究特别重要的是，早在受精后2天（dpf），感觉神经纤维就存在于咽弓区域（图2H），并且MLCs早在3dpf（图1B和1F-1J）就被证明受到神经支配，早在发育中NECs，直到7 dpf才受到神经支配。20支配MLCs的神经纤维也表达嘌呤能受体p2rx3b（图1I和1J），该受体已被证明在与脑神经VII、IX和X相关的鳃上神经节内的感觉神经元中表达。因此，MLCs和中枢神经系统（CNS）之间存在潜在的信号转导通路（图1B），该通路尚未被证明用于NECs。

图1.整只斑马鱼幼体Merkel样细胞（MLCs）的免疫组织化学特性和脑神经IX和X（nIX和nX）的神经支配。（A）受精后4天（dpf）Tg（sall4：eGFP，tph1b：mCherry）幼虫的代表性侧视图；比例尺，100毫米。（B）4dpf Tg（p2rx3b：eGFP，tph1b：mCherry）幼虫的代表性侧视图；比例尺，100毫米。（C-F）4dpf Tg（sall4：eGFP，tph1b：mCherry）幼虫咽弓区（PA）中钙视黄素、突触囊泡蛋白2（sv2）、血清素（5-HT）和神经元标记zn12的共同定位。箭头指向tph1b和5-HT均呈阳性的MLCs，而箭头指向仅对5-HT呈阳性的神经上皮细胞（NEC）；比例尺，25毫米。（G）4dpf Tg（p2rx3b：eGFP，tph1b的咽弓区：Zn12在2 dpf Tg（p2rx3b：eGFP，tph1b：mCherry）幼虫中的共定位；比例尺，100毫米。（I和J）Zn12在3 dpf和4 dpf Tg（p2rx3b：eGFP，tph1b：mCherry）幼虫的PA中的共定位；比例尺，分别为50毫米（I）和100毫米（J）。

因为肥大和/或增生是长时间缺氧暴露下的化学感受器细胞我们检测了幼虫MLC是否会发生此类形态变化。对暴露于低氧环境4、7或14天龄（dpf）的动物的NECs和MLC的细胞数量及大小进行了定量分析。正如预期的那样，神经内分泌细胞（NECs）的细胞数量和大小均有所增加慢性缺氧。虽然未观察到平滑肌样细胞（MLCs）增殖，但其肥大现象十分明显（图S1）。平滑肌样细胞对缺氧的这些形态学反应，使其具备作为(O_{2})化学感受器细胞的候选资格。

味觉信号通路的氧敏感性

化学感受器细胞可通过其在体内对所检测到的特定刺激引发适当细胞反应的能力来鉴定。因此，为了确定斑马鱼MLC为(O_{2})型化学感受器细胞，我们在低氧条件下开展了同步体内(Ca^{2+})成像实验，通过在支配MLC的第九、第十对颅神经（nIX/X）中的MLC内表达jRCaMP1a [Tg(tph1b:jRCaMp1a)]以及GCaMP6s [Tg(p2rx3b:GCaMP6s)]来实现（图2）。在低氧暴露前，尽管细胞内(Ca^{2+})水平(([Ca^{2+}]_{i}))保持稳定，但在MLC和nIX/X神经末梢均观察到了自发性(Ca^{2+})瞬变。随着低氧的出现，MLC中的([Ca^{2+}])升高（图2B），同时(Ca^{2+})瞬变的频率增加（((f_{Ca}^{2+}))）（图2C），但未观察到(Ca^{2+})瞬变幅度((Amp_{Ca}^{2+}))的变化（图2D）。([Ca^{2+}])的升高是暂时性的；随着低氧水平趋于稳定，([Ca^{2+}])和749ef7fe-ae97-4ca4-9191-f833ba02a74恢复至常氧水平（或降至低于(f_{Ca}^{2+})常氧水平）（图2B）。即使恢复常氧后，(f_{Ca}^{2+})的降低仍持续存在（图2C）。在支配MLC的nIX/X神经纤维（图2E-2H）和nIX/X神经节（图2I-2L）中也观察到了类似变化，其中nIX/X神经纤维在低氧出现时([Ca^{2+}])升高，而nIX/X神经节在低氧初期([Ca^{2+}])和(f_{Ca}^{2+})均升高，且在低氧水平稳定时([Ca^{2+}]_{i})进一步升高。重要的是，在所有检测的斑马鱼中，低氧初期阶段的MLC、nIX/X神经纤维和nIX/X神经节之间，平均40%的(Ca^{2+})瞬变呈同步化（图S2），这表明存在从MLC到感觉颅神经的有效信号转导通路。

第Ⅸ/Ⅹ对脑神经的神经节由多个细胞体构成（图1G）。因此，我们开展了更高分辨率的后续(Ca^{2+})成像实验，以探究第Ⅸ/Ⅹ对脑神经神经节内单个细胞体对缺氧的反应。首先采用主成分分析（PCA）对单细胞体(Ca^{2+})数据进行降维，随后通过k均值聚类识别数据集中的聚类簇⁴²。研究确定最佳聚类数量为2，其中聚类1包含暴露于常氧或缺氧环境的混合细胞体，而聚类2仅包含暴露于缺氧环境的细胞体（图2M和图2N），这表明第Ⅸ/Ⅹ对脑神经神经节中仅有一个亚群细胞会产生反应(O_{2}) 的变化。簇2中的细胞体显示出相似的(Ca^{2+})(O_{2}) 的变化。簇2中的细胞体显示出相似的(Ca^{2+})在暴露于缺氧条件时，nIX/X神经节的动态变化表现为：缺氧开始时([Ca^{2+}]_{i})水平升高，缺氧水平稳定后([Ca^{2+}])进一步升高（图2O-2Q）。在暴露于缺氧条件时，nIX/X神经节的动态变化表现为：缺氧开始时([Ca^{2+}]_{i})水平升高，缺氧水平稳定后([Ca^{2+}])进一步升高（图2O-2Q）。

图2斑马鱼幼体中MLCs、颅nIX/Xs末端和颅神经IX/X神经节的体内(Ca^{2+})成像。（A、E和I）代表性MLC、nIX/X终末和nIX/X神经节（nIX/X的细胞体）(Ca^{2+})痕迹由荧光强度校正为基线强度（((AF/F)）表示从受精后4天（dpf）Tg（tph1b：jRCaMP1a，p2rx3b：GCaMP6s）幼虫暴露于常氧或缺氧缺氧暴露期间的氧水平由实心黑线表示并分为5个阶段：基线（B）阶段、缺氧起始（HO）阶段、缺氧稳定（HS）阶段、恢复起始（RO）阶段和恢复稳定（RS）阶段。（B-D、F-H和J-L）MLCs（常氧、(n=48)缺氧、(n=32)(n=19))）和整个nIX/X神经节（常氧、(n=14)(n=15)）的归一化细胞内(Ca^{2+}(Delta[Ca^{2+}]_{i}))(Ca^{2+})事件频率（((Delta f_{Ca}^{2+}))(Ca^{2+})事件幅度（((Delta A m p_{C a}^{2+}))）。数据以平均值±SEM表示。星号（*）表示与每种处理内的基线值相比的显著性，而匕首（y）表示在同一时间阶段内正常氧和缺氧处理之间的显着差异。双向方差分析，然后是Holm-Sida'k事后测试，完整的统计数据可在表S2中获得。（M）聚类分析来自4 dpf Tg（tph1b：jRCaMP1a，p2rx3b：GCaMP6s）幼虫暴露于正常氧((n=61))((n=72))）处理的nIX/X神经节内单个细胞的(Ca^{2+})痕迹。每个点代表来自单个细胞的(Ca^{2+})痕迹，其尺寸通过主成分分析减小。用聚类1鉴定了两个聚类，包含来自正常氧和缺氧处理幼虫的细胞，而聚类2仅包括来自缺氧暴露幼虫的细胞。（N）来自每个治疗/集群的单个nIX/X神经节细胞的代表性(Ca^{2+})痕迹，由(Delta F / F_{0})（O-Q）表示。来自每个治疗/集群的单个nIX/X神经节细胞的标准化细胞内(Ca^{2+}(Delta[Ca^{2+}]))(Ca^{2+})事件频率（((Delta f_{Ca}^{2+}))(Ca^{2+})事件幅度（((Delta A m p_{Ca}^{2+}))）。数据以平均值±SEM表示。星号（*）表示与每个治疗/集群内的基线值相比的显著性，而不同的字母表示同一时间阶段内的显著性。双向方差分析随后是Holm-Sida'k事后测试，表S2中提供了完整的统计数据。另见图S2。

MLC 和颅神经节中 ([Ca^{2+}]_{1}) 与 (f_{Ca}^{2+}) 的增加几乎同时发生（图2B、2C、2F、2G、2J和2K），这表明两个位点之间的神经连接形成了一条通路，源自MLC的细胞信号可通过该通路传递至颅神经节。为了确认MLC与颅神经节之间存在信号通路，我们通过对咽弓区域进行周期性光照来特异性光激活MLC[Tg(tph1b:CoChR-eGFP)]，以模拟(Ca^{2+})低氧起始阶段MLC的反应（图3A-3D），并检测了Tg(p2rx3b:jRCaMP1a)品系中IX/X神经节内(Ca^{2+})的动态变化。当MLC被光激活后，([Ca^{2+}]_{i})和(f_{Ca}^{2+})两组中的IX/X神经节均出现活性增强，这与它们在低氧条件下的反应相似（图3E-3H）。MLC的刺激可直接激活IX/X神经节，这一发现提示存在一条将低氧信号从外周传递至中枢神经系统的感觉通路。由于MLC与味蕾复合体中的味觉受体细胞紧密相关，因此MLC在低氧期间的激活，可能是由味觉受体细胞产生的信号所介导，而非其自身具有固有的(O_{2})敏感性。无论化学感受的初始位点是味觉受体细胞还是MLC，低氧期间MLC内活性的增强都会将信号传递至脑神经节，这构成了斑马鱼幼鱼低氧通气反应（HVR）初始感觉阶段的基础。遗憾的是，我们无法评估MLC的光激活对通气反应本身的影响，因为在MLC中驱动转基因所需的tph1b启动子也存在于中枢神经系统的神经元中，这会使数据解释变得复杂。

图3.斑马鱼幼体在光刺激MLCs期间颅骨nIX/X神经节的体内(Ca^{2+})成像。（A）代表性(Ca^{2+})痕迹的MLCs表示的荧光强度校正为基线强度（((AF/F)）在4天受精后（dpf）Tg（tph1b：jRCaMP1a）或Tg（tph1b：jRCaMP1a，tph1b：CoChR-eGFP）幼虫。每个蓝色条代表一个光刺激事件，旨在复制低氧条件下的MLC活动。（B-D）归一化细胞内(Ca^{2+}(Delta[Ca^{2+}]_{i}))。光刺激后MLCs（((n=15)）的(Ca^{2+})事件频率（((Delta f_{Ca}^{2+}))，和(Ca^{2+})事件幅度（((Delta A m p_{Ca}^{2+}))）。数据以平均值±SEM表示。星号（*）表示与每个转基因行内的基线值相比的显著性，而匕首（y）表示两个转基因行在同一时间阶段内的显著性差异。双向方差分析随后进行Holm-Sida'k事后测试，完整的统计数据可在表S2中获得。（E）代表(Ca^{2+})痕迹的nIX/X神经节在4 dpf Tg（p2rx3b：GCaMP6s）或Tg（p2rx3b：GCaMP6s，tph1b：CoChR）斑马鱼幼虫由(Delta F / F_{0})表示。每个蓝色条代表咽弓区域的光刺激事件。（F-H）归一化细胞内(Ca^{2+}(Delta[Ca^{2+}]_{i}))。nIX/X神经节的(Ca^{2+})事件频率（((Delta f_{Ca}^{2+})).和(Ca^{2+})事件幅度（((Delta A m p_{Ca}^{2+}))）（((n=10 each ))在咽弓区域的光刺激之后。数据以平均值±SEM表示。星号（*）表示与每个转基因行内的基线值相比的显著性，而匕首（y）表示两个转基因行在同一时间阶段内的显著性差异。双向方差分析随后进行Holm-Sida'k事后测试，完整的统计数据可在表S2中获得。

味觉信号通路的改变会改变呼吸换气反应

化学感受细胞被激活时，会引发相应的生理反应形态学反应。在本研究中，我们重点关注了低氧通气反应（HVR），这是一种由(O_{2})启动的反应，且在所有被检测的水生呼吸鱼类中均一致观察到。尽管低氧通气反应（HVR）期间通气量的增加与通气幅度和/或通气频率的变化相关，但我们仅监测了，因为在小型生物中，通气幅度的可靠量化难度极大。例如斑马鱼幼体。

为了建立心肌层细胞（MLCs）与高通气反应（HVR）之间的直接联系，我们检测了缺失MLCs的(asc/1a ^{-1-})突变幼虫的高通气反应（HVR）（图4A）。在ascl1a+/+（野生型）幼虫中，高通气反应（HVR）呈多相性，首先表现为(f_{V})的大幅上升（起始阶段），随后逐渐下降（下降阶段），最终达到高于常氧值的新稳定状态（稳定阶段）。这种高通气反应（HVR）模式在保留MLCs的ascl1a+/-杂合子幼虫中得以保留，而在缺失MLCs的(asc/1a ^{-1-})突变体中，高通气反应（HVR）则被完全消除（图4B和图4C）。

由于MLC激活会使nIX/X中的(Ca^{2+})活性升高，且这一效应与低氧条件下的情况相似，我们进一步检测了nIX/X激活后的通气反应，以建立MLC、第九、十对颅神经与低氧通气反应（HVR）之间的关联。通过让表达大鼠TRPV1阳离子通道的转基因幼虫[Tg(p2rx3b:dTomato-T2A-rTRPV1)]暴露于TRPV1激动剂辣椒素，实现了对颅神经的特异性激活。当暴露于辣椒素时，Tg(p2rx3b:dTomato-T2A-rTRPV1)幼虫的nIX/X神经节表现出与低氧暴露幼虫相似的(Ca^{2+})变化规律，即([Ca^{2+}]_{i})在低氧起始阶段升高，并在稳定阶段进一步升高（图4D-4I）。这种对nIX/X的化学激活引发了(f_{V})的升高，其变化趋势与低氧通气反应起始阶段相似，不过仅激活nIX/X不足以在稳定阶段维持(f_{V})处于升高状态（图4J、4K及补充图S3），这表明中枢神经系统（CNS）可能在调控低氧通气反应的下降阶段和稳定阶段中发挥作用。

总体而言，数据表明MLCs直接促进了HVR的形成，不过需要注意的是，在ascl1a突变体中，MLCs和皮肤NECs都不存在。目前，支持皮肤NECs在(O_{2})化学接收中作用的主要证据是它们的化学去神经支配可以钝化斑马鱼幼体的HVR。然而，用于去神经支配NECs的化学处理可能也减少了MLCs的神经支配（当时未知(O_{2})敏感）。根据这一观察，再加上MLCs在体内对缺氧有反应，nIX/X的化学激活导致过度通气，theweightofevidencestronglysuggeststhatMLC激活roleininitiatingtheHVR。因此，我们建议MLCs作为幼体鱼类中以前未记录的一类(O_{2})化学感受器细胞发挥作用。MLCs和味觉信号通路是否也参与成年鱼的(O_{2})信号传递还需要进一步研究。

图4. MLC消融或颅骨nIX/X激活对斑马鱼幼体缺氧通气反应的影响。（A）受精后4天（dpf）ascl1a+/+(ascl1a)幼虫的代表性腹侧视图。箭头表示咽弓区域的MLCs。（B）暴露于30 mmHg缺氧的4 dpf ascl1a+/+((n=19))(ascl1a+/-)((n=26))((n=11))）幼虫的每分钟(t_{v})。（C）ascl1a+/+(ascl1 a^{+/-})的归一化(Delta f_{v})，(ascl1 a^{-1-})幼虫在基线的最后一分钟（B，5分钟），缺氧开始（HO，6-10分钟内最大值），缺氧稳定（HS，16-20分钟）和缺氧恢复（R，21-25分钟）阶段。数据以平均值±SEM表示。星号（*）表示与每个基因型内的基线值的显着差异，而匕首（y）表示与同一时间阶段内ascl1a+/+幼虫的值的显着差异。Twoway ANOVA随后进行Holm-Sida'k后期测试，完整的统计数据可在表S2中获得。（D-F）代表性(Ca^{2+})痕迹的nIX/X神经节表示荧光强度校正到基线强度（((AF/F )_{0}))）在4 dpf Tg（p2rx3b：GCaMP6s，p2rx3b：dTomato-T2A-rTRPV1）斑马鱼幼虫暴露于水无辣椒素（TRPV1+，Cap，D），Tg（p2rx3b：GCaMP6s）斑马鱼幼虫暴露于10mM辣椒素（TRPV1，Cap+，E），和Tg（p2rx3b：GCaMP6s，p2rx3b：dTomato-T2A-rTRPV1）斑马鱼幼虫暴露于10mM辣椒素（TRPV1+，Cap+，F）B，基线；CO，辣椒素起病；CS，辣椒素稳定；RO，恢复起病；RS，恢复稳定。（G-I）归一化细胞内(Ca^{2+}(Delta[Ca^{2+}]))(Ca^{2+})事件频率（((Delta f_{Ca}^{2+})).和(Ca^{2+})事件幅度（((Delta A m p_{Ca}^{2+}))）的nIX/X神经节数据以平均值±SEM表示。星号（*）表示与每种处理内的基线值相比的显著性，而匕首（y）表示在同一时间阶段内与对照的显著性差异。双向方差分析，随后是Holm-Sida'k事后测试，完整的统计数据可在表S2中获得。（J）4 dpf Tg（p2rx3b：GCaMP6s，p2rx3b：dTomato-T2A-rTRPV1）斑马鱼幼虫暴露于缺氧（n=5）或10mM辣椒素（((n=5))）的每分钟fV。数据以平均值±SEM表示。（K）基线最后一分钟（B，5分钟）、缺氧/辣椒素开始（H/CO，6-10分钟内最大值）、缺氧/辣椒素稳定（H/CS，16-20分钟）和恢复（R，21-25分钟）阶段期间处理的归一化D(f_{v})。数据以平均值±SEM表示。星号（*）表示每次治疗中与基线值的显着差异，而匕首（y）表示同一时间阶段内与缺氧治疗中的值的显着差异。双向方差分析，随后是Holm-Sida'k事后测试，完整的统计数据见表S2。另见图S3。

(O_{2})信号的集中集成

通过MLCs的氧信号最终通过nIX/X转导到中枢神经系统。因此，我们研究了(O_{2})信号如何集成在中枢神经系统中，soughttoidentifyregionsthat可能有助于HVR。作为第一步，我们在nIX/X中表达小麦胚芽凝集素（WGA）[Tg（p2rx3b： tWGA）]以使神经元顺行到中枢神经系统内的nIX/X的神经元追踪。因为WGA可以顺行方式跨神经元运输，中枢神经系统中任何WGA阳性神经元都将代表连接到nIX/X的纤维。在斑马鱼幼体中，面部鳃运动神经元（FBMNs）以前与呼吸控制有关，但在FBMN中没有观察到WGA（图5A）。相反，WGA与迷走神经运动神经元（VMNs）相关，主要在后脑的迷走神经叶（图5B和5C）。在斑马鱼中，VMNs已被证明支配咽弓肌肉，这对吞咽和介导鳃的打开和关闭很重要，并与控制狗鱼（Scyliorhinus cancola）和七鳃鳗（Petromyzon marinus）的呼吸有关。此外，nX的颅感觉神经元不与VMNs直接接触，而是通过WGA阳性的中间神经元与它们相连（图5B和5C），类似于3神经元反射回路（感觉>中间神经元>运动），在一些鱼类中用于从口咽腔中的难吃材料中分类可食用的物质大脑后区区域内的身体，由nX感觉神经元和VMNs支配（图5C-5E）。然而，由于VMNs的后1/3支配斑马鱼的内脏器官，这些VMNs不太可能支配byneuronswithintheareapostremadirectlymodulateventilation。然而，这并不排除后区参与调节HVR的可能性，因为在哺乳动物中，后区除了作为呕吐诱导中心的主要作用外，还参与控制呼吸，后区神经元在(O_{2})化学感受器细胞刺激期间被激活，并在直接刺激时刺激呼吸速率因此，我们推测检测到缺氧信号通过MLCs并通过nIX/X感觉神经元传递到postrema区域内的中间神经元，进一步驱动HVR。

图5. 斑马鱼幼鱼中枢神经系统内接受第Ⅸ/Ⅹ对脑神经输入的神经元追踪。(A) 受精后4天（dpf）Tg(p2rx3b> mCherry-NTR2.0, isl1:eGFP, p2rx3b:tWGA) 幼虫的腹侧视图。感觉神经元呈红色，由p2rx3b的表达标记；运动神经元呈青色，由isl1的表达标记；接收感觉神经元输入的神经元因存在截短型小麦胚芽凝集素（tWGA）而呈黄色；比例尺为100微米。(B) 和 (C) 展示了与(A)中幼虫不同的两只幼虫的框内区域。(B) 为缺乏tWGA表达的Tg(p2rx3b> mCherry-NTR2.0, isl1:eGFP) 幼虫后脑区域中p2rx3b和isl1的表达。表达p2rx3b的感觉神经元与表达isl1的运动神经元无直接接触，两种细胞类型之间由箭头头指示的间隙可证明这一点；比例尺为100微米。(C) 为Tg(p2rx3b> mCherry-NTR2.0, isl1:eGFP, p2rx3b:tWGA) 幼虫后脑区域中p2rx3b、isl1和tWGA的表达。在箭头指示的感觉神经元与运动神经元之间的间隙中观察到tWGA染色；比例尺为100微米。(D) 为后脑最后区中同时接受感觉神经元和运动神经元支配的tWGA阳性细胞。DAPI染色呈灰色；比例尺为10微米。

为了检查中枢神经系统内区域对缺氧的反应，我们使用光可转换(Ca^{2+})指示器[（Tg（elavl3： CaMPARI2）]对缺氧暴露期间的整个大脑进行了体内(Ca^{2+})成像。将暴露于缺氧的鱼的大脑活动与在正常氧下保持的鱼的大脑活动进行比较，以控制大脑中非缺氧相关的活动变化。正如预期的那样，缺氧开始时激活了postrema区域内的神经元（图6A），尽管观察到VMNs内(Ca^{2+})活动增加，直到缺氧水平稳定下来（图6B）。后脑的另一个区域，内侧八侧核（MON），在缺氧期间也显示出活动增加，然后在重新建立正常氧时对其进行抑制（图6A-6C）。在七鳃鳗中，颅神经IX/X终止于MON，55其延伸至呼吸节律发生器的兴奋性投射。七鳃鳗中运动性面神经核（MON）的刺激可增加 (f_{V})，从而表明运动性面神经核参与了通气的调控。本研究中，第九/第十对脑神经（nIX/X）纤维延伸至运动性面神经核（图6A–6C），这提示在斑马鱼幼体中，与成年七鳃鳗类似，运动性面神经核在介导低氧通气反应（HVR）中发挥作用。

其他在低氧刺激下活性发生改变的区域包括脑室层顶盖、视顶盖的顶盖神经纤维层、丘脑前区以及视前区（图6A-6C）。由于这些区域此前未被发现与呼吸调控相关，其内部活性的改变可能介导除低氧通气反应之外的生理反应。

图6 缺氧斑马鱼幼鱼全脑Ca2+成像。(A–C) 缺氧开始阶段、缺氧稳定阶段和恢复阶段最后一分钟中枢神经系统内细胞体的 Ca2+ 活性。 Ca2+ 活性增加的细胞体呈绿色，而 Ca2+ 活性降低的细胞体呈洋红色（每组 n = 8 条鱼）；表达 p2rx3b 的感觉神经元呈黄色。从左到右，这些面板从大脑的腹侧到背侧； ap，postrema区； VMN，迷走运动神经元； tpl，顶盖室周层； pt，前丘脑； pa，视前区； mon，内侧八外侧核； tn，顶盖神经纤维。后脑在蓝色括号中，中脑在橙色括号中，前脑在白色括号中。

为了以更高的时间分辨率检测后脑不同区域对 (Ca^{2+}) 信号的反应，我们在 Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s) 幼虫中，于最后区和腹内侧核所在的深度对后脑进行成像，该深度大致对应图 6A–6C 中的前两个成像平面。对最后区成像平面内细胞的聚类分析揭示了三类细胞群（图7A和7B），其中一群细胞主要分布在最后区，在缺氧状态下于([Ca^{2+}])、(f_{Ca}^{2+})和(A m p_{C a}^{2+})区域的活性增强（图7B和7E-7H），这与CaMPARI2成像结果一致；而另一群细胞虽在最后区有一定表达，其活性却在缺氧状态下下降（图7B和7J-7L）。第三群细胞在缺氧暴露后未出现显著变化（图S4）。在Tg(p2rx3b:dTomato-T2A-rTRPV1)幼虫中，用辣椒素激活nIX/X后，同一群细胞在([Ca^{2+}]_{i})、(f_{Ca}^{2+})和(A m p_{Ca}^{2+})区域的活性也出现类似升高（图7C和7M-7P）；而通过硝基还原酶介导的nIX/X消融[Tg(p2rx3b>mCherry-P2A-NTR2.0)]后，该细胞群在缺氧状态下不再形成独立的细胞簇（图7D）。nIX/X消融后，最后区内的细胞簇其活性与缺氧暴露下活性下降的细胞群更为相似（图7D和S4）。在腹内侧核（VMN）层面，细胞可聚为四群，但无一细胞群特异性代表腹内侧核。MON 内的细胞始终稳定聚集成独立的细胞群，其特征是在常氧恢复阶段，([Ca^{2+}])、(f_{Ca}^{2+})、(A m p_{C a}^{2+}) 这三个指标出现显著下降（图 S4）。VMN 平面中另一个对低氧产生反应的细胞群也位于最后区，其 (Ca^{2+}) 指标变化与最后区平面内的反应性细胞群相似，因此二者很可能是同一细胞群（图 S5）。然而，激活 nIX/X 并未导致 MON 细胞聚集，不过在低氧条件下消融 nIX/X 后检测的三条斑马鱼幼虫中，有两条的 MON 内细胞不再形成独立的细胞群（图 S5）。一种可能的解释是，MON 的活性由多种信号介导，nIX/X 是其中之一，这也解释了为何激活 nIX/X 后 MON 缺乏活性，以及消融 nIX/X 后 MON 对低氧的敏感性消失。综上，数据表明多个区域的活性缺氧暴露期间及暴露后，中枢神经系统会发生改变，最后区的激活由nIX/ X直接介导，且这一激活很可能对缺氧通气反应起到促进作用。

图7. 缺氧暴露下斑马幼鱼最后区的钙成像。(A) 在受精后 4 天的 Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s) 幼虫中成像的中枢神经系统内平面的代表性图像。 ap，postrema 区。 mon，内侧八外侧核。 (B–D) 暴露于缺氧的 Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s) 幼虫后脑内神经元细胞体的聚集 (B)，暴露于 10 μM 辣椒素的 Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s, p2rx3b:dTomato-T2A-rTRPV1) 幼虫 (C) 和Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s, p2rx3b> mCherry-NTR2.0) 幼虫与消融的 nIX/X 暴露于缺氧 (D)。不同的细胞簇根据其活动的相似性进行颜色编码。(E 和 I) 代表性 Ca2+ 迹线，由暴露于缺氧的 Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s) 幼虫的后区青色和黄色细胞簇的基线强度 (ΔF/F0) 荧光强度表示。 （F–H 和 J–L）暴露于缺氧的青色簇（n = 来自 3 个幼虫的 124 个细胞）和黄色簇（n = 来自 3 个幼虫的 722 个细胞）细胞的标准化细胞内 Ca2+ (Δ[Ca2+]i)、Ca2+ 事件频率 (ΔfCa2+) 和 Ca2+ 事件幅度 (ΔAmpCa2+)。不同字母表示不同时间阶段之间存在显着差异。对排名进行 Kruskal-Wallis 单向方差分析，然后进行 Tukey 事后检验，表 S2 中提供了完整的统计数据。(I) 暴露于 10 μM 辣椒素的 Tg(elavl3:H2B-GCaMP6s, p2rx3b:dTomato-T2A-rTRPV1) 幼虫后部区域内青色簇状细胞的代表性 Ca2+ 痕迹，以 ΔF/F0 表示。 (J–L) 暴露于 10 μM 辣椒素的青色簇细胞的标准化细胞内 Ca2+ (Δ[Ca2+]i)、Ca2+ 事件频率 (ΔfCa2+) 和 Ca2+ 事件幅度 (ΔAmpCa2+)（n = 来自 3 个幼虫的 141 个细胞）。不同字母表示不同时间阶段之间存在显着差异。对排名进行 Kruskal-Wallis 单向方差分析，然后进行 Tukey 事后检验，表 S2 中提供了完整的统计数据。另请参见图 S4 和 S5。

讨论

本研究结果表明，味蕾复合体中的肌球蛋白轻链以及下游的味觉信号通路参与了发育中斑马鱼的化学感受过程，这构成了鱼类中首个有记录的信号通路：该通路以化学感受器细胞的<uuid:(O_{2})>感知为起点，最终以高通气率（HVR）为终点，对应标识为<uuid:(O_{2})>，也是首个被记录的鱼类信号通路标识<uuid:(O_{2})>。

针对发育中斑马鱼(O_{2})化学感受的模型 早期研究表明鱼类(O_{2})化学感受自神经内分泌细胞被发现以来，它们一直是鱼类 (O_{2}) 化学感受器细胞的主要候选对象。有证据表明在缺氧条件下，NECs 会发生去极化，并增加 ([Ca^{2+}]_{i}) 以及 (Ca^{2+}) 依赖性突触囊泡的释放与循环。在此情况下，我们提供了有力证据，表明味芽复合体中的MLC在发育中的斑马鱼体内同样是(O_{2})化学感受细胞，它们可能与NEC协同工作，并采用类似的(O_{2})感知和信号转导机制。此外，MLC具备NEC与哺乳动物颈动脉体I型细胞共有的多项特征，包括血清素的产生、突触小泡的存在以及感觉神经元的神经支配。尽管尚无直接证据，但与其他物种的味觉受体细胞类似，MLC很可能是神经嵴来源的细胞，这与哺乳动物颈动脉体（细胞）不同由神经嵴衍生而来的I型细胞。在我们的模型中，充当(O_{2})化学感受器细胞的迷走神经背核/舌下神经核（nIX/X）在缺氧状态下被激活。(O_{2})信号进一步传递至后脑，此处最后区的活性发生改变，可能导致腹内侧核（VMNs）内的神经活动变化。与此同时，迷走神经背核/舌下神经核（nIX/X）与其他尚未明确的脑区协同作用，可能会改变向中枢呼吸节律发生器发出投射的面神经运动核（MON）的活性。最终，最后区和面神经运动核（MON）的综合变化驱动了缺氧性通气反应（HVR）的启动，而维持通气量增加则需要其他细胞类型（本研究中尚未明确）参与。

感知氧气

尽管这是一项新发现，但非传统化学感受器细胞检测呼吸气体的能力并非没有先例。事实上，昆虫和哺乳动物的味觉和嗅觉感受器都能检测到(CO_{2}) ，而支配鱼类味觉化学感受器细胞的传入神经在高碳酸血症期间活性增强，这表明鱼类中也存在类似情况。肌样细胞（MLCs）与哺乳动物味蕾中参与酸性味觉检测的III型味觉感受器细胞也极为相似。 两者均为血清素能神经元，并由含有嘌呤能受体的传入感觉神经支配。研究表明，III型味觉感受器细胞在受到酸刺激时会发生去极化并释放血清素，激活表达5HT3受体的面神经亚群。我们在此证实，肌样细胞（MLCs）拥有类似的神经回路，可实现这种信号转导模式。此外，在哺乳动物中，来自外周的味觉传入神经（包括支配III型味觉感受器的神经）直接投射到孤束核，而脑桥臂旁核内的细胞则对味觉物质具有调节作用。这些正是相同的中枢神经系统中被哺乳动物的(O_{2})化学感受器细胞激活的区域会导致通气发生变化⁶⁴，这表明味觉感知和(O_{2})感知存在保守的神经通路。我们通过提供直接的体内证据进一步支持这一观点：斑马鱼幼体中的MLCs是能够调节低通气反应（HVR）的(O_{2})化学感受器细胞。未来还需进一步研究，以明确通过味觉信号通路进行的化学感受是否是斑马鱼幼体（可能还包括成体）检测环境低氧的普遍策略。

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