标题：A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing

期刊：Stem Cell Reports

原文链接：http://dx.doi.org/10.1016/j.stemcr.2016.12.004

摘要

为筛选可调控过继转移后造血细胞归巢的小分子化合物，我们构建了在泛素启动子（ubi）下游表达萤火虫荧光素酶的转基因斑马鱼（ubi:luc），将其作为造血供体。生物发光成像（BLI）可在移植后1天即检测并追踪归巢至骨髓的ubi:luc造血细胞。该技术能够检测前列腺素(E_{2})对供体造血细胞早期归巢/植入的生物学效应。我们利用该系统开展小分子化合物功能筛选，以寻找能增强造血细胞归巢/植入的物质。研究发现植物甾醇麦角固醇可在斑马鱼和小鼠体内提升造血细胞归巢能力。此外，麦角固醇在体外可增加CXCR4的表达，并促进Lin⁻SCA-1⁺KIT⁺细胞的增殖。本研究证实，体内生物发光成像可无创监测成年斑马鱼体内供体造血细胞的活性，可作为细胞归巢介导因子的功能性筛选工具。

引言

斑马鱼是模拟造血细胞移植（HCT）的有用模式生物。与哺乳动物一样，从全肾髓（WKM）中采集的移植斑马鱼造血干/祖细胞（HSPC）能够在所有造血谱系中重建，并在经辐照的受体鱼体内实现长期造血重建（Traver 等人，2004）。此外，哺乳动物中成功进行造血细胞移植所依赖的诸多生物学特征在斑马鱼中也具有保守性。近期有两个典型例子：一是主要组织相容性复合体匹配的作用；二是我们此前的研究证实了基质细胞衍生因子-1（SDF-1）在造血干/祖细胞归巢过程中的作用（de Jong 等人，2011；Glass 等人，2011，2013）。

成年斑马鱼的细胞植入情况需通过分析受体的背侧中肾（WKM）来确定，通常采用流式细胞术检测荧光团标记的供体细胞。随着透明的卡斯特斑马鱼（Casper fish）的研发成功（White 等人，2008），供体的荧光造血细胞也可通过活体成像在体内进行监测，这能更全面地呈现移植后造血功能的恢复过程。然而，尽管荧光成像具有检测速度快、分辨率高的优势，但其灵敏度会因高背景噪声和组织穿透性受限而大幅降低，难以检测深层组织中的低强度信号，例如造血细胞归巢以及造血细胞移植（HCT）后最初几天内肾脏早期植入阶段的信号。而生物发光成像（BLI）则具备优异的信噪比，因为其组织背景几乎为零（Lin 等人，2008）。在小鼠造血细胞移植（HCT）后，通过无创生物发光成像（BLI）追踪供体细胞，能够揭示受体体内不同造血细胞重建的动态变化（Cao 等人，2004；Wang 等人，2003）。尽管在小鼠体内，造血细胞移植后7-8天会产生强烈的生物发光信号，但斑马鱼的光学透明性使其成为开发生物发光成像技术的理想模型，可用于追踪造血细胞在造血细胞移植后最初几天内的归巢功能。

为探究生物发光成像（BLI）在追踪移植供体造血细胞方面的适用性，我们构建了泛素启动子驱动萤火虫荧光素酶表达的 ubi:luc 斑马鱼，并将该转基因品系作为造血细胞移植（HCT）中的尾静脉造血组织（WKM）供体。研究表明，借助生物发光成像技术，可对同一活体个体中表达荧光素酶的供体造血细胞进行持续监测，以此揭示成年斑马鱼移植后造血重建的动力学过程。此外，本研究还证实，这种基于生物发光成像的系统可作为筛选能够增强细胞归巢与植入能力的小分子化合物的“功能性”化学筛选工具。

结果

ubi:luc造血细胞中的荧光素酶表达

为制备适用于生物发光成像（BLI）的转基因造血细胞供体，我们在Tol2载体上的萤火虫（Photinus pyralis）荧光素酶基因上游克隆了一段3.5千碱基对的斑马鱼泛素基因（ubi）片段，该载体还包含由心肌肌球蛋白轻链启动子驱动的增强绿色荧光蛋白（EGFP），以便快速鉴定转基因动物。此前研究已证实，该片段足以驱动斑马鱼在多个发育阶段几乎所有组织中的表达。发育（莫斯曼等人，2011年）。通过向胚胎水中施加D-荧光素对首建转基因胚胎进行筛选（图S1A）。将首建个体与非转基因个体杂交以获得生殖系F1代动物（作为胚胎时通过生物发光成像筛选），随后再将F1代与非转基因个体杂交产生F2代后代。如图1A所示，许多成年F2代动物表现出高水平的全身生物发光成像信号，但在解剖F2代成年鱼的多种器官后发现，不同个体的器官中既有生物发光成像信号强烈的，也有信号缺失的（图S1B）。我们筛选出三个F1代品系，用于繁殖高水激酶体生物发光成像信号的F2代动物（图1B）。水激酶体信号与外周血生物发光成像信号高度相关，这使得后续可通过尾静脉采集外周血对成年鱼进行筛选。7号品系产生稳定的水激酶体生物发光成像信号，且其后代的水激酶体生物发光成像强度在大多数情况下波动幅度低于10%（因此该品系被用于大部分后续实验）（图1C）。体外水激酶体的系列稀释实验显示，细胞数量与生物发光成像信号之间存在高度线性相关（图1C，(r^{2}=0.98)）。当电荷耦合器件（CCD）的分辨率提升至8像素合并时，低至6250个细胞即可检测到生物发光成像信号（图S1C）。水激酶体的免疫染色结果显示，大部分水激酶体细胞表达荧光素酶（图1D）。为探究泛素启动子驱动的荧光素酶基因（ubi:luc）是否在特定血细胞谱系中表达，我们通过荧光激活细胞分选术将水激酶体细胞分为淋巴样、髓样以及富含祖细胞的前体细胞亚群（特拉弗等人，2003年）。加入底物后，在所有三种血细胞群中均检测到生物发光信号（图1E），尽管髓样群体的信号略有减弱，我们推测这可能是由启动子功能下调导致的。

图1. 泛素启动子驱动荧光素酶基因在斑马鱼中的表达

优化用于造血细胞归巢检测的生物发光成像技术

我们最初尝试将 ubi:luc 斑马鱼浸泡在 D-荧光素（150 毫克/毫升）中，或采用腹腔注射（75 毫克）的方式，结果发现腹腔注射效果显著在我们的系统中，生成生物发光成像（BLI）的效果显著更稳定（图S1D）。需注意的是，我们使用的D-荧光素浸泡浓度（0.5毫摩尔）远低于其他研究中采用浸泡法时所用的50至100毫摩尔浓度（Chen等人，2013年）。因此，后续研究采用了腹腔注射D-荧光素的方式。为确定造血细胞移植（HCT）后发光成像采集的最佳时间点，我们对成年移植受体在注射D-荧光素后的发光强度变化进行了55分钟的连续监测。给五只实验动物腹腔注射75毫克D-荧光素，随后每2至5分钟进行一次连续成像。发光信号逐渐增强，在10分钟时达到平台期，并在随后的45分钟内保持相对稳定，这与Chen等人（2013年）使用类似模型的报道结果几乎一致（图1F）。尽管该剂量的D-荧光素能维持较长的平台期，我们仍将成像采集时间标准化为注射后最多15分钟，以最大限度减少实验差异。接下来，我们评估了造血细胞移植（HCT）中的心内注射、腹腔注射和眶后注射三种细胞递送途径（图1G）。腹腔注射在移植后1天和5天（dpt）均产生了强烈的归巢/植入生物发光成像（BLI）信号，但50%至80%的实验动物在造血细胞移植后5天内死亡。眶后注射也能产生强烈的生物发光成像信号，但归巢/植入的生物发光成像往往呈现不对称性（注射侧身体信号更强），这可能是由于细胞仅单侧递送所致。心内注射则能实现稳定、对称且一致的头肾（WKM）归巢/植入生物发光成像，因此后续所有实验均采用该递送方式。随后，我们探究了移植后1天观察到细胞归巢现象所需的供体头肾细胞数量。图1H显示，20万至50万个供体泛素化荧光素酶（ubi:luc）细胞能在头肾中产生对称分布的强信号（图1H）。5万个细胞的造血细胞移植在移植后8天可从植入的头肾细胞中检测到生物发光成像信号，但早期成像并非总能获得稳定的信号。此外，我们发现使用20万个供体头肾细胞可提高实验动物28天的存活率（图S1E）。使用50万个供体肾组织细胞产生的信号被我们认为足够强，可作为基线使用；因此，在后续实验中，20万个供体肾组织细胞的剂量被选定为未来造血干细胞移植的剂量。为了确认生物发光成像信号来自归巢至头肾的供体细胞，我们使用了来自泛素化荧光素酶转基因与组蛋白H2A变体启动子绿色荧光蛋白转基因杂交的供体肾组织细胞进行造血干细胞移植（组蛋白H2A变体启动子是一种组成型启动子），该转基因在包括造血细胞在内的所有组织类型中均表达强烈的绿色荧光蛋白信号（Pauls等人，2001年）。我们在移植后1天收集受体肾组织，并通过流式细胞术定量分析归巢的供体细胞数量。移植后1天归巢的肾组织细胞平均数量为1897±33个，与de Jong等人（2011年）报道的移植成功所需的肾组织细胞最低数量非常接近。归巢后，细胞快速扩增，移植后7天和14天的平均植入细胞数量分别为47263±13662个和306459±136561个（图1I）。

虽然我们的首要任务是利用ubi:luc模型研究造血干细胞移植后24–48小时内的归巢行为，但能够稳定评估造血干细胞移植的长期效果同样具有重要意义。我们最初在造血干细胞移植后进行生物发光成像的实验中，使用了20万个供体细胞，并在移植后1天和5天对动物进行镇静状态下的生物发光成像采集，结果显示动物存活率极低（造血干细胞移植后10天全部死亡）（图S1F）。正如我们的对照实验所示，在不进行生物发光成像的情况下，移植20万个供体细胞后，动物造血干细胞移植30天的典型存活率约为50%，这也与de Jong等人（2011年）的研究结果一致。我们推断，低存活率可能是由于动物在生物发光成像过程中承受了过度的应激反应和缺氧状态。因此，我们改进了镇静条件，在水中加入高氧水，以在镇静期间氧气交换减少的阶段为动物提供氧气来源。这一改进使动物的存活率与未进行镇静生物发光成像的移植动物相当，该条件也被用于后续的实验中（图S1F）。综上，这些数据表明，在最佳条件下，生物发光成像可用于评估斑马鱼中造血细胞的早期归巢行为。

移植后供体细胞的纵向检测

我们通过对受体斑马鱼进行生物发光成像（BLI），在多个时间点研究了成年斑马鱼中造血细胞归巢和植入的动态过程，研究对象包括经辐射预处理和未辐射的受体鱼，这些受体鱼均移植了50万个泛素启动子驱动荧光素酶表达（ubi:luc）的头肾白细胞（WKM）。移植后1天（1 dpt），在辐射预处理和未辐射的受体鱼的头肾（强效造血位点）中均检测到了发光信号，不过未辐射组的信号较弱（图2A）。这表明，与在小鼠中已证实的结果类似，供体造血细胞向骨髓的迁移并不需要辐射预处理。宿主的预处理。在接受20戈瑞辐射的受体中，随时间推移观察到了稳定且累积的信号，而在未接受辐射的受体中，移植后7天（甚至早在移植后2天）就未检测到供体细胞。接受辐射的受体中的信号在移植后4周持续上升，之后降至较低且更稳定的荧光素酶水平，并在移植后至少维持3个月（图2B）。这些研究证实，即使在未进行辐射预处理的情况下也会发生归巢（小鼠实验中也观察到了这一现象），但随后会出现排斥反应，且无法实现长期植入，这可能是由先天和/或适应性免疫反应导致的。进一步优化辐射剂量的实验（15戈瑞对比20戈瑞）表明，使用20戈瑞剂量时，移植后1天和8天的供体造血细胞生物发光成像信号略有增加，但差异不显著，因此最终选择20戈瑞用于筛选实验（图S2A和S2B）。

为了测试小分子在我们的系统中调节归巢的能力，我们使用了二甲基前列腺素 (E_{2}) ((dmPGE_{2}))），此前已有研究证实该物质可在斑马鱼、小鼠和人体研究中调节造血干祖细胞（HSPC）的归巢、植入及存活（Hoggatt 等人，2009；North 等人，2007；Porter 等人，2013）。我们在造血细胞移植（HCT）前，用 10 微摩尔的 (dmPGE_{2}) 处理 200,000 个 ubi:luc 尾肾髓样细胞（WKM），并在冰上放置 2 小时。我们发现，移植后第 1 天，细胞归巢率显著提高，早期植入（移植后第 7 天）也得到改善，这与已发表的小鼠研究结果相似（Frisch 等人，2009）（图 2C 和 2D）。而后期植入（移植后第 14 天及以后）与对照组无差异。早期归巢/植入情况与造血细胞移植后的存活率提升密切相关（图 2E）。在本系统中，(dmPGE_{2}) 可加速造血细胞的早期恢复，但在移植后第 14 天及以后未观察到差异，这很可能是因为对照组动物的植入速度较慢，而存活的动物最终植入程度与 (dmPGE) 处理组一致。这些实验表明，利用 ubi:luc 供体尾肾髓样细胞进行生物发光成像（BLI），是开展造血细胞移植归巢增强子小分子筛选的有效且可靠的平台（图 S2C）。

造血细胞归巢增强作用的筛选

我们使用经10毫摩尔浓度候选化合物处理的泛素启动子荧光素酶（ubi:luc）斑马鱼肾脏髓样组织（WKM）进行造血干细胞移植（HCT），该候选化合物来自具有已知生物活性的天然化合物文库（编号 ((n=860))），但此前尚未被探索用于调控造血细胞归巢。我们可在一天内轻松完成50至100只实验动物的移植。造血细胞归巢情况通过移植后1天（1 dpt）的生物发光成像（BLI）进行评估。每个实验均设置三组重复的对照造血干细胞移植受体（使用二甲基亚砜处理的供体斑马鱼肾脏髓样组织）。化学文库首次筛选的实例如图2F所示，我们在此次首次筛选中发现了78个候选“阳性结果”，“命中”被定义为血球细胞的(>25%)增加。每组使用三到五只动物进行第二轮HCT，从第二个屏幕中验证了30种化合物增加了造血细胞归巢（示例如图2G所示）。在这一点上，我们选择了一种化合物（04-B11）麦角甾醇进行进一步评估。

图2. 用于增强供体细胞归巢能力的小分子筛选。(A) 对未照射和20戈瑞照射的受体小鼠进行50万个ubi:luc斑马鱼肾髓细胞（WKM）的连续生物发光成像（BLI）。(B) 移植受体小鼠随时间变化的平均生物发光辐射强度及标准差，每组(n=6)只个体。(C) 移植赋形剂处理和(dmPGE)处理的ubi:luc斑马鱼肾髓细胞的受体小鼠的连续生物发光成像（BLI）。(D) 赋形剂组和(dmPGE)处理组受体小鼠的生物发光成像（BLI）定量分析，每组(n=13)只个体，数据以平均值±标准差表示，经Student's t检验，差异显著（(*p<) P<0.05，(^{*} p<0.01)）。(E) 对照组和(dmPGE)处理组受体小鼠的存活率存在显著差异，每组(n=13)只个体。(F) 一系列测试化合物的生物发光成像（BLI）读数示例。所有受体小鼠在造血细胞移植（HCT）前均接受20万个ubi:luc供体细胞与10毫摩尔化合物共孵育。每个柱形代表一只小鼠。虚线表示该实验组三只对照小鼠中最高的生物发光成像（BLI）值。(G) 对初步命中化合物的二次筛选，每种化合物使用(n=3-5)只小鼠。数据以对照组平均值+标准差的虚线为参照。该示例显示了在后续研究中检测的化合物04-B11（麦角固醇）。

麦角固醇促进造血细胞归巢

麦角固醇是一种植物固醇（图3A），由真菌和蘑菇作为细胞壁的组成部分产生。有趣的是，紫外线辐射会将麦角固醇转化为麦角钙化醇，即维生素D（Bikle, 2014）。图3B展示了麦角固醇介导的ubi:luc供体造血细胞归巢在1天内增加的示例。为检测其在哺乳动物细胞中的生物活性，我们在与供体骨髓混合前以及造血干细胞移植（HCT）时将麦角固醇浓度提高至50毫摩尔。将化合物暴露浓度提高5倍的基本原理在于，在斑马鱼模型中，化合物和供体细胞以5毫升的体积注入受体动物；而在总血容量10-20毫升的情况下，10毫摩尔储备液可使化合物的循环浓度达到2-3毫摩尔）。成年小鼠的平均血容量约为1毫升，因此我们推断在0.2毫升的注射体积中加入50毫摩尔麦角固醇，可使循环化合物暴露浓度达到10毫摩尔，与我们的斑马鱼化合物筛选平台条件相近。我们将经麦角固醇处理或等体积对照处理的全骨髓（WBM）注射到经致死剂量辐射的受体小鼠体内。16小时后收集骨髓洗涤液，通过流式细胞术评估归巢的供体细胞。与斑马鱼不同，可通过评估富含造血干细胞活性的Lin⁻Sca-1⁺c-Kit⁺（LSK）细胞来定量更特异的小鼠祖细胞（图3C和3D）。对照组小鼠在造血干细胞移植后归巢的LSK细胞数量为228±68，而麦角固醇处理组为417±124（图3D）。我们还发现归巢的LSK细胞数量显著增加（图3D），但谱系阴性细胞数量无明显变化（图3D）。Lin⁻Sca-1⁺c-Kit⁺细胞在麦角固醇处理组中也表现出归巢优势；该细胞群通常包含粒细胞-巨噬细胞祖细胞、普通髓系祖细胞和巨核细胞-红细胞祖细胞亚群。

图3麦角甾醇增强小鼠造血细胞归巢。（A）麦角甾醇的结构，甾醇家族化合物的成员。（B）BLI在1 dpt的鱼接受麦角甾醇处理的细胞在二级屏幕。感兴趣的区域（ROI）和WKM的供体细胞辐射值显示。在注射部位可以看到一些残余信号。右图显示车辆和麦角甾醇处理的宿主供体细胞之间的辐射差异。显示的数据是来自五个个体受体的平均值±SD。（C）流式细胞仪门控用于鉴定小鼠HCT后(Lin ^{-} SCA-1^{+} KIT +)供体细胞。初始门用于鉴定碘化丙啶（PI）阴性的单核细胞。

麦角固醇可提高CXCR4水平

由于我们的平台依赖于向受体动物递送化合物和造血细胞，有人可能会提出这不仅会对受体微环境产生影响，使其更利于归巢，也会对供体造血细胞产生作用。鉴于龛微环境的复杂性质和细胞组成，我们最初选择先进一步探究麦角固醇对供体造血细胞的影响。

我们按照图4A所示进行了体外细胞迁移实验。评估了鼠源骨髓单核细胞在麦角固醇存在下向SDF-1梯度迁移的能力。本实验及后续实验均使用10 mM麦角固醇，因为这一浓度与小鼠归巢实验中的循环浓度相近。经麦角固醇处理的鼠源骨髓细胞向SDF-1的迁移能力显著高于对照组（(p<0.001)，图4B）。调控造血细胞迁移的研究最充分的受体之一是CXCR4，它是SDF-1的主要受体（Peled等人，1999年）。有多项研究表明，维生素D家族成员能有效上调造血细胞上的CXCR4表达（Biswas等人，1998年；Hiraguchi等人，2012年；Savli等人，2002年）。与这些研究结果一致，我们发现鼠源骨髓单核细胞经麦角固醇处理12小时后，Cxcr4基因表达上调超过1.5倍（图4C）。对经相同处理的全骨髓细胞进行流式细胞术分析发现，谱系阴性细胞中在细胞表面表达CXCR4的细胞数量约增加两倍（图4D），且CXCR4的平均荧光强度也增加了两倍（(p<0.0001)，图4E）。LSK细胞经麦角固醇处理后，CXCR4表达水平也显著升高（(p<0.0001)，图4F和图4G）。这些数据与CXCR4的调控可能参与麦角固醇归巢相关生物学活性的假说相符。

维生素D反应元件（VDRE）在整个基因组中广泛存在（Carlberg, 2003），接下来我们旨在确定维生素D家族成员麦角固醇是否能激活VDRE，以此作为其潜在的作用机制。我们利用了一个VDRE调控荧光素酶的报告系统来验证这一假设。与溶剂对照组相比，麦角固醇处理12小时后，VDRE报告型HEK293细胞未表现出VDRE活性，而骨化三醇（1,25-二羟维生素D (D_{3})）如预期般刺激了VDRE活性（图4H和图4I）。为了确定在麦角固醇存在的情况下维生素D受体（VDR）是否能增强VDRE活性，我们将小鼠Vdr基因（NM_0095494）的拷贝瞬时转染至VDRE报告型HEK293细胞中。VDR的表达增强了骨化三醇介导的VDRE信号传导540%（荧光素酶活性平均值为286，对比1486，均相对于对照组，(p<0.0001)），麦角固醇介导的VDRE信号通路未出现增强（图4H和图4I）。

既往研究表明，CXCR4启动子包含特异性蛋白1（SP1）结合元件，该元件在血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子以及(PGE_{2})等生长因子存在时可特异性激活转录（Salcedo等人，2003）。我们利用基于荧光素酶的SP1报告系统（在该实验中，SP1报告基因被瞬时转染）评估了麦角固醇增强SP1活性的能力。结果发现，与溶剂处理组相比，暴露于麦角固醇的SP1报告型HEK293细胞的SP1活性提升了28%（荧光素酶活性分别为128和100，(p<) (0.0001))，P<0.0001）。当在麦角固醇处理的细胞中表达小鼠维生素D受体（VDR）时，SP1活性并未升高（图4J）。这些数据表明，麦角固醇可介导SP1活性，但不影响维生素D反应元件（VDRE）活性。在上述两种情况下，麦角固醇的作用似乎均不依赖于VDR。

为确定麦角固醇介导的CXCR4表达增加是否会影响其功能活性，我们采用CXCR4拮抗剂AMD3100将祖细胞从骨髓动员到外周循环，具体方法如先前所述（Ramirez等人，2009年）。在给予AMD3100（3毫克/千克，静脉注射）前24小时，给小鼠注射麦角固醇（使循环浓度达到10毫摩尔）。我们发现，AMD3100注射1小时后，小鼠外周中性粒细胞计数有所增加（图4L），但经麦角固醇处理和未处理的小鼠在中性粒细胞动员方面无差异（数据未展示）。相反，通过集落形成单位-细胞（CFU-C）实验检测外周血祖细胞发现，接受麦角固醇处理的小鼠其祖细胞数量显著更高（(p=0.02) 图4M）。这些数据表明麦角固醇增强的CXCR4能够增强CXCR4拮抗剂AMD3100的动员效应。

图4麦角甾醇通过CXCR4增强造血细胞归巢。（A）用于测试小鼠WBM体外迁移的系统。（B）麦角甾醇处理的小鼠WBM与载体的体外迁移。将WBM细胞置于10mM麦角甾醇存在下的3mm Transwell中（或等于v/v的载体），并使其向100ng/mL rSDF1迁移过夜。通过流式细胞术（每组(n=12)孔，重复一式三份）计数下腔室中的迁移骨髓单核细胞（BMMC）。

麦角固醇提高细胞存活率

为了确定麦角固醇除了对细胞迁移之外是否具有更广泛的生物学效应，我们在麦角固醇存在的情况下对体外培养扩增的小鼠LSK细胞进行了处理。我们发现，培养14天后，与仅用溶剂处理的LSK细胞相比，麦角固醇处理使细胞数量增加了ea db8338-fd85-4724-85d4-b9ce331a9734>250%（图5A）。此外，暴露于麦角固醇的扩增细胞在培养4天和14天后的存活率均有所提高（图5B）。基于这些关于造血细胞存活率提升的数据，我们在斑马鱼模型中测试了麦角固醇是否能加速辐射后的自体恢复，而这一过程依赖于造血细胞的存活与生长/恢复。我们将斑马鱼暴露于20戈瑞的X射线辐射下，并在水中添加麦角固醇使其恢复14天。在本实验中，由于动物会通过口腔或鳃途径摄取麦角固醇，且其摄取量大多未知，我们以50毫摩尔的浓度经验性地添加了麦角固醇。14天后，收集斑马鱼的骨髓并通过流式细胞术进行评估（图5C-5E）。我们发现，麦角固醇对“前体”细胞群((p=0.002))的恢复具有显著影响，同时还提高了后肾骨髓（WKM）的整体细胞存活率（(p=0.02)，图5F-5J）。这些数据表明，麦角固醇能够对造血细胞的扩增和存活产生积极影响，这提示其除了增加CXCR4的表达外，还具有更多的多效性特性。

图5麦角甾醇在体外扩大造血祖细胞，提高活力，并促进辐射恢复。（A）小鼠LSK在24孔板（每组(n=12)孔代表两个实验之一）中以2,500个细胞/孔的体积铺板。麦角甾醇以10 mM（或等于v/v的载体）加入。每6天加入新鲜培养基（200 mL）。14天后通过流式细胞仪计数细胞。所示数据是与对照组的相对膨胀。（B）小鼠LSK细胞在培养天中4或14天后的活力通过PI排除来确定。框图显示(25th)(75^{th })百分位数，在中值处有一条线，胡须代表最小值和最大值（每组(n=12)孔代表两个实验之一）。（C）辐射恢复实验。斑马鱼接受25 Gy照射。24小时后，将50 mM麦角甾醇（或等于v/v的载体）加入水中。WKM在放射处理后14天收获，并通过流式细胞术分析，使用典型的红系细胞、髓单核细胞、前体和淋巴细胞的正向和侧向散射光控，如图所示。（D和E）分别来自对照组和麦角甾醇处理组的动物的代表性流式细胞术图。（F）WKM自体恢复后的活力，由WKM中的PI排除决定。（G-J）自体造血恢复后每种细胞类型的恢复。除非另有说明，否则显示的所有数据均为学生t检验的平均值±SD和p值。

讨论

在斑马鱼中进行造血细胞移植（HCT）的能力，拓展了我们研究脊椎动物造血干祖细胞（HSPC）及移植生物学的能力。体内光学成像，与供体细胞植入的死后分析相反，可以无创地分析移植造血细胞随时间推移的时空信息。与基于荧光的屏幕不同，生物组织不具有固有的生物发光，使BLI具有高信噪比的优势。此外，萤火虫luciferase-expressing细胞发出的光的波长足以在小动物中产生良好的组织穿透。BLI可以在短曝光时间内进行，允许更多数量的动物同时进行图像采集并增加吞吐量。BLI的敏感性可以进一步增加时透明的成年斑马鱼，卡斯帕（源自交配罗伊和珍珠色素突变体）被使用，因为它们的光吸收最弱（White 等人，2008）。生物层干涉技术（BLI）作为一种快速且灵敏的定量技术，可助力多种中通量筛选，且用于斑马鱼研究时具有显著优势——斑马鱼在实验操作和成本方面都是药物研发极具吸引力的模式生物。

在我们的首个实验中，我们确认麦角固醇是斑马鱼和小鼠体内造血细胞归巢的正向介导物。麦角固醇是蘑菇和真菌大量产生的甾醇家族成员。经UVB照射后，麦角固醇会转化为维生素(D_{2})（麦角钙化醇），这是一种维生素D类似物。与维生素(D_{3})不同，(D_{2})不易转化为25-羟维生素D，而25-羟维生素D是活性形式维生素D (1,25(OH)_{2} D_{3})的前体。尽管历史数据表明维生素(D_{2})与维生素D受体（VDR）的结合亲和力与维生素(D_{3})的代谢物相似，但维生素(D_{2})与维生素D结合蛋白的亲和力更低，这缩短了其血浆半衰期，且有研究表明其效力与维生素(D_{3})并不相当（Hollis, 1984; Houghton and Vieth, 2006）。我们关于麦角固醇不通过维生素D受体发挥作用的研究数据，也为经典的维生素(D_{3})-维生素D受体通路提供了另一种替代途径。

在本报告之前，尚未在造血作用的相关研究中探讨过麦角固醇。尽管其他维生素D家族成员已被证实对造血系统具有促进细胞生长的作用，且已被专门用于治疗贫血（Christakos 等人，2013；Erturk 等人，2002；Hall & Juckett，2013；Hewison 等人，2001）。此外，Cortes 等人（2016）近期研究发现，维生素 (D_{3}) 对斑马鱼胚胎和人脐带血中的造血干祖细胞（HSPC）均具有促生长作用。同时，麦角固醇可能还具有细胞保护作用，给大鼠在四氯化碳诱导肝损伤前注射麦角固醇，其肝损伤、炎症和纤维化程度会显著降低（Peng 等人，2014）。这些数据与我们发现的麦角固醇可提高细胞存活率的结果一致。

越来越多的研究数据表明，维生素D在造血细胞移植（HCT）中发挥着积极作用（Hall 与 Juckett，2013年）。Hansson 等人（2014年）近期对造血细胞移植前的儿童进行了维生素D水平检测（总维生素D包括(D_{2})和(D_{3})）。他们发现，造血细胞移植前维生素D充足的儿童，在移植后第30天（首个检测时间点）中性粒细胞植入效果更佳，且造血细胞排斥的发生率更低。患有恶性肿瘤且维生素D充足的儿童，其总体生存率也有所提高（87%对比50%，(p=0.01)）。其他研究团队证实，造血细胞移植时严重缺乏维生素D的儿科患者，移植后的生存率会降低（Wallace 等人，2015年）。这些研究表明，维生素D对造血细胞植入及造血细胞移植的整体结局具有积极影响。目前尚未明确维生素D促进植入的具体机制，但我们的研究数据显示，维生素D家族成员或许能够提高CXCR4的表达水平，而CXCR4是移植后归巢过程的关键介导因子之一。

在本研究中，我们证实生物发光成像（BLI）是一种无创追踪斑马鱼体内移植造血细胞的有效工具，可在活体成年受体中观察细胞归巢/植入过程。量化的发光信号稳定且与植入细胞数量高度吻合。我们的纵向分析揭示了供体尾鳍肌（WKM）细胞的归巢动力学：短期祖细胞实现高水平植入，而更为罕见的长期重建干细胞则维持较低且稳定的植入水平。借助生物发光成像（BLI）技术，我们完成了化合物化学筛选，成功筛选出能够增强细胞归巢的物质。研究发现，植物固醇及维生素前体麦角固醇可促进造血细胞在斑马鱼和小鼠模型中的归巢。尽管其作用机制尚未完全阐明，但CXCR4受体上调在其中发挥作用，且该物质可能对细胞增殖与存活产生多效性影响。

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