题目：Dynamic S-acylation controls CMG2 maturation extracellular matrix regulation and anthrax toxin susceptibility in vivo

原文链接：https://www.nature.com/ncomms

期刊：Nature Communications

摘要

CMG2/ANTXR2 作为 VI 型胶原蛋白受体，是细胞外基质稳态维持所必需的，同时也是炭疽毒素进入细胞的主要门户。CMG2 基因突变会导致透明纤维瘤病综合征（HFS），这是一种罕见且通常致命的遗传性疾病，其特征是细胞外基质过度积聚，但调控 CMG2 功能的分子机制仍知之甚少。我们发现 CMG2 受有序周期的调控S-酰化与去酰化过程调控其折叠、运输和信号传导能力。ZDHHC7 在两个近膜半胱氨酸上进行的S-酰化作用，通过稳定折叠中间体保护CMG2免受内质网相关降解，使具备内质网出芽能力的折叠型受体数量增加约5倍。在高尔基体中，ZDHHC3介导的第三个半胱氨酸酰化作用促进Arf6介导的CMG2向质膜转运，CMG2在此处发挥其功能。配体结合会触发硫酯酶APT2的募集，使CMG2从肌动蛋白细胞骨架上释放并发生内吞作用，将细胞外识别与细胞内信号传导及摄取关联起来。抑制APT2可减少VI型胶原的更新，并在斑马鱼模型中显著减弱炭疽毒素的毒性，这表明脂质化循环是受体功能的调控因子且可作为潜在治疗靶点。

关键词：CMG2、S-酰化；炭疽毒素；LYPLA2/APT2；ZDHHC 酶；透明纤维瘤病综合征、GAPO 综合征、棕榈酰化

引言

毛细血管形态发生基因2（CMG2/ANTXR2）是一种广泛表达的I型膜蛋白，在细胞外基质（ECM）稳态中发挥核心作用^{1–4}。CMG2的功能丧失性突变会导致透明纤维瘤病综合征（HFS），这是一种以VI型胶原蛋白（COL6）及其他细胞外基质成分过度蓄积为特征的严重遗传病^{4–7}。CMG2还是炭疽毒素的主要哺乳动物受体^{8}。尽管CMG2在生理过程和感染过程中均具有核心作用，但其生物发生和信号传导的分子调控机制仍知之甚少。我们此前的研究发现，CMG2及其旁系同源物TEM8（ANTXR1，同样是炭疽毒素受体^{9}，且与遗传病GAPO综合征相关^{10}）会发生S-酰化且这是炭疽毒素有效内吞所必需的11。S-酰化是指中链脂肪酸（通常为棕榈酸）通过硫酯键与胞质半胱氨酸残基共价结合的过程12-14。该过程由跨膜ZDHHC家族酰基转移酶催化，并由APT1/LYPLA1、APT2/LYPLA2以及ABHD17家族成员等胞质酰基蛋白硫酯酶逆转13-15。这种动态修饰可调控蛋白质构象、亚细胞运输、蛋白-蛋白相互作用、蛋白更新及功能16。尽管S-酰化会延缓炭疽毒素的内吞作用11，但CMG2酰化的分子效应、其动态变化以及所涉及的酶类仍未明确。

CMG2 带有信号序列被合成，这使其共翻译插入内质网（ER）膜¹⁷。在内质网中，它在聚糖结合分子伴侣的协助下完成折叠¹⁷。然而，CMG2 胞外域¹⁸（图1a）的折叠效率较低，这降低了其对错义突变的耐受性¹⁹。多种 HFS 错义突变会损害 CMG2 的折叠，导致其通过内质网相关降解（ERAD）途径被降解，进而引发依赖蛋白丢失的功能丧失³¹⁹²⁰。不过，目前人们对 CMG2 折叠效率在生物发生过程中的调控机制仍知之甚少。

折叠后，CMG2 从内质网（ER）中输出，通过高尔基体转运至质膜¹⁹。在细胞表面，未结合配体的 CMG2 通过与含塔林-纽蛋白-肌动蛋白（TVA）的复合物相互作用，与细胞骨架结合²¹。当配体（如炭疽毒素或Ⅵ型胶原蛋白⁴）结合到 CMG2 的胞外域时，这种 TVA 相互作用会被释放，使其胞质域随后能够与为 CMG2 信号传导和内吞作用募集的蛋白质结合，例如 RhoA、β-抑制蛋白和 Cbl¹¹²¹²²。这一转变对于毒素摄取和 CMG2 介导的Ⅵ型胶原蛋白内吞均至关重要²¹，但 S-酰化是否以及如何参与这一信号转换尚未得到阐明。

本研究表明，CMG2的功能由时间有序的S-酰化-去酰化循环调控，该循环协同受体的成熟、转运与信号传导。研究发现不同的酰基转移酶和硫酯酶分别在CMG2生命周期的连续阶段发挥作用，将脂质修饰与内质网质量控制、分泌转运及配体诱导的受体激活联系起来。本研究结果揭示，可逆性脂质化可调节CMG2的丰度，控制其发生配体诱导构象转换的能力，并调控下游内吞信号传导。与这一调控作用相符的是，对去酰化过程的遗传或药理学调控可改变细胞外基质的更新，并在体内影响机体对炭疽毒素的易感性。这些结果证实，动态的S-酰化是CMG2生物学功能的核心调控因子，并表明去酰化酶可作为肥厚型心肌病和炭疽中毒中潜在的治疗靶点。

结果

CMG2 对其三个胞质半胱氨酸进行连续的S-酰化

据报道，CMG2 及其旁系同源物 TEM8 会发生 S-酰化修饰¹¹（图1a）。我们通过 [³H]-棕榈酸代谢标记法在培养细胞中验证了这一发现，并利用 Acyl-RAC 检测法在小鼠组织中进行了验证——该方法可从细胞提取物中捕获 S-酰化蛋白（图1b、c）。

CMG2 亚型4包含三个胞质半胱氨酸（半胱氨酸344、半胱氨酸345和半胱氨酸479；图1a）。我们构建了一组单、双和三半胱氨酸突变为丙氨酸的突变体，其中野生型（WT）对应CCC型，三突变体C344A-C345A-C479A记为AAA型。ACC、AAC和AAA型突变体的表达水平略有降低（扩展图1a）。三个半胱氨酸全部缺失会消除[³H]-棕榈酸酯的掺入（图1d、扩展图1b）。在双突变体中，AAC变体（其中半胱氨酸344和半胱氨酸345发生突变）表现出最强的降低程度，但其较低的表达水平仅能部分解释这一现象，这表明 Cys344 和 345 的 S-酰化可能促进最远端半胱氨酸的修饰。动力学标记实验表明，CMG2 有效的 S-酰化需要从跨膜结构域到 C 端胞质尾的半胱氨酸依次进行修饰（图 1e）。

接下来我们利用聚乙二醇化（PEGylation）评估了位点占有率，在此过程中羟胺会裂解硫酯键，从而可用5千道尔顿的马来酰亚胺聚乙二醇（PEG-maleimide）对游离的半胱氨酸进行标记。由于CMG2在两个天冬酰胺残基上发生糖基化，其在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中会以弥散条带的形式迁移¹⁷，这使得聚乙二醇化引发的迁移率变化难以解读。因此，我们在进行SDS-PAGE前，用N-糖基化酶F处理了所有样品以去除N-连接糖链。AAA突变体在聚乙二醇化后未出现条带迁移，表明了该检测方法的特异性（图1f）。对于AAC突变体，除未迁移的条带外，还可观察到一条轻微迁移的条带，这表明部分CMG2分子在Cys479位点发生了酰化修饰（图1f）。对于CCA突变体，初始的未迁移条带基本消失，说明全部CCA型CMG2分子都发生了酰化修饰，且观察到两条迁移条带，其中上方的主要条带对应双酰化的CCA型CMG2（图1f）。ACC突变体呈现出相似的条带模式，但条带强度显著降低，这表明半胱氨酸虽可发生酰化修饰，但仅在ACC型CMG2群体中少数分子上发生。最后，野生型（WT）蛋白的条带模式与CCA型相似，但其上方条带的迁移位置略高于CCA型的上方条带，这与三个半胱氨酸均发生S-酰化修饰的结果一致（图1f）。

综合来看，这项分析表明CMG2的S-酰化反应是依次进行的，首先发生在两个膜近端半胱氨酸上，这一修饰过程会促进距离最远的半胱氨酸发生修饰。在稳定状态下，所有野生型CMG2蛋白都发生了S-酰化，且主要是三个半胱氨酸均被修饰。

图1：CMG2 在半胱氨酸-344、半胱氨酸-345 和半胱氨酸-479 位点发生 S-棕榈酰化修饰。a.CMG2 结构域组织的带状图。由冯·维勒布兰德 A 型（vWA）和免疫球蛋白样（Ig-like）结构组成的胞外区域基于 2.6 埃分辨率的冷冻电镜结构 (2.6 AA)（EMD-54238）¹⁸绘制。跨膜螺旋和胞内结构域通过 AlphaFold³ 预测。跨膜结构域（TMD）的位置通过 PPM3.0 网络服务器预测。为给膜留出空间，对胞内螺旋进行了手动调整。三个胞内CMG2 异构体4尾部存在的半胱氨酸已标注。b. RPE1 细胞或原代人成纤维细胞在 37 °C 下用 ([^{3} H]) - 棕榈酸进行 2 小时代谢标记。对 CMG2 进行免疫沉淀，部分样品用羟胺（((+NH_{2} OH))）处理以切割硫酯连接的酰基链。通过 SDS-PAGE 分离蛋白质，并通过放射自显影（³H-棕榈）和抗 CMG2 免疫印迹进行分析。c. 采用 Acyl-RAC 技术分析小鼠器官中的 CMG2。将等体积的上样液（Inp.）和 Acyl-RAC 洗脱液（((+NH_{2} OH))）通过 4–20% SDS-PAGE 分离。使用抗小鼠 CMG2（大鼠单克隆 8F7）或抗 TRAPα（作为对照）进行免疫印迹。加入 RPE1 细胞的核后上清液（PNS）作为 CMG2 和 TRAPα 条带的阳性对照。d. 用野生型（WT）和突变体 CMG2-V5 转染 HeLa 细胞 24 小时。AAA 代表三个半胱氨酸突变为丙氨酸，CCC=野生型（所有半胱氨酸均保留），其他突变体为不同的半胱氨酸突变体。细胞在 37 °C 下用 [³H]-棕榈酸标记 2 小时，对 CMG2-V5 进行免疫沉淀。分别采用放射自显影和抗 V5 免疫印迹检测酰化的 CMG2 和总 CMG2。e. 表达野生型或半胱氨酸突变体的 HeLa 细胞在 37 °C 下用 [³H]-棕榈酸标记不同时间。对 CMG2-V5 进行免疫沉淀，并按（d）中的方法分析。将 1 小时时的 ³H-棕榈酸掺入量设为 100%，各时间点数值均相对于该值表示（(n=3) 对应包含所有时间点的 3 组完整动力学实验，均值±标准差）。f. 用 CMG2-V5 野生型、AAA、AAC、ACC 或 CCA 转染 HeLa 细胞 24 小时，进行酰基-PEG 交换处理。所有裂解液均经 N-糖苷酶 F 处理 16 小时，随后经羟胺处理后，通过 SDS-PAGE 和蛋白质印迹（WB）检测 CMG2-V5、质量标签蛋白（+PEG）和对照蛋白（-PEG）。

CMG2 经 ZDHHC7 和 ZDHHC3 依次进行 S-酰化修饰

为了确定负责CMG2修饰的酰基转移酶，我们针对人类全部23种ZDHHC酶开展了siRNA筛选，并将其分为六个池。仅M1池导致CMG2 S-酰化水平降低（图2a、补充图2a）。对该池内的酶进行单独敲低后发现，ZDHHC7和ZDHHC3介导了CMG2的S-酰化（图2b、补充图2b-c）。用对应的酰基转移酶对ZDHHC3或ZDHHC3沉默的细胞进行重新互补，可恢复其S-酰化水平（补充图2d）。这两种酶还能对TEM8蛋白11位的4个半胱氨酸进行S-酰化（补充图2e-f）。

我们接下来探究了这两种酶是否作用于不同的半胱氨酸，且可能在不同的细胞内区室发挥作用。ZDHHC7定位于早期分泌途径（内质网和高尔基体），ZDHHC3则定位于高尔基体[23]。为探究CMG2新合成时是否在内质网发生S-酰化，我们用环己酰亚胺抑制了蛋白质合成。我们通过沉默ZDHHC3来监测ZDHHC7介导的S-酰化，反之，通过沉默ZDHHC7来监测ZDHHC3介导的S-酰化。ZDHHC7介导的S-酰化基本被环己酰亚胺（CHX）消除（图2c），这表明ZDHHC7主要对新合成的蛋白质进行修饰。相比之下，ZDHHC3介导的S-酰化不受环己酰亚胺的影响（图2c），这与ZDHHC3在高尔基体中对药物处理前合成的CMG2分子起作用的结果一致。接下来，我们测试了布雷菲德菌素A对高尔基体的破坏作用，观察到了相反的现象：ZDHHC7介导的S-酰化不受布雷菲德菌素A的影响，而ZDHHC3介导的S-酰化基本被消除（图2d）。最后，我们测试了CCA突变（即仅C479A突变）是否能模拟ZDHHC3沉默的表型。环己酰亚胺处理显著降低了CCA的S-酰化水平，而布雷菲德菌素A处理无效果（图2e）。因此，CMG2 经历连续的S-酰化，首先在内质网中由 ZDHHC7 对 Cys344 和 Cys345 进行修饰，随后在高尔基体中由 ZDHHC3 对 Cys479 进行修饰（图2f）。

图2：CMG2 的 S-棕榈酰化由 ZDHHC3 和 ZDHHC7 介导。a、b. 用针对人类 ZDHHC 酶的混合/组合（a，组合的组成见方法部分）或单独（b）的小干扰 RNA（siRNA），或非靶向对照 siRNA 沉默 RPE1 细胞。将细胞在 37 °C 下用 [³H]-棕榈酸进行 2 小时代谢标记，免疫沉淀 CMG2，样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS–PAGE）后，通过放射自显影和抗 CMG2 免疫印迹分析。利用 Typhoon 成像对 [³H]-棕榈酸酯的掺入量进行定量，并以 (control =100 %) 为参照进行标准化（a：(n=3)；b：(n=4)；平均值±标准差）。通过双因素方差分析（two-way ANOVA）计算 p 值，****：近似 (p<0.0001)，***：(p<0.001)。c、d. 用 siZDHHC3、siZDHHC7 或对照 siRNA 沉默 RPE1 细胞，随后用环己酰亚胺（CHX）或布雷菲德菌素 A（BrefA）预处理或不预处理 1 小时，并在代谢标记期间在相同条件下维持培养。将细胞在 37 °C 下用 [³H]-棕榈酸酯标记 2 小时，免疫沉淀 CMG2，样品经 SDS–PAGE、放射自显影（³H-棕榈酰）和抗 CMG2 免疫印迹分析。利用 Typhoon 成像对放射性标记的掺入量进行定量，并以对照 (siRNA/untreated =100 %) 为参照进行标准化（(n=4)；平均值±标准差）。通过双因素方差分析计算 p 值，****：近似 (p<0.0001)。（e）用野生型（WT）或 CCA 型 CMG2-V5 转染 HeLa 细胞，随后如 c、d 所述用环己酰亚胺或布雷菲德菌素 A 预处理，并用 ([^{3} H])-棕榈酸酯处理。使用抗 V5 抗体免疫沉淀 CMG2。定量方法如 c、d 所述（(n=4)；平均值±标准差）。通过双因素方差分析计算 p 值，****：近似 (p<0.0001.)。f. CMG2 的连续 S-酰化过程为：首先在内质网（ER）中由 ZDHHC7 对 Cys344/345 进行酰化修饰，随后在高尔基体（Golgi）中由 ZDHHC3 对 Cys479 进行修饰。使用 BioRender 制作。Abrami, L. (2026) https://BioRender.com/sx07sq9

S-酰化-去酰化调控内质网中CMG2的成熟

由于CMG2在合成过程中或合成后不久发生S-酰化修饰，我们探究了该修饰是否会影响其生物发生，进而影响从内质网（ER）中输出的完全折叠蛋白的量。我们采用([^{35} ~S]) -半胱氨酸/甲硫氨酸脉冲追踪标记法，通过20分钟的短脉冲来重点研究新合成的分子。内源性（对照组）和异位表达的野生型（WT）CMG2 的半衰期（t₁/₂）均约为 6.5 小时并异位表达的（野生型）蛋白（图3a、补充图3ab）。用MG132抑制蛋白酶体会增强(t=0)处的信号，并显著延缓和减弱降解，这表明在未处理的细胞中，新合成的CMG2大部分在最初5-6小时（成熟阶段，图3a）通过内质网相关降解（ERAD）被降解，这与野生型囊性纤维化跨膜调控因子（CFTR）²⁴及其最常见的ΔF508疾病突变体²⁵,²⁶的行为相似。当我们对AAA三重突变体进行类似实验时，新合成蛋白的降解显著加速（((t_{1} / 2 ≈1.2 ~h))处信号变化更明显，脉冲期间降解已十分显著，图3a、补充图3ab）。沉默ZDHHC7和ZDHHC3完全重现了突变三个半胱氨酸的效果（补充图3ab）。仅突变Cys344或Cys345时，也观察到代谢脉冲后降解加速（图3b，已归一化至(t=0)以方便动力学比较），这与这些残基在内质网中发生S-酰化并保护折叠中间体免受ERAD降解的结论一致。野生型与AAA型CMG2在(t=0)处的([^{35} ~S])-半胱氨酸/甲硫氨酸信号差异表明，部分野生型分子在20分钟脉冲期内发生了S-酰化。然而该池的S-酰化新合成的CMG2分子的过程可能需要超过20分钟。为验证这一点，我们对比了20分钟和2小时的([^{35} ~S]) -Cys/Met标记时长的效果。延长脉冲周期会导致新合成的野生型（WT）CMG2库的降解明显减少并出现延迟（图3c）。当敲低ZDHHC7和ZDHHC3后，脉冲时长的影响便消失了（图3c），这证实了更长脉冲时长下观察到的降解减少，反映的是稳定分子的富集，而非降解动力学的改变。对于另外两种在内质网中发生S-酰化的S-跨膜蛋白——钙联蛋白（calnexin）和LRP6，我们也得到了类似的观察结果，且二者的衰变动力学均受到([^{35} ~S]) -Cys/Met标记时间的显著影响[27,28]。为支持S-酰化在生物发生过程中的重要性，我们在原代人成纤维细胞中敲低ZDHHC7和ZDHHC3后，发现CMG2蛋白的总水平显著降低（图3d）。

图 3 ：ZDHHC3 与 ZDHHC7 调控 CMG2 的生物合成过程。a–c. 分别转染野生型或突变型 CMG2 的 HeLa 细胞（a、b）、单独转染各 ZDHHC 小干扰 RNA 进行基因沉默的 RPE1 细胞（c），采用 [³⁵S]- 甲硫氨酸进行 20 分钟脉冲标记，部分组别同时加入蛋白酶体抑制剂 MG132（a 图），随后按指定时间进行追踪孵育。对 CMG2 蛋白进行免疫沉淀，经十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS–PAGE）分离后，通过放射自显影与抗 CMG2 免疫印迹检测蛋白。利用 Typhoon 成像系统定量放射标记信号：a、c 组以未处理野生型 / 对照组信号值为 100% 进行归一化；b 组以各组 0 时刻信号值为基准归一化（所有实验均设置 3 组生物学重复，数值以平均值 ± 标准差表示）。b 图中，AAA、ACC、CAC、CAA 突变体在所有追踪时间点均与野生型存在统计学差异（p < 0.05）；CCA 突变体在全部时间点与 AAA 突变体差异显著，且在 5 小时及之后的时间点与野生型存在统计学差异。 d. 采用指定小干扰 RNA 处理原代成纤维细胞并沉默基因 72 小时，提取 40 μg 细胞总蛋白进行免疫印迹检测内源性 CMG2 表达，微管蛋白（Tubulin）作为上样对照（设置 4 组重复，数值以平均值 ± 标准误表示）。采用双因素方差分析计算 p 值，代表近似 p<0.0001。 e. 转染 CMG2-V5 质粒的 HeLa 细胞用 [³H]- 棕榈酸标记 2 小时，随后按设定时长追踪孵育。免疫沉淀 CMG2，通过放射自显影与免疫印迹完成检测。 f. HeLa 细胞转染或不转染 APT2 小干扰 RNA 进行基因沉默，后续处理流程同 e。将追踪孵育后的 [³H]- 棕榈酸信号以脉冲标记时点信号值归一化（3 组重复，平均值 ± 标准差）。 g. RPE1 细胞分别用棕榈抑素 B（Palmostatin B）、ML348、ML349 或 ABD957 处理，随后按 e 组方法进行 [³H]- 棕榈酸标记，追踪孵育 5 小时。追踪后的放射性信号以脉冲标记时点数值归一化（4 组重复，平均值 ± 标准差）。双因素方差分析计算 p 值，代表近似 p<0.0001。 h、i. 抑制去酰化修饰对 CMG2 蛋白折叠的影响：h 组为 APT1/APT2 基因沉默的 RPE1 细胞；i 组为转染野生型或 L45P 突变 CMG2、同时 / 不添加棕榈抑素 B 的 HeLa 细胞。两组均使用 [³⁵S]- 甲硫氨酸脉冲标记 20 分钟后追踪孵育。免疫沉淀 CMG2 并定量，以对照组数值为 100% 进行换算（3 组重复，平均值 ± 标准差）。 j. 体内蛋白稳定实验：小鼠腹腔注射 ML349（给药剂量 40 毫克 / 千克，第 0、2、4、6、8 天给药），在指定时间点处死小鼠并收集各脏器，提取 40 μg 组织裂解液，免疫印迹检测内源性 CMG2；通过光密度定量分析 CMG2 蛋白表达水平。

内质网中APT2介导的去酰化使CMG2靶向至未成熟的内质网相关降解

由于S-酰化是可逆的，我们接下来研究了在内质网生物发生过程中，CMG2是否也会发生去酰化作用。为解决这一问题，我们首先评估了CMG2是否能够被去酰化。采用2小时脉冲标记的[³H]-棕榈酸酯脉冲追踪分析显示，CMG2的放射性标记缓慢且持续减少（图3e-f）。[³H]-棕榈酸酯信号的丢失可能由去酰化作用以及蛋白质降解导致。为确定去酰化作用的贡献度，我们检测了酰基蛋白硫酯酶抑制剂的作用。泛硫酯酶抑制剂Palmostatin B和APT2特异性抑制剂ML349，而非APT1抑制剂ML348或ABHD17抑制剂ABD957，可阻止追踪期间[³H]-棕榈酸酯的丢失（补充图3c、图3g）。动力学检测结果表明，APT2沉默确实显著延迟并减少了CMG2上[³H]-棕榈酸酯的丢失（图3f、补充图3d）。

为了更具体地确定在生物发生过程中，作为胞质表达酶的 APT2 是否能作用于 CMG2，我们再次开展了 ([^{35} ~S]) -Cys/Met 脉冲追踪实验。敲低 APT2 可保护新合成的 CMG2 免受 ERCD 降解，且在脉冲阶段即可观察到稳定现象（图3f）。当用棕榈司他丁 B 处理细胞时，该效应更为显著，其具体原因尚待阐明（补充图3e）；本次实验出于实用性考虑选用了该试剂，而非 APT2 抑制剂 ML349。值得注意的是，棕榈司他丁 B 不会影响 AAA 突变体的降解动力学，这表明所观察到的效应与野生型 CMG2 的 S-酰化相关（补充图3e）。

这些结果表明，在新合成的CMG2群体折叠过程中，APT2能够去除保护性的S-酰化修饰，从而促进这些分子提前靶向ERAD。从定量角度看，脉冲标记5小时后CMG2水平的对比显示，ZDHHC7/3沉默、APT2沉默与PalmB处理组之间存在约4至6倍的差异（p=0.001，图3c、h，扩展图3f），这凸显了S-酰化对CMG2折叠效率的重要作用。

该机制对影响折叠的透明样纤维瘤病综合征（HFS）错义突变具有重要意义3,19,20。我们此前的研究表明，这些定位于细胞外血管性血友病因子A结构域的突变中有多种在大肠杆菌中表达时能正确折叠19，这表明在人类细胞中，是较慢的折叠动力学——而非内在的无法正确折叠——这会触发 ERAD 的识别机制。我们目前的研究结果表明，抑制去酰化作用以保护折叠中间体免受 ERAD 靶向，应能提高成功折叠的受体数量。我们针对 L45P HFS 突变验证了这一假设19。事实上，棕榈酰他汀B阻止了CMG2 L45P的过早降解，并使CMG2的水平升高，达到了与野生型（WT）CMG2相似的水平（图3i）。

由于L45P通过内质网质量控制机制的识别而滞留在内质网中，这些观察结果表明CMG2的去酰化可在内质网的胞质表面发生。为检测APT2能否在该区域接触CMG2，我们免疫沉淀了内质网滞留的L45P突变体，并评估其与APT2的相互作用。我们观察到L45P CMG2与APT2之间存在强烈的共免疫沉淀反应（扩展图3g）。我们将这一分析扩展至另外三种与遗传性高草酸尿症相关、会导致CMG2内质网滞留的突变（G105D、I189T和L349R），所有这些突变均与APT2存在相互作用（扩展图3g）。为进一步验证抑制APT2以提高CMG2蛋白水平的治疗潜力，我们通过腹腔注射APT2抑制剂ML349处理小鼠数天，在特定时间点处死动物，并收集多个器官进行分析。ML349处理使所有检测组织中CMG2的丰度呈时间依赖性增加，其中以结肠中的变化最为显著（图3j、补充图3h），而mRNA水平无显著变化（补充图3i）。综上，本研究结果表明，新合成的CMG2通过近膜半胱氨酸的S-酰化作用，能有效避免内质网相关降解；同时提示在受体折叠受损的情况下，抑制APT2可能是提高CMG2表达的潜在策略。

CMG2从高尔基体到细胞膜的转运依赖ZDHHC3且由Arf6介导

我们接下来研究了ZDHHC3介导CMG2在其远端胞质半胱氨酸处发生S-酰化的功能后果。在对照细胞中，CMG2主要定位于质膜，而ZDHHC3敲低会导致CMG2在高尔基体中显著积累（图4a），这一结果经高内涵图像分析得到了验证（图4b）。与此一致的是，表面生物素化实验显示，敲低ZDHHC3后，CMG2在质膜上的水平显著降低（图4c、d）。为排除“敲低ZDHHC3的细胞中质膜CMG2水平降低是因CMG2内吞作用增强”这一替代解释，我们在敲低网格蛋白重链（CHC）的细胞中重复了表面生物素化实验——敲低CHC可阻止CMG2的内吞作用[22]。在这种条件下，ZDHHC3缺失对CMG2表面丰度的影响更为显著（图4d）。因此，敲低ZDHHC3导致CMG2表面水平下降，是由于其向质膜的顺行运输存在缺陷，而非内吞作用增强所致。这一现象可能并非CMG2所特有，其他ZDHHC3的靶蛋白也可能出现类似情况。

由于ZDHHC3会对Cys479进行S-酰化修饰，我们检测了CCA突变体在ZDHHC3沉默的细胞中是否会与野生型CMG2表现出相同的行为。该突变体的质膜定位减少，且对ZDHHC3敲低不敏感（图4e），这证实了Cys479的S-酰化修饰能促进CMG2向细胞表面的转运。已有研究表明S-酰化蛋白从高尔基体到质膜的转运依赖于Arf6²⁹，因此我们检测了其潜在作用。沉默Arf6会导致CMG2的细胞表面水平降低（图4f），而当Cys479发生突变或ZDHHC3被敲低时，CMG2与Arf6之间的相互作用显著减弱（图4g、h）。

这些研究结果共同表明，ZDHHC3介导的Cys479位点S-酰化作用使CMG2能够与Arf6结合，并高效地从高尔基体转运至质膜。

图 4 ：依赖 ZDHHC3、由 Arf6 介导的 CMG2 向细胞膜转运过程。a. 转染 CMG2-GFP 的 HeLa 细胞，分别转染对照小干扰 RNA、ZDHHC3 小干扰 RNA 处理 72 小时，免疫荧光显微镜观察蛋白定位；GM130 为高尔基体标记蛋白。比例尺：10 微米。 b. 高通量自动化免疫荧光定量分析：HeLa 细胞转染对照小干扰 RNA、ZDHHC3 小干扰 RNA、ZDHHC13/17 联合小干扰 RNA，沉默 72 小时后转染 CMG2-GFP 质粒表达 24 小时。数据为高尔基体区域（GM130 阳性区域）的整合荧光强度，以对照小干扰 RNA 组数值归一化。柱状图为两组独立重复实验中一组的平均值 ± 标准误，两组实验结果趋势一致。各组分析细胞数量：对照小干扰 RNA 组 2548 个、ZDHHC3 沉默组 2540 个、ZDHHC13/17 沉默组 2756 个。采用单因素方差分析结合邓尼特多重比较检验（与对照组对比）计算 p 值，对照组与 ZDHHC3 沉默组对比的 p 值为近似值。 c. RPE1 细胞分别转染 ZDHHC3 小干扰 RNA、ZDHHC7 小干扰 RNA、两种联合小干扰 RNA 或对照 RNA 干扰片段，沉默 3 天；对细胞膜表面蛋白进行生物素标记，提取细胞总裂解液，采用链霉亲和素下拉实验富集膜蛋白，免疫印迹检测内源性 CMG2（3 组重复，平均值 ± 标准误）。 d. 沉默网格蛋白重链（Clathrin Heavy Chain）以抑制炭疽保护性抗原（PA）诱导的 CMG2 内吞；定量检测 c 组实验条件下生物素标记的细胞膜表面 CMG2 丰度（3 组重复，平均值 ± 标准误）。单因素方差分析计算 p 值，：p<0.0001，*：p<0.001，：p<0.01，：p>0.05。 e. HeLa 细胞转染 ZDHHC3 小干扰 RNA 或对照干扰片段沉默 3 天，随后分别转染野生型 CMG2-V5、CCA 突变 CMG2-V5 质粒表达 24 小时；细胞膜蛋白生物素标记后，链霉亲和素富集沉淀，抗 V5 抗体免疫印迹检测（4 组重复，平均值 ± 标准误）。单因素方差分析计算 p 值，**：p<0.0001，：p>0.05。 f. RPE1 细胞沉默处理 3f. 使用靶向 ARF6 的小干扰 RNA 或对照干扰 RNA 处理 RPE1 细胞 3 天，对细胞膜表面蛋白进行生物素标记，经链霉亲和素树脂沉淀富集膜蛋白，再通过蛋白免疫印迹检测细胞内源性 CMG2 与 ARF6 蛋白（实验重复 8 次，数据以平均值 ± 标准误表示）。 g. 采用靶向 ZDHHC3 的小干扰 RNA 或对照干扰 RNA 沉默 RPE1 细胞 3 天；随后分别共转染野生型 CMG2-V5、CCA 突变型 CMG2-V5、AAA 突变型 CMG2-V5 质粒与 ARF6-HA 质粒，表达 24 h；利用 V5 亲和树脂进行免疫沉淀，免疫印迹检测沉淀复合物中的 CMG2-V5 与 ARF6-HA 蛋白（实验重复 4 次，数据以平均值 ± 标准误表示）。 h. 定量统计不同 CMG2 突变载体、或 ZDHHC3 沉默（siZD3）细胞中与 CMG2 共免疫沉淀的 ARF6 蛋白水平（实验重复 4 次，数据以平均值 ± 标准误表示）。

CMG2 的S-酰化是配体诱导的细胞骨架解聚和信号传导所必需的

我们接下来研究了CMG2的S-酰化状态是否影响其功能，首先聚焦于配体诱导的质膜信号传导21。在没有配体的情况下，表面CMG2与踝蛋白相互作用，进而与纽蛋白和肌动蛋白（TVA）结合，将其锚定在肌动蛋白细胞骨架上21。然而，配体结合会触发从TVA结合到肌动蛋白调节因子RhoA和mDia的招募，以及与信号传导和内吞作用所需蛋白（如支架蛋白β-抑制蛋白或激酶Src）的结合，Src随后会使CMG2发生磷酸化11,22,21,30,31（图5a）。当在细胞经炭疽毒素受体结合成分——保护性抗原（PA，83 kDa或63 kDa形式）于4℃处理后，再于37℃孵育30分钟的条件下分析CMG2免疫沉淀物时，这种转换很容易被观察到：在对照细胞中，纽蛋白和肌动蛋白与CMG2共免疫沉淀，而在毒素处理的细胞中，该受体与RhoA相关联（图5b）。若细胞保持在4℃，则不会观察到TVA的释放21。AAA CMG2突变体无法响应PA结合而释放TVA组分，且也未能招募RhoA（图5b、c）。需注意，CMG2免疫沉淀物中PA的存在表明，AAA的瞬时转染能使突变体在细胞表面获得足够的表达量，从而可检测其结合情况。CCA突变体表现出部分表型，且实验间存在变异性，而AAC突变体仍保留显著的TVA结合能力，且始终仅能有限招募RhoA（图5b、c）。我们认为这反映了一种异质群体，即部分AAC CMG2分子结合TVA，另一部分结合RhoA，而非同时结合TVA和RhoA，我们之前的研究已表明二者结合存在互斥性21。同样，敲低ZDHHC7和ZDHHC3后，尽管PA能结合受体，但PA诱导的TVA释放和RhoA招募均被阻断（图5c）。血清中存在的CMG2配体（目前尚未鉴定）21以及VI型胶原蛋白也呈现出相同现象（补充图4a、b）。这些研究结果表明，CMG2必须发生S-酰基化，才能将配体结合的信号传导至胞内信号通路，其机制可能是通过约束其胞质尾区，使配体诱导的胞外域构象变化可跨膜传递，从而释放TVA复合物。

图 5 ：S - 酰化调控 CMG2 从结合 TVA 复合物向招募 RhoA 的信号转换，同时介导配体诱导的去酰化修饰。a.细胞膜上 CMG2 信号通路示意图。静息状态下，CMG2 与踝蛋白 - 黏着斑蛋白 - 肌动蛋白（TVA）复合物结合；配体（炭疽保护性抗原 PA）结合后，会破坏 CMG2 与 TVA 的相互作用，促进 RhoA 与 β- 抑制蛋白招募至 CMG2，进而启动内吞及下游细胞骨架相关信号通路。本图由 BioRender 绘制（Abrami L., 2026），原图链接：https://BioRender.com/9nbx8cq b. 将野生型 CMG2-V5 或各半胱氨酸突变型 CMG2-V5 质粒转染 HeLa 细胞，表达 48 h；细胞分为两组，一组加入 500 μg/mL 炭疽保护性抗原 PA 处理（4 ℃孵育 1 h，再 37 ℃孵育 30 min），一组不加 PA 作为对照。使用抗 V5 抗体在含 1% Triton X-100 的 PBS 体系中 4 ℃免疫沉淀 CMG2 蛋白，产物经 SDS-PAGE 分离后，分别采用抗 PA、抗黏着斑蛋白、抗肌动蛋白、抗 RhoA、抗 V5 抗体进行免疫印迹检测。 c. 对图 b 实验结果进行定量分析：统计野生型、各半胱氨酸突变体，以及同时沉默 ZDHHC3 与 ZDHHC7 后，CMG2 与肌动蛋白、APT2 的结合水平（共 5 组生物学重复，数据为平均值 ± 标准差）。采用单因素方差分析计算显著性，**** 代表近似 p<0.0001。 d. RPE1 细胞 37 ℃条件下用 [³H]- 棕榈酸标记 2 h，清洗后更换追踪培养基孵育 2.5 h；随后分组处理：有无 500 μg/mL PA、有无 100 nM 巴佛洛霉素 A（BafA）、有无 10 μM MG132 蛋白酶体抑制剂。采用抗 CMG2 抗体免疫沉淀 CMG2，经 SDS-PAGE 分离后，通过放射自显影检测 ³H 标记棕榈酰化蛋白，同时使用抗 CMG2、抗 PA 抗体进行免疫印迹。 e. 利用 Typhoon 成像系统定量放射性标记信号；将追踪 2.5 h（配体刺激前）的 [³H]- 棕榈酸信号值设定为 100%，各时间点数值均以此为基准归一化（共 3 组生物学重复，平均值 ± 标准差）。

配体诱导的CMG2去酰化

我们此前已证实，非酰化的炭疽毒素受体会导致毒素摄取提前且无效，即单体PA被内吞，但毒素的酶亚基仍留在细胞外¹¹。非酰化CMG2的这种更强的内吞能力促使我们探究配体结合是否能诱导野生型（WT）CMG2的去酰化。为验证这一点，我们用[³H]-棕榈酸酯标记细胞2小时，经追踪使CMG2到达质膜，随后用毒素刺激细胞。PA引发了[³H]-棕榈酸酯的时间依赖性减少（图5d）。用液泡ATP酶抑制剂巴弗洛霉素A处理细胞无法阻止这种减少，排除了观察到的[³H]-棕榈酸酯减少是由CMG2的溶酶体降解导致的可能性（图5d）。同样，蛋白酶体抑制剂MG132也无此作用（图5d、e，扩展图4c）。因此，细胞外配体结合会触发细胞内CMG2的去酰化，这一调控步骤是我们此前已提出的假说，但若无本研究为CMG2 S-酰化提供的机制学见解，我们无法直接证实这一过程。

配体结合触发膜结合APT2的募集

我们接下来检测了配体诱导的 CMG2 去酰基化是否由 APT2 介导。我们首先检测了 APT2 抑制剂 ML349 是否会影响 TVA 向 RhoA 的转换。ML349 完全阻断了内源性 CMG2（图6a）以及异位表达的 CMG2（图6b）、CCA 和 AAC 突变体的该转换（图6b），这些蛋白可与踝蛋白、纽蛋白和肌动蛋白共免疫沉淀，但不能与 RhoA 共免疫沉淀。APT2 的必要性通过 APT2 沉默进一步得到了证实（图6c、补充图5a）和敲除实验（补充图5b）。通过对PA处理的细胞进行免疫沉淀，可检测到APT2向CMG2的募集（图6d）。PA低聚后，APT2的募集并不依赖于CMG2的聚集，因为一种无法被弗林酶加工、因此不能低聚的PA突变体32,33，仍能诱导APT2的募集（图6d）。APT2的募集同样不依赖于CMG2与肌动蛋白细胞骨架的相互作用，无法结合塔林的CMG2 W396L突变体21，在PA刺激下仍能募集APT2（补充图5c）。

APT2是一种可溶性球状蛋白，可通过三步过程与膜相互作用，该过程涉及静电相互作用、疏水环（β-舌）的插入以及半胱氨酸23位的S-酰化。S-酰化缺陷型C2S突变体无法结合CMG2（图6e-f），这证实APT2自身必须发生S-酰化才能对其底物进行去酰化作用23。同样，另外两个膜结合能力受损的APT2突变体——APT2PosPatch（其中带正电的结构域发生突变，无法通过静电相互作用接近膜23）和APT2 M68E（影响膜插入β-舌的疏水性23），在配体结合后也无法被招募至CMG2（扩展图5d）。相比之下，无催化活性的S121A APT2突变体能够结合CMG2，但无法触发TVA释放（图6e-f），这证实了硫酯酶活性的必要性。值得注意的是，用ML349抑制APT2会阻止其被招募至CMG2（图6f、扩展图5e-f），而ABHD17抑制剂ABD957则无此作用（图6f）。这并非由于ML349对APT2的膜结合能力产生影响，因为从经ML349处理的细胞中分离的核后上清液进行分级分离后，膜组分中仍能检测到APT2（扩展图5g），且APT2在体外存在ML349的情况下仍能与脂质体结合（扩展图5h）。由于ML349会插入APT2的疏水酰基链结合口袋34，这些结果表明，APT2与CMG2的相互作用需要通过免疫沉淀检测可知，与 CMG2 结合的一条酰基链必须插入到 APT2 的疏水口袋中。APT2 的募集始终与肌动蛋白细胞骨架与 CMG2 结合的丧失同时发生（图 6g）。

因此，膜锚定的 APT2 的募集是对配体结合的首个胞质反应，而去酰基化则是 CMG2 信号开关的执行步骤，它将胞骨架锚定的受体转化为具有内吞能力的复合物（图6h）。

图 6 翻译：配体结合诱导 APT2 招募至 CMG2 并介导 CMG2 去酰化修饰。血清饥饿处理 RPE1 细胞，提前加入 APT2 特异性抑制剂 ML349 预孵育（对照组不加抑制剂）；再分为两组，一组加入 PA / 致死毒素 LF 刺激，一组不刺激；4 ℃孵育后转至 37 ℃继续反应。免疫沉淀 CMG2，经 SDS-PAGE 分离后，免疫印迹检测炭疽保护性抗原 PA、踝蛋白、黏着斑蛋白、肌动蛋白、β- 抑制蛋白、RHOA 及 CMG2。 b. 向 HeLa 细胞转染野生型、CCA 突变、AAC 突变型 CMG2-V5 质粒，表达 48 h；血清饥饿处理后，用 ML349 预孵育（对照组不加抑制剂），再用 PA/LF 刺激（空白组不刺激）。免疫沉淀 CMG2-V5 复合物，检测指标同图 a，额外增加磷酸酪氨酸抗体检测。 c. 分别使用靶向 APT1、APT2 的小干扰 RNA 沉默 RPE1 细胞 3 天，血清饥饿后用 PA/LF 刺激（空白组不刺激）；免疫沉淀 CMG2，检测 PA、肌动蛋白、CMG2 表达。以不加 PA 对照组中与 CMG2 共沉淀的肌动蛋白信号值为 100% 进行归一化定量（共 5 组生物学重复，平均值 ± 标准差）。单因素方差分析计算显著性，**** 代表近似 p<0.0001。 d. 表达野生型 APT2-Myc 的 RPE1 细胞，分别用野生型 PA、不可剪切型 PA 突变体联合 LF 刺激；免疫沉淀 CMG2，免疫印迹检测 PA、APT2-Myc、踝蛋白、黏着斑蛋白、肌动蛋白与 CMG2。 e、f、g. 向 APT2 敲除（APT2-KO）RPE1 细胞分别回补野生型 APT2-FLAG、酶活失活突变体 S121A、膜结合缺陷突变体 C2S 或空载体；血清饥饿后用 PA/LF 刺激。免疫沉淀 CMG2，检测 PA、APT2-FLAG、肌动蛋白、CMG2。定量结果以 “回补野生型 APT2 且加 PA 刺激组” 的 APT2、肌动蛋白共沉淀信号为 100% 归一化（3 组重复，平均值 ± 标准差）。平行设置对照组：RPE1 细胞提前 4 h 分别用二甲基亚砜 DMSO（溶剂对照）、ML349、ABD957 处理，数值以 DMSO+PA 组为基准归一化（4 组重复，平均值 ± 标准差）。 h. CMG2 信号转换机制模型：配体结合会招募 APT2 至 CMG2 并催化 CMG2 去酰化，促使 CMG2 与踝蛋白 - 黏着斑蛋白 - 肌动蛋白复合物解离，从而完成内吞。本图由 BioRender 绘制（Abrami L., 2026），原图链接：https://BioRender.com/2lsvclz

抑制APT2可阻止炭疽毒素致病

我们接下来探究了APT2介导的去酰化作用在炭疽毒素进入细胞过程中的作用。炭疽致死毒素的作用机制，即保护性抗原（PA）与致死因子（LF）结合，具体过程为：PA与CMG2/TEM8结合，形成可与LF结合的PA63寡聚体，随后发生内吞作用，PA寡聚体转化为PA孔道——这是LF穿越内体膜并最终到达胞质的必要条件35,36。在胞质中，LF最终会切割MEK1、2或3等丝裂原活化蛋白激酶激酶的N端。我们首先通过靶向MEK3 N端的抗体进行免疫荧光检测，监测MEK3水平，以此验证APT2在炭疽毒素致毒过程中的作用12。实验采用APT2敲除（KO）细胞，该细胞分别回补了野生型（WT）APT2或无活性的APT2 C2A23。正如预期37，在表达WT APT2的细胞中，致死毒素（LeTx）处理后MEK的N端信号显著降低（图7a-b）；而在表达APT2 C2A的细胞中，致死毒素处理对MEK3水平无影响（图7a-b）。

因此我们从生物化学角度监测了致死毒素作用机制的不同步骤。使用 APT2 抑制剂 ML349 处理可显著抑制 PA 孔的形成（图 7cd），而 APT1 抑制剂 ML348 则无此效果。该效应并非由 PA 低聚化受损导致，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS–PAGE）前对细胞裂解液进行酸化处理22后，观察到低聚体组装正常（图7c、补充图6a）。与PA孔形成受损的结果一致，在ML349处理的细胞中未检测到MEK2的切割（图7c）。进一步的实验验证了这一结论：APT2沉默（补充图6b）和APT2敲除（补充图6c）均显著降低了PA孔的形成以及MAPK激酶的切割，而通过重新表达APT2，这两种表型均得到了恢复（补充图6d）。值得注意的是，通过在APT2敲除（KO）细胞中观察到表皮生长因子（EGF）的正常内吞和降解可知，APT2敲除并未导致内吞作用或内体-溶酶体运输通路出现普遍缺陷（补充图7a-c）。APT2介导的去酰化作用也是CMG2发挥生理功能所必需的，因为ML349处理会抑制VI型胶原蛋白的降解（图7f）。

综合这些研究结果可以证明，APT2的活性对于CMG2转变为具备内吞能力的状态至关重要，因此也对炭疽毒素进入细胞以及VI型胶原的稳态维持必不可少（图7g）。

图7：CMG2去酰化对于炭疽致死毒素的内吞作用至关重要。a. 经 Citrin 标记 N 端的 APT2 野生型（WT）或 C2A 突变体重新互补的 RPE1 APT2 基因敲除（KO）细胞的代表性共聚焦显微镜图像（上图）。细胞在 4℃ 下与 500 纳克/毫升炭疽毒素保护性抗原（PA）和 100 纳克/毫升致死因子 LF（合称致死毒素 LeTx）共孵育 1 小时；洗涤细胞后，在无血清培养基中于 37℃ 再孵育 1 小时。通过免疫荧光染色检测 MEK3，用 Hoechst 染色细胞核。表达 APT2-柠檬酸蛋白的细胞用红色轮廓标出。比例尺 (bar =10 mu m) b. 图 a 的定量分析结果。使用 Cellpose3 对细胞进行分割，并测量每个细胞的 MEK3 平均染色强度。采用 Kolmogorov 检验分析两组分布的差异，评估两组分布间的统计学差异。APT2 野生型条件下的 p 值为近似值。 c. RPE1 细胞在 37℃ 下与 ML348 或 ML349 预孵育 4 小时。随后在 4℃ 下与 500 微克/毫升 PA 和 50 纳克/毫升 LF 共孵育 1 小时，再在 37℃ 下按指定的不同时间进行追踪。取 40 微克蛋白质样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），并通过兔抗人 CMG2、兔抗 PA 或兔抗 MEK2 N 端抗体进行免疫印迹分析。定量检测 PA 孔（SDS 抗性形式）的含量（图 d）和裂解的 MEK2 N 端片段含量（图 e），以 4℃ 孵育 1 小时、追踪前的含量设为 1，不同追踪时间的含量均以相对于该值的比例表示（(n=4)，平均值±标准差）。f. 用人源 APT2 小干扰 RNA 或对照小干扰 RNA 对 RPE1 细胞进行 3 天的沉默处理。实验前 24 小时将细胞更换为无血清培养基，加入 1 微克/毫升的 VI 型胶原蛋白，分别孵育指定时长。取 40 微克蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），并使用兔抗 VI 型胶原蛋白抗体、抗 CMG2 抗体和兔抗免疫球蛋白 G 抗体进行免疫印迹分析。g. 展示CMG2生命周期中S-酰化和去酰化事件的示意图。由BioRender制作。Abrami, L. (2026) https://BioRender.com/iqtwk20

去酰化抑制剂在体内挽救LeTx诱导的血管表型

为探究蛋白质去酰化的药理学抑制是否能在体内抵消炭疽致死毒素（LeTx）的活性，我们采用了先前建立的斑马鱼中毒模型³⁸。与炭疽芽孢杆菌感染或注射LeTx的哺乳动物模型一样，向斑马鱼胚胎注射毒素会导致血管功能障碍，这一现象可通过体内成像进行观察³⁸。我们让同时表达两种荧光报告基因的斑马鱼胚胎——一种在血管中表达（fli:eGFP），另一种在循环红细胞中表达（gata1:dsRed）（图8a-a''）——分别注射LeTx，同时添加或不添加不同浓度的Palmostatin B或ML349（图8）。

PBS注射对血管系统形态或血流无影响（图8a-f''、补充视频S1和S5）。与此前报道一致38且与LeTx不诱导胚胎组织或血管内细胞死亡的观察结果相符38，LeTx注射后24小时内严重损害红细胞循环，但不影响整体形态或心脏收缩力（图7b-b''、补充视频S2和S6）。全胚胎成像显示，红细胞通过轴血管和节间血管（ISVs）的循环完全或近乎完全停滞（图8b''、补充视频S2和S6）。躯干血管系统的共聚焦成像进一步显示，LeTx注射的胚胎节间血管直径显著减小（图8f-f''对比e-e''）。

为实现系统性且可重复的表型评分，基于红细胞对脉管系统的灌注情况，将LeTx诱导的循环缺陷分为三个严重程度，代表性共聚焦图像对此进行了说明（图8i-k）。1级对应背主动脉和尾静脉仍保留轴向血流的胚胎，其节间血管有部分红细胞灌注。2级指轴向循环得以保留但节间血管完全无灌注的胚胎。3级为最严重的表型，特征是轴向血管内红细胞缺失或显著减少。我们随后将LeTx与棕榈司他丁B共同注射。观察到红细胞循环的恢复呈浓度依赖性（图8l、视频S3和S7），在1、10和100微摩尔浓度下，3级表型的比例分别降至77%、72%和50%，同时1级和2级表型的比例相应增加。在100微摩尔浓度下，33%经棕榈司他丁B处理的胚胎实现了1级表型的恢复。共聚焦成像结果证实，轴向血管内红细胞循环的部分恢复，伴随着节间血管直径的恢复以及节间血管灌注的部分重建（图8g–g''）。

ML349在挽救胚胎表型方面的效果显著更强（图8l、视频S4和S8）。在1微摩尔和5微摩尔浓度下，严重受影响胚胎的比例仍分别高达74%和70%，且1级挽救的比例有限（分别为3%和8%）。然而，在50微摩尔浓度下，观察到表型分布出现显著变化：3级胚胎的比例骤降至10%，而74%的胚胎实现了1级挽救，10%实现2级挽救，这表明在该浓度下红细胞循环几乎完全恢复（图8d''）。共聚焦成像进一步证实了这些结果，显示经50微摩尔ML349处理的胚胎中，节间血管直径和红细胞灌注情况大幅恢复，接近磷酸盐缓冲液注射对照组的数值（图8h–h''）。

综合来看，这些结果表明，在体内，Palmostatin B 和 ML349 均能以浓度依赖的方式挽救 LeTx 诱导的红细胞循环损伤，且 ML349 的作用显著更强（图 8l）。

值得注意的是，在这种共注射范式中，抑制剂必须进入细胞并抑制脱酰基作用，同时毒素需可被内吞以发挥作用。因此，所观察到的挽救效应尤为显著。这些发现支持了抑制脱酰基作用可在体内抵消毒素活性的观点，并表明该方法在感染情境下可能具有治疗潜力——在感染过程中，毒素暴露是渐进发生的，而非一次性大量暴露。

图8：抑制脱酰作用可预防炭疽毒素诱导的斑马鱼胚胎血管缺陷。a-i. 3天龄（3dpf）的Tg(fli1:eGFP; gata1:dsRed)活体胚胎，代表不同实验条件：对照组、致死毒素（LeTx）组，以及致死毒素分别联合100μM棕榈司他丁B（LeTx + PalmB）或50μM ML349（LeTx + ML349）组。fli1:eGFP的表达以绿色显示，gata1:DsRed在ImageJ软件中使用Fire查找表（LUT）进行可视化。a-d. 全胚胎图像显示所有实验条件下胚胎均具有正常的宏观形态和血管模式。注射致死毒素会严重损害红细胞循环（b’’），而联合注射棕榈司他丁B或ML349可部分改善这些循环缺陷（c’’、d’’）；（a-d）为明场图像，（a’-d’、a’’-d’’）为荧光通道图像。e-h. 共聚焦显微镜图像显示躯干的固定区域，用于观察节间血管（ISVs）、主动脉和尾静脉的灌注及血流情况。e’’-h’’是e-h中框选区域的放大图，标注了节间血管（箭头头）、主动脉（A）和尾静脉（CV）（箭头）的位置。注射致死毒素会导致节间血管变窄（f、f’’），并使红细胞通过节间血管、主动脉和尾静脉的灌注受损（f’、f’’）。联合注射棕榈司他丁B或ML349可恢复主动脉和尾静脉的循环，并部分恢复节间血管的直径和灌注（g-g’’、h-h’’）。i-k.共聚焦图像展示了LeTx注射后观察到的严重程度分级（从1级至3级递增）的代表性示例。1级对应主动脉和尾静脉存在轴向血流、部分节段间血管灌注的胚胎；2级保留轴向循环但无节段间血管灌注；3级则表现为轴向血流缺失或显著减少。l. 图表展示了不同实验条件的表型定量结果，表明共注射PalmB或ML349可浓度依赖性地预防LeTx诱导的缺陷。采用费希尔精确检验对各组进行比较——该检验应用于4×2列联表（4个严重程度等级×2种实验条件）——每组至少有20个胚胎。****：近似值 (p<0.0001)。比例尺代表300微米（a-d、e-h）。

讨论

CMG2是一种多功能受体，可将细胞外基质与细胞骨架信号传导及内吞作用联系起来，同时也被炭疽毒素劫持为主要的宿主受体。本文研究表明，CMG2的生物合成与功能受到贯穿分泌和内吞途径的连续S-酰化-去酰化循环的调控。这些循环使CMG2能够呈现出与生命周期不同阶段相对应的独特构象或相互作用状态：在内质网中折叠、转运至质膜，以及配体诱导的信号传导和内吞作用。因此，我们所描述的脂质化事件将CMG2的生物发生与其作为质膜上信号传导和内吞受体的功能联系了起来。

我们的研究结果表明，内质网中ZDHHC7对膜近端半胱氨酸的S-酰化作用，通过阻止新合成的CMG2被内质网相关降解（ERAD）过早降解，从而促进其正确折叠。相反，APT2介导的这些酰基链的去除会使折叠中间体易被ERAD降解。因此，急性抑制APT2可提高细胞和体内的CMG2水平。这些发现证实，S-酰化是CMG2蛋白质稳态的关键正向决定因素。由于部分透明纤维瘤病综合征相关的错义突变会导致CMG2折叠动力学受损，慢性部分抑制APT2成为一种合理的治疗策略，可提高这些患者体内的CMG2表达水平。该机制在概念上与旨在稳定内质网中CFTR及其他折叠异常的突变跨膜蛋白的药理学策略相关。

内质网（ER）输出后，发生第二次S-酰化事件，该事件由高尔基体中ZDHHC3介导，发生在Cys479位点，这使得CMG2能够与Arf6相互作用并转运至质膜。这表明CMG2的生物发生不仅在折叠阶段受到调控，在通过分泌途径的转运过程中也受到调控，不同的S-酰化事件依次发挥作用。在细胞表面，我们发现配体诱导Talin-Vinculin-Actin复合物解离以及RhoA、β-抑制蛋白、mDia和肌球蛋白轻链11等信号传导和内吞作用所需的其他蛋白的募集，都要求CMG2发生S-酰化。这些数据支持这样一种模型：S-酰化将胞质尾约束在特定构象中，使其能够通过跨膜螺旋传递配体诱导的构象变化，从而使CMG2重新定位其胞质相互作用。在缺乏S-酰化的情况下，配体结合仍会发生，但构象信号无法穿过细胞膜，从而阻止受体被激活。

最后，我们发现配体结合会触发APT2被招募至CMG2，这一过程涉及CMG2结合的酰基链依次插入APT2的疏水酰基链结合口袋。APT2的招募发生在TVA释放之前，并介导CMG2的去酰基化作用，使受体从细胞骨架锚定状态转变为肌动蛋白调控且具备内吞能力的状态。尽管全长CMG2的调控性内吞需要这种依赖于S-酰基化的细胞骨架相互作用释放，但缺乏胞质尾的截短突变体可绕过这类调控限制39,40。

与我们的观察一致，APT2的基因或药理学抑制可阻断炭疽致死毒素的内吞、内体中的孔道形成以及胞质内下游的MAPK切割。同样，在生理环境中，APT2抑制可阻止CMG2介导的VI型胶原蛋白降解。此外，APT2抑制对斑马鱼的致死毒素诱导的血管损伤具有保护作用。这些结果表明，去酰化作用并非仅仅是逆转有利于生物发生的修饰，而是一个信号执行步骤。APT2对CMG2生物发生和配体诱导的内吞作用的相反效应，凸显了S-酰化-去酰化循环具有阶段特异性和时间上分离的特性，因此APT2抑制的效果可能会因作用时机和持续时间的不同而有所差异。针对炭疽芽孢杆菌感染的暴露后预防需对APT2活性进行急性且最大化的抑制，从而使免疫系统清除感染，同时避免受体失活带来的长期影响。相比之下，HFS治疗则需采用慢性低浓度给药或间歇性治疗，以提高CMG2蛋白的表达水平，同时至少间歇性保留CMG2的信号传导能力和细胞外基质调控功能。

更广泛地说，这些研究结果强调，在以脂质修饰酶为治疗靶点时，需要考虑其时间动态变化。

总之，本研究发现协调且按时间顺序进行的S-酰化-去酰化循环是控制CMG2折叠、运输和功能（包括生理和病理状态）的核心调控机制。因此，本研究证明S-酰化-去酰化循环可调控生物合成和内吞途径中的连续运输步骤。除阐明CMG2 S-酰化的分子机制外，我们的研究还将APT2确立为受体功能的可成药调控因子，这一发现对遗传性面部高钙血症（HFS）治疗、炭疽感染以及其他影响膜蛋白折叠的遗传病均具有重要意义，而50%至70%的膜蛋白都会发生S-酰化41-44。

方法

除图3j以及补充图3hi和图8中的实验外，本手稿中描述的所有实验均无需伦理批准。图3j和补充图3hi中展示的小鼠实验已获得瑞士州兽医办公室批准（授权号VD3794b）。对于图8中关于斑马鱼胚胎的实验，所有实验程序均按照瑞士联邦动物实验相关法律法规（《动物福利法》TSchG；《动物福利条例》TSchV）开展，并获得瑞士沃州联邦食品安全与兽医办公室（FSVO）的授权（授权号VD-H23）。

细胞系

海拉细胞（ATCC CCL-2）在添加了10%胎牛血清、2毫摩尔L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素和链霉素（GIBCO）的改良伊格尔培养基（Sigma Life Science）中培养。原代成纤维细胞以及RPE1（ATCC CRL-4000）和RPE1 APT2敲除细胞23 株细胞在添加了10% 胎牛血清、青霉素和链霉素（GIBCO 公司）。

质粒与转染

人源CMG2（异构体4，UniProt P58335-4）野生型被克隆至pcDNA3.5/V5-HIS-TOPO表达载体或pHS003-EGFP载体中。利用QuikChange定点诱变试剂盒（Agilent），按照制造商的操作流程，在pcDNA3.5/V5-HIS-TOPO载体中构建了半胱氨酸突变体以及L45P、G105D、I186T、L349R、W396L突变体。人源APT2/LYPLA2野生型被克隆至pCMV6-myc-flag表达载体中。同样使用QuikChange定点诱变试剂盒（Agilent），按照制造商的操作流程，在pCMV6-myc-flag载体中构建了S121A、M68E、Pospatch和C2S APT2突变体。MYC融合的人源ZDHHC3和人源ZDHHC7被克隆至pcDNA3.145载体中。根据实验需求，质粒通过TRANSIT–X2转染试剂（MIRUS）按照制造商的操作流程转染至细胞中，转染时间为24小时或48小时。人源ZDHHCs、人源APT1和APT2的验证型siRNA购自Qiagen公司。APT1的靶序列为：5’-AACAAACTTATGGGTAATAAA-3’。APT2的靶序列为：5’-CAGCTGCTTCTCAGTCATGAA-3’。ARF6的靶序列为：5’TGCGACCACTATGATAATATT-3’。siRNA混合池的配制如下：Mix1（ZDHHC1（5’-ACCGGCTGTGATGCTCCAATA-3’）+ ZDHHC3（5’-TCCGTTCTCATGAATGTTTAA-3’）+ ZDHHC7（5’-CCCGTGGTTACTATGAATGTA-3’）+ ZDHHC13（5’CAGCATAGTAGCCTTTCTATA-3’）+ ZDHHC17（5’-CAGTACCTGTTTGATACGAAA-3’））；Mix2（ZDHHC2（5’-TAGCTACTGCTAGAAGTCTTA-3’）+ ZDHHC6（5’GAGGTTTACGATACTGGTTAT-3’）+ ZDHHC4（5’-ATGGATTGCTTCATTACCTTT-3’）+ ZDHHC16（5’-CTCGGGTGCTCTTACCTTCTA-3’））；Mix3（ZDHHC5（5’ACCACCATTGCCAGACTACAA-3’）+ZDHHC8（5’- CCGGGCTCCGCTGTACAAGAA-3’）+ ZDHHC15（5’-ATCGCTATATCAAGTATCTAA-3’）+ ZDHHC20（5’TACCTGTTATGAGTTGCCTATA-3’））；Mix4（ZDHHC9（5’-CTCAACCAGACAACCAATGAA-3’）+ ZDHHC12（5’-CAGATACTGCCTGGTGCTGCA-3’）+ ZDHHC18（5’AAGCCTGATGCCAGCATGGTA-3’））；Mix5（ZDHHC11（5’-CGCGTGGAAATACATTGCCTA3’）+ ZDHHC23（5’-CTGCGAGTACATAGATCGGAA-3’）+ ZDHHC24（5’CCGCTGCGTGGGGCTTCGGCAA-3’））；Mix6（ZDHHC14（5’CTGGGTGTCCTCGGCAAAGTT-3’）+ZDHHC19（5’-GACCCTGGCATCTTACATCAA-3’）+ ZDHHC21（5’-GTGGGACTAATACAAGATCTA-3’）+ZDHHC22（5’TGGGTTCATTTATGCCCTATA-3’））。

   作为对照 siRNA，使用了一段针对病毒糖蛋白 VSV-G 的序列（5’ATTGAACAAACGAAACAAGGA-3’）。使用 TRANSIT-X2（MIRUS）转染 50 纳摩尔的 siRNA，转染后至少 72 小时对细胞进行分析。

实时定量逆转录聚合酶链式反应

使用 RNeasy 试剂盒（Qiagen）从细胞或组织中提取 RNA。使用随机六聚体和 SuperScript II 逆转录酶（Invitrogen）进行逆转录反应。采用 SYBR Green 预混液进行实时荧光定量 PCR，以管家基因 TBP 和 ALAS1 作为内参，使用的特异性引物如下：

人ZDHHC3 CTGCAGCATCAAGCCCGACC；CGGTGCATTCGGAAGATGGACC

-h ZDHHC7CCTGTGCCTTGAGGGTCTTCTG；GAAGCCCACATGGGAGCGG

-h APT1GCGGCAATAACATGTCAACC；Smith， J.CATGCAGGAAAATCACCGCA

-h APT2CCCTGTGACCCTCAACATGA；Smith， J.CCCATCAGGTCAAACCAGGA

-人类CMG2：GGCAAGTTGGACGGTCTGGTG； Smith，J.CACTAGCCCCAAGTGACCTGG

-人类TEM8：GGCCACTCTGGTGCTCATCTG； Smith，J.CCAGTGGTGCAGCACACTTCC

-m LRP6：CAGAAGAGCGCCATCAACCGC；GGATGCCCTGCCCACTACTC

-小鼠CMG2：CCCTGAAATGAGATTGTCCTTCATTGTG；

CCTTTGCCAATTTTGTACCTGTCTCCAG

-小鼠 TEM8：GGGGGACCAGCTTGCTACGG，GGAAGTGTGCTGCACCACTGG

结果以 $2^{-ΔΔCt}×100%$ 表示。

抗体和试剂

抗小鼠CMG2单克隆抗体8F7是通过用小鼠CMG2构建体46（德国Genovac公司）对大鼠进行基因免疫制备的。其余抗体均为市售产品：山羊抗人CMG2（R&D公司，货号AF2940，RRID：AB_2056740）；兔抗人CMG2（Proteintech公司，货号：16723-1，RRID：AB_2056741）；山羊抗人TEM8（R&D公司，货号：AF3886，RRID：AB_2056726）；兔抗ARF6（LSBio公司，货号：LS-C81881，RRID：AB_2058487）；小鼠抗TRAPα（Santa Cruz公司，货号：100314，RRID：AB_1130631）；抗V5（Invitrogen公司，货号46-0705，RRID：AB_2556564）；抗GFP（Takara Bio公司，货号：632592，RRID：AB_2336883）；小鼠抗Myc（SIGMA公司，9E10，货号M4439，RRID：AB_439694）；抗人ZDHHC3（Abcam公司，货号ab31837，RRID：AB_742236）；抗GM130（BD biosciences公司，货号610823，RRID：AB_398142）；小鼠抗GAPDH（Acris Antibodies公司，货号4A1-MA0100，RRID：AB_1874646）。抗肌动蛋白抗体（Merck Millipore，货号：MAB1501，RRID：AB_2223041）；抗踝蛋白抗体（Sigma，货号：T3287，RRID：AB_477572）；抗黏着斑蛋白抗体（Sigma，货号：V9131，RRID：AB_477629）；抗磷酸化酪氨酸抗体（Millipore，货号：05-1050，RRID：AB_916371）；抗RhoA抗体（Cell Signaling，克隆号67B9，货号：2117，RRID：AB_10693922）；抗SRC抗体（Abcam，货号：16885，RRID：AB_443522）；抗炭疽保护性抗原抗体（List Biological Laboratories，货号：771B）；抗N端MEK2抗体（Santa Cruz，货号：12578，RRID：AB_648958，已停产）；抗N端MEK3抗体（Santa Cruz，货号：960，RRID：AB_631928，已停产）；抗Ⅵ型胶原蛋白抗体（Fitzgerald laboratories，货号：70R-CR009X，RRID：AB_1283876）；抗钙连蛋白抗体（Millipore，货号：MAB3126，RRID：AB_2069152）；抗免疫球蛋白G抗体（Santa Cruz，货号：SC-2025，RRID：AB_737182）；辣根过氧化物酶标记的二抗（Pierce）；免疫沉淀所用的蛋白G磁珠购自GE Healthcare。

本实验室与 Covalab 合作制备了抗 MEK1 N 端抗体（Abrami 等人，2008），该抗体针对被 LF 切割的 N 端 20 个氨基酸。

布雷菲德菌素A（Sigma）的使用浓度为2微克/毫升，巴弗洛霉素A（Sigma）的使用浓度为100纳摩尔，MG132（Sigma）的使用浓度为10微摩尔，环己酰亚胺（Sigma）在³H-棕榈酸实验开始前1小时及实验过程中以10微克/毫升的浓度使用。ABD957、ML348和ML349（Cayman Chemical公司）在指定时间点的使用浓度为10微摩尔。棕榈他汀B（Merk）在指定时间点的使用浓度为50微摩尔。

野生型炭疽毒素保护性抗原（PA）和炭疽毒素致死因子（LF）由本实验室按照文献（Feld 等人, 2012）⁴⁷所述方法，在大肠杆菌中通过过表达制备⁴⁷。VI型胶原蛋白由 Bonaldo 实验室惠赠⁴⁸。

蛋白质印迹法

细胞在4℃下用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次，随后在裂解缓冲液（含1×PBS、1% Triton X100和蛋白酶抑制剂混合物；罗氏公司）中于冰上裂解30分钟。裂解液经台式离心机以5000转/分钟离心，取上清液测定蛋白质含量；样品先在拉埃姆利缓冲液（Laemmli buffer）中煮沸5分钟，再通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，并针对本研究使用的不同抗体进行蛋白质印迹（western blotting）检测。蛋白质印迹条带采用增强化学发光法（ECL）显影（赛默飞世尔科技公司），并在Vilber Lourmat公司的Fusion Solo成像系统上成像。光密度分析使用厂家提供的Bio-1D软件完成。

所有未裁剪、未处理的蛋白印迹图均已提供在补充信息文件中。

酰基-受体关联捕获测定法

采用Acyl-RAC检测法49，按照先前描述的方法50并稍作修改，对蛋白质S-棕榈酰化进行了评估进行了一些修改。将小鼠组织在400微升缓冲液（0.5% Triton-X100、25 mM HEPES、25 mM 氯化钠、1 mM EDTA，pH 7.4，以及蛋白酶抑制剂混合物）中裂解。随后，向裂解液中加入200微升封闭缓冲液（100 mM HEPES、1 mM EDTA、87.5 mM SDS和1.5% [体积/体积] 甲基甲烷硫代磺酸盐[MMTS]），并在40摄氏度下孵育4小时，利用MMTS封闭游离的巯基（-SH）。蛋白质经丙酮沉淀后重悬于缓冲液（100 mM HEPES、1 mM EDTA、35 mM SDS）中。为用羟胺（NH₂OH）处理并通过硫丙基琼脂糖®磁珠捕获，将2 M羟胺与磁珠（预先用水活化15分钟）一同加入，使羟胺终浓度为0.5 M，磁珠浓度为10%（质量/体积）。作为阴性对照，用2 M三羟甲基氨基甲烷（Tris）替代羟胺。随后将这些样品在室温下于旋转仪上孵育过夜。洗涤后，将蛋白质置于40微升含β-巯基乙醇的SDS上样缓冲液中，在95摄氏度下孵育5分钟，从磁珠上洗脱。最后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离样品，并进行免疫印迹分析。保留一部分组织裂解液作为输入样品。

酰基-聚乙二醇交换

将细胞裂解并在400微升缓冲液（含0.2%十二烷基硫酸钠、0.5%曲拉通X-100、100毫摩尔/升羟乙基哌嗪乙磺酸、1毫摩尔/升乙二胺四乙酸、100毫摩尔/升N-乙基马来酰亚胺，pH值7.5，以及蛋白酶抑制剂混合物）中于40摄氏度孵育处理2小时。为去除过量未反应的N-乙基马来酰亚胺，蛋白质经丙酮沉淀后重悬于缓冲液（含100毫摩尔/升羟乙基哌嗪乙磺酸、1毫摩尔/升乙二胺四乙酸、1%十二烷基硫酸钠，pH值7.5）中。先前的棕榈酰化半胱氨酸通过在37摄氏度下用500毫摩尔/升羟胺处理1小时得以暴露。细胞裂解液使用Zerra旋转脱盐柱脱盐，随后在37摄氏度下与2毫摩尔/升5千道尔顿甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺孵育1小时。将样品置于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳样品缓冲液中于95摄氏度孵育5分钟以终止反应。样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，通过蛋白质印迹法进行分析。

(^{3} H) - 棕榈酸放射性标记实验与免疫沉淀

HeLa、RPE1 及人成纤维细胞用不同构建体转染或不转染，于格拉斯哥最低必需培养基（IM；用 10 mM 羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲，pH7.4) 用200微居里/毫升的(^{3} H)棕榈酸（9,10-³H[N]）（美国放射性化学品公司）处理50。洗涤细胞后，将其在完全DMEM培养基中孵育指定的追踪时间，或直接裂解以用指定抗体进行免疫沉淀。免疫沉淀时，先用PBS洗涤细胞三次，然后在IP缓冲液（0.5% 壬基酚P-40、500毫摩尔/升Tris（pH 7.4）、20毫摩尔/升EDTA、10毫摩尔/升氟化钠、2毫摩尔/升苯甲脒和蛋白酶抑制剂混合物[罗氏]）中于4°C裂解30分钟，再以5000转/分钟离心3分钟。上清液在免疫沉淀反应前先用蛋白G琼脂糖珠进行预清除。随后将上清液与相应抗体（V5或山羊抗人CMG2）及蛋白G琼脂糖珠共同孵育过夜。免疫沉淀完成后，洗涤后的琼脂糖珠在还原样品缓冲液中于90°C孵育5分钟，随后进行4−20%梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶在固定液（25%异丙醇、65%水、10%乙酸）中孵育30分钟，再与信号增强剂Amplify NAMP100（通用电气医疗集团）孵育30分钟。使用Typhoon磷光成像仪对放射性标记产物进行成像，并使用Typhoon成像仪（ImageQuanTool，通用电气医疗集团）进行定量。(^{3} H)-棕榈酸标记的所示图像是通过放射自显影在胶片上获得的。

膜与胞质组分的分离

Hela 细胞用 PBS 洗涤后，在匀浆缓冲液（2.9 mM 咪唑、250 mM 蔗糖，pH 7.4 且含蛋白酶抑制剂）中通过 22G 注射针匀浆。离心后，上清液被收集为核后上清液（PNS）。将 PNS 在 Sorvall MX150 超速离心机中以 100,000g 离心 30 分钟。沉淀和上清液（上清）用等体积的还原上样缓冲液溶解，在 95 °C 下孵育 5 分钟，随后在 4–20% 梯度 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上进行分离23。

脂质体漂浮实验

将纯化的 APT2 蛋白（50 微克）与 200 微升脂质体（卵磷脂（Avanti 131601C）、L-α-磷脂酰丝氨酸（Avanti 840032C）与 L-α-磷脂酰乙醇胺（Avanti 840026C）摩尔比为 2:2:1）在 10 摄氏度下孵育 2 小时。将混合物调节至 40% 蔗糖浓度后，加样至蔗糖梯度分层离心管底部（梯度为 40%/30%/10% 蔗糖）。在 100000 倍重力加速度下离心 1 小时后，收集每个界面的 10 微升样品并经4-20% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后用考马斯亮蓝染色分析（界面1：10%至30%之间，界面2：30%至40%之间，界面3：底部）。

免疫荧光显微镜法

细胞用4%多聚甲醛固定15分钟，随后用含2%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中的0.05%皂角苷进行透化处理。抗体在含0.05%皂角苷和1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中稀释。盖玻片与一抗在4℃下孵育过夜，用磷酸盐缓冲液洗涤三次后，再与二抗孵育1小时。

将盖玻片用 Fluoromount-(GTM)（00-4958-02）封片至载玻片上，Invitrogen）。图像采集方面，MEK3 切割实验使用配备 60x Plan apo Lambda D 油浸物镜和 sCMOS 相机（Teledyne Kinetix M-C）的转盘式共聚焦显微镜（倒置尼康 Eclipse Ti2 电动型），其余实验则使用共聚焦激光扫描显微镜（蔡司 LSM 700），并通过 (Fiji TM) 软件进行图像处理。

对于自动显微镜成像实验，将 HeLa 细胞以每孔 (5 ×10^{3}) 个细胞的密度接种于 Ibidi 96 孔板中，在含有 TRANSIT-X2（MIRUS）的转染混合物中直接加入 siRNA 进行基因沉默处理。72 小时后，用 3% 多聚甲醛（PFA）固定细胞，洗涤后进行免疫荧光染色。

通过自动转盘共聚焦显微镜检测EGF的摄取与降解

将RPE1细胞和RPE1 APT2基因敲除细胞以每孔1×10²⁸db3a-257c-4720-aae0-8bf070c02638个细胞的密度接种于Ibidi 96孔板中。24小时后，使用TRANSIT-X2转染试剂（MIRUS公司）向每孔转染0.1微克APT2-柠檬黄质粒。24小时后，将培养基替换为含0.5微克/毫升A647-表皮生长因子的温热培养基，将细胞在37℃下孵育15分钟，洗涤两次，随后在37℃温热培养基中继续孵育脉冲追踪实验指定的时间，最后用3%多聚甲醛固定15分钟⁵¹。固定完成后，将细胞与含0.01%皂苷、0.5%牛血清白蛋白以及2000倍稀释的Hoechst的磷酸盐缓冲液共同孵育。使用Biotek EL406洗板机洗涤该板3次，随后使用40倍水镜获取图像在配备1.15数值孔径浸油物镜的转盘共聚焦自动显微镜（Molecular Device公司产品）上进行成像。对于每个视场（FOV），采集5层间隔1微米的图像堆栈，并合成为最大强度投影图像。图像分析通过MetaXpress自定义模块编辑器软件完成。对图像进行分割以生成相关掩模，随后将掩模应用于荧光图像以提取相关测量数据。为了便于表皮生长因子（EGF）囊泡的分割，我们采用顶帽反卷积方法以降低背景噪声并突出明亮颗粒。在所有自动显微镜实验中，每个生物学重复至少对1000个细胞进行成像，并通过我们的高通量显微镜装置进行分析。未采用统计学方法预先确定样本量。使用科尔莫戈罗夫-斯米尔诺夫检验（结合计算P值的达拉尔-威尔金森-利利耶检验）检验数据是否符合高斯分布。对于非高斯分布，采用以下非参数检验：使用双尾曼-惠特尼U检验比较两种条件，或采用单因素方差分析（ANOVA；克鲁斯卡尔-沃利斯检验）结合邓恩检验对两个以上数据组进行比较。对于符合高斯分布的数据，采用双尾t检验比较两种条件下的均值，采用参数化单因素方差分析结合图基真实显著差异检验或邓内特多重比较检验对两个以上数据组进行比较。均值比较的显著性在图表中以星号表示；(^{*} P<0.05)：(**P<0.01) 与 (***P<0.001)。

表面生物素化

对表达内源性CMG2的RPE1细胞或转染了CMG2的HeLa细胞进行表面生物素化处理。转染72小时后，将细胞置于4℃摇床上冷却15分钟以阻断内吞作用。随后用冷PBS洗涤细胞三次用EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin（赛默飞世尔科技，无重量）在4℃下振荡处理30分钟。随后细胞用100mM氯化铵洗涤3次，每次5分钟，再在4℃下于IP缓冲液中裂解1小时。裂解液以5000转/分钟离心5分钟，上清液与链霉亲和素琼脂糖珠（西格玛）在4℃的转盘上孵育过夜。采用ECL试剂盒（赛默飞世尔科技）进行免疫印迹显影，在Vilber Lourmat公司的Fusion Solo成像系统上成像。使用厂商提供的Bio-1D软件进行光密度分析。

小鼠实验

ML349 溶解于磷酸盐缓冲液中的 50% 聚乙二醇 300 溶液中。对 11 周龄的雄性和雌性 C57BL/6-K18 小鼠，以每 2 天一次、40 毫克/千克的剂量腹腔注射 ML349^{52,53}。对照组小鼠注射等体积的聚乙二醇 300 溶液。经过不同天数的处理后，收集不同器官并提取蛋白质。

斑马鱼饲养与胚胎收集

成年斑马鱼（斑马鱼）以每升8条的密度饲养在聚碳酸酯水箱中，在标准饲养条件下连接至流通式循环系统⁵⁴。水温维持在26℃，光周期为14小时光照/10小时黑暗。水质参数持续监测并维持在pH值7.5（用碳酸氢钠调节），电导率为(600 mu S / cm^{2})（用氯化钙和Instant Ocean调节）。成年鱼每日投喂五次卤虫无节幼体和干颗粒饲料（Sparos）。转基因品系Tg(fli:eGFP)yt⁵和(Tg(gata1:DsRed) ^{sd2 56})购自瑞士伯尔尼大学Mercader实验室。

胚胎通过自然产卵获得，并在系统水中于28.5摄氏度条件下培养。为抑制色素沉着并便于活体成像，胚胎用0.002%的N-苯基硫脲处理从受精后1天（dpf）开始使用（PTU）。所有实验均在受精后4天以内的胚胎上进行，该阶段尚无法进行性别鉴定。

斑马鱼胚胎的显微注射与成像

受精后2天，斑马鱼胚胎通过机械方式去除绒毛膜，并筛选出同时表达fli1:eGFP和gata1:DsRed转基因的个体。注射前片刻，用0.016%的三卡因（MS-222）对胚胎进行麻醉，将其包埋在0.8%低熔点琼脂糖中固定，并以侧位方式固定在玻璃底培养皿上。

通过库维管向体循环进行微量注射，使用的是连接至显微操作器（IM-300，NARISHIGE公司）的气体驱动显微注射器（PV820，世界精密仪器公司），搭配拉制的硼硅酸盐玻璃微量毛细管吸头（世界精密仪器公司），并在SZ61体视显微镜（奥林巴斯公司）下进行观察。

炭疽致死毒素（LeTx）通过将9.25微摩尔的致死因子（LF）与6.25微摩尔的保护性抗原（PA）混合制备，添加0.1%的酚红后置于冰上保存直至使用。在去酰化抑制处理实验中，LeTx分别与三种不同浓度的Palmostatin B或ML349混合（Palmostatin B的浓度为1、10和100微摩尔，ML349的浓度为1、5和50微摩尔）。每个胚胎接受两次连续的压力脉冲注射，每次注射量约为2纳升，总注射体积为4纳升，最终每个胚胎的LF含量为37飞摩尔，PA含量为25飞摩尔，具体方法参考Bolcome等人2007年的研究38。对照组胚胎注射等量的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。最后一次脉冲注射完成后立即启动后续分析的计时。

注射后，将胚胎转移至含有0.002% PTU的新鲜系统水中，于28.5℃条件下培养。注射后24小时进行表型评分。成像时，将胚胎包埋在玻璃底培养皿的0.8%低熔点琼脂糖中（美国 MatTek 公司），并用 0.008% 的三卡因麻醉。使用配备 MVPLAPO 1× 物镜和 SOLA 固态光引擎（Lumencor 公司）的 MVX10 宏观视野显微镜（Olympus 公司），借助 cellSens Standard 2.3 软件（Olympus 公司）获取荧光图像和延时电影。

为了观察节间血管、主动脉和尾静脉中的灌注情况与血流，使用配备 HC FLUOTAR 25× 0.95NA 水浸物镜的倒置 LEICA 共聚焦 SP8 显微镜，搭配混合光子计数探测器（HyD）对同一批胚胎进行成像。对每个胚胎以 1 微米的步长采集 z 轴堆叠图像。所有样本均采用相同参数采集每张图像。图像后续通过 ImageJ 1.54p 版本进行处理。图中展示的是 40-50 微米深度的最大强度投影，该深度约占胚胎体积的一半，涵盖主动脉、尾静脉以及节间血管。图像裁剪均采用固定的感兴趣区域（ROI）尺寸完成。

鱼类数据分析

数据以每个处理组中受影响胚胎数占总胚胎数的百分比表示。在4次独立重复实验中，每种实验条件下至少分析20个胚胎。

数据可用性

所有图表及补充图表的源数据均已提供在源数据文件中。所有未裁剪、未处理的印迹图已提供在补充信息文件中。

统计学与可重复性

未使用统计方法预先确定样本量。分析中未排除任何数据；实验未进行随机分组；研究人员在实验过程及结果评估中未对分配情况设盲。