题目：Egg Yolk-Derived Peptide VPF Orchestrates OPG/RANKL/RANKMediated Signaling to Suppress Osteoclast Differentiation and Facilitate Bone Development in Zebrafish

原文链接：https://pubs.acs.org/journal/acsodf

期刊：ACS Omega

摘要

本研究结合网络药理学、分子对接/分子动力学模拟及斑马鱼体内实验，旨在全面分析蛋黄源肽VPF（缬氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸）对骨骼发育的益处及作用机制。结果表明，在0.2~10 μg/mL浓度范围内，VPF对正常斑马鱼和骨骼发育异常斑马鱼均呈现剂量依赖性干预作用。具体而言，在正常斑马鱼模型中，0.2 μg/mL的VPF可使总长度、矿化程度和游动距离显著提升4.01%、14.00%和7.31%；而在骨骼发育异常斑马鱼模型中，1 μg/mL的VPF可使上述指标分别显著增加6.30%、45.26%和51.05%。随后的网络药理学分析显示，VPF改善骨骼发育的作用与破骨细胞分化通路的相关性最高，骨保护素（OPG）为该通路的核心节点。分子对接结果表明，VPF与OPG的结合亲和力最高，200纳秒的分子动力学模拟进一步验证了这一相互作用，证实了VPF-OPG复合物的稳定性。此外，VPF可上调斑马鱼体内OPG的基因表达，下调核因子κB受体活化因子配体（RANKL）和肿瘤坏死因子受体相关因子6基因（TRAF6）的基因表达，并降低斑马鱼体内RANKL/OPG的比值。上述数据表明，VPF主要通过OPG介导的OPG/RANKL/RANK轴内破骨细胞分化抑制作用来缓解骨骼发育异常，这为其作为促进骨骼发育的功能性食品原料提供了潜在价值。

引言

骨骼发育是一个高度协调且动态的生物学过程，涵盖成骨细胞和破骨细胞谱系细胞的增殖、分化、基质分泌及矿化，最终形成支撑机体、保护内脏、实现运动并维持矿物质稳态的框架。1 该过程的紊乱会导致儿童生长迟缓，表现为线性生长滞后、矿化不足及骨强度下降，给患儿带来严重的生理和心理负担。2−4 目前促进儿童骨骼发育的策略主要包括营养干预、科学运动方案、健康生活方式及医疗手段。营养干预聚焦关于补充锌、镁、维生素和蛋白质等关键营养因素的研究。5 运动建议强调高冲击负重活动和力量训练。6 当这些方法效果不佳时，会采用药物干预，主要涉及补充生长激素和钙。尽管这两种方法在改善方面均已显示出潜力骨骼发育不良，长期使用可能引发继发性高钙血症、胰岛素抵抗以及注射部位纤维化等并发症。7 因此，寻找安全有效的天然替代品以促进骨骼发育具有重要且迫切的意义。

食物来源的生物活性肽因其潜在的健康益处以及相较于其他物质更高的安全性而受到关注药物制剂。8-10 这是一个被广泛认可的范式食品肽研究表明，痕量内源性肽通过长期饮食积累发挥生理作用，而纯化/合成肽则以中等剂量使用用于机制验证的有效剂量。11−13 相关研究已研究证实，通过脱脂蛋黄酶解获得的蛋黄肽对骨骼健康具有有益作用。例如，有研究表明水溶性蛋黄肽可提高矿物质密度，从而发挥骨保护作用¹⁴。此外，研究人员还进一步证实，HEYP 可通过 MAPK/ELK1 信号通路促进成骨分化，进而起到强化骨骼的作用¹⁵。同时，近期一项研究显示，在骨质疏松症去卵巢大鼠模型中，蛋黄来源的肽可减轻骨质流失¹⁶。水解蛋黄粉通过调节骨骼代谢和肠道微生物组，促进大鼠骨骼生长发育¹⁷。水解蛋黄肽可通过调节脂质代谢，缓解去卵巢诱导的骨质疏松症¹⁸。然而，现有关于蛋黄肽成骨机制的研究仅局限于成骨细胞分化信号通路，目前仍不清楚蛋黄肽如何作用于破骨细胞分化。因此，阐明蛋黄肽与破骨细胞分化之间的关系具有重要意义。

研究表明，骨保护素（OPG）/核因子κB受体活化因子配体（RANKL）/核因子κB受体活化因子（RANK）信号通路在调节破骨细胞的分化与成熟过程中发挥关键作用。19 骨保护素是肿瘤坏死因子受体超家族的分泌型糖蛋白，是骨代谢的核心调控因子。20 它可中和核因子κB受体活化因子配体，阻止其与核因子κB受体活化因子结合，进而阻断驱动破骨细胞形成的核因子κB受体活化因子配体-核因子κB受体活化因子信号级联反应。分化、激活和存活。21,22 在骨骼形成过程中生长方面，骨保护素通过抑制破骨细胞生成维持骨形成与骨吸收的平衡。23 因此，骨保护素/核因子κB受体活化因子/核因子κB受体活化因子配体轴不仅是骨骼稳态的核心，也是生长相关疾病发病机制的关键所在发育迟缓、骨质疏松症和类风湿关节炎。

本研究旨在全面分析蛋黄源肽VPF在骨骼发育中的有益作用及其潜在机制。本研究选用正常和骨发育异常的斑马鱼，全面评估蛋黄源VPF促进骨骼发育的有益作用。随后，结合网络药理学、分子对接和分子动力学技术，确定VPF促进骨骼发育的潜在作用靶点。为探究VPF促进骨骼发育的作用机制，本研究进一步分析了破骨细胞分化的关键调控轴——OPG/RANKL/RANK信号通路中关键基因的表达情况。研究结果为将VPF开发为下一代骨骼健康功能性食品成分或营养补充剂提供了科学依据。

结果

VPF 可促进正常斑马鱼的幼体生长、骨矿化和运动能力，且不引发软骨异常

为评估幼虫的体细胞生长情况，研究人员在受精后第7天测量了其总长度。与对照组相比，0.2−2 微克/毫升的VPF以剂量依赖的方式显著增加了幼虫的总长度，在0.2 皮克/毫升时增幅达到4.01%（(P<0.01)）（图1A），表明该肽具有促进生长的潜力。为进行全面的骨骼评估，对幼虫进行了茜素红S和阿尔辛蓝染色。茜素红S在矿化骨骼中形成红色的(Ca^{2+})螯合复合物28,29，而阿尔辛蓝则通过静电结合软骨糖胺聚糖30,31。在0.2−10 μg/mL的VPF作用下，矿化强度和面积显著升高；0.2 μg/mL浓度使矿化程度提高了14.00%（(P<0.05)），而0.5-2 μg/mL浓度则使其提高了22.00%（(P<0.01)）、23.10%（(P<0.01)）、23.10%(P<0.05) 图1B-D），显示钙沉积增强。重要的是，对照组与VPF组的软骨形态未检测到显著差异；两组均表现出清晰且结构完整的软骨（图1E−I），证实VPF能促进发育且不诱发软骨损伤。此外，研究在光/暗周期下评估了作为骨骼功能间接指标的运动活性。31 VPF显著增加了总距离和平均速度；在5微克/毫升时，总距离和平均速度分别提升了36.66%（(P<0.05))和36.63% (P<) P<0.05），而10微克/毫升时则分别提升了36.86%（(P<) P<0.05）和36.80%（(P<0.05)) 图1J、K）。在2、5和10微克/毫升浓度下，活动频率和静止频率也得到了改善（(P<) P<0.01）（图(1 ~L, M），且在从黑暗到光照的转换过程中速度变化显著（图1N）。总体而言，VPF可增强斑马鱼幼体的骨骼矿化能力和运动能力。

图1.活动频率（L）、静息频率（M）和时程速度分布（N）。将正常斑马鱼在受精后3至7天（dpf）用浓度为0.2−10微克/毫升的缬氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸（VPF）处理。数据以平均值±标准误（每组n=(n=10)）表示。显著性水平：(* P<0.05)、(* * P<0.01)和(未来客户)，P<0.001，与对照组相比。VPF：缬氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸。阿尔辛蓝染色。（F−I）颅面结构的形态计量分析，包括角舌骨角（F）、下颌长度（G）、梅克尔软骨长度（I），以及颅间相对骨矿化强度（IOD）和矿化面积分析。（E）通过测量幼鱼总体长观察到的颅面软骨代表性图像。（B）通过茜素红S染色观察到的骨矿化典型图像。（C−D）定量分析。图1 缬氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸（VPF）促进正常斑马鱼幼鱼在受精后7天（dpf）的骨骼发育并提升运动能力。（A）移动距离；（J−N）运动活性评估，包括总移动距离（J）、平均速度（K）、典型距离（H）和运动轨迹速度分布（N）。

地塞米松诱导的骨发育不良模型的建立

糖皮 质激素被广泛用于治疗炎症性和自身免疫性疾病；然而，过量使用会抑制成骨细胞分化、诱导成骨细胞凋亡并促进破骨细胞生成，从而破坏骨形成与骨吸收的平衡，最终导致骨质疏松症。激动剂，其盐皮质激素活性极低，具有高效性以及骨骼发育异常。32,33 地塞米松（DEX）是一种纯糖皮质激素受体 # 输出要求 - 直接输出翻译结果，不添加任何其他内容，如括号、注释或解释 - **严格保留原文格式**：不得自行添加任何原文中没有的格式符号，包括 Markdown 标题（`#` `##` `###`）、加粗、列表等 - 输出中**严禁包含** `<context>`、`</context>`、`<originalContent>`、`</originalContent>` 结构标签 - 输出长度应与 `<originalContent>` 中的内容相当，**不得输出明显更多的内容**适用于斑马鱼幼虫的浸泡暴露实验，也可用于产生可重复的骨骼畸形表型。

为确定地塞米松（DEX）的最佳浓度，将斑马鱼幼鱼暴露于20–35微摩尔/升的环境中4天。在30微摩尔/升和35微摩尔/升浓度下，幼鱼总长度显著缩短，分别减少3.32%（(P<)，P<0.05）和3.39%（(P<0.05)，P<0.05）（图2A）。在20–35微摩尔/升范围内，矿化程度呈剂量依赖性下降（(P<0.05)，P<0.05），其中30微摩尔/升组的矿化程度降低了32.31%（(P<0.01)，P<0.05）（图2B–D）。与对照组相比，地塞米松处理的幼鱼麦克尔软骨变短、颅间距变窄、下颌长度缩短（(P<0.05)，P<0.05），进而导致头骨前部变窄、眼间距缩短、颅骨长度降低（图2E–I）。行为追踪结果显示，幼鱼的总移动距离、平均速度和活动能力均下降，尤其是30微摩尔/升组，移动距离减少33.07%、速度减少37.43%（(P<0.05)，P<0.05）（图2J–N）。综上，30微摩尔/升的地塞米松可稳定诱导斑马鱼幼鱼发生骨骼发育异常，因此被选为后续拯救实验的模型浓度。

图2. 7天龄（dpf）地塞米松（DEX）诱导的斑马鱼幼鱼骨发育异常特征。(A) 对照组与地塞米松处理组幼鱼的总体长对比，显示全身性生长迟缓。(B) 茜素红S染色可视化骨矿化的代表性图像。(C−D) 相对骨矿化强度（积分光密度，IOD）和矿化面积的定量分析。(E) 阿尔辛蓝染色可视化颅面软骨的代表性图像。(F−I) 颅面结构损伤的形态计量分析，包括角舌骨角（F）、下颌长度（G）、颅间距离（H）和梅克尔软骨长度（I）。(J−N) 运动能力受损的评估，包括总移动距离（J）、平均速度（K）、活动频率（L）、静止频率（M）和时程速度分布（N）。为建立骨发育异常模型，斑马鱼幼鱼在3至7天龄（dpf）时用30微摩尔地塞米松处理。数据以平均值±标准误（每组(n=10)）表示。显著性水平：与对照组相比，(* P<0.05)、(* * P<0.01)和(* * * P<0.001)均有显著差异。DEX：地塞米松。

卵黄肽VPF可缓解地塞米松诱导的斑马鱼骨骼发育异常

暴露于地塞米松后，斑马鱼幼虫的矿化程度显著降低、软骨缩短，运动能力受损，表型与以往研究报道一致。0.2−10 μg/mL 浓度的VPF干预可剂量依赖性地恢复幼虫的躯体和骨骼相关指标。与地塞米松组相比，总长度分别增加了3.57%（(P<0.05)）、6.38%（(P<0.001)）、6.30%（(P<0.001)）、6.30%（(P<0.001)）、6.00%（(P<0.001)）和5.89%（(P<0.001)），矿化强度则在测试浓度范围内分别提升了41.90%（(P<0.05)）、49.92%（(P<0.01)）、45.26%（(P<0.01)）、38.53%（(P<0.05)）、39.44%（(P<0.05)）和35.42%（图3A−D）。下颌麦氏软骨长度、颅间宽度及下颌长度均显著增加（(P<0.05)），且与空白对照组无显著差异（图3E−I），表明VPF可完全恢复骨骼发育，且无软骨异常。地塞米松还会降低幼虫的总游动距离、平均速度和活动指数。1−5 μmol/L 浓度的VPF可显著逆转这些运动功能缺陷：游动距离分别提升51.05%（(P<0.01)）、52.48%（(P<0.01)）和41.24%（(P<）（P<0.01），平均速度分别提升57.07%（(P<0.01)）、52.46%（(P<0.01)）和41.18%（(P<0.01)）（图3J-N）。综上，VPF可有效缓解地塞米松诱导的斑马鱼幼虫骨骼发育异常。

图3. 缬氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸（VPF）可减轻地塞米松（DEX）诱导的斑马鱼幼鱼骨发育异常，并在7天受精后（dpf）增强其运动能力。(A) 不同组的总体长（TL）测量结果。(B) 茜素红S染色可视化骨矿化的代表性图像。(C−D) 相对骨矿化强度（积分光密度，IOD）和矿化面积的定量分析。(E) 阿尔辛蓝染色可视化颅面软骨的代表性图像。(F−I) 颅面结构的形态计量分析，包括角舌骨角(F)、下颌长度(G)、颅间距离(H)和梅克尔软骨长度(I)。(J−N) 运动能力恢复评估，包括总移动距离(J)、平均速度(K)、活动频率(L)、静止频率(M)和时程速度分布(N)。幼鱼从3到7 dpf用30 μM地塞米松和不同浓度（0.2−10 μg/mL）的VPF联合处理。数据以平均值±标准误（(n=10 per)组）表示。显著性水平：* P<0.05、**P<0.01和***P<0.001与对照组相比；# P<0.05、##P < 0.01和###P < 0.001与地塞米松诱导模型组相比。VPF：缬氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸；DEX：地塞米松。

网络药理学揭示VPF通过靶向破骨细胞分化调控骨发育

为解析VPF促进骨合成代谢的分子机制，我们整合了靶点预测、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建和通路富集分析，开展了一套网络药理学分析流程。将VPF的结构上传至SuperPred、TargetNet和SwissTargetPrediction数据库；与GeneCards数据库中“骨生长发育”和“骨骼发育异常”相关条目取交集，得到194个共同基因（图4A）。通过STRING和Cytoscape构建PPI网络（图4B-C），并进行模块分析（(degree ≥2)，节点得分(≥0.2)、(k-core ≥2)），最终筛选出10个核心靶点：MMPB、PTGS2、CXCR4、TRAF6、LCK、AKT1、STAT3、NFKB1、TNFRSF11B和CDK4（图4D）。

KEGG 富集分析（图4E）和GO 分类分析（图4F、G）显示，预测靶点在破骨细胞分化、TNF 信号通路、NF-κB 信号通路、cAMP 信号通路、IL-17 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、Th17 细胞分化、生长激素合成/分泌以及 MAPK 信号通路中显著富集，这些通路主要归属于“环境信息处理-信号转导”超类。GO 术语涵盖骨组织发育、成骨、矿化和软骨发育（生物过程 BP），BMP 结合与细胞外基质结构成分（分子功能 MF），以及细胞外基质、质膜和细胞质（细胞组分 CC）。核心基因与 KEGG 通路的交集分析（图4H）表明，破骨细胞分化通路的连接性最高，涉及 AKT1、TRAF6、NFKB1 以及 TNFRSF11B（骨保护素 OPG）。因此，破骨细胞分化被选为后续机制验证的主要通路。

图4.网络药理学分析揭示VPF在骨骼发育背景下的潜在靶点及信号通路。(A) 韦恩图展示VPF、骨骼发育异常与骨生长/发育相关候选基因集的交集。(B−C) 基于STRING数据库构建的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，呈现所鉴定靶点的相互关联情况。(D) 基于网络拓扑分析的核心靶点鉴定与展示。(E−F) KEGG通路富集图谱与注释，重点突出破骨细胞分化和MAPK信号通路的参与。(G) 基因本体论（GO）富集分析，按生物过程、分子功能和细胞组分进行分类。(H) 整合的靶点-通路网络展示核心靶点与其调控的KEGG通路之间的复杂关联。所有网络可视化均使用Cytoscape软件完成。VPF：缬氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸三肽。

分子对接与动力学分析揭示卵黄肽VPF与骨保护素的高亲和力结合

将交集靶点AKT1、TRAF6、LCK、NFKB1和TNFRSF11B输入UniProt数据库，查询得到对应的蛋白名称分别为AKT1、TRAF6、LCK、NFKB1和OPG，随后对这些蛋白进行分子对接并计算结合能。分子对接结合能分析结果显示，VPF与TRAF6、NFKB1和OPG蛋白的结合能分别为−5.9、−5.8和(-8.2 kcal / mol,)（图5A）。结合能数值越小，说明化合物所需的自由能越少，对接能力越强，且分子对接后的稳定性越高。VPF与OPG的结合能最低，二者结合也更为稳定。为进一步研究二者结合的动态过程，本研究采用分子动力学模拟对其进行评估200纳秒内的动态变化。36RMSD 衡量的是特定构象中所有原子相对于参考构象的总偏差并且是判断系统稳定性的关键指标。37,38 作为如图5B所示，VPF与OPG蛋白的结合状态保持稳定。尽管在150纳秒左右出现一个小的波动峰，平均均方根偏差（RMSD）仍从0.4纳米上升至0.6纳米，这表明VPF进入结合位点后发生了短暂的构象调整，但随后迅速恢复至基线水平，并未破坏整体的结合稳定性。

RMSF 可反映蛋白质内氨基酸残基的柔性。37 残基波动分析显示，大多数残基的波动值处于 0.2−0.4 纳米范围内，但部分残基的波动值更高（((>0.5) 纳米），这些残基可能位于结合界面或具有柔性环区。整体波动水平表明结合区域具有一定的柔性，但未出现异常波动，佐证了结合的稳定性（图5C）。溶剂可及表面积结果显示，复合物在稳定阶段的溶剂可及表面积未显著增加，说明结合界面形成了有效的疏水核心，减少了溶剂暴露（图5D）。回旋半径维持在2.4±0.2纳米，波动系数较小，表明整体构象紧凑，未发生明显的解折叠或压缩，进一步验证了复合物的结构稳定性（图5E）。氢键数量在10个范围内动态波动，说明氢键在结合过程中发挥了关键作用（图5F）。尽管数量存在波动，但氢键始终存在，表明结合亲和力较强。同时，氢键曲线与均方根偏差基本同步，说明氢键的稳定性可能推动整个体系进入稳定状态。

如图(5 G, 5 H,)中的自由能低能区（蓝色区域）所示，该系统在特定的RG和RMSD数值附近具有最低的自由能，这表明VPF和OPG蛋白在这些构象下结合最稳定。39 同时，自由能低能区对应的稳定构象与RMSD分析结果一致。综合模拟结果表明，VPF与OPG蛋白之间的相互作用具有稳定性，且该相互作用可能通过特定的氨基酸残基和构象变化调控OPG的生物学功能。这些研究发现为后续的实验研究与药物设计提供了重要的结构基础和理论指导。

图5. VPF-OPG复合物在200纳秒轨迹下的分子对接与分子动力学（MD）模拟。(A) VPF对接至OPG蛋白活性口袋的代表性3D示意图与2D相互作用图。(B) 复合物主链的均方根偏差（RMSD）曲线，表明结构收敛且稳定。(C) OPG氨基酸残基的均方根波动（RMSF）值，反映VPF结合后蛋白的局部柔性。(D) 溶剂可及表面积（SASA）随时间变化分析。(E) 回旋半径（Rg）变化，表征蛋白-肽复合物的紧凑程度。(F) 分子间氢键数量变化，显示200纳秒模拟过程中持续存在的极性相互作用。(G−H) 2D与3D自由能面（FEL）分析，确定VPF-OPG复合物的热力学稳定性及主要构象簇。所有分子动力学分析均用于评估动态生理条件下的结合稳定性。VPF：缬氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸；OPG：骨保护蛋白。

VPF 调控 OPG/RANKL/RANK 介导的信号通路以抑制斑马鱼破骨细胞分化并促进骨骼发育

基于网络药理学分析结果，本研究开展了进一步验证，重点探究破骨细胞分化相关基因及信号通路的表达变化。实验结果显示，与骨吸收过程密切相关的基因，如骨保护素（OPG）（(P<0.05)）、核因子κB受体活化因子配体（RANKL）（(P<)，0.05）、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）（(P<0.001)）、P65（(P<0.01)）、JNK（(P<0.001)）、P38（(P<0.01)）等，在VPF干预后表达水平发生了变化，图6A-H也展示了这一变化。具体而言，在生长发育迟缓的斑马鱼中，地塞米松（DEX）处理显著提高了RANKL与OPG的比值，导致骨吸收过程增强；经VPF干预后，该比值显著降低，表明VPF可能通过调控RANKL/OPG比值抑制骨吸收、改善骨发育异常。

进一步的分析表明，VPF 干预不仅抑制了破骨细胞相关基因的表达，还与骨形成密切相关的基因被显著上调，包括转化生长因子β（对应ID：75ee407-dce5-4afd-9dbc-5adf1f119f17）、骨形态发生蛋白（BMP，对应ID：((P<)，0.05）、碱性磷酸酶（ALP，对应ID：(P<0.05)）等（图6K）。这些基因在骨发育中发挥关键作用，其上调表明VPF可能通过促进这些基因的表达来加速骨形成。根据机制图（图6L）可知，VPF上调骨保护蛋白（OPG）的表达，阻断核因子κB受体活化因子配体（RANKL）与核因子κB受体活化因子（RANK）的结合，进而抑制肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）介导的核因子κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK，JNK/P38）信号通路，降低核因子活化T细胞胞质1（NFATc1）的转录活性（对应ID：((P<0.01))），最终减少破骨细胞特异性基因（抗酒石酸酸性磷酸酶，TRAP，对应ID：((P<0.01))）的表达。同时，VPF激活转化生长因子β/骨形态发生蛋白/母系同源物（TGFβ/BMP/Smad）信号通路，促进成骨相关基因（碱性磷酸酶，ALP）的表达，增强成骨细胞的分化与矿化能力。这种“双向调控”机制使VPF在促进骨形成的同时抑制骨吸收，有效恢复骨发育平衡。

图6. 长春花总生物碱（VPF）通过调节7天龄斑马鱼幼虫的骨保护素（OPG）/核因子κB受体活化因子配体（RANKL）/核因子κB受体活化因子（RANK）信号级联反应，减轻地塞米松（DEX）诱导的骨骼发育异常。(A−K) 通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测的关键破骨和成骨标志基因的相对mRNA表达水平，包括骨吸收相关基因，如骨保护素（opg）(A)、核因子κB受体活化因子配体（rankl）(B)、肿瘤坏死因子受体相关因子6（traf6）(C)、核因子κB p65亚基（p65）(D)、c-Jun氨基末端激酶（jnk）(E)、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38）(F)、活化T细胞核因子1（nfatc1）(G)和抗酒石酸酸性磷酸酶（trap）(H)；以及骨形成相关基因如转化生长因子-β1（I）、骨形态发生蛋白2（J）和碱性磷酸酶（K）。（L）综合示意图展示了血管内皮生长因子相关肽如何调控骨保护蛋白/核因子-κB受体活化因子配体轴，以抑制破骨细胞分化并促进骨骼发育的机制。在7天龄时，每个重复从30条幼鱼的混合样本中提取总RNA。数据以平均值±标准误表示（(n=3) 生物学重复）。显著性水平：(* P<0.05)、(* * P<0.01) 与对照组相比；(# P<0.05)、(# # p<0.01) 和(###P < 0.001) 与地塞米松诱导的模型组相比。

综上所述，VPF通过调控OPG/RANKL/RANK信号通路实现对破骨细胞分化的负向调控，并协同激活TGF-β/BMP/Smad信号通路以促进成骨细胞分化，因此在体外和体内实验中均表现出显著的骨保护作用。这一发现不仅加深了对VPF作用机制的理解，也为针对骨发育异常的功能性食品开发提供了新的理论依据。

讨论

  骨骼发育不良及其伴随的生长迟缓是一项重大的全球健康负担。在过去十年中，从食物蛋白质中挖掘骨活性肽已成为功能性食品和营养保健品领域极具前景的研究方向。本研究提供了系统性证据，证明卵黄来源的三肽VPF可促进斑马鱼的生理性骨骼发育，并挽救地塞米松（DEX）诱导的斑马鱼骨骼发育不良，同时明确了其作用的分子机制。

斑马鱼具有光学透明性、发育迅速的特点，遗传易操作性、高繁殖力和低成本优势40,41，并且成为研究早期成骨作用的首选脊椎动物模型。42 利用钙黄绿素、茜素红S等荧光染料进行实时高分辨率成像，可直接可视化软骨内骨化和膜内骨化，43 并能评估骨骼对全身性因素的反应信号（激素、营养物质）⁴⁴,⁴⁵以及环境刺激（药物、有毒物质）。46 人类疾病基因中有 70% 在斑马鱼中存在直系同源基因，且代谢通路高度保守，47 该物种是解析骨骼发育分子机制的理想平台。在本研究中，我们证实 0.2−10 微克/毫升的 VPF 可显著增加正常斑马鱼幼体的总长度、骨矿化程度和运动能力，且不会引发软骨异常。这与近期食品肽相关研究的结果一致：吕等人（Lv et al.）报道全卵水解物促进大鼠骨骼生长¹⁷，而普林齐等人的研究表明，早期肽类营养会影响斑马鱼的骨骼形态⁴⁵。本研究将活性成分缩小至单一、明确的三肽，并提供了定量的表型细节，为配方研发提供了一种精准的功能性成分。为评估干预潜力，我们进一步建立了地塞米松诱导的骨发育不良模型，该模型可真实再现糖皮质激素过量的临床表型——线性生长迟缓、矿化不足以及活动能力下降，这与哺乳动物的相关表现一致数据。16,35 VPF 在营养水平下完全逆转了这些缺陷可实现的浓度下，这一效果与斑马鱼中松脂醇二葡萄糖苷的相关报道相当31，但所用物质为更小的食品级肽，适合口服递送。

近年来，网络药理学、分子对接与分子动力学模拟技术的结合已成为快速筛选生物活性肽靶点的有效工具。例如，乳铁蛋白肽ENLPEKADRDQYEL与表皮生长因子受体（EGFR）具有高的分子结合亲和力，从而促进成骨细胞增殖活性⁴⁸。海洋肽YPRKDETGAERT与整合蛋白对接的CDOCKER能量值为204.482千卡/摩尔，可促进MC3T3-E1细胞增殖⁴⁹。研究人员从星虫蛋白中提取出三肽亮氨酸-脯氨酸-赖氨酸（Leu-Pro-Lys），通过网络药理学技术预测其与骨骼发育的相互作用，发现该三肽可通过调控内分泌抵抗、松弛素信号通路和雌激素信号通路来促进骨骼发育⁵⁰。同理，本研究首次将上述三重技术策略应用于蛋黄来源肽VPF，预测其最佳作用靶点为骨保护素（OPG），表明VPF可能通过“抑制破骨细胞”而非单纯“促进成骨”的方式重塑骨平衡。OPG是RANKL的天然诱饵受体，当其与RANKL结合时，可阻断RANK-TRAF6-NF-κB-NFATc1级联反应，进而抑制破骨细胞分化和骨吸收¹⁹。本研究显示，VPF-OPG复合物在200纳秒分子动力学模拟下的均方根偏差（RMSD）为0.4–0.6纳米，且氢键相互作用持续存在，证实了该复合物的结构稳定性。在功能层面，VPF可降低RANKL/OPG比值，下调NFATc1和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的表达，直接复现OPG过表达的表型，从结构和功能两方面验证了其作为“OPG增强剂”的作用。

有趣的是，目前关于蛋黄肽的研究聚焦于促进骨信号传导：蛋黄肽通过MAPK/ELK1信号通路促成成骨分化；51 蛋黄肽激活Wnt/β-连环蛋白信号通路以诱导RUNX2表达，促进成骨与成骨细胞分化，从而改善骨质疏松症16 以及与骨骼生长相关的血清代谢物17；蛋黄肽通过激活BMP2/RUNX2通路、抑制Akt/PPARγ通路，减少脂肪生成并促进骨形成18。相比之下，本研究首次将蛋黄肽的功能拓展至“破骨细胞抑制”，通过直接靶向OPG实现对破骨细胞分化的负向调控，补齐了“成骨-破骨”双向调控的最后一块拼图。与现有肽类基因谱一致，黄瓜籽肽下调RANKL/TRAF6并抑制NFATc1的表达52；小麦胚芽肽抑制破骨细胞分化特异性基因c-fos、NFATc1、TRAP和CTSK的表达20；脱盐鸭蛋清肽通过调控RANK的表达降低其水平Runx2和OPG的上调。53 水溶性蛋黄组分FC抑制了关键破骨细胞标志物TRAF6、NFATc1和组织蛋白酶K的表达，从而促进破骨细胞凋亡。54 在本研究中，VPF同时下调RANKL、TRAF6、JNK、P38、P65、NFATc1和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP），同时上调OPG、转化生长因子-β1（TGF-β1）和骨形态发生蛋白2（BMP2）。本研究首次在食品源肽中实现了以“OPG为中心”的双向转录调控，为精准营养干预提供了分子标志物。

通过“网络对接动态基因”四重证据，我们证实VPF是天然的骨保护素增强剂，且在模拟胃肠道酶解后仍能稳定存在。它可通过介导骨保护素/核因子κB受体活化因子配体/核因子κB受体活化因子（OPG/RANKL/RANK）通路抑制破骨细胞分化，并通过介导转化生长因子β/骨形态发生蛋白（TGFβ/BMP）通路协同激活成骨细胞分化，从而双向重塑骨骼稳定性。未来研究将聚焦于将当前的体内研究结果与高分辨率机制研究及更广泛的生理验证相结合。具体而言，将采用破骨细胞模型（如核因子κB受体活化因子配体诱导的RAW264.7或骨髓单核细胞）和整体原位杂交技术，进一步阐明VPF的细胞特异性及时空机制。此外，还将在去卵巢大鼠或糖皮质激素处理的大鼠模型中验证VPF的口服生物利用度和长期安全性，为制定儿童骨骼发育不良的温和膳食干预策略奠定科学基础。

结论

本研究结合网络药理学、分子模拟与体内验证等整合方法，证实蛋黄来源的肽VPF主要通过调控OPG/RANKL/RANK信号通路来抑制破骨细胞分化，从而促进骨骼发育。在正常和骨发育异常的斑马鱼模型中，VPF给药均以剂量依赖的方式显著提升总体长、骨矿化程度和运动能力。分子分析证实，VPF可上调骨保护蛋白（OPG）的表达水平，同时下调核因子κB受体活化因子配体（RANKL），有效降低RANKL/OPG的比值并抑制骨吸收。这些发现不仅阐明了VPF在骨骼发育中的作用机制，也为开发促进骨骼健康的功能性食品或营养保健品提供了新的候选物质。未来研究将评估VPF在人体中的安全性、生物利用度和临床疗效，旨在将这种食物来源肽转化为治疗骨骼疾病的实用干预手段。

材料与方法

材料

蛋黄来源肽 VPF（缬氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸，纯度 98.0%，已脱盐）购自中国深圳博润思达生物科技有限公司。高效液相色谱法测定蛋黄水解物中 VPF 的含量为 0.5−0.75 毫克/克（表 S1）。二次离子质谱分析及化学结构式见图 S1。模拟胃肠道酶解过程见图 S2。甘油、氢氧化钾、(H_{2} O_{2}) 以及地塞米松（DEX）购自中国上海阿拉丁生化科技股份有限公司。氯化镁购自中国医药集团有限公司（上海）。茜素红S染色液和阿尔辛蓝染色液购自中国北京索莱宝生物科技有限公司。4%多聚甲醛购自中国合肥白鲨生物技术有限公司。磷酸盐缓冲液（PBS）购自中国辽宁迈伦生物技术有限公司。总RNA快速提取试剂盒购自中国杭州伊赛德生物技术有限公司，实时荧光定量PCR试剂盒购自中国南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

基于正常与骨发育异常斑马鱼的血管活性肠肽对骨骼发育影响的评价

成年斑马鱼饲养于28℃的恒温繁育系统中，每日固定时间采用14/10小时的光照周期，在指定位置投喂成熟虾 twice。实验前一日，将成年斑马鱼以雌雄2:2的比例放入鱼缸，用隔板分隔雌雄鱼，次日清晨移除隔板。约30分钟后，将鱼缸中的鱼卵转移至添加亚甲基蓝工作液的系统水中（500毫升系统水中加入80微升0.37克/100毫升的母液），随后置于28℃恒温光照培养箱中培养。受精3天后（dpf），随机选取幼鱼进行干预处理。本实验已通过浙江大学动物福利伦理审查委员会批准，伦理编号为ZJU20250166。

正常斑马鱼模型的实验设计骨骼发育

将3天龄（dpf）的幼年斑马鱼随机分配至6孔板中，每孔10条鱼，分为以下组别：空白对照组：仅含系统水；不同剂量VPF组：含VPF（0.1−10微克/毫升）的系统水。每日使用新鲜配制的含药系统水进行干预，直至7天龄（dpf）。测定斑马鱼的标准体长、骨骼茜素红S染色、软骨阿尔辛蓝染色、运动能力及基因表达情况。

斑马鱼骨发育异常实验设计骨骼发育模型

斑马鱼骨发育异常模型的建立

将3天龄幼龄斑马鱼随机分配至6孔板中，每孔10条鱼，分为以下组别：空白对照组：仅含系统水；不同剂量地塞米松组：含地塞米松（15-35微摩尔/升）的系统水。每日使用新鲜配制的含药系统水进行干预，直至7天龄。测定总长度、骨骼茜素红S染色、软骨阿尔新蓝染色、运动活性及基因表达情况。

地塞米松诱导的斑马鱼骨发育异常实验设计

为评估VPF对地塞米松诱导的斑马鱼骨发育异常的治疗效果，将3天龄（dpf）的幼龄斑马鱼随机分配至6孔板中，每孔10条鱼，并分为以下组别：空白对照组：仅含系统水；模型对照组：持续暴露于30微摩尔/升地塞米松的系统中；不同剂量地塞米松+VPF组：暴露于含地塞米松和VPF（0.1−10微克/毫升）的系统中。每日使用新鲜配制的含药系统水进行干预，直至7天龄（dpf）。测定总长度、骨骼茜素红S染色、软骨阿尔辛蓝染色、运动活性及基因表达水平。

总长度测量

将斑马鱼幼鱼培养至7天龄（dpf）后，使用0.008%的MS-222（甲磺酸三卡因）进行麻醉。确认鱼体麻醉完成后，将其转移至透明玻璃板上进行总长度成像。采用尼康SMZ18体视荧光显微镜，成像倍数设定为2倍，以幼鱼吻端（头部前端）至尾鳍末端的距离作为标准长度进行测量。

茜素红S染色用于骨

幼虫固定在4%多聚甲醛中（4℃，24小时），漂白（3%(H_{2} O_{2}+0.5 % KOH ,)30分钟），冲洗（25%甘油+0.1%KOH），并用0.01%茜素红S染色（2小时，深色）。连续洗涤（50%甘油+0.1%KOH）后，将标本安装在100%甘油中并成像。

软骨的Alcian Blue染色

固定幼虫（4%PFA，4℃，6小时）漂白，在PBST中冲洗，用0.05%Alcian Blue染色（过夜，深色），脱水（80%，50%，25%乙醇，各10分钟），重新漂白，清除（25%甘油+0.1%KOH），并拍照。使用ImageJ量化形态参数（颅间距离、角膜软骨长度、下颌长度和角膜角）。

运动活性

在7 dpf时，将单个幼虫置于96孔板的每孔200μL系统水中，驯化5分钟，并使用分析总距离、平均速度和活动频率。

生化分析

在7 dpf下，每组30只斑马鱼幼体随机采样，并汇集在200μL冰冷的PBS（pH7.4）中。为了确保完全的蛋白质提取和保持酶的稳定性，使用60 Hz的高速组织匀浆器将样品在冰上匀浆60 s。所得匀浆在4℃下以12,000g离心10分钟，以有效去除细胞碎片并获得透明的上清液。立即收集上清液（每组三个技术重复），并根据制造商的说明使用商业试剂盒（江苏美眠生物技术有限公司，中国）进行耐酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性定量。所有程序都在4℃下严格执行，以防止TRAP酶的潜在热降解…

网络药理学

使用SuperPred平台((probability ≥0.5 )）、TargetNet数据库((score ≥0.7 ))和SwissTargetPrediction((probability ≥0.1 )）预测蛋黄衍生肽VPF的潜在靶点同时，使用关键词“骨生长”从GeneCards和OMIM数据库中检索疾病相关靶点以及发育”和“骨骼发育不良”。对于 GeneCards，仅选择相关性评分为 (≥1.0) 的靶点以确保高相关性。使用维恩图确定 VPF 预测靶点与疾病相关靶点的交集，从而建立候选基因集。

随后将识别出的靶点导入STRING 12.0数据库（最低相互作用评分：高置信度0.700），以构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。使用Cytoscape 3.10.1对该网络进行可视化。为识别核心基因，采用MCODE模块，参数设置如下：度临界值=2，节点评分(cutoff =0.2)、(K-core =2)，以及最大(depth =100)。最后，利用DAVID 2021数据库进行GO生物学过程富集分析和KEGG通路分析。仅将p值为(<0.05)且错误发现率（FDR）<0.05的条目视为显著富集，并进行后续可视化处理。

分子对接与动力学

分子对接

从PDB数据库（https://www.rcsb.org/）获取核心靶标蛋白OPG、AKT1、TRAF6、LCK和NFKB1的结构文件。获取后利用Pymol软件去除结构文件中的水分子和小分子配体，得到蛋白受体文件。使用Maestro学术版构建多肽链，将其导入AutoDock Vina 1.1.2中进行加氢和加电荷处理，然后导出为配体文件。利用AutoDock Vina 1.1.2计算每对小分子配体与蛋白质受体文件之间的最佳结合区域。随后，通过半柔性分子对接计算各小分子与其靶点的亲和力值，并使用Pymol软件绘制多肽与靶点的结合构象图。

分子动力学

利用Gromacs v2024.6软件和CHARMM36力场，对从分子对接中获得的蛋白-肽复合物进行200纳秒的分子动力学模拟。模拟过程先通过L-BFGS算法对蛋白与小分子复合物的初始能量进行最小化处理并优化结构，以确保系统稳定性。随后，系统经历等容等温（NVT）和等压等温（NPT）平衡过程，温度和压力分别维持在300开尔文和1巴。借助力场提供的参数和算法计算系统的动态行为，并在200纳秒内完成生产型模拟。在整个在模拟过程中，采用了粒子网格埃瓦尔德（PME）方法，并通过LINCS算法约束了所有键长。

为评估结合稳定性与构象动态变化，研究人员利用 GROMACS 内置工具计算了均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）、旋转半径（((R_{g}))）以及溶剂可及表面积（SASA）。此外，研究人员在整个 200 纳秒的轨迹中监测了分子间氢键的数量，以评估 VPF-OPG 相互作用的动态稳定性。为进一步表征热力学稳定性并确定具有代表性的稳定构象，研究人员以 RMSD 和 (R_{g}) 为反应坐标构建了自由能面（FEL）。通过可视化能量区间和簇，研究人员确认了复合物在模拟过程中处于全局最低能量状态。

利用实时荧光定量聚合酶链反应分析测定信使核糖核酸表达量

每组取30只幼虫提取总RNA，26,27 反向使用HiScript III RT SuperMix（含gDNA清除剂）进行转录，并在CFX96系统上使用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix进行扩增。通过(2 Lambda^{(-Delta Delta C t)})计算相对表达量，以β-肌动蛋白作为内参。引物由浙江某生物技术有限公司设计，引物序列见补充文件的表S2。

统计分析

数据以平均值±标准误表示。差异采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey检验（GraphPad Prism 10.1.2）；(P<0.05) 被认为具有显著性。