题目：The Wiskott-Aldrich Syndrome protein (WASp) contribution to microglial phagocytic function and neurodevelopmental support

原文链接：https://jneuroinflammation.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12974-026-03948-3 

期刊：Journal of Neuroinflammation

摘要

髓系祖细胞在胚胎发生过程中定植于大脑，并分化为小胶质细胞。小胶质细胞在发育过程中塑造神经元连接，并在成年期维持大脑稳态，这两种过程均需要完整的细胞骨架功能。维斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白（WASp）介导外周髓系细胞的细胞骨架动态变化，这表明其在小胶质细胞中也可能发挥类似作用。为探究WASp在小胶质细胞中的作用，我们将人诱导多能干细胞来源的小胶质细胞（iMicro）和斑马鱼胚胎暴露于选择性WASp抑制剂中。

WASp 与肌动蛋白细胞骨架共定位于吞噬性 iMicro 的膜皱褶处，且似乎对其吞噬功能必不可少。当与神经元细胞共培养时，受WASp抑制的iMicro对神经元网络连接的支持能力受损。同样，暴露于WASp抑制的斑马鱼胚胎表现出未被清除的凋亡小体在脑部积聚、髓样细胞的脑部定植减少，以及对机械刺激的感觉运动反应受损。

这些研究结果表明WASp是小胶质细胞吞噬作用和细胞骨架动态变化的调节因子，其功能与神经发育过程中的神经元连接密切相关。

关键词：小胶质细胞、神经发育、原发性免疫缺陷、维斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白（WASp）

背景

中枢神经系统（CNS）的驻留巨噬细胞可分为两大主要群体：位于脑实质内的小胶质细胞，以及存在于脑实质外区域（即脑边界膜界面，包括血脑屏障、脉络丛和脑膜）的中枢神经系统相关巨噬细胞（CAMs）。CAMs 和小胶质细胞均源自胚胎卵黄囊（YS）的祖细胞，并在胚胎发生过程中定居于中枢神经系统，位于能提供分化信号的特定微环境中。小胶质细胞与外周巨噬细胞和树突状细胞具有关键的免疫功能（如吞噬作用）及表型特征。小胶质细胞参与脑内稳态维持，并能迅速对威胁状态做出反应：它们持续对大脑进行的相关研究梳理了与信号传导机制相关的传感器系统，这些机制使这些细胞能够对环境变化做出反应并适应环境变化。除了小胶质细胞在成年大脑中的功能外，新的证据已明确其在出生后早期阶段对大脑发育的作用。小胶质细胞通过吞噬作用修剪突触来塑造神经元连接，改造其细胞骨架以吞噬补体标记的突触并将其彻底清除。此外，小胶质细胞会释放携带促髓鞘形成脂质信使的细胞外囊泡（EVs），如内源性大麻素类物质花生四烯酸乙醇胺（AEA）和2-花生四烯酸甘油酯（2-AG），从而促进少突胶质前体细胞（OPC）的分化和髓鞘再生。

小胶质细胞通过持续监测脑实质、在发育过程中发挥作用以及对环境信号做出反应，成为连接免疫活动与神经发育障碍的关键中介因子。免疫缺陷，尤其是在脑发育早期就已存在的免疫缺陷，可能对神经元的发育和功能产生不利影响，并在日后的生活中出现临床症状。特别是，改变小胶质细胞活性的免疫功能障碍可能会破坏神经回路并损害认知过程。此外，越来越多的证据表明，相当一部分原发性免疫缺陷病中存在神经炎症相关因素。

维斯科特-奥尔德里奇综合征（Wiskott-Aldrich Syndrome，简称WAS）是一种罕见的、隐性遗传的X连锁原发性免疫缺陷病，每10万名活产男婴中约有1例发病。

患者通常在出生后的前五年内被确诊，但近期研究报告了女性的成年发病病例，中位确诊年龄为47岁。该综合征以三联征临床表现为特征：湿疹、血小板减少症（血小板计数低）和免疫缺陷，这会导致反复感染。

WAS由位于X染色体（Xp11.22-p11.23）上的WAS基因突变引起，该基因编码维斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白（WASp）。WASp是一种由502个氨基酸组成的胞质蛋白，仅在造血细胞中表达，通过肌动蛋白相关蛋白（Arp）2/3复合物在将细胞表面信号转导至肌动蛋白聚合过程中发挥关键作用。通过这一通路，WASp调控吞噬作用、细胞骨架重塑和细胞运动等多种细胞功能。研究表明，WAS患者的外周免疫细胞存在迁移缺陷，巨噬细胞因无法形成吞噬杯而表现出吞噬功能受损，同时由于缺乏足小体还存在黏附功能异常和趋化作用缺陷。

WAS 表现出广泛的临床症状，临床谱可从轻度（如孤立性血小板减少症）到危及生命的严重并发症不等。目前已明确基因型-表型相关性：WAS 基因携带半合子变异的患者，其 WASp 表达缺失或蛋白表达量减少且存在功能缺陷。Vallée 等人鉴定出一类 WAS 基因变异体，命名为 I 类变异，可作为疾病表型较轻的预测性生物标志物。I 类错义突变主要集中在外显子1和外显子2中，会导致WASp蛋白表达量下降。与之不同的是，II类突变与严重的、危及生命的疾病表型相关。

可能会出现神经系统症状，例如急性脑出血（在WAS患者中占总死亡率的16%）和炎症，或是社会心理健康、情绪及认知功能下降。这些影响可能与小胶质细胞有关，它是大脑中唯一高表达WASp的细胞类型。值得注意的是，在接受神经炎症模型处理的Was-/-小鼠中，小胶质细胞的反应受到了抑制。

然而，与WAS相关的脑部病理机制仍知之甚少。为填补这一研究空白，我们探究了WASp在小胶质细胞细胞骨架组织及吞噬功能中的作用，并分析了WASp缺失引发的小胶质细胞功能障碍所带来的行为学影响。

在本研究中，我们证实了WASp是诱导多能干细胞来源的人小胶质细胞（hiPSCs）的小胶质细胞吞噬作用、细胞骨架完整性以及细胞运动的关键调控因子。为此，我们分析了在有无WASp药理学抑制剂存在的情况下，或WAS基因发生遗传失活后，小胶质细胞吞噬荧光生物颗粒的能力。此外，我们还在斑马鱼胚胎中对WASp进行了体内抑制，以分析其感觉运动功能以及正常的脑/体发育。

结果

人诱导多能干细胞衍生的小胶质细胞（iMicro）表达特异性小胶质细胞标志物以及Was基因

iMicro细胞由两个人诱导多能干细胞系生成，并对小胶质细胞表达的多个关键基因进行分析，以验证其转录组特征。我们通过实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）评估了小胶质细胞特异性基因的表达情况，并将iMicro细胞与其造血祖细胞进行了对比。具体而言，我们分析了HEXB、SALL1、CD68和P2RY12，结果如图1所示。我们观察到，与祖细胞相比，P2RY12基因在iMicro细胞中的表达水平显著更高。HEXB在iMicro细胞和祖细胞中均以相似水平被检测到；然而，与从相同人诱导多能干细胞分化而来的巨噬细胞样细胞相比，iMicro细胞中的HEXB转录水平显著更高（补充图S1），这支持了iMicro细胞获得小胶质细胞特异性表型的结论。出乎意料的是，SALL1在iMicro细胞中被下调，这表明要么是我们的分化方案未能维持这一小胶质细胞标志物——正如先前某些研究方法所报道的——要么是iMicro细胞呈现出了更激活的状态。与后一种假设一致，编码溶酶体相关蛋白CD68的转录本与祖细胞相比，iMicro 中显著富集了一种与吞噬功能相关的膜蛋白。

分析iMicro中WAS和WASL基因的表达情况（图1），我们发现与祖细胞相比，WAS基因表达上调，而WASL基因表达下调。

图1. 诱导小胶质细胞（iMicro）基因表达特征分析，显示其向小胶质细胞成熟。HEXB、P2RY12、SALL1、CD68、WAS和WASL基因在诱导小胶质细胞中的表达水平以相对于其祖细胞的倍数变化表示。成熟诱导小胶质细胞中P2RY12、CD68和WAS表达富集，表明其成功分化为成熟小胶质细胞。未成熟小胶质细胞发育标志物SALL1以及主要在神经元细胞中表达的WASL，其表达水平相较于其祖细胞均下调。数据以柱状图呈现，均值及单个数值标注±标准差（n=5个孔）。非配对t检验，***p<0.001，(* * * p<0.001) **** (p<0.0001)。

iMicro 表现出活跃的吞噬作用，而经 WASp 抑制剂处理后这种吞噬作用会减弱

为了确定iMicro细胞的吞噬能力，我们对暴露于荧光pHrodo™ BioParticles™（直径500纳米）的活细胞进行了共聚焦显微镜延时吞噬实验。这些纳米颗粒的荧光发射依赖于pH值；具体而言，纳米颗粒被细胞溶酶体吞噬后发生酸化，会引发染料信号的释放。因此，检测细胞内pHrodo™荧光强度的变化，可作为其吞噬功能的指标。为诱导iMicro细胞进入促炎状态并激活其吞噬功能，我们评估了两种激活方法：在实验前一天开始，用脂多糖（LPS，1微克/毫升）处理18小时，或使用含肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β，各10纳克/毫升）的双因子混合物处理。我们分析了相对于基线（即细胞暴露于pHrodo™前获取的共聚焦图像）的荧光强度随时间的变化。曲线显示了荧光变化值((Delta F / F_{0}))，在整个200分钟实验过程中每5分钟测量一次。每个孔至少3个视野的置信区间（标准差）下，经TNF-α和(IL-1 beta)激活的iMicro细胞吞噬活性高于无活性对照组，而经LPS激活的组别则无此现象，其吞噬水平与未激活对照组相当（图2A）。在验证双因子鸡尾酒是激活iMicro细胞的最佳炎症诱导剂后，我们探究了WASp药物抑制对其吞噬功能的影响。为此，我们设置两组细胞，经双因子激活后，分别用5μM维司他汀或100μM CK-666处理1小时（图2B）。选择这两种化合物是因为它们通过不同机制抑制WASp信号通路：维司他汀靶向WASp的调控性GTP酶结合域，使其稳定为自抑制构象；而CK-666则在下游发挥作用，阻止短间距Arp2–Arp3二聚体的形成——该二聚体是WASp促进的中间产物，可为新肌动蛋白丝的成核提供模板[44]。使用两种作用于WASp信号级联不同环节的抑制剂，有助于增强研究结果的可靠性。此外，本实验所用iMicro细胞源自Gibco™人诱导多能干细胞（hiPSCs），并在源自NYSCF人诱导多能干细胞的iMicro细胞中重复验证（合并分析见图2C，各细胞系单独分析见补充图S2o）。在两种细胞来源中，我们均证实经TNF-α和(IL-1 beta)激活的iMicro细胞吞噬活性高于未激活对照细胞，而抑制剂处理会显著降低吞噬活性，其中CK-666使吞噬水平降至甚至低于未处理且未激活的细胞对照组细胞。我们计算了每种条件下的曲线下面积（AUC）（图2D），结果显示，Wiskostatin（曲线下面积±标准差为84.87±21.65）以及作用更显著的CK-666（25.56±6.63）均抑制了iMicro的吞噬功能。为了排除抑制剂导致的细胞大小或形态差异对pHrodo吞噬率测定造成的潜在偏差，我们在基线水平（暴露于pHrodo之前）评估了iMicro的形态。所有实验组的细胞大小（面积）和形态（圆度）均无显著差异（补充图S3）。

激活后，iMicro 在最初约75分钟内显示出pHrodo荧光增强，表明其发生吞噬作用并与溶酶体融合；而在更长时间点荧光淬灭，这可能意味着探针通过循环或胞吐作用从溶酶体中被移除。我们在iMicro细胞暴露于pHrodo™ 生物颗粒™的最初一小时内对其进行追踪，以计算不同实验条件下的细胞运动能力。具体而言，我们分析了位移（以微米为单位的细胞路径起点与终点之间的距离）和平均速度（以纳米/秒为单位）（图2E）。我们观察到，与未激活的小胶质细胞（11.3±26）相比，经TNF-α和IL-1β激活的小胶质细胞平均速度有所提高（37.9±58.7±标准差）。Wiskostatin 导致iMicro运动停滞，其位移和平均速度与未激活细胞相近；而CK-666对激活后的iMicro运动能力无影响，细胞平均速度为（图2F）。这些观察结果表明，WASp抑制剂对iMicro的吞噬作用产生了不同程度的影响程度。我们假设维斯科他汀主要抑制了iMicro细胞向pHrodo纳米颗粒的趋化作用，而CK-666则主要影响了内吞过程。

图2. WASp 药物抑制降低了小胶质细胞的吞噬功能。A）测试了两种激活细胞的炎症刺激物：脂多糖（LPS，1 微克/毫升）与含肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β，各10纳克/毫升）的双因子混合物，两者均在吞噬实验前施加18小时。共聚焦观察3小时内的荧光信号强度变化显示，双因子混合物可诱导吞噬作用增强，而LPS则无此效果。实线（4邻域多项式平滑拟合）以ΔF/F表示与基线的荧光变化，虚线表示均值标准误差边界。采用韦尔奇方差分析（Welch’s ANOVA）后进行邓尼特T3多重比较检验。B）小胶质细胞（CFSE标记，绿色）在pHrodo（火焰色编码像素）吞噬实验中的代表性单焦平面显微图像。展示了暴露于刺激物后5至180分钟不同实验时间点的快照。展示了pHrodo的相关结果。比例尺为10微米。C）经两种因子激活后，抑制剂Wiskostatin或CK-666处理的iMicro的吞噬作用显著降低。实线代表未抑制组，虚线代表Wiskostatin抑制组，虚线代表CK-666抑制的iMicro组（(2^{nd }) 阶多项式平滑，对4个邻域取平均），其荧光变化与基线的对比如(Delta F / F_{0})所示，细虚线表示标准误边界。数据为使用两种不同人诱导多能干细胞（hiPSC）细胞系（(Gibco ^{TM})和NYSCF）的实验重复结果。D）相对于左图中呈现的所有ΔF/F曲线（(n=8-12) 个视野）的曲线下面积（AUC）。采用Welch方差分析（ANOVA）后进行Dunnett's T3多重比较。**** (p<0.0001) 对应i (* * * p=0.0003)；(* * * p<0.001) E）吞噬实验中CFSE标记的iMicro的显微照片，展示了延长时间点的视图，细胞轨迹以颜色编码刻度表示，范围从0（红色）到(300 ~nm cdot sec^{-1})（黄色）。比例尺为40微米。F）为各实验条件绘制的1小时吞噬实验中的位移和平均速度。数据为柱状图，均值以单个细胞±标准差（( n=38-82 cells)）表示，为使用两种不同人诱导多能干细胞（hiPSC）细胞系（dbc9add4-8bc4-418b-b27b-395370187a81和NYSCF）的实验重复结果。采用Welch方差分析（ANOVA）后进行Dunnett's T3多重比较，(* p<0.05)对应：(* * p<0.01)

WASp抑制剂改变了细胞的细胞骨架结构与活化状态

为了研究iMicro的细胞骨架组织，我们对吞噬实验结束时（即pHrodo™标记后3小时）固定的细胞进行了鬼笔环肽免疫荧光染色（图3A）。鬼笔环肽是从毒蝇伞真菌中分离的毒素，能够结合F-肌动蛋白，实现细胞骨架丝的可视化。具体而言，我们观察到，对照组活化的iMicro（CTRL）中，肌动蛋白丝（呈紫色）排列高度有序，主要定位于细胞边缘（皮质肌动蛋白纤维），这可能与膜皱褶和丝状伪足的萌发有关，这与小胶质细胞的既往研究结果一致[（图3A中白色箭头所示）。经Wiskostatin和CK-666抑制剂处理的小胶质细胞，其F-肌动蛋白丝失去了外周定位，且未出现新生的丝状伪足/膜皱褶。WASp与细胞边缘的鬼笔环肽信号存在部分共定位，但在丝状伪足/膜皱褶区域未检测到其存在（图3A）。

我们通过量化显微照片中鬼笔环肽和WASp荧光像素的分布，进一步分析了所有实验组（即添加/不添加Wiskostatin或CK-666）的细胞骨架组织情况（图3B）。未激活的iMicro显示出鬼笔环肽和WASp的均匀分布在细胞质中；当iMicro被双因子混合物激活时，WASp在细胞边缘聚集，这表明其可能在具有吞噬活性的细胞中对膜皱褶/丝状伪足的形成有促进作用。用Wiskostatin或CK-666处理的活化iMicro出现了鬼笔环肽和WASp信号的重排，WASp在细胞外周的富集现象消失（图3B）。随后，我们采用灰度共生矩阵（GLCM）分析[46]（图3C）来测定鬼笔环肽和WASp阳性像素的分布。灰度共生矩阵是一种用于纹理分析的方法，可量化图像中的空间模式和强度变化，得到熵（衡量随机性）和角二阶矩（衡量均匀性）等指标。在本研究中，熵值升高反映荧光信号定位于膜皱褶处。这些结构内的阳性像素被背景像素包围，会增加空间无序性（即熵值），因为阳性像素更可能与阴性相邻像素相邻。对于鬼笔环肽和WASp两种标记物，我们观察到活化iMicro的像素熵值显著高于未活化iMicro（鬼笔环肽：2.13±0.90；WASp：2.0±0.48）和经CK-666处理的活化iMicro（鬼笔环肽：0.77±0.31；WASp：0.57±0.28）；而Wiskostatin处理虽使熵值呈下降趋势，但差异未达到统计学显著水平。

图3. WASp 药物抑制对细胞骨架动态的调控作用。A) 微丝在对照条件下或经 Wiskostatin 与 CK-666 处理后的显微照片。WASp 呈绿色，鬼笔环肽呈紫色，细胞核呈蓝色（DAPI 染色）。右侧图像为经图像去卷积处理后的细胞放大细节，可见对照细胞中伸出的丝状伪足（箭头）。比例尺：前四张图像为20微米，放大图为2微米。B) 所选未激活iMicro、或经激活并暴露于DMSO、Wiskostatin或CK-666的高分辨率显微照片。鬼笔环肽呈绿色-火焰色编码，WASp呈火焰色编码。仅在经DMSO处理的激活细胞中，两种信号的像素均在膜褶皱处聚集。比例尺为10微米。C) 灰度共生矩阵分析图，以熵值和角二阶矩表示鬼笔环肽和WASp阳性像素在iMicro中分布的变化。数据为均值柱状图，单个细胞±标准差（n=4个细胞）(( n=4 cells)。单因素方差分析后进行Dunnett多重比较，*p<0.01，(* p<0.01)，(* * p<0.001)，ns表示无显著差异。

我们还测量了角二阶矩（ASM），这是一种衡量图像像素均匀性的纹理特征，因此其数值与熵相反。经双因子组合液激活的iMicro呈现出显著的在 WASp 和鬼笔环肽的检测中，活化细胞的肌动蛋白丝相关信号（ASM）值均低于未活化细胞；经 CK-666 处理后，该差异完全逆转，而经维司他汀处理后，差异仅部分恢复，且无统计学显著性（图 3C）。由人诱导多能干细胞（hiPSCs）衍生的小胶质细胞、神经元和星形胶质细胞共培养体系经 CK-666 处理后，突触标志物数量和神经元树突数量均减少小胶质细胞通过多种机制参与发育过程中神经元网络的重塑，包括突触修剪、神经元碎片清除和神经元突起调节，以及通过与星形胶质细胞等其他细胞类型的相互作用。这些功能依赖于完整的细胞骨架动力学和吞噬作用。因此，我们研究了在诱导多能干细胞（hiPSCs）来源的神经元与星形胶质细胞共培养体系中，小胶质细胞的功能。这些共培养体系可形成完整的神经元网络，分别显示突触前标志物突触素和突触后标志物PSD95的存在（图4A）。经图像去卷积以提高分辨率后，这两种标志物紧密相邻（图4B），与它们在突触小体内的预期定位一致。

我们每天用 Wiskostatin（5 微摩尔）、CK-666（100 微摩尔）或溶剂（1% 二甲基亚砜）处理共培养体系，连续处理 5 天，每天处理 1 小时。处理结束后，我们用抗 GFAP 荧光抗体（绿色）标记星形胶质细胞，用抗突触素荧光抗体（红色）标记突触前间隙，用抗 IBA1 抗体（紫色）标记小胶质细胞（图 4C）。从荧光在图像（图4C）中，我们观察到与载体处理组相比，经CK-666处理的共培养物中突触素阳性斑点数量显著减少（图4D）。我们测量发现，与未处理的共培养物相比，经CK-666处理的共培养物的iMicro体积有所增加（图4E）。然而，由于所有二甲基亚砜（DMSO）处理的共培养物均具有更高的iMicro体积，载体诱导的iMicro体积变化似乎与突触形态发生的调控无关。

图4. 用CK-666抑制WASp会影响人诱导多能干细胞衍生神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞共培养体系中的神经元连接。A) 二甲基亚砜（DMSO）处理的共培养体系中突触蛋白（绿色）、突触后密度蛋白95（PSD95，红色）和微管相关蛋白2（MAP2，深蓝色）的代表性显微照片。白色方框标注了高倍视野的位置，该视野经过反卷积处理以清晰显示突触斑点。比例尺分别为20微米（左图）和0.5微米（中、右图）。B) 反卷积图像中追踪线条上突触蛋白和PSD95的像素强度曲线图。C) 星形胶质细胞（胶质纤维酸性蛋白，GFAP，绿色）、突触（突触蛋白，SYN，红色）和小胶质细胞（离子钙结合衔接分子1，Iba1，紫色）的共聚焦显微照片代表性三维重建图。插图中突出显示了突触蛋白的等值面重建结果。实验组分为未处理组、二甲基亚砜（DMSO）处理组、疣状菌素（Wiskostatin）处理组和CK-666处理组，均为每日处理1小时，连续处理5天。经CK-666处理的共培养体系中似乎出现了更少的突触素斑点。比例尺40微米。D）突触素阳性斑点的定量分析显示，与二甲基亚砜处理组相比，CK-666处理的共培养体系突触数量减少。E）与未处理组相比，接受二甲基亚砜、维司他丁和CK-666处理的共培养体系小胶质细胞体积均有相似程度的增加。数据以柱状图表示均值，单个视野（突触斑点，(n=8)）或细胞（小胶质细胞体积，(n=24-50)）±标准差，结果来自两次重复实验。采用Welch校正的多重t检验，*p<0.05；(* p<0.05)；(* * p<0.01)

接下来，我们通过对经 MAP2 染色的细胞进行 Sholl 分析来评估神经元形态，该分析可提供从细胞胞体出发的树突长度和分支的定量信息（图 5A）。与突触密度降低的结果一致，经 CK-666 处理的共培养体系中的神经元表现出树突数量更少、长度更短。这一点体现在 Sholl 曲线下面积显著更低（67.19 ± 8.59），而未处理组为（127.1 ± 16.90）、二甲基亚砜（DMSO）处理组为（129.5 ± 13.49）（图 5B、C）。经 Wiskostatin 处理的细胞的 Sholl 评分也呈现下降趋势，尽管降幅较小且无统计学意义（95.34 ± 12.29；图 5B、C）。重要的是，在我们的共培养体系中，无论是否经过处理，均在小胶质细胞中检测到 WASp 表达，而在神经元中未检测到（图 5D）。这表明这些抑制剂对小胶质细胞具有选择性靶向作用。人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的小胶质细胞中 WAS 基因敲除会导致其活化功能受损为了进一步证实我们对WASp在小胶质细胞中作用的观察，我们通过CRISPR-Cas9介导的WAS基因敲除（WAS敲除）构建了新的人诱导多能干细胞系。按照Iannello等人的研究方法，我们首先对该细胞系的未分化状态标志物——SOX2、OCT4和NANOG的表达进行了鉴定，证实其与未突变细胞系（野生型）一样保持了干细胞特性（图6A、B）。随后，我们将WAS敲除的人诱导多能干细胞诱导分化为三个胚胎胚层。免疫荧光分析表明，该细胞系成功分化为外胚层（OTX2阳性）、内胚层（SOX17阳性）和中胚层（Brachyury阳性）细胞系（图6C）。

图5. 用CK-666抑制WASp会影响人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞共培养体系中的神经元形态。A）神经元的代表性显微照片（MAP2，红色）及其用于Sholl分析的分割信号。与未处理或二甲基亚砜（DMSO）处理的共培养体系相比，经CK-666处理的共培养体系中神经元的树突数量更少、长度更短。比例尺为20微米。B）Sholl分析以细胞体中心为起点，在20至200微米范围内绘制。曲线代表每组n=25个细胞(n=25)，以平均值（实线）±标准误均值（SEM，虚线边界）绘制。C）相对于Sholl分析的曲线下面积显示，与未处理和DMSO处理的实验条件相比，CK-666导致Sholl曲线面积减小。数据以平均值+标准误均值表示（(n=25)个细胞）。采用单因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey多重比较检验（(* p<0.05)、(* * p<0.01）。D）共培养体系中诱导小胶质细胞（iMicro，CD11b，绿色）、神经元（MAP2，品红色）和WASp（红色）的共聚焦代表性显微照片。在所有实验条件下，WASp信号均与CD11b共定位，而不与MAP2共定位。比例尺为40微米。

随后我们推导得到WAS基因敲除型诱导性小胶质细胞（WAS KO iMicro），并采用双因子方案（暴露于10纳克/毫升的肿瘤坏死因子-α和白介素-1β共18小时）对其进行激活处理。激活与未激活的诱导性小胶质细胞随后均接触大肠杆菌来源的纳米颗粒，以诱导吞噬作用。3小时后，通过共聚焦显微镜分析细胞形态。经肿瘤坏死因子-α和白介素-1β处理的野生型诱导性小胶质细胞（(1 beta)）与未激活的对照组相比，表现出反应性表型（图6D），其特征为细胞体积增大（面积增加4.9倍、周长增加3.1倍、直径增加2.8倍），且形态复杂程度更高（圆度降低0.54倍，图6E）。此外，激活的野生型诱导性小胶质细胞还出现空泡化细胞质，提示吞噬作用的发生（图6D）。相比之下，WAS基因敲除型诱导性小胶质细胞经细胞因子处理后未出现这些与激活相关的形态学变化，仍保持较小的圆形形态，与未激活的细胞相似（图6D、E）。

图6. Wiskott-Aldrich综合征敲除（WAS KO）人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的诱导微胶质细胞（iMicro）对细胞因子激活的反应存在损伤。A) 针对SOX2（红色）、OCT-4（绿色）和NANOG（红色）染色的WAS KO hiPSC代表性显微照片，显示该突变细胞系保留了干性特征。比例尺50微米。B) 非突变型（野生型，WT）和WAS KO hiPSC针对三种干性标志物的每个细胞核荧光强度直方图，显示细胞对标志物的阳性分布相似（已识别的细胞核）。C) WAS KO hiPSC成功分化为三个胚层，细胞对OTX-2（外胚层）、SOX-17（内胚层）和短尾（中胚层）呈阳性。比例尺50微米。D) 展示了野生型和WAS KO iMicro未刺激（未激活）或经肿瘤坏死因子-α（TNF-α）激活18小时后的代表性显微照片。细胞核用蓝色染色（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，DAPI），细胞用绿色标记（羧基荧光素二乙酸酯，CFSE示踪剂）；比例尺20微米。激活后，野生型iMicro呈现肥大形态，特征为细胞突起延伸和细胞质空泡化。相比之下，WAS KO iMicro仍保持小而圆的形状。E) 细胞形态定量分析显示，激活的野生型iMicro的大小（面积、周长和直径）显著增加，表型更具分支性（圆形度降低），而激活的WAS KO iMicro未观察到此类变化。数据为均值柱状图，单个细胞±标准差（激活组n=18个细胞，未激活组n=7个细胞）。采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）后进行图基多重比较检验。

与载体对照组相比，暴露于CK-666的斑马鱼胚胎大脑中凋亡小体的积累量增加，且在触碰诱发的行为测试中反应延迟。接下来，我们采用体内斑马鱼胚胎模型，探究WASp抑制对大脑髓样细胞（主要依赖吞噬功能的小胶质细胞）神经发育功能的影响。为验证斑马鱼可作为研究WASp参与小胶质细胞功能的相关模型，我们分析了Daniocell斑马鱼数据库中的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，结果显示was基因（wasa和wasb旁系同源基因）在mpeg1+细胞群（对应髓样细胞）中表达富集（补充图S4）。相比之下，编码神经型WASp（N-WASp）的wasl基因旁系同源基因在这些细胞中不表达。我们获得了一种在mpeg1启动子下表达荧光报告基因的转基因斑马鱼品系（mpeg1-RFP），借此能够特异性观察髓样细胞，并对其行为特征进行分析，包括大脑归巢、吞噬活性以及经CK-666调控WASp活性后的迁移动态。为此，我们将2天龄（dpf）的胚胎随机分为两组，分别用50微摩尔的CK-666抑制剂或0.5%二甲基亚砜（DMSO）载体处理过夜。在3天龄时，我们开展了触碰诱发反应测试（图7A）。行为测试开始前，我们先测量胚胎的心率，仅保留心率≥120次/分钟的胚胎用于后续实验，该心率是斑马鱼健康的指标（图7B）。这些纳入标准基于对CK-666抑制剂靶点——Arp2/3复合体的观察。蛋白质复合物也在斑马鱼胚胎的心脏周细胞中表达（参见补充图S5）。

DMSO（溶剂处理）组的所有动物均纳入本研究，而CK-666处理组有15只动物（14.7%）被排除（图7B）。如图5C所示，触觉诱发反应实验显示，67%的DMSO处理胚胎对刺激表现出快速反应（1-2次触碰后出现反应），17%表现为轻度反应受损（3-4次触碰后出现反应），16%无反应（4次以上触碰后无反应）。对于CK-666处理的胚胎，11%表现为轻度反应受损，78%无反应，仅11%对刺激正常反应，这表明WASp被抑制的动物存在严重的感觉运动功能损伤。

包括大脑在内的众多器官的发育均以程序性细胞死亡作为关键调控过程。神经营养理论提出，神经元会争夺有限的存活因子供应，因此相当一部分神经元会发生细胞死亡。神经发育的一个关键机制是小胶质细胞介导的吞噬作用清除大脑中的凋亡小体。为探究WASp抑制是否影响这一机制，我们利用Tg(-3.1neurog1:GFP;mpeg1:Gal4;UAS:lyn-tagRFP-T)斑马鱼胚胎实现了神经元与髓系细胞的同时可视化，并对3天胚胎期（dpf）的胚胎进行TUNEL染色，以观察CK-666处理后凋亡小体的分布情况。与对照组相比，我们观察到胚胎大脑中的凋亡小体数量显著增加（图7D）。经 CK-666 处理后。我们通过测量 neurog1-GFP 标记区域内 TUNEL 阳性细胞的数量对这一现象进行了量化（图7E）。与 DMSO 处理的对照组（10.0 ± 5.96）相比，CK-666 处理的斑马鱼中该数值显著更高（151.4 ± 72.35，均值±标准差）。此外，在 DMSO 处理组中，mpeg1-RFP 标记的细胞似乎吞噬了凋亡小体，而在 CK-666 处理的斑马鱼中则未观察到这一现象。与这一观察结果一致，DMSO 处理的动物中，mpeg1-RFP 细胞内的 TUNEL 信号强度占 neurog1-GFP 标记区域总信号的比例（0.051 ± 0.028，积分密度比值±标准差）高于 CK-666 处理的斑马鱼（0.012 ± 0.004，图7F）。

图7. 用CK-666抑制WASp会损害斑马鱼的感觉运动功能，并阻碍大脑中凋亡小体的清除。A）实验方案：从受精后第2天（dpf）开始，斑马鱼胚胎用50微摩尔的CK-666处理过夜。在3 dpf时，对斑马鱼进行触碰反应行为测试，以评估其感觉运动功能。B）在处理前（预处理）的2 dpf，以及接受二甲基亚砜（DMSO）处理的斑马鱼在触碰诱发反应测试前的3 dpf（DMSO处理后）和CK-666处理的斑马鱼在3 dpf（CK-666处理后），测量其胚胎的心率。本研究仅纳入心率≥120次/分钟的斑马鱼。费希尔精确检验，DMSO组与CK-666组相比p<0.001。(p<0.001. C)）与赋形剂处理的胚胎（DMSO组）相比，经CK-666处理的斑马鱼胚胎对机械刺激的反应受损，表现为对刺激作出反应所需的触碰次数增加。数据以频率分布呈现（(n=102)为DMSO组样本量，90为CK-666组样本量）。卡方检验，(* * * * p<0.0001) D）3 dpf时固定后TUNEL染色（红色）、neurog1-GFP（绿色）和mpeg1-RFP（蓝色）的代表性三维显微照片。比例尺200微米。插图显示共聚焦显微照片的高放大倍数单焦平面，仅在DMSO组中可见mpeg1-RFP阳性细胞吞噬的TUNEL信号。比例尺20微米。E）在neurog1阳性区域内进行TUNEL信号定量，以TUNEL凋亡小体的数量表示。与接受DMSO处理的斑马鱼相比，接受CK-666处理的斑马鱼胚胎的凋亡小体数量增加。数据为柱状图，显示单个斑马鱼的平均值±标准差(n=5)。韦尔奇校正非配对t检验，(* * p=0.01) F）TUNEL以mpeg1-RFP分割体积中信号强度占neurog1-GFP体积总强度的比例表示，接受CK-666的斑马鱼中该比例值降低。数据为柱状图，均值±标准差，单个斑马鱼数据（n=5）。(n=5))。经Welch校正的非配对t检验，(* p<0.05)

用CK-666处理的斑马鱼胚胎与对照组相比，其髓系细胞对脑部的定植减少，且运动方式也发生了改变

发育性凋亡是驱动小胶质细胞脑内定位的一个关键信号，这一现象主要在受精后6天内的斑马鱼视顶盖中被观察到。因此，我们利用Tg(mpeg1:Gal4;UAS:lyn-tagRFP-T)斑马鱼品系，评估了经CK-666处理的斑马鱼胚胎在受精后3天和5天时视顶盖内髓样细胞的数量（图8A-D）。受精后3天时，经CK-666处理的斑马鱼胚胎视顶盖中mpeg1-RFP阳性细胞数量（细胞数为11.04±4.14，均值±标准差）少于经二甲基亚砜（DMSO）处理的对照组（14.23±4.14）（图8A、B）。受精后5天时也观察到了类似效应，此时经CK-666处理的斑马鱼视顶盖中mpeg1-RFP阳性细胞数量（6.00±2.89，均值±标准差）仍低于经DMSO处理的对照组（8.64±3.23；图8C、D）。为了探究髓样细胞向斑马鱼视顶盖的归巢机制，我们使用 Tg( 进行了延时共聚焦成像3.1 神经胶质细胞缺失1型绿色荧光蛋白（neurog1:GFP）；巨噬细胞表达Gal4转录因子（mpeg1:Gal4）；上游激活序列连接红色荧光蛋白标签（UAS:lyn-tagRFP-T）的斑马鱼胚胎。用二甲基亚砜（DMSO）处理的对照组胚胎在该区域表现出强烈的细胞迁移行为。相比之下，用CK-666处理的斑马鱼中，mpeg1-RFP阳性细胞的迁移行为发生改变，进入视顶盖或在视顶盖内移动的细胞数量减少（图8E）。对16小时内髓系细胞运动性的定量分析显示，与DMSO处理的对照组（位移为102.7±68.70微米，迁移速度为(0.028 pm 0.001 mu m cdot sec^{-1}）相比，CK-666处理的斑马鱼位移降低（80.98±55.86微米，平均值±标准差；图8F），迁移速度也更低（0.020±(0.012 mu m cdot sec^{-1})；图8G）。总体而言，我们的研究数据表明，WASp在包括小胶质细胞在内的髓系细胞中发挥作用，通过促进这些细胞向脑部迁移并在脑部聚集，从而帮助清除凋亡神经元，进而维持正常的神经发育生理过程。

图8. 用CK-666抑制WASp对斑马鱼髓系细胞向脑部归巢的影响。A-D) 3天胚胎期（A）和5天胚胎期（C）表达mpeg1-RFP的髓系细胞代表性显微照片。虚线区域对应视顶盖。比例尺为500微米。对视顶盖进行mpeg1-RFP信号定量分析，统计3天胚胎期（B）和5天胚胎期（D）的已识别细胞数量。接受CK-666处理的斑马鱼胚胎视顶盖中的细胞数量少于接受二甲基亚砜（DMSO）处理的胚胎。数据以柱状图呈现，为单个斑马鱼的平均值±标准差（3天胚胎期样本量为26，对应标识(n=22)；5天胚胎期样本量对应标识(n=11-15）。非配对t检验，显著性标识对应(* p<0.05)。E) 代表性显微照片显示neurog1-GFP（绿色）、mpeg1-RFP（红色）以及自动识别的小胶质细胞体（白色斑点）。对mpeg1-RFP标记的细胞进行16小时追踪，结果显示抑制WASp会减少髓系细胞在视顶盖内的迁移。F、G) 位移量（F）和平均速度（G）的定量分析表明，CK-666会降低髓系细胞的运动能力。数据以柱状图呈现，为单个细胞的平均值±标准差（DMSO组样本量为196，对应标识(n=202)；CK-666组样本量为196）。曼-惠特尼检验，显著性标识分别对应(* * * p<0.001)和****，****的显著性标识对应(p<0.0001)。

讨论

本研究明确了维斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白（WASp）在小胶质细胞吞噬作用和细胞骨架完整性调控中的作用。基于WASp在外周髓样细胞成熟及细胞骨架组织中的已知功能，本研究为其在脑内驻留髓样细胞中的功能提供了新见解。此外，我们的原创发现——抑制WASp会影响斑马鱼胚胎的小胶质细胞行为及脑部凋亡小体的清除——也为其在小胶质细胞神经发育功能中的作用提供了依据。

在外周髓系细胞中，WASp 蛋白通过 Arp2/3 复合物将细胞表面接收的信号传导至肌动蛋白聚合，从而调控吞噬作用和细胞骨架重塑等关键细胞功能[57]。为探究脑内驻留髓系细胞是否也存在这一机制，我们将人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的小胶质细胞（iMicro）暴露于两类抑制剂中：一类是抑制 Arp2/3 复合物激活的 Wiskostatin，另一类是将复合物稳定于非活性状态的 CK-666。两种抑制剂均能减少 iMicro 对荧光大肠杆菌偶联纳米颗粒的吞噬，证实了 WASp 蛋白在小胶质细胞吞噬作用中的作用。这一过程依赖于 Arp2/3 复合物激活介导的细胞骨架重排，同时也与清道夫受体、调理素相关受体（包括 CD36、补体受体 CR3 以及 Toll 样受体 4 TLR4）密切相关。

免疫荧光技术显示，WASp与丝状肌动蛋白（F-actin）共定位，尤其是在具有活跃吞噬功能的小胶质细胞（iMicro）的细胞外周区域，这进一步表明该蛋白直接参与了小胶质细胞细胞骨架的结构变化。事实上，小胶质细胞会将丝状肌动蛋白丝定位于膜皱褶处以实现其重分布，而膜皱褶是吞噬作用的结构基础，这反映出小胶质细胞的行为从广泛的监测状态转变为局部的小规模运动，这种行为变化与吞噬作用等活跃的免疫功能密切相关。

为了量化不同实验组（包括使用WASp抑制剂的实验组）中F-肌动蛋白丝和WASp的不同定位，我们通过GLCM进行了纹理分析，从而能够测量像素强度分布。对F-肌动蛋白信号的GLCM分析显示，激活的iMicro

具有较高的荧光像素熵和较低的角二阶矩（ASM），这两个参数反映了信号在选择性结构内的空间组织方式。事实上，阳性肌动蛋白丝（F-actin）像素主要存在于细胞外周结构中，例如膜皱褶处，从而在相邻像素之间形成了强烈的对比度（阳性信号与背景对比）。相反，抑制剂处理导致肌动蛋白丝（F-actin）失去外周定位，在细胞质中分布更为均匀。这种肌动蛋白丝（F-actin）在WASp抑制的微细胞（iMicro）中的均匀分布，表现为熵值显著降低和角二阶矩（ASM）升高，这表明其细胞骨架结构不具备吞噬功能。对WASp定位信号进行相同分析，得到的结果与肌动蛋白丝（F-actin）的分析结果相似，进一步证实了WASp与细胞骨架之间紧密的空间关联。

由于吞噬作用需要细胞运动能力，我们接下来评估了WASp抑制是否会影响iMicro的这一特性。经炎症刺激激活后，iMicro的移动速度比未激活的细胞更快、移动距离也更远。在激活的iMicro中，Wiskostatin会降低细胞的运动速度和位移，而CK-666则不会改变细胞的运动能力。这一发现表明，这两种抑制剂通过不同的机制抑制了激活的iMicro的吞噬作用。我们推测，Wiskostatin影响了细胞对趋化刺激的反应，而CK-666则破坏了目标纳米颗粒的内化过程。

我们生成WAS KO小胶质细胞后，观察到这些细胞在细胞因子刺激下并未呈现反应性表型。具体而言，它们未出现与激活相关的典型特征，例如细胞体积增大、突起呈分支状，以及吞噬作用诱导后出现的细胞质空泡化。这些发现证实了WASp在小胶质细胞应对激活信号的反应中发挥作用，并表明其可能参与吞噬作用及相关形态学变化。吞噬作用是小胶质细胞参与大脑发育的主要过程。事实上，从胎儿阶段开始，小胶质细胞就通过突触修剪来塑造正在形成的神经网络，而这一过程需要活跃的吞噬功能。小胶质细胞功能异常进而导致突触修剪受损，会改变大脑发育，造成长期的行为学后果。有研究观察到，出生后早期条件性敲除SHIP1（一种新发现的、对小胶质细胞介导的突触重塑至关重要的蛋白质）的小鼠，成年后会出现突触丢失和认知功能缺陷，而在发育后期敲除则无此现象，这一结果也佐证了上述观点。

我们通过将诱导微胶质细胞（iMicro）与诱导多能干细胞衍生的神经元和星形胶质细胞共培养，探究了WASp抑制是否会在体外影响突触形成。我们观察到，与对照组相比，经CK-666处理的共培养体系中突触数量减少，这与WASp抑制后小胶质细胞对神经元连接的支持作用受损的结果一致。与这一发现相符的是，暴露于CK-666的共培养体系中的神经元，其树突在数量和长度上均出现减少。这些效应在以下情况中均未出现使用了Wiskostatin。Wiskostatin未检测到作用，这可能是由于所采用的治疗方案（每天1小时，持续5天）未能实现有效的抑制。

基于我们的体外研究结果——这些结果揭示了WASp在诱导微胶质细胞（iMicro）的吞噬机制中发挥作用，且在与神经元共培养时支持突触形成的能力——我们将研究拓展至体内斑马鱼胚胎模型。这一模型使我们能够评估WASp是否对神经发育至关重要。与哺乳动物类似，斑马鱼在mpeg1+微胶质细胞和巨噬细胞这一免疫细胞亚群中表现出was基因的高表达，这为利用斑马鱼研究这些细胞中WASp的功能提供了支持。然而，斑马鱼拥有两个旁系同源基因wasa和wasb，二者均在mpeg1+髓系细胞中表达。值得注意的是，只有wasa——而非wasb——在spic+间质细胞（皮肤中mpeg1+但CSF1R非依赖的非造血巨噬细胞样细胞）中呈高表达。这种复杂性限制了构建稳定敲除模型的直接基因靶向操作。因此，我们采用了在体外对突触重塑作用最强的WASp抑制剂CK-666，以探究斑马鱼胚胎中WASp的功能。

我们观察到，暴露于 CK-666 的斑马鱼胚胎在受精后3天出现感觉运动功能受损，这一点从其在触觉反应测试中的表现不佳可以得到证实。在同一时间点，斑马鱼胚胎的大脑中同时伴随着凋亡小体的积累。发育性细胞凋亡是包括大脑在内的许多器官的一种生理过程。正如之前据报道，发育中大脑内凋亡小体的清除依赖于吞噬性小胶质细胞，这是组织驻留巨噬细胞归巢的关键过程。在WASp被抑制的斑马鱼胚胎中，凋亡小体在大脑中积累。在mpeg1+细胞中检测到的TUNEL信号比例降低，这与小胶质细胞等髓系细胞的吞噬或清除功能缺陷一致。然而，CK-666处理后总TUNEL信号水平显著升高，这也可能表明细胞凋亡增加，而非仅仅是清除减少。因此，细胞凋亡增多和清除受损可能共同导致了WASp抑制剂处理的胚胎中观察到的TUNEL信号升高。值得注意的是，WASp被抑制后，mpeg1+细胞在视顶盖（神经发育过程中小胶质细胞定植率最高的脑区）中的归巢能力也下降了。为佐证这一发现，CK-666处理改变了mpeg1+细胞的运动性，导致其位移和平均速度降低，同时在视顶盖内的迁移范围也减小。CK-666会影响斑马鱼髓系细胞的运动性，却不损害iMicro的运动性，这一现象表明二者存在模型特异性差异。这种差异可能源于每个系统中可用的作用靶点不同（即iMicro检测所用的大肠杆菌生物颗粒，与斑马鱼髓系细胞所用的凋亡小体不同）。因此，体内斑马鱼模型可能更好地反映神经发育相关的生理过程，提供一个完整的大脑微环境，进而塑造小胶质细胞的特性、反应性和动态变化。我们的研究结果表明WASp在生理过程中具有重要作用神经发育。在受精后5天，经CK-666处理的斑马鱼胚胎出现身体形态改变，这表明其整体发育受到了损害（补充图S6）。

WAS基因的突变会导致威斯科特-奥尔德里奇综合征（Wiskott-Aldrich Syndrome，WAS），这是一种X连锁型原发性免疫缺陷病。该综合征的表型影响主要见于外周髓系细胞，这类细胞因无法形成吞噬杯而存在吞噬功能缺陷，同时因缺乏足体而出现黏附功能与趋化功能异常。目前关于WAS对脑内驻留髓系细胞的影响研究较少。Bosticardo等人的一项研究在模拟多发性硬化症的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型中探究了WASp的作用。具体而言，研究人员发现，与野生型同窝小鼠相比，WASp缺陷型小鼠的中枢神经系统EAE诱导的自身免疫反应发展延迟，这一现象除其他机制外，还与小胶质细胞活化程度降低有关。

我们的研究数据拓展了对WASp在小胶质细胞功能中作用的认知，研究表明该蛋白介导吞噬作用——这是维持大脑稳态以及在神经发育过程中塑造神经元连接的关键过程。这一信号通路的紊乱或许有助于解释沃斯克特-亚历山大综合征（WAS）患者出现的神经系统症状，据报道，这类患者中有20%的症状由免疫介导。例如，功能异常的WASp可能会削弱小胶质细胞限制损伤进展的能力脑出血后，若神经网络支持不足，认知功能也会受损。

为了探究WASp的作用，我们使用了两种WASp的药理学抑制剂，以此干扰该蛋白的功能，而非其合成过程。这一方法可解释WAS基因中发现的多种突变——这些突变会导致被归为轻度表型（评分为1-2分，被标记为X连锁血小板减少症，XLT）的WAS患者体内产生截短型或部分功能的蛋白。这类患者的预期寿命通常长于WASp完全缺失的患者（重度疾病评分为3-5分），且可能在晚年出现神经系统症状。此外，我们检测了从WASp敲除的人诱导多能干细胞系中获得的iMicro细胞，发现其获取具有吞噬细胞典型特征的空泡化细胞质反应形态的能力受损。我们承认，目前我们的实验方法尚未直接转化为该综合征的诊断或治疗应用。然而，鉴于小胶质细胞几乎参与所有脑部病变，我们的研究结果揭示了脑驻留髓样细胞激活的一条此前未被发现的通路，值得在一系列神经系统疾病中开展进一步研究。

2-AG：2-花生四烯酸甘油酯；AEA：内源性大麻素花生四烯酸乙醇胺；Arp2/3：肌动蛋白相关蛋白复合物2/3；ASM：角二阶矩；AUC：曲线下面积；bpm：每分钟心跳次数；CAMs：中枢神经系统相关巨噬细胞；中枢神经系统：中枢神经系统；dpf：受精后天数；实验性自身免疫性脑脊髓炎：实验性自身免疫性脑脊髓炎；细胞外囊泡：细胞外囊泡；视场：视场；灰度共生矩阵：灰度共生矩阵；人诱导多能干细胞：人诱导多能干细胞；hpf：受精后小时数；造血祖细胞：造血祖细胞；iMicro：人诱导多能干细胞衍生小胶质细胞；脂多糖：脂多糖；数值孔径：数值孔径；神经前体细胞：神经前体细胞；神经前体细胞培养基：神经前体细胞培养基；少突胶质前体细胞：少突胶质前体细胞；感兴趣区：感兴趣区；单细胞RNA测序：单细胞RNA测序；维斯科特-奥尔德里奇综合征：维斯科特-奥尔德里奇综合征；维斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白：维斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白；胚胎卵黄囊：胚胎卵黄囊；斑马鱼：斑马鱼。

方法

体外实验

人诱导多能干细胞（hiPSCs）

本研究使用了两株人诱导多能干细胞（hiPSCs）系。其中一株购自(Gibco ^{TM})（美国加利福尼亚州生命科技公司，批号V2.0），该样本的收集与使用已获得约翰斯·霍普金斯大学机构干细胞研究监督委员会的批准；另一株（纽约干细胞基金会，编号7889SA）取自纽约干细胞基金会（以NYSCF研究所名义运营，地址为美国纽约州纽约市西54街619号，邮编10019）的样本库，其从人类供体收集这些样本的所有伦理审批均由该基金会负责。解冻后，两株hiPSCs系均在无饲养层培养体系中培养，使用无血清培养基（mTeSR™ Plus，STEMCELL Technologies公司，货号100-0276），并添加浓度为1微摩尔的ROK抑制剂（StemMACS Y27632，德国美天旎生物技术公司，货号120-193-922），培养于基质胶®（康宁公司356231，德国赛力昂公司）包被的6孔板中。当细胞融合度达到70%至80%时，每3至5天使用ReLeSR™（STEMCELL Technologies公司，货号05872）进行传代。所有细胞均在37摄氏度、5%(CO_{2})的条件下培养维持。

小胶质细胞的分化

本研究使用 STEMCELL Technologies 公司的 STEMdiff™ 试剂盒及制造商提供的方案，对赛默飞世尔科技（Gibco™）诱导多能干细胞（hiPSCs）系和纽约干细胞基金会（NYSCF）诱导多能干细胞（hiPSCs）系进行小胶质细胞分化。在第-1天，汇合度为70%-80%的诱导多能干细胞（hiPSCs）使用 ReLeSR™ 进行分离。测试了多种铺板密度：将 100、140 和/或 190 个聚集体/孔铺板至基质胶®包被的6孔板中，每孔加入2 ml 含ROK抑制剂的mTeSR™ Plus培养基。第0天，更换为2 ml 培养基A（45 ml HPC基础培养基 + 225 μl 补充剂A，STEMdiff™造血试剂盒-1培养基A，STEMCELL Technologies，货号05310），启动造血祖细胞（HPC）分化。第2天，更换一半培养基为新鲜的培养基A；第3天，完全更换为2 ml 培养基B（75 ml STEMdiff HPC基础培养基 + 375 μl 补充剂B，STEMdiff™造血试剂盒-1培养基B，STEMCELL Technologies，货号05310）。此后每隔一天更换一次培养基B，直至第11天。第12天，收集HPC释放的非贴壁细胞，以每孔1×10⁵ - 2×10⁵ 个细胞的密度铺板至基质胶®包被的6孔板中，每孔加入2 ml STEMdiff™小胶质细胞分化培养基（STEMCELL Technologies，货号100-0019）。此后每隔一天添加1 ml STEMdiff™小胶质细胞分化培养基进行换液。第24天，将细胞收集至离心管中，300×g离心5分钟。弃去上清液，沉淀用1 ml 新鲜培养基重悬。将每支管中的细胞分别重新铺板至6孔板的原孔中，每孔加入1 ml 新鲜的STEMdiff™小胶质细胞分化培养基。此后每隔一天添加1 ml 培养基，直至第36天。当天，将每孔中的细胞收集至离心管中，300×g离心5分钟。弃去上清液，仅保留1 ml 培养基覆盖细胞，将每支管中的细胞分别铺板至新的基质胶®包被孔中。

将细胞接种于6孔板中，每孔加入1毫升新鲜的STEMdiff™小胶质细胞成熟培养基（STEMCELL Technologies公司，货号100-0020）。此后每隔一天更换1毫升培养基。细胞在STEMdiff™小胶质细胞成熟培养基中培养4至10天后完成终末分化。在成熟培养基中培养10天后，细胞死亡的情况可能会增加。完全分化的细胞被称为诱导多能干细胞来源的小胶质细胞（iMicro）。细胞培养条件为37摄氏度、5%二氧化碳，培养环境编号为(CO_{2})

星形胶质细胞和神经元的分化

神经祖细胞（NPCs）购自赛默飞世尔科技（GibcoTM）诱导多能干细胞产品。每孔使用1毫升Versene（赛默飞世尔科技欧洲公司，货号15040066）在室温（RT）下孵育2分钟以消化细胞，随后将细胞接种至基质胶（Matrigel®）包被的6孔板中，所用培养基为STEMdiff™ SMADi神经诱导试剂盒（STEMCELL公司，货号08582），并添加5μM ROCK抑制剂。细胞每6-9天传代一次，培养21天后，将培养基更换为STEMdiff™神经祖细胞培养基（NPM）（STEMCELL公司，货号05883）。获取星形胶质细胞-神经元共培养物的第一步是从神经祖细胞分化出星形胶质细胞，随后将新的神经祖细胞接种至已形成的星形胶质细胞层上，并诱导其分化为神经元。具体操作如下：将处于汇合状态的神经祖细胞用StemPro™ Accutase™细胞解离试剂（赛默飞世尔科技公司，货号A1110501）消化分离，计数后以(15,000-20,000 cells / cm^{2})的密度接种至基质胶（Matrigel®）包被的6孔板中，每孔加入1毫升含1μM ROCK抑制剂的神经祖细胞培养基（NPM）。接种次日，加入1毫升向每孔中加入星形胶质细胞培养基（ScienCell 研究实验室，货号 1801-sc），从第3天至第25天，每2-3天更换一半培养基，以促进细胞增殖并分化为星形胶质细胞。分化第25天时，使用 StemPro™ Accutase™ 细胞解离试剂消化星形胶质细胞，以15,000-20,000 个细胞/平方厘米的密度接种于包被有 Matrigel® 的带盖玻片24孔板中。更换一半培养基培养5-7天以维持星形胶质细胞生长。数日后星形胶质细胞形成单层，在此之上接种神经前体细胞（NPCs）进行神经元分化。为此，消化神经前体细胞并以 (10,000 cells / cm^{2}) 的密度接种（与星形胶质细胞比例为1:1）。30天后完成神经元分化，每周更换两次半量培养基，培养基采用添加了200纳摩尔抗坏血酸（Sigma-Aldrich，货号 A4544）、1毫摩尔丁酰环腺苷酸（Sigma-Aldrich，货号 D0627）、20纳克/毫升人重组脑源性神经营养因子（Miltenyi Biotec，货号 130-138-877）和20纳克/毫升人重组胶质细胞源性神经营养因子（Miltenyi Biotec，货号 130-129-542）的 BrainPhys™ 神经元培养基N2-A及SM1试剂盒（STEMCELL 技术公司，货号 05793）。

星形胶质细胞-神经元-小胶质细胞共培养体系的构建

为构建星形胶质细胞-神经元-小胶质细胞共培养体系，收集分化末期（第36天）的小胶质细胞至管中，经离心和计数后，以每孔10,000个细胞的密度（小胶质细胞:神经元比例为1:2）接种于已分化至相应阶段的星形胶质细胞-神经元共培养体系中。在神经元分化的第22至25天，将细胞置于体积为300微升、比例为1:1的小胶质细胞/神经元混合分化培养基中培养。小胶质细胞需与星形胶质细胞-神经元共培养体系相互作用至少2天，之后再更换培养基。接种后第3天，更换为新鲜的BrainPhys™ 神经元培养基N2-A及SM1培养基，至此完成30天的神经元分化过程。实验在小胶质细胞接种后的5至8天进行，以避免其预期的细胞死亡。

WASp的细胞激活与抑制

收集 iMicro 细胞，并以 90,000 个细胞/孔的密度接种于 8 孔 Matrigel® 包被的 IBIDI 培养板（µ-Slide 8 Well，IBIDI，货号：80826）中，进行延时分析。用两种不同的炎症刺激物刺激细胞：1 μg/ml（储备液 1 mg/ml）来自大肠杆菌的脂多糖（LPS，SigmaAldrich，货号：L2630），或 10 ng/ml 的肿瘤坏死因子-α（TNF-α，Biolegend，货号 570104）加 (1 beta) 白介素-1β（IL-1β，Peprotech，货号：200-01B），刺激时长为 18-24 小时。随后，用两种 WASp 功能抑制剂处理 iMicro 细胞：最终浓度为 5 μM（储备液 5 mg/ml）的维司他汀（Wiskostatin，MERCK，货号：E2270），以及浓度为 100 μM（储备液 10 mM）的 CK-666（Merck Life Science S.r.l，货号：442633-00-3）。两种抑制剂均用二甲基亚砜（DMSO）稀释，处理时长为 1 小时。共培养细胞每天用维司他汀（5 μM）、CK-666（100 μM）或溶剂对照（1% DMSO）处理 1 小时，连续处理 5 天。

共聚焦延时显微镜吞噬作用测定

使用尼康A1共聚焦扫描仪搭配40倍、数值孔径（NA）为0.75的物镜进行共聚焦显微镜成像，该过程由NIS-elements软件控制。在开始吞噬作用测定前，按照先前描述的方法对细胞进行激活，并使用WASp抑制剂处理。通过pHrodo™大肠杆菌偶联纳米颗粒（货号P35361，赛默飞世尔科技）的延时共聚焦成像，可显示活跃的吞噬作用。iMicro细胞使用活性细胞示踪剂CFSE（Vybrant™ CFDA SE细胞示踪剂试剂盒，赛默飞世尔科技，货号V12883）进行荧光标记，将该示踪剂按1:1000的比例稀释于磷酸盐缓冲液（PBS）中孵育30分钟。随后对细胞进行15分钟的基线成像，每5分钟拍摄一次，激发波长分别为488纳米（用于细胞示踪剂）和540纳米（用于消除pHrodo通道的背景噪声）。更换培养基为100微升荧光亮培养基（意大利生命科技公司，荧光亮™低糖无酚红DMEM，货号A1896701）后，向培养基中加入pHrodo纳米颗粒，继续对iMicro细胞进行3小时成像，每5分钟拍摄一次。

发射荧光变化的计算

我们采用自主开发的 ImageJ 算法，根据 iMicro（细胞示踪剂）发出的信号生成掩模。随后，我们使用该掩模，通过公式 $boldsymbol{ [frac{F-F_{0}}{F_{0}}] }$，以 $boldsymbol{Delta F/F}$ 为指标，计算出随时间变化的 pHrodo 信号相对基线的波动情况。

其中 F₀ 为在前 3 次基线采集内记录的平均荧光值，F 为在每个视野（FOV）的每个时间帧中测得的信号。分析在相同的焦平面上进行，在该焦平面上对细胞示踪剂（CFSE）和 pHrodo 信号进行了定位，确保测得的信号反映的是 pHrodo 的内化过程，而非其表面黏附现象。

细胞固定

iMicro 和共培养物分别在室温下用 4% 多聚甲醛固定 20 分钟和 30 分钟。用 PBS 洗涤 2 次后，细胞储存在 4℃ 的 PBS 中直至使用。

qPCR SYBR Green

从分化方案收集的人胎盘细胞（HPC）和诱导微胶质细胞（iMicro）中提取总RNA。使用PureLink RNA迷你试剂盒（赛默飞世尔科技公司）按照制造商的说明提取RNA。取130纳克总RNA样品，用脱氧核糖核酸酶（应用生物系统公司）处理，并用Multi-Scribe逆转录酶（赛默飞世尔科技公司）和随机六聚体引物进行逆转录。采用Power SYBR Green试剂，按照制造商的说明（应用生物系统公司）进行实时逆转录聚合酶链式反应。以肌动蛋白和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GADPH）作为持家基因。采用ΔΔCt法测定相对基因表达量。数据以相对于人胎盘细胞（HPC）的倍数变化表示，具体标识为(log _{2})。

引物被设计为跨越外显子连接点，以仅扩增来自剪接RNA的cDNA，这是基于GenBank®数据库，使用免费可用的PRIMER-3软件（https://primer3.ut.ee/）设计的。基因和引物序列列于表1中。

表1. 为所检测的每个基因设计的引物，包括参考序列。

引物设计

为了对iMicro进行表征，我们选取了多个转录组学标志物进行鉴定，部分标志物是基于其预期特性筛选的，其余则用于与具有相似谱系的重要脑驻留细胞相区分。我们分析了CD68、HEXB、P2RY12、SALL1、WAS和WASL的基因表达情况。引物通过多种免费在线工具设计而成。我们通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站上的GenBank®核苷酸搜索引擎获取了目标基因的mRNA序列。该引物所采用的设计工具为Primer3，我们将mRNA序列复制并输入至该引物设计工具中。我们确定了外显子与外显子的边界，确保最终的扩增子包含这一区域，从而提高引物对mRNA相较于总RNA的选择性。为设计出高质量的引物，我们设定了以下参数：引物长度最小值为18、最大值为27，解链温度最小值为59、最大值为61，扩增子长度范围为80-110。随后生成引物并复制至现有文档中，以进行质量检测。这一过程需借助NCBI的Primer-BLAST工具完成，我们将产物长度的最大值设为500、最小值设为70，选用的数据库为Refseq RNA（refseq_rna），并根据需求选定物种，本实验中为智人（Homo Sapiens）。生成的结果会告知我们引物是否与其他基因存在交叉反应，以及自身互补性等其他关键指标。

F-肌动蛋白与WASp的免疫荧光检测

按照之前描述的方法对固定细胞进行免疫荧光实验。将细胞置于含5%正常山羊血清（NGS）和0.3% Triton-X 100的0.01M磷酸盐缓冲液（PBS）中，室温（RT）透化处理1小时。使用含5%正常山羊血清的0.01M PBS封闭非特异性结合位点15分钟。将抗WASp一抗按表2所示稀释比例，加入含1%正常山羊血清和0.1% Triton-X 100的0.01M PBS中，4℃孵育过夜。次日，将细胞与按表2所示稀释比例的二抗在含1%正常山羊血清的0.01M PBS中室温孵育1小时。随后，用含1%牛血清白蛋白（BSA，Sigma-Aldrich，货号：SLBX7447）的0.01M PBS洗涤细胞30分钟，再按表2所示方法，将细胞与荧光素标记的抗鬼笔环肽抗体在含1%牛血清白蛋白的0.01M PBS中孵育20分钟。对细胞核进行染色在含1微克/毫升Hoechst 33342的磷酸盐缓冲液中孵育10分钟。IBIDI培养板置于4℃环境保存，直至成像。

表2. 免疫荧光实验方案中使用的抗体

神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞共培养的免疫荧光实验

透化处理采用含3%牛血清白蛋白（BSA）、0.4% Triton-X 100的0.01M磷酸盐缓冲液（PBS），在室温（RT）下处理1小时。共培养物与一抗以及荧光偶联抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体（荧光偶联物488）在封闭液（含3% BSA、0.2% Triton-X 100的0.01M PBS）中于4℃孵育过夜，一抗和荧光偶联抗GFAP抗体的稀释比例见表3。使用不同激发波长的Alexa Fluor™二抗，稀释比例见表3，稀释于含3% BSA的0.01M PBS中，在室温下孵育2小时。细胞核用1微克/毫升的Hoechst 33342（Invitrogen公司，生命科技公司）染色。共培养物被固定在载玻片上延长金固定（意大利生命技术公司），并使用尼康 A1 或 Evident FV500 共聚焦显微镜拍摄图像。

表3. 免疫荧光实验方案中使用的抗体

利用CRISPR-Cas9技术构建WAS基因敲除的人诱导多能干细胞系

敲除（KO）人诱导多能干细胞（hiPSC）系是作为突变型WAS基因构建过程的副产物获得的。简要来说，我们参考了Patel等人描述的方案，通过仙台病毒介导的重编程，将CRISPR-Cas9系统递送至源自健康男性供体的FA0000010人诱导多能干细胞中，并向其WAS基因中引入(c. 256 C>T)（p.Arg86Cys）突变——该突变在WAS患者中较为常见。我们基于预测的高靶向活性和低脱靶风险设计了三条候选单导向RNA（sgRNA）。通过聚合酶链式反应（PCR）和桑格测序对靶向区域进行验证，确定FP1-RP1为最佳引物组合。通过电转染Cas9/单导向RNA核糖核蛋白（RNP）复合物，并利用Synthego公司的在线工具ICE分析编辑结果，以此评估单导向RNA的效率；其中单导向RNA2显示出最高的插入缺失和敲除评分，因此被选定使用。

使用包含R86C突变和沉默的PAM破坏替换的ssODN供体模板进行敲入。将Cas9（IDT）、sgRNA2（Synthego）和ssODN（IDT）通过电穿孔（Lonza 4D-Nucleofector）导入人诱导多能干细胞（hiPSCs）。对混合细胞的ICE分析显示，插入缺失率为84%，敲入效率为77%。对编辑后的细胞进行克隆扩增和基因分型；筛选出导致WAS基因敲除的人诱导多能干细胞（WAS KO hiPSCs）的移码突变克隆。确认细胞系无支原体污染且核型正常。通过免疫荧光染色检测干细胞特性，使用的标志物包括SOX2（兔源，Cell Signaling Technology；1:100）、OCT4（鼠源，Alexa Fluor 488偶联，Cell Signaling Technology；1:50）和NANOG（兔源，Cell Signaling Technology；1:400）。使用Imaris软件分析共聚焦图像。细胞核被通过生成最大直径为8微米、表面粗糙度为2微米的等值面进行分割。使用估计直径为9微米的区域生长算法对细胞分割进行优化。对每个细胞核内各标志物的平均荧光强度进行定量分析。最后，通过免疫染色检测胚层特异性标志物来评估编辑后的人诱导多能干细胞（hiPSCs）的多系分化潜能，其中包括作为外胚层标志物的OTX2（山羊来源，R&D Systems公司；稀释比例1:20）、作为中胚层标志物的Brachyury（山羊来源，R&D Systems公司；稀释比例1:20），以及作为内胚层标志物的SOX17（R&D Systems公司；稀释比例1:10）。

数字图像分析

按照之前发表的研究，通过灰度共生矩阵（GLCM）分析了F-肌动蛋白和WASP阳性像素的分布。简要来说，为进行灰度共生矩阵（GLCM）分析，图像被转换为8位格式。在背景归一化后，绘制包含细胞的感兴趣区域（ROI），并使用ImageJ插件“GLCM分析”（步长=1像素，步方向=0度）完成灰度共生矩阵分析。

为分析细胞运动性，我们使用了Imaris软件的“追踪”功能。选定平均细胞直径为1.5微米后，我们计算了细胞在吞噬作用实验第一小时内的运动路径。细胞的运动性以总覆盖距离（位移，微米）和平均速度来表示，对应标识符为(nm cdot sec^{-1}))。

使用Imaris软件对共培养体系中星形胶质细胞（GFAP）、突触（突触素）和小胶质细胞（Iba1）的荧光信号进行定量分析。我们为每个信号构建等值面，将适配目标结构的物体最大直径设为1微米（针对GFAP和Iba1）或0.6微米（针对突触素）。借此我们得以计算突触数量以及GFAP或Iba1阳性结构所占据的体积。为获取代表性图像，我们对各个通道及其对应的等值面进行了快照拍摄。

采用专用的 ImageJ 插件进行肖尔分析。简要而言，通过奥林巴斯 CellR 宽场荧光显微镜获取了尺寸为 2370×1800×10 微米的大视野显微照片，检测到细胞核（DAPI）和神经元（MAP2）的信号。使用大津自动阈值法进行图像分割后，在整张大图像中随机选取 25 个 MAP2 阳性细胞，并确定其胞体质心。对每个选定的神经元，在距质心 20 至 200 微米的范围内进行肖尔分析，同心环域间的步长为 3 微米。

使用尼康A1共聚焦显微镜拍摄了经鬼笔环肽和WASp染色的iMicro显微照片，该显微镜由NIS Elements软件控制，配备100倍物镜，数值孔径1.49，油浸折射率1.515，体素尺寸124×124×360纳米，图像尺寸1024×1024×29像素。使用Evident公司的FV5000共聚焦显微镜拍摄了经PSD95和突触素染色的突触显微照片，该显微镜由Cell Sense软件控制，配备60倍物镜，数值孔径1.42，油浸折射率1.518，体素尺寸51.79×51.79×400纳米，图像尺寸2048×2048×7像素，2倍放大。我们使用Deconwolf软件[33]，对每个通道进行20次迭代，对共聚焦显微照片进行去卷积处理。随后使用ImageJ软件对去卷积后的图像进行处理，得到合并后的显微照片并绘制信号直方图。

体内实验

斑马鱼品系

斑马鱼（斑马拟丽鱼）按照国际（欧盟指令 2010/63/EU）和国家（2014 年 3 月 4 日第 26 号意大利法令）指导原则，饲养于米兰大学生物科学系。实验使用了 Tg(3.1:neurog1:GFP)[34] 和 Tg(mpeg1:Gal4;UAS:lyn-tagRFP-T)[35,36] 斑马鱼品系。胚胎按照 Kimmel 等人（1995 年） 的方法进行分期，并依据成熟技术，在 28℃ 的培养皿中于养鱼水（0.01% Instant Ocean、0.01% 碳酸氢钠、0.019% 硫酸钙、0.1% 亚甲蓝）中饲养。胚胎阶段以受精后小时数（hpf）和受精后天数（dpf）表示。必要时，在养鱼水中添加 0.003% 1-苯基-2-硫脲（PTU，Sigma-Aldrich 公司）以抑制色素沉着。为进行成像实验，胚胎在 4℃ 下用含 4% 多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）固定过夜，随后通过甲醇梯度脱水。

斑马鱼胚胎的药物处理

2 dpf 的斑马鱼胚胎经手动脱膜后，在 6 孔板中每孔 20 枚胚胎，用 50 微摩尔浓度的 CK-666 处理 1 夜。CK-666 溶于二甲基亚砜（DMSO）后加入养鱼水中，二甲基亚砜（DMSO）作为阴性对照对照组。过夜处理后，将含药的水更换为新鲜水。

心率评估

通过光学观察法测定了斑马鱼胚胎在2天和3天龄（dpf）时的心跳频率。人工计数心跳次数，将每15秒的心跳数乘以4，得出每分钟心跳数（bpm）。为最大程度减少环境温度对斑马鱼胚胎心率的影响，每次从28摄氏度的培养箱中取出5枚胚胎进行心跳评估。

触碰诱发反应测定

在受精后3天进行触觉诱发反应测定。将胚胎单独放置在直径35毫米的培养皿中，使用微量加样器尖端触碰每个胚胎的尾部以诱发反应。触碰操作重复进行，直至胚胎产生反应或最多触碰10次。1-2次触碰后产生反应被视为野生型反应，3-4次触碰后产生反应则表明存在轻度反应障碍。超过4次触碰后产生反应或无反应均被视为严重反应障碍。

TUNEL染色

每个实验组对5条随机选取的3天龄Tg(3.1neurog1:GFP;

mpeg1:Gal4;UAS:lyn-tagRFP-T)斑马鱼胚胎进行TUNEL染色。固定后的胚胎复水后进行TUNEL染色实验采用赛默飞世尔科技的 Click-iT™ Plus TUNEL 检测试剂盒（Alexa Fluor 647 标记），按照制造商说明书操作进行。随后将斑马鱼胚胎包埋在含 1% 低熔点琼脂糖的磷酸盐缓冲液（PBS）中。使用激光扫描共聚焦显微镜（Evident FV5000），搭配 20 倍物镜并以 2 倍变焦，采集尺寸为 320×320×80 微米、像素分辨率 0.31 微米/像素、步长 0.89 微米的图像；其中绿色荧光蛋白（GFP）激发波长为 488 纳米，红色荧光蛋白（RFP）为 561 纳米，TUNEL 标记为 640 纳米。 利用 Imaris 软件（Bitplane 公司）的斑点检测功能对 TUNEL 阳性凋亡小体进行定量分析，设定目标物体预期直径为 10 微米。分析时纳入位于 GFP 衍生等值面（平滑度固定为 2 微米，目标物体尺寸 20 微米）内部的斑点。此外，以 1 微米的平滑因子和 5 微米的目标物体尺寸生成 RFP 等值面。通过计算 RFP 等值面内 TUNEL 积分密度与 GFP 等值面内 TUNEL 积分密度的比值，评估 RFP 阳性小胶质细胞/巨噬细胞对 TUNEL 阳性物质的吞噬情况。

小胶质细胞的定量分析

使用配备 ORCA-spark 数码相机（滨松光子学）和 HCImage 成像软件（滨松光子学）的奥林巴斯 SZX16 体视显微镜（日本东京奥林巴斯），以 540 纳米的激发波长，拍摄了受精后 3 天和 5 天胚胎的数字荧光图像。在进行实验步骤前，用 0.016% 的三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，西格玛-奥德里奇）对胚胎进行麻醉。在对应斑马鱼视顶盖的区域。后一区域是根据斑马鱼中脑图谱通过视觉识别并绘制的（https://zebrafishucl.org/midbrain）。

斑马鱼的延时成像

在2天龄（2 dpf）的Tg(-3.1neurog1:GFP;mpeg1:Gal4;UAS:lyn-tagRFP-T)斑马鱼中，将其置于含0.016%三卡因的鱼水中的1%低熔点琼脂糖中固定，在延时共聚焦成像过程中于28℃孵育过夜，以评估mpeg1-RFP阳性细胞的运动性。使用配备横川W1-SoRa转盘式共聚焦显微镜（尼康）的ECLIPSE Ti2-E显微镜，获取包含斑马鱼头部、尺寸为400×442×166微米（像素大小0.65微米）的显微照片，成像时长16小时，时间间隔为15分钟。利用Imaris软件（Bitplane）处理延时图像，通过斑点检测功能识别mpeg1-RFP阳性细胞，设置参数如下：预估直径20微米、最大距离100微米、最大间隙4、最小追踪时长2000秒。每个实验组均开展三次独立实验，每次实验使用来自不同批次的三枚斑马鱼胚胎。数据以初始位置与最终位置之间的距离（位移，微米）和单个小胶质细胞的平均速度（微米·(sec ^{-1})）表示。

统计学分析

数据以至少两次独立实验的平均值±标准差表示。统计分析采用GraphPad Prism软件（美国加利福尼亚州圣地亚哥，9.2版）进行。我们实施了非参数t检验和单因素采用单因素方差分析，随后进行图基检验；或采用经韦尔奇校正的单因素方差分析，随后进行邓尼特T3检验，以比较两组或多组之间的差异。在通过巴特利特检验验证方差不齐质性后，应用韦尔奇校正。