题目：Cystobactamid off-target profiling reveals favorable safety, superoxide reduction, and SCARB1 inhibition in eukaryotes

原文链接：https://doi.org/10.1038/s44386-025-00020-7

期刊：npj | drug discovery

摘要

抗菌药物耐药性构成了根本性的全球威胁，亟需开发有效的治疗新策略。囊杆菌胺是一类以细菌旋转酶和拓扑异构酶IV为作用靶点的抗菌剂，属于具有广谱活性的非传统化学骨架。为降低毒理学风险，我们对真核细胞开展了全面分析，重点研究细胞毒性、遗传毒性和线粒体毒性，证实其具有细胞安全性及超氧化物清除特性。对斑马鱼胚胎的研究评估了发育毒性、心血管毒性和肝毒性，结果显示其体内安全性良好。代谢研究表明，葡萄糖醛酸化和酰胺键水解是关键代谢途径，考比司他联合治疗可显著提升囊杆菌胺的代谢稳定性。基于亲和性的蛋白质分析鉴定出胆固醇和丙型肝炎病毒受体B类1型清道夫受体（SCARB1）为主要的真核脱靶蛋白，且囊杆菌胺可抑制SCARB1的功能，从而阻止丙型肝炎病毒假病毒颗粒进入细胞。这些研究结果表明囊杆菌胺具有较高的治疗潜力，并揭示SCARB1是其主要的真核作用靶点。

包括欧洲药品管理局（EMA）和世界卫生组织（WHO）在内的顶尖卫生机构，将抗菌耐药性列为对患者日益增加的全球性风险，并且医疗系统抗生素在人类中的滥用与过度使用在动物体内也会推动多重耐药（MDR）细菌的产生与传播。与此同时，未来采用具有创新结构和作用机制的新型抗生素的治疗选择数量不足。此前发现的胱内酰胺类化合物（CYS）的研发或许有助于填补这一空白，因为它们是一类前景良好的广谱抗生素，包含一种新型骨架。

CYS 是源自囊球菌属和粘球菌属的天然产物⁷。它们对多种临床菌株具有抗菌活性相关的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，包括鲍曼不动杆菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的多重耐药菌株。CYS通过抑制细菌IIa型拓扑异构酶（旋转酶和拓扑异构酶IV）发挥全新的作用机制。近期研究揭示了结构相关的阿尔比西丁和CYS具有双重结合模式：分子的一端阻断旋转酶二聚体界面，另一端插入切割后的DNA片段之间，从而阻止DNA的再连接。值得注意的是，CYS以及结构相关的阿尔比西丁和珊瑚霉素类化合物，构成了一种新型化学骨架，该骨架由对硝基苯甲酸和多个通过氨基酸连接子连接的对氨基苯甲酸单元组成。这种新颖的结构以及无交叉resistancewithcommerciallyuseddrugsandtheirnewmechanismofaction有助于临床观察到的抗性破坏特性多药耐药病原菌的分离株。此外，CYS被证明具有低频耐药13，这对于作为抗生素的广泛和可持续使用至关重要。建立和改进了几个CYS的总合成，成功地产生了数百多个衍生物。这允许大规模生产和结构化对推导结构-活性和结构-性能关系的修改，以优化效力、抗菌谱覆盖率目标活性和物理化学性质。

为了确保疗效和安全性，需要在进入临床研究之前确定药理学和毒理学特性。事实上，候选药物在药物开发过程中失败的主要原因是缺乏疗效（52%）或不利的安全概况（24%）（2013-2015）。药物批准需要三个关键特性，即生产过程中的高质量标准、针对目标疾病或症状的疗效以及有利的安全概况。

在本研究中，我们评估了细胞、基因和有丝分裂毒性ofCYSderivativesCN-861-2、CN-DM-861andCysto-180usinginvitrocell培养模型，并通过体内斑马鱼胚胎模型研究了更复杂的器官毒性，包括一般发育、心脏和肝脏毒性。此外，在体外研究了CYS的代谢途径和生物转化，并提出了改善其体内暴露的策略。此外，通过基于亲和力的蛋白质组谱和功能抑制试验，在分子水平上识别和分析了CYS的真核脱靶蛋白，令人惊讶地发现了CYS作为抗菌剂之外尚未探索的潜在治疗领域。

结果与讨论

CYS在细胞毒性和遗传毒性检测中表现出普遍的安全性，对线粒体电子转移链（ETC）的解耦作用轻微

选择三种CYS衍生物（CN-861-2、CN-DM-861和Cysto-180；图1a）furtherinvestigatepropertiesof真核细胞的生物活性。选定的衍生物包括具有改进抗菌性能的早期前沿分子（CN-861-2和CN-DM-86115；前者因其可用性而成为本研究的主要参考化合物）和进一步改进的衍生物（Cysto-18013）。

由于CYSarebacterialtopoisomeraseII抑制剂，因此会影响DNA合成和修复6，CYS的一个明显的潜在脱靶分子是人DNA拓扑异构酶IIα（TOP2A）。一半的抑制浓度((IC_{50}))）为6.26-12.22μM（图1亿）againstTOP2Aweredetermined（CN-861-2(IC_{50}=6.26 pm 4.69 mu M)，CN-DM-861(IC_{50}=10.83 pm 2.38 mu M)Cysto-180(IC_{50}=12.22 pm 0.63 mu M)），其范围远远超过（约100倍）以前观察到的CYS对其目标病原体的最小抑制浓度（MIC）以及大肠杆菌回旋酶（CN-DM-861）上确定的(IC _{50})

细胞培养模型被广泛用于测定化合物的细胞毒性，并初步评估分子是否与影响细胞分裂和存活力的基本细胞功能相互作用。有趣的是，尽管CYS对分离的TOP2A活性具有抑制作用，但在其测试的溶解度范围内（针对所有测试的人类和非人类细胞系，((≤20 mu M))），CYS并未使细胞存活力出现任何降低（图1c）。Cysto-180的溶解度高于CN-861-2和CN-DM-861，可在更高浓度下进行测试。Cysto-180在 Huh-7.5或CHO-K1细胞中未产生细胞毒性效应，(IC_{50}>100 mu M)，这凸显了该化合物类别在细胞存活力测定中的安全性。由于我们仅观察到最低抑菌浓度（MIC）出现可忽略不计的变化（2倍），因此可以排除CYS与细胞培养基中存在的胎牛血清（FBS）结合导致假阴性结果的可能性。在细菌生长培养基（阳离子调节的穆勒-辛顿肉汤）中添加10%（体积/体积）胎牛血清（FBS）时，对参考菌株大肠杆菌ATCC25922进行了测试。

为了评估拓扑异构酶抑制或先前观察到的小沟结合是否会转化为细胞中的遗传毒性在细胞背景下，进行了微核试验。DNA交联剂丝裂霉素C（0.05微摩尔）、嵌入剂阿霉素（0.05微摩尔）以及拓扑异构酶II抑制剂依托泊苷（0.25微摩尔）均诱导了大量核芽/微核形成。值得注意的是，作为TOP2抑制剂的依托泊苷，尽管其浓度远低于针对TOP2A的半数抑制浓度（46.3微摩尔，由Inspiralis测定），但仍引发了显著的微核形成。CYS处理组中，当浓度超过其针对TOP2A的半数抑制浓度（20微摩尔，Cysto-180为100微摩尔）时，细胞也出现了一定程度的微核/核芽形成，但其程度与二甲基亚砜（DMSO）对照组相当（图1d、补充图1）。尽管在分离的蛋白水平上观察到了拓扑异构酶抑制作用，但这些结果表明，在完整细胞环境中CYS的遗传毒性相对温和，这可能与受试CYS衍生物的真核细胞被动膜通透性较差有关。尽管如此，仍强烈建议在CYS的研发过程中采取进一步的风险降低措施，因为基因毒性效应的可能性无法排除。

鉴于喹诺酮类抗生素已知会干扰线粒体拓扑异构酶和电子传递链蛋白，从而损害线粒体线粒体功能，进一步通过Seahorse XF Mito Tox测试了CYS采用安捷伦检测试剂盒评估线粒体毒性风险。该试剂盒检测经测试化合物处理的HepG2细胞的耗氧率（OCR）。检测过程中，加入寡霉素作为氧化磷酸化抑制剂，使线粒体内膜的电化学梯度过度饱和，进而导致耗氧率下降。随后加入羰基氰化物对三氟甲氧基苯腙（FCCP，离子载体），使电子传递链与氧化磷酸化解偶联，从而提高耗氧率。氧化磷酸化抑制表现为初始耗氧率下降，而解偶联则定义为加入寡霉素后耗氧率上升。此外，初始耗氧率及加入FCCP后耗氧率均降低，表明测试化合物对电子传递链存在抑制作用。CYS在初始条件下及加入FCCP后均未因耗氧量减少而表现出对氧化磷酸化或电子传递链的抑制作用²⁷。然而，在最高可溶性浓度下，CYS在加入寡霉素后使电子传递链与氧化磷酸化发生轻微但显著的解偶联，其线粒体毒性解偶联指数（MTI）为13%–17%（图1e、f）。这表明作为亲脂性弱酸的CYS可能充当线粒体质子载体，在线粒体内膜间穿梭质子²⁸。在线粒体内膜间隙的酸性环境中，CYS可能以中性电荷形式存在。这种质子化作用可增强其向线粒体基质的膜迁移，随后线粒体基质中的羧酸基团发生去质子化。该过程可能部分恢复电化学梯度，进而恢复电子传递链的功能。但如上所述，这种轻微的解偶联似乎并未对细胞生长和活性产生直接的有害影响。

图1），而丝裂霉素C处理的细胞则出现了广泛的微核形成。（细胞核染为白色，白色箭头指示微核，比例尺=50微米）(bar =50 mu m)）((n=3)) e 海马细胞线粒体毒性检测显示，CYS具有轻微的解偶联作用，表现为寡霉素处理后耗氧率（OCR）升高。将复合物I抑制剂鱼藤酮（Rot）与复合物III抑制剂抗霉素A（AA）联用作为阳性对照。数据以带标准差的平均值表示（(n=3 ×6)个孔）。f 展示了归一化平均值（以对照组最大耗氧率归一化的百分比形式）及标准差((n=3 ×6))。通过普通单因素方差分析并与二甲基亚砜（DMSO）处理的对照组进行多重比较，分析了寡霉素处理后耗氧率的统计学显著差异。（(^{* *} p<0.01) i (* * * * p<0.0001)）。采用小提琴图进行数据展示。

CYS处理显著减少了超氧自由基的生成

已有研究表明，抗感染药物会频繁影响线粒体功能。为探究因活性氧（ROS）水平升高所导致的潜在线粒体毒性，由于跨CYS 处理后电子传递链（ETC）的中断，超氧自由基（((O_{2}^{-}))）研究人员使用MitoSOX Red探针检测了线粒体超氧阴离子的产生情况。活性氧（ROS）是多种重要生物学功能的副产物，参与细胞稳态维持和信号传导过程。然而，由于细胞应激、（紫外线）照射或外源性物质导致的活性氧过量，会引发脂质、蛋白质和DNA等生物成分的氧化损伤，最终破坏其生理功能29。已有研究表明，体内活性氧水平升高会导致心力衰竭、肝功能衰竭等问题，同时增加死亡率，例如在相关研究中观察到了这一现象。属于蒽环类抗癌化疗药物。该超氧自由基是大多数活性氧的前体，因此可作为定量活性氧生成的指标。红色。b 相比之下，半胱胺类化合物对人DM-861（上图）和Cysto-180（下图）均表现出浓度依赖性抑制作用。N端的A环和B环通过氨基酸连接子与C端的C至E环相连。CN-861-2作为本研究的参照，衍生物之间的结构差异标注于图1中。| CYS在细胞毒性和遗传毒性试验中显示出总体安全性，涉及拓扑异构酶IIα。数据以平均值±标准差表示。采用非线性回归分析对(IC _{50})进行评估（((n=3))）。c 在溶解度范围内，CYS衍生物对人和非人永生化细胞系的细胞活力无不良影响（((n=3))）（n.d.，未测定）。d 经CYS处理的细胞出现的微核形成情况与二甲基亚砜对照组相当（另见补充材料）。电子传递链（ETC）。a 所测试的CYS衍生物CN-861-2（上图）的化学结构，以及对线粒体电子传递解偶联具有轻微作用的相关成分

将DMSO对照组与CYS处理组的超氧化物生成进行比较时，未观察到明显增加。令人意外的是，与对照组相比，CN-861-2和Cysto180处理的样品中超氧自由基水平出现了下降。我们还注意到CN-DM-861出现了沉淀现象，这可能是导致 （注：原文未完整结束，译文保留对应截断状态）由颗粒处的光散射导致的荧光强度被测定（图2a第一行、图2b）。为了研究CYS是否能够清除超氧自由基，我们通过氧化还原循环剂甲萘醌处理诱导活性氧（ROS）的生成，并使用(CYS ^{33})对细胞进行共处理。确实，在CN-DM-861和Cysto-180的存在下，未观察到超氧物的显著增加。经CN-861-2共处理的细胞，其超氧物生成量出现轻微但具有统计学意义的增加，尽管诱导作用仍显著低于甲萘醌对照组（图2a 底行，图2c）。

图2 | CYS处理显著减少了超氧自由基的生成。a U-2 OS细胞中的超氧生成情况（通过MitoSOX红色荧光标记（伪彩色红色）、Hoechst染色的细胞核（伪彩色蓝色）显示）（比例尺设为200微米）。b 经CN-861-2和Cysto-180处理后，细胞的基础超氧水平显著降低。对于CN-DM-861，观察到部分沉淀现象，且在最大可溶性浓度下未诱导活性氧生成。数据以平均值±标准差表示。统计显著性通过单因素方差分析结合对照组多重比较（A组）以及多组未配对两阶段t检验（B组）进行分析（((n=6))（ns 无显著性差异）；(^{*} p<0.05)、(* * * * p<0.0001)）。c CYS联合处理可抑制甲萘醌诱导的活性氧生成。

尽管如此，在半胱氨酸共处理的细胞中也观察到了一些轻微的形态异常，这表明未能实现全面的活性氧保护。然而，这些结果表明，半胱氨酸能够抵消甲萘醌诱导的超氧自由基生成，且提示半胱氨酸在一定程度上普遍能抑制活性氧的生成。这种效应部分可通过观察到的电子传递链轻微解偶联来解释。此前有研究报道，线粒体解偶联蛋白介导的轻度解偶联会因轻微的质子泄漏而减少超氧自由基的生成。这种质子泄漏可能会降低电子传递链中多余电子向氧气的传递（电子泄漏），而电子泄漏随后会导致超氧自由基的生成。此外，半胱氨酸的结构因其芳香族部分捕获的自由基共振稳定作用，还可作为自由基清除剂。这些发现表明，半胱氨酸不会诱导活性氧生成，而是作为抗氧化细胞应激的保护剂发挥作用。

CYS 在肝细胞中通过酰胺键水解和葡萄糖醛酸化代谢，这一过程可被可比司他补充抑制

对潜在新药的体外药物代谢与药代动力学（DMPK）特性进行研究，是其药理学和毒理学评估的关键环节，这对于评估药效与安全性特征至关重要。新分子的表征包括例如血浆或代谢半衰期，进而影响药物在相关体内腔室中达到足够暴露量的能力。此外，化合物的代谢途径可指导化合物优化，并可能对毒理特性产生影响，例如通过生成活性或毒性中间体，或消耗谷胱甘肽等解毒剂。

体外评价揭示了所测试的CYS在小鼠血浆中的代谢稳定性（((t_{1 / 2}>240 ~min))。在小鼠肝微粒体（MLM）中，观察到一些周转，衍生物之间略有差异。Cysto-180和CN-861-2稳定，120分钟后分别剩余(t_{1 / 2}>120 ~min)和81%和59%的母体化合物，而CN-DM861的半衰期为89分钟（表1）。当在含有I期和II期药物代谢酶全部补充的小鼠肝细胞中测试时，观察到CN-DM-861（((t_{1 / 2} 94 pm 15 ~min))和Cysto-180（(t_{1 / 2})41±16分钟）的降解，而CN-861-2稳定超过3小时（表1）。这些值令人鼓舞，特别是对于CN-DM-861和CN-861-2，CN-DM-861相当低的代谢清除率符合观察到的小鼠非代谢化合物的肾脏排泄。尽管如此，我们还是对CYS代谢途径的定性评估感兴趣。鉴定了CN-DM-861和小鼠肝细胞中不太稳定的Cysto180的代谢产物，目的是生成信息，指导进一步的化合物优化以降低清除率。此外，鉴于潜在的有毒代谢物，这些信息有助于未来的风险降低。这些研究揭示了亲本化合物的酰胺键水解和葡萄糖醛酸化是主要的代谢途径（补充图2-5）。特别是，C环与D环之间的酰胺键表现出代谢不稳定性。

结合这些研究结果，我们探索了化学优化的替代方案，评估了通过降低肝脏摄取来减少体内半胱氨酸（CYS）更新率的可能性。为此，我们研究了该药物在考比司他存在下的代谢稳定性。考比司他是有机阴离子转运多肽1B（OATP1B）和细胞色素P450 3A（CYP3A）的抑制剂，常与HIV治疗药物联合使用提高它们在体内的代谢稳定性。

事实上，补充剂以浓度依赖性的方式显著提高了CN-DM-861在小鼠肝细胞中的代谢稳定性。观察到的CYS稳定性提升是否仅与通过抑制OATP减少其向肝细胞的转运有关，还是也受到CYP介导的酰胺裂解减少的影响，这些实验无法给出完整答案。可比司他也能降低肝微粒体中CN-DM-861的代谢这一事实表明，从原理上讲，通过抑制CYP来减少CYS代谢是可行的（补充图6）。无论如何，CYS与可比司他的联合使用是一种有望增强其代谢稳定性和体内生物利用度的策略。不过，仍需在小鼠药代动力学研究中进行验证，以确定与可比司他联用是否能提升其体内稳定性。

所有化合物均表现出高血浆蛋白结合率（PPB 约为 96%–100%，见表1），由于游离药物的可利用度降低，这可能在体内引发相关问题。只有化合物的游离组分能够与其抗菌靶点相互作用，进而发挥药理作用。不过，此前的实验已证实，在多种小鼠感染模型的评估中，CYS 具备体内有效的药效。此外还需考虑，部分血浆蛋白结合甚至可能有助于延长代谢半衰期，并延长感染部位的药物作用时间。

对斑马鱼胚胎中CYS进行的体内毒性评估显示，其在发育、心脏功能或肝脏形态方面均未出现异常

体外实验足以在细胞水平上为新化合物的药理特性提供基础认知，但往往无法涵盖整个生物体的复杂性。斑马鱼胚胎可作为更复杂的体内模型，例如用于早期评估化合物潜在的（器官）毒性及其I相代谢潜能，II相代谢物。符合3R原则为了减少、优化并替代动物实验，我们采用了该模型，因为根据2010/63/EU指令，处于发育早期（受精后((≤120h)小时，hpf）的斑马鱼未被归类为动物模型。

发育毒性可由多种机制引发，包括化合物干扰基因表达、细胞生长与分化、体内稳态，或抑制血管生成。为探究潜在的发育毒性和体内遗传毒性，斑马鱼胚胎从发育早期（受精后1天，dpf）开始，在CYS存在的条件下培养至大多数器官发育完全（受精后5天，dpf）。阳性对照3,4-二氯苯胺⁴⁹处理组出现了脊柱弯曲、水肿等多种畸形，最终导致胚胎死亡。在最高测试可溶性浓度（20微摩尔）下，经CYS处理的斑马鱼胚胎直至受精后5天均未出现畸形，存活率达100%（图3a）。由于其在孵化培养基Cysto-180的测试浓度最高达200微摩尔，结果一致。因此，半胱氨酸（CYS）在斑马鱼胚胎中的最大耐受浓度高于其溶解极限。鉴于其强大的抗菌活性（最低抑菌浓度处于亚微摩尔范围15），这些数据表明半胱氨酸可能拥有较大的治疗窗口。

此外，有研究报道，对人类具有心脏毒性的物质，在斑马鱼胚胎中也能以极高的准确率表现出相同的毒性效应⁵⁰。尤其是人类醚-a-go-go相关基因（hERG）通道抑制，被视为预测心脏毒性的主要风险因素。抑制该离子通道会导致心脏QT间期延长，进而引发一种名为尖端扭转型室速的特异性心律失常，这种心律失常是与高死亡率相关21,51。表型终点在斑马鱼胚胎实验中测定的指标包括心率、心律以及心包水肿的发生情况44。用已知的hERG通道抑制剂特非那定处理后，胚胎的心包面积出现了显著的浓度依赖性增加（图3b、c）。此外，对心率的检测显示，绝大多数处理过的胚胎每分钟心跳次数显著减少，且呈浓度依赖性下降，同时出现明显的心律失常（图3d）。经CYS处理的胚胎既未出现心包畸形，心包面积和心率也无显著变化（图3b-d）。这些结果表明CYS在体内具有良好的心脏毒性安全性。

图3 | 对斑马鱼胚胎中CYS的体内毒性评估显示，其发育或心脏功能均未出现异常。a CYS未表现出体内发育毒性。所有经CYS处理的斑马鱼胚胎从受精后第1天至第5天（1–5 dpf）暴露处理后均存活，且发育无异常。CYS的最大耐受浓度高于其溶解度极限（((n=20))）。b 为评估心脏毒性，对斑马鱼胚胎从受精后第2天至第3天（2–3 dpf）进行CYS处理，未观察到心脏形态出现病理异常；而阳性对照特非那定处理组则可见心包水肿（白色箭头）（由BioRender绘制，Risch, T. (2025) https://BioRender.com/u43t186）。c 心包面积的统计评估显示，CYS处理的胚胎无异常，而特非那定处理后心包面积增大。d 胚胎心率的统计评估显示，CYS处理后心率无异常，而阳性对照特非那定处理后心率降低。图中为箱线图（四分位距Q1至Q3，含中位数），须线表示最小值至最大值。通过普通单因素方差分析（ANOVA）结合对照组多重比较检验分析统计学显著性（((n ≥20))）（ns 无显著性差异；(* * * * p<0.0001)）。

对于药物诱导的肝毒性，也观察到了人类和斑马鱼毒理学之间的相关性。体内肝毒性的评估提供了机会，不仅可以识别母体分子的毒性作用，还可以识别体内代谢物的潜在毒性。同时，考虑了药物及其代谢物的实际体内分布，如果化合物在某些隔室中显示积累，例如肝脏，这可能会造成不利影响。功能性毒性，例如胆汁酸泵抑制或脂肪变性，在体内也比在体外更有效地评估。对于中毒的斑马鱼胚胎，通过量化肝脏大小缩小和观察治疗后的组织学变化，可以很容易地观察到肝脏退化。

阳性对照丙戊酸drug-inducedhepatotoxicitywereproposed的几种机制，即活性代谢物的形成、线粒体功能和脂肪酸代谢的紊乱以及最终诱导氧化应激。

使用带有荧光肝细胞的转基因鱼系[Tg（Fabp10a： DsRed；elaA：EGFP）]，促进肝脏大小的定量45。丙戊酸处理的胚胎显示出显着的肝脏大小减少，反映了其肝毒性。CYS没有显示出任何明显的肝脏大小减少，因此表明在体内具有有利的和非肝毒性特征（图4a，b）。

图4 | 半胱氨酸（CYS）在斑马鱼胚胎中的体内毒性评估显示肝脏形态无异常。a 经CYS处理的斑马鱼胚胎未观察到体内肝毒性作用。以转基因斑马鱼胚胎[Tg(fabp10a:DsRed; elaA:EGFP)]处理后肝脏体积缩小作为终点指标进行检测。与阳性对照丙戊酸相比，通过对比荧光肝脏面积与肝脏体积来检查肝脏变性情况。展示了包含四分位数Q1至Q3（含中位数）及须线（最小值至最大值）的箱线图，用于肝脏体积的定量分析。通过单因素方差分析（ordinary one-way ANOVA）结合多重比较对对照组进行统计学显著性分析（((n ≥15))，ns表示无显著性差异）。b 与对照组相比，经CYS处理的胚胎肝脏体积未出现显著减小（(^{*} p<0.05)）。

分子脱靶鉴定显示SCARB1是真核生物中CYS的主要结合伙伴

表型检测提供了潜在中毒的全面概述；然而，他们经常未能提供对分子机制的见解，包括研究化合物的结合伙伴。

为此，我们设计并合成了CYS光探针Cysto-354，通过基于亲和的蛋白质谱（AfBPP）研究CYS的真核靶蛋白（补充图7-27）。Cysto-354是testedforpotentialcytotoxicity，revealingaslighteffectoncellviabilityatthe最高测定浓度（37μM），在任何测试的较低浓度下均无影响（((≤12.3 mu M))（补充图28）。

AfBPP 旨在通过光反应性交联，随后富集结合蛋白来鉴定分子结合伴侣。为排除富集但非特异性结合的蛋白，通过与未功能化母体化合物（此处为 CN-861-2）共同处理来竞争结合位点。在此类情况下，当存在母体化合物时，结合富集度降低则表明存在特异性结合。

通过对经Cysto-354处理的HepG2细胞（一种广泛用于药物候选物早期毒性分析的永生化肝细胞系）开展AfBPP分析，我们成功鉴定出显著富集的蛋白质。这些蛋白质属于由脂蛋白和脂质结合介导的胆固醇转运功能模块（图5a、b）。该功能模块内的蛋白质具有一个共同特征，即它们均与高度富集的胆固醇、脂质及脂蛋白受体——B类清道夫受体1型（SCARB1）发生相互作用。

通过对比显著富集和竞争的蛋白质，我们成功确定了清道夫受体B类1型（SCARB1）（图5c）和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3（LPCAT3）作为CYS的潜在特异性结合伴侣。为了深入了解不同细胞类型中的情况，本研究利用人胚肾细胞（HEK293，肾脏来源）和海拉细胞（HeLa，宫颈来源）两种细胞系对该实验进行了重复验证。结果显示，SCARB1在所有检测的细胞类型中均呈现富集状态，而LPCAT3在HEK293和HeLa细胞中均未出现富集（图5d、e）。转录共调节因子蝶螺蛋白（PIR）和酰基转移酶AGPAT2在所有细胞类型中均被检测到富集（图5e），但这两种蛋白质并未因添加CN-861-2而发生竞争，表明Cysto-35453仅与它们存在非特异性结合。值得注意的是，在HepG2、HeLa和HEK293细胞的全细胞环境中，未检测到人类拓扑异构酶（TOP1、TOP2A、TOP2B）的富集，这或许可以解释为何未观察到明显的细胞（基因）毒性（补充图29）。将SCARB1（Acrobiosystems公司产品）固定在包被有链霉亲和素的SPR传感器芯片上（传感器芯片SA，Cytiva公司产品）。所有测试的CYS衍生物（20微摩尔浓度）均与固定的SCARB1蛋白发生相互作用，表现出不同的结合动力学（图5f）。然而，竞争实验结果表明，CYS似乎并非仅与SCARB1发生特异性结合；同时，我们在实验中还观察到一些非特异性相互作用，其特征为随着CYS的接触时间和浓度增加，响应值超过了理论最大响应值(R_{max })（约41响应单位），且并未达到饱和状态。这种效应很可能由先前观察到的CYS芳香系统的π-π堆积作用介导，该作用发生于初始特异性结合之后⁵⁴。因此，我们无法可靠测定CYS与SCARB1的平衡解离常数((K_{D}))。

尽管如此，受这一发现的鼓舞，我们进一步针对 CYS 潜在的新型治疗适应症，对 SCARB1 的结合作用和功能抑制进行了表征。

图5 | 分子脱靶鉴定揭示SCARB1是CYS在真核生物中的主要结合伴侣。a 基于亲和的蛋白质谱分析（AfBPP）显示CYS光探针Cysto-354。亲和富集后，显著富集的蛋白质在胆固醇转移活性方面呈现功能聚类，这与脂蛋白和脂质结合相关（GO术语错误发现率：5.05e−7）（使用STRING数据库12.0版构建）。c SCARB1表现出最高的富集度，且在加入CN-861-2后出现显著竞争，表明CYS与其特异性结合。数据以平均值±标准差表示。显著富集和竞争通过双尾非配对Student’s t检验分析（(p<0.05) (* * * p<0.001)）((n=4)) d HepG2、HeLa-CCL-2和HEK293细胞经Cysto-354处理后显著富集的蛋白质列表。e CYS AfBPP在HeLa、HEK293和HepG2细胞中富集蛋白质的维恩图（使用BioVenn构建）。f 利用表面等离子体共振（SPR）进行的结合分析证实CYS与SCARB1蛋白结合，其结合响应超过了41响应单位（RU）的理论最大响应值（((R_{max }))）。

CYS与SCARB1的结合会功能性抑制HCVpp进入肝细胞

研究人员评估了清道夫受体B类I型成员1（SCARB1）的功能抑制情况，以探究半胱氨酸（CYS）与该蛋白质相互作用所产生的影响。

SCARB1 可结合磷脂、胆固醇酯、脂蛋白、磷脂酰丝氨酸等多种配体，尤其能以高亲和力结合高密度脂蛋白（HDL）。因此，SCARB1 在胆固醇代谢中发挥双重作用。首先，它能促进动脉壁等外周组织中的胆固醇外流，帮助清除多余胆固醇。其次，它是高密度脂蛋白胆固醇颗粒的重要受体，促进胆固醇、脂质和脂蛋白回流至肝脏。因此，它在许多生理和病理过程中发挥着至关重要的作用包括胆固醇和脂质稳态、心脏在内的生理过程血管疾病、肝病和癌症。

慢性丙型肝炎是一种会导致肝硬化和肝细胞癌的病毒感染。2019年，有150万人新感染丙型肝炎病毒，同年有29万人因感染相关原因死亡。感染后，丙型肝炎病毒以病毒脂质颗粒的形式在血液中循环，从而接触到肝细胞的基底外侧表面，并通过病毒脂质相关载脂蛋白E与低密度脂蛋白受体和糖胺聚糖的低亲和力相互作用附着在该表面。随后，清道夫受体B类I型结合病毒脂质相关脂蛋白，启动该蛋白的脂质和胆固醇转运活性，这可能介导病毒颗粒与其相关脂蛋白的解离。重要的是，SCARB1 与丙型肝炎病毒（HCV）表面糖蛋白 E2 结合，引发构象变化，从而使 CD81 能够结合 E2。因此，CD81 介导丙型肝炎病毒与紧密连接蛋白-1（CLDN1）的侧向移动和相互作用，促进其通过内吞作用进入细胞并释放病毒基因组（图6a）。

图6 | 半胱氨酸（CYS）与清道夫受体B类I型（SCARB1）结合可功能性抑制丙型肝炎病毒假型颗粒（HCVpp）进入肝细胞。a 已知清道夫受体B类I型（SCARB1）在丙型肝炎病毒脂病毒颗粒结合并转运至肝细胞的过程中发挥关键作用（由BioRender绘制。里施，T.（2025）https://BioRender.com/z15x436）。b 采用糖蛋白JFH-1（2a型基因型）进行丙型肝炎病毒假型颗粒（HCVpp）进入实验。半胱氨酸（CYS）与清道夫受体B类I型（SCARB1）结合会以浓度依赖的方式抑制丙型肝炎病毒假型颗粒（HCVpp）进入肝细胞。ITX5061用作阳性对照。c 采用糖蛋白Con1（1b型基因型）进行的丙型肝炎病毒假型颗粒（HCVpp）进入实验也显示，半胱氨酸（CYS）具有浓度依赖性的进入抑制活性。数据以平均值±标准差形式展示（((n=5))）

我们通过检测CYS处理后丙型肝炎病毒假病毒（HCVpp）进入肝细胞（Huh-7.5）的情况，探究了CYS与SCARB1的功能性相互作用。为此，我们采用了基于慢病毒的假型检测法，其中HCVpp配备了源自两种不同基因型的糖蛋白（2a型JFH1和1b型Con1）。以SCARB1抑制剂ITX5061作为阳性对照60，利用荧光素酶报告基因对HCVpp的进入效率进行定量分析。结果显示，对于两种测试的基因型，CYS处理均以浓度依赖的方式成功抑制了HCVpp的细胞进入。CN-861-2和CN-DM-861表现出相似的抑制能力，而Cysto-180是最有效的衍生物，在约3.3微摩尔浓度下即可实现50%的进入抑制（图6b、c）。

为阐明CYS抑制HCVpp进入受体SCARB1的特异性，我们检测了CYS对配备相应病毒糖蛋白的水泡性口炎病毒假型颗粒（VSVpp）的SCARB1非依赖性进入的影响。事实上，我们证实CYS对VSVpp的细胞进入无抑制作用（补充图30）。因此，这些结果为CYS介导的HCVpp细胞进入抑制是由其对SCARB1的功能性抑制所导致这一特异性提供了证据。

采用生物信息学分子对接方法（MOE），仅在SCARB1建模结构中识别出一个潜在的CYS结合位点。确定的结合口袋位于该蛋白的胞外结构域，这对于与天然结合伴侣的相互作用可能具有重要意义。CYS对该位点的阻断可能会阻碍这些结合伴侣与SCARB1的相互作用，这或许可以解释CYS对HCVpp进入的抑制特性。然而，根据对接结果，CYS在结合口袋中的多种结合构象均具有可行性（补充图31）。未来的研究将更详细地验证CYS与SCARB1的结合模式，并为通过结构导向优化来高效抑制这一宿主靶点提供可能。

这些研究结果不仅有望将CYS的潜在治疗应用从广谱抗生素拓展至抗病毒药物，还可适用于多种非抗感染适应症。CYS对SCARB1的抑制可能会影响其在体内的脂质和胆固醇转运活性。在以往的小鼠体内研究中，SCARB1的抑制作用由ITX5061成功提高了有益的高密度脂蛋白胆固醇水平，并部分减轻了动脉粥样硬化病变。此外，目前正在研究抑制SCARB1对多种疾病是否具有潜在治疗益处，这些疾病包括动脉硬化及其他心血管疾病、非酒精性脂肪肝，以及特定癌症与SCARB1基因上调相关的类型。对于ITX5061，其在人体中的安全性已得到证实，因此可以得出结论通过抑制SCARB1来调节细胞功能和脂质代谢并非特别需要关注的问题。然而，由于CYS对SCARB1的抑制是一项早期发现，未来的实验需要在专门的体内研究中验证CYS的疗效和安全性。

本研究证实了细菌酰胺类化合物在细胞培养实验以及斑马鱼胚胎体内模型中具有安全性。这类抗生素对线粒体电子传递链存在轻微的解偶联作用，这可能是其发挥活性氧保护特性的原因之一，而细菌酰胺类化合物凭借其结构特性，还可作为直接的自由基清除剂。从细胞活力以及斑马鱼胚胎的发育、心脏和肝脏毒性等方面评估，这种对电子传递链的影响在体外和体内均未表现出有害作用。体外药物代谢动力学与药物相互作用研究表明，葡萄糖醛酸化和酰胺键水解是细菌酰胺类化合物的主要生物转化途径。加入奥他匹克（一种有机阴离子转运多肽和细胞色素P450抑制剂）可显著提升其代谢稳定性，这为探索联合疗法作为改善细菌酰胺类化合物体内药代动力学/药效学特性的可行方法提供了可能。此外，在分子层面，细菌酰胺类化合物与胆固醇和脂蛋白受体B类清道夫受体1结合，这是其在全细胞环境中主要的真核生物脱靶蛋白。通过与B类清道夫受体1结合，这类化合物能有效阻止丙型肝炎病毒进入肝细胞。解析其与B类清道夫受体1的结合模式，可为细菌酰胺类化合物的进一步研发和优化提供指导。以及相关的化合物类别，如阿尔比西丁和珊瑚霉素，适用于各种可能的治疗领域。

方法

细胞培养

所有细胞类型均在37℃、5% (CO_{2})条件下培养。HepG2、HEK293、HCT116、CHO-K1、HeLa-CCL-2和Huh-7.5细胞购自ATCC。相应的细胞培养基（Gibco）在使用前添加了10%胎牛血清（FBS，Gibco）。细胞在第5代至第30代之间使用。为获得生物学重复，细胞至少单独传代两次。

拓扑异构酶IIα抑制

按照制造商的说明，使用人拓扑异构酶IIα解连环测定试剂盒（Inspiralis）检测拓扑异构酶活性的抑制情况。简要操作如下：在二甲基亚砜中配制化合物梯度稀释液。将水、稀释缓冲液、测定缓冲液、质粒与酶加入化合物溶液中，于37℃孵育30分钟。设置不加化合物的阳性对照（活性为100%），以及不加化合物和酶的阴性对照（活性为0%）。加入gSTEB缓冲液和氯仿/异戊醇（体积比24:1）终止反应。样品经涡旋振荡和离心后进行凝胶电泳。凝胶经溴化乙锭染色后，使用Fusion Fx凝胶成像仪（Vilber Lourmat）成像。后续分析采用ImageJ和GraphPad Prism（10.0.2版）完成。

细胞毒性

细胞用PBS洗涤后，加入0.5毫升胰蛋白酶。随后，将细胞孵育5分钟，再加入10毫升含10%胎牛血清的培养基。每孔接种120微升细胞悬液（约）将细胞接种于透明96孔细胞结合板中，孵育2小时（37℃，5% (CO_{2})）。在含10%胎牛血清的相应培养基中制备测试化合物的1:3系列稀释液，向制备好的细胞板中加入60微升稀释液。将细胞继续孵育72小时（37℃，5% (CO_{2})）。随后，向每孔中加入20微升MTT溶液（5毫克/毫升，溶于磷酸盐缓冲液），孵育2小时（37℃，5% (CO_{2})）。倒空各孔中的液体，每孔加入100微升异丙醇/10摩尔盐酸混合液（体积比1000:4）。

通过在570纳米波长下测定吸光度，对平板进行分析（使用 Infinite® 200 Pro 酶标仪，Tecan 公司生产）。将数据相对于各自的溶剂对照进行归一化处理后，使用 GraphPad Prism 软件（10.0.2版本）绘制出计算所得的生长抑制百分比。

最低抑菌浓度（MIC）

按照EUCAST指南，使用大肠杆菌ATCC25922，在阳离子调节的穆勒-辛顿肉汤（MHBII）中采用标准微量肉汤稀释法测定头孢西酮的最低抑菌浓度（MIC）。在第二项实验中，向MHBII中添加10%（体积比）胎牛血清（FBS），以模拟细胞培养实验的条件，并记录最低抑菌浓度的变化。

微核试验

CHO-K1 细胞按上述方法洗涤并接种，浓度为 (5 ×10^{4}) 个细胞/毫升。用 CYS（20 微摩尔/升，Cysto-180 用 100 微摩尔/升）处理细胞并孵育 24 小时。丝裂霉素 C（0.05 微摩尔/升）、阿霉素（0.05 微摩尔/升）和依托泊苷（0.25 微摩尔/升）用作阳性对照。洗涤细胞后，在 F12 培养基中用 Hoechst（5 微克/毫升，赛默飞世尔科技公司产品）染色 15 分钟。随后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞三次，使用 Cell Discoverer 7 蔡司显微镜进行成像。

线粒体毒性

按照安捷伦海马XF线粒体毒性检测试剂盒用户指南（试剂盒103595-100，安捷伦）执行海马线粒体毒性检测。简要来说，传感器板在37°C下进行水合处理，检测开始前一天在200微升水中水合，使用前在校准液中放置2小时。将HepG2细胞以每孔(10 ×10^{3})的密度接种于80微升培养基中，在37°C、5% (CO_{2})条件下孵育过夜。检测当天，通过添加葡萄糖（10毫摩尔）、丙酮酸钠（1.0毫摩尔）和谷氨酰胺（2.0毫摩尔）制备100毫升海马XF高糖杜氏改良伊格尔培养基。在检测培养基中制备CYS化合物稀释液，同时制备阳性对照甲萘醌（50微摩尔）和鱼藤酮/抗霉素A（1.0微摩尔）。用检测培养基洗涤细胞后加入化合物，随后在37°C、非(CO_{2})条件下孵育2小时。制备寡霉素（1.5微摩尔）和羰基氰化物对三氟甲氧基苯腙（1.0微摩尔），并加入到传感器板的相应孔位。将装有传感器板的检测板插入海马系统（安捷伦）中进行校准。之后放入细胞板，启动耗氧率的检测。该检测独立重复三次，每个条件至少设置6次技术重复。解偶联线粒体毒性指数的计算方法如下：  [Uncoupling MTI =frac{ Max Oligo OCR( Compound )- Min Oligo OCR( Vehicle) }{ Max FCCP OCR ( Vehicle )- MinOligo OCR( Vehicle )- MinO Iigo OCR( Vehicle )}]

线粒体超氧化物生成

研究检测了CYS在U-2 OS细胞中诱导氧化应激的潜力。为此，将120微升含(5 ×10^{4} cells / mL)的麦氏培养基（含10%胎牛血清）细胞悬液接种至黑色96孔成像板（BD Falcon）中。将培养板孵育两天（37℃、5% (CO_{2})），直至细胞汇合度达到约70%。随后，用汉克平衡盐溶液（HBSS）洗涤细胞，再加入CYS（20微摩尔）、活性氧诱导剂甲萘醌（50微摩尔，作为阳性对照）以及染色液（汉克平衡盐溶液、钙、镁、5微摩尔米托索红和10微克/毫升赫斯特（赛默飞））。为检测其活性氧保护特性，将甲萘醌（50微摩尔）直接加入染色液中。将细胞在37℃、5% (CO_{2})条件下孵育1-2小时。之后，用汉克平衡盐溶液洗涤细胞两次HBSS 中。使用自动荧光显微镜（Celldiscoverer 7，蔡司公司）对细胞进行成像（激发光：485 纳米，发射光：535 纳米），以分析超氧化物示踪剂 MitoSOX Red 的荧光强度。每个实验条件设置六个重复样本进行实验。采用蔡司 ZEN 软件（3.4 版，蓝色版）通过高内涵图像分析进行定量分析。数据展示使用 GraphPad Prism 软件（10.0.3 版）完成，通过普通单因素方差分析（ANOVA）结合对照组多重比较，对染色液中未经甲萘醌诱导活性氧（ROS）的样本进行统计分析。对于染色液中经甲萘醌孵育的活性氧保护特性样本，采用多重非配对 t 检验进行比较分析。

小鼠肝微粒体中的代谢稳定性

在评估I相代谢稳定性时，将化合物（1 μM）与0.5 mg/mL的混合小鼠肝微粒体（美国堪萨斯城Xenotech公司）、2 mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、10 mM氯化镁在37 ℃下于微孔板振荡器（德国汉堡Eppendorf公司）中孵育120分钟。同时测定睾酮、维拉帕米和酮康唑的代谢稳定性，以验证小鼠肝微粒体的酶活性。在联合实验中，将考比司他与待测化合物一同加入孵育体系。在设定的时间点，取等体积的酶体系，加入2倍体积的冷内标溶液（15 nM 苯海拉明溶于10%甲醇/乙腈）中使蛋白沉淀，从而终止孵育。样品全程置于冰上，孵育结束后通过离心（15分钟，4 ℃，4000 g）去除沉淀的蛋白质。采用高效液相色谱-串联质谱法（赛默飞世尔科技德国德赖艾希公司，Vanquish Flex 联用 TSQ Altis Plus）分析不同时间点剩余待测化合物的浓度，并据此计算半衰期（((t_{1 / 2}))

小鼠肝细胞的代谢稳定性

为评估I相和II相联合代谢稳定性，将化合物（1 μM）与(0.25 ×10^{6} cells / mL)混合小鼠肝细胞（美国堪萨斯城Xenotech公司）共同孵育。细胞在不含酚红的利波维茨L-15培养基（美国沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司）中解冻。简要操作如下：将细胞转移至50 mL培养基中，以55 g离心6分钟。弃去上清液，将细胞沉淀轻轻重悬于1 mL培养基中后计数肝细胞。将肝细胞稀释至0.5×1 (0.5 ×10^{6})个细胞/mL，在37 ℃、700 rpm条件下孵育10分钟，随后向培养基中加入等体积的待测化合物，使最终待测浓度为1 μM、二甲基亚砜（DMSO）浓度为1%，以达到目标细胞密度。样品在37 ℃、700 rpm条件下孵育240分钟，在指定时间点，将等份样品加入4倍体积的冷内标溶液（12.5 nM苯海拉明溶于10%甲醇/乙腈中）终止孵育。为测定考比司他存在时的代谢情况，将该药物与待测化合物一同按目标浓度范围加入。同时测定睾酮、维拉帕米、酮康唑和7-羟基香豆素的代谢稳定性，以验证小鼠肝细胞的酶活性。样品全程置于冰上保存，通过离心（15分钟，4 ℃，4000 g）去除沉淀的蛋白质。采用高效液相色谱-串联质谱法（赛默飞德国德赖艾希公司Vanquish Flex联用TSQ Altis Plus设备）分析不同时间点剩余待测化合物的浓度，进而测定半衰期((t_{1 / 2}))。内在清除率计算公式如下：  [C L_{int }left[frac{mu L}{min × 10^{6} cells }right]=frac{ Incubation volume [mu L] × ln (2)}{ Cells in incubation mixture left[10^{6}right] × t_{1 / 2}} (2)]

在代谢物鉴定研究中，将测试化合物以终浓度10微摩尔每升进行孵育，并使用高效液相色谱-高分辨质谱联用仪（赛默飞世尔科技公司，德国德赖艾希，与Q Exactive Focus联用的Ultimate 3000）对样品进行分析。液相色谱条件如下：色谱柱为Accucore Phenyl-Hexyl柱（2.6微米，100×2.1毫米；赛默飞世尔科技公司，德国德赖艾希）；柱温40摄氏度；流速0.500毫升/分钟；流动相A为水+0.1%甲酸；流动相B为乙腈+0.1%甲酸；梯度洗脱：0–4.0分钟2–35% B，4.0–7.0分钟；35–98% B，7.0–8.0分钟；98% B，8.0–10.0分钟；2% B。质谱分析采用全扫描模式进行（极性切换，全质谱分辨率35,000，扫描范围200–2000；数据依赖型二级质谱分辨率17,500，阶梯式碰撞能量为17.5、35、52.5）。平行运行以二甲基亚砜为溶剂的空白样品以扣除背景信号。代谢物鉴定的样品前处理采用Compound Discoverer 3.2软件（赛默飞世尔科技，德国德莱艾希）完成。代谢物的鉴定基于质量偏移、代谢反应的可行性，同时结合质谱峰强度随时间的变化情况。

斑马鱼处理

成年斑马鱼的处理及斑马鱼胚胎实验均按照欧盟2010/63/EU指令和《德国动物福利法》（《动物福利法》第11条第1款）进行。斑马鱼饲养采用自动水生生态系统（英国Apoka公司PENTAIR品牌）。成年斑马鱼在交配笼中放置一晚后（光暗周期：14小时/10小时），在斑马鱼养殖设施内成对交配。交配2小时后收集鱼卵，置于装有养鱼水（pH值7.36±0.08，电导率800±50微西门子）的培养皿中。鱼卵用0.3倍丹尼奥氏培养基（17毫摩尔氯化钠、0.2毫摩尔氯化钾、0.12毫米(MgSO_{4}) (0.18 mM Ca(NO_{3})_{2})、1.5毫摩尔羟乙基哌嗪乙磺酸，pH值7.1–7.3，以及1.2微摩尔亚甲基蓝）清洗。每个培养皿放置300枚鱼卵，置于28℃培养箱中过夜。交配24小时后，剔除未受精的鱼卵。培养皿中的0.3倍丹尼奥氏培养基每24小时更换一次，出现发育异常的胚胎用冰水实施安乐死。  使用受精后120小时内（hpf）的斑马鱼胚胎进行胚胎/基因毒性、心脏毒性和肝毒性测试。胚胎/基因毒性和心脏毒性测试采用野生型AB品系，肝毒性评估采用转基因品系Tg(fabp10a:DsRed; elaA:EGFP)。为进行肝毒性和心脏毒性分析，从受精后1天（dpf）开始用苯硫脲（PTU）处理胚胎。添加化合物前，用蛋白酶（1毫克/毫升）对胚胎进行去卵膜处理并多次清洗。胚胎在受精后最长120小时于冰上实施安乐死，随后在-20℃冷冻保存。

最大耐受浓度（MTC）

斑马鱼胚胎（AB品系）在受精后1天（1 dpf）用蛋白酶去除卵膜。进行胚胎/基因毒性测试时，每种条件下的20枚胚胎从受精后1天至5天（1 dpf至5 dpf）分别用20微摩尔CN-861-2、CN-DM-861（溶解度上限）以及200微摩尔（溶解度上限）、100微摩尔、50微摩尔和20微摩尔的Cysto-180处理。二甲基亚砜（0.2%）作为阴性对照，(3,4)-二氯苯胺（16微克/毫升）作为阳性对照。进行急性体内毒性测试时，胚胎从受精后4天至5天（4 dpf至5 dpf）分别用CYS的最大可溶性浓度、二甲基亚砜（0.2%，阴性对照）以及3,4-二氯苯胺（32和64微克/毫升，阳性对照）处理。采用GraphPad Prism软件（10.0.3版，美国马萨诸塞州波士顿市GraphPad公司）绘制凯普兰-迈耶曲线。当观察不到心跳时，判定胚胎为死亡。

斑马鱼胚胎的体内心脏毒性

按照上述方法制备胚胎。在受精后第2天（2 dpf），将胚胎置于6孔板中，每孔10枚胚胎。在达尼奥氏培养基（Danieau’s media）中，用半胱氨酸（CYS，20微摩尔）和阳性对照特非那定（10、20微摩尔）处理胚胎，仅含二甲基亚砜（DMSO）的达尼奥氏培养基作为阴性对照。每种处理条件至少检测20枚胚胎。将胚胎置于28℃条件下孵育24小时。  随后，向培养基中加入三卡因（tricaine，40微克/毫升，0.004%（质量/体积））对胚胎进行麻醉，使用体视显微镜（蔡司Stemi 508，放大倍数1.25倍）搭配Media Recorder软件（4.0版本）录制视频，并通过DanioScope软件（1.2.208版本，Noldus公司）进行分析。重点观察胚胎是否出现特定的心脏毒性表型，包括心率下降、心律失常和心包水肿。以无心跳作为胚胎死亡的判定标准。  数据展示与统计分析采用GraphPad Prism软件（10.0.3版本）完成，使用单因素方差分析（ordinary one-way ANOVA）进行组间多重比较，并通过非配对t检验进行统计分析。

斑马鱼胚胎的体内肝毒性

斑马鱼胚胎 [Tg(fabp10a:DsRed; elaA:EGFP)] 按上述方法制备。将胚胎置于6孔板中，每孔10枚胚胎。从受精后第3天至第5天，在0.3倍达尼厄氏培养基中通过浸泡法用CYS以及阳性对照丙戊酸（20、40 µg/mL）进行处理。每个条件下至少处理15枚胚胎。含二甲基亚砜的达尼厄氏培养基作为阴性对照。胚胎在28℃下培养。处理48小时后，使用体视荧光显微镜（M205 FA，徕卡）观察胚胎肝脏退化情况。用三卡因（40 µg/mL）麻醉胚胎后，以侧位拍摄荧光图像（激发光波长558 nm，发射光波长583 nm，放大倍数35倍）。特异性表型肝毒性终点为肝脏退化，定义为肝脏体积缩小。使用ImageJ软件计算肝脏体积（格式：8位，阈值：40–255，二值化，颗粒大小：10.0-无限大）。将对照组胚胎的肝脏体积设为100%，并据此计算处理组胚胎的相对肝脏体积，以对照组为基准进行标准化。数据展示使用GraphPad Prism软件（10.0.3版本）完成，采用单因素方差分析并与对照组进行多重比较以进行统计学分析。

基于亲和性的蛋白质谱（AfBPP）样品制备

将细胞以每样本 (2.8 ×10^{6}) 个细胞的浓度接种于 100 mm 细胞结合培养皿中，在（37 °C、5% (CO_{2})）条件下孵育 3 天，至约 80% 汇合度。加入化合物前，先用预热的 PBS 洗涤细胞。化合物溶液以及 DMSO 对照品通常以新鲜配制的溶液形式，加入预热的无血清培养基中。通过用 Cysto-354（2.5 微摩尔）处理相应细胞系 3 小时，进行基于亲和作用的蛋白质组分析。对于竞争样本，先用 CN-861-2（12.5 微摩尔）处理细胞 1 小时，再加入光探针 Cysto-354（2.5 微摩尔）孵育 3 小时。对照样本用 DMSO 处理。之后，将细胞在冰上进行 10 分钟紫外照射，刮取后转移至离心管，用 1 毫升冷 PBS 洗涤（500g、4 °C 离心 5 分钟）。细胞沉淀于 -80 °C 保存直至裂解。样本的进一步制备按先前报道的方法进行¹³。简要而言，将细胞沉淀在含 0.4% SDS 的 PBS 中通过超声裂解（Bandelin Sonoplus 超声仪）。蛋白质组定量后（每样本 1000 微克），对标记蛋白与生物素进行叠氮-炔基环加成反应。随后沉淀蛋白质组，并用丙酮和甲醇洗涤，接着进行亲和素磁珠富集。之后，对样本进行酶解（胰蛋白酶 Platinum，Promega）、脱盐并经真空离心浓缩仪干燥，再将样本溶于 1% 甲酸溶液中。将样本过滤（Merck Millipore，UFC30GV0S）后转移至高效液相色谱自动进样瓶（QuanRecovery，Waters）中。

HepG2 蛋白质组的液相色谱-质谱联用测定

使用配备 CaptiveSpray 纳米电喷雾离子源和 Sonation 柱温箱的 UltiMate 3000 纳米高效液相色谱系统（赛默飞世尔科技）与布鲁克 timsTOF Pro 质谱仪联用，对肽段进行检测并在线分离。首先将肽段上样至捕集柱（Acclaim PepMap 100 C18，内径 75 微米×长度 2 厘米，粒径 3 微米，赛默飞世尔科技），以 5 微升/分钟的流速用含 0.1% 甲酸的水溶液冲洗 7 分钟，随后转移至分离柱（IonOpticks Aurora C18 柱，25 厘米×75 微米，粒径 1.7 微米），在 400 纳升/分钟的流速下进行 60 分钟梯度洗脱分离：流动相 B 比例从 5% 升至 28%，再在 13 分钟内升至 40%，接着以 95% 的比例维持 10 分钟，最后完成平衡。流动相 A 为含 0.1%（体积比）甲酸的水溶液，流动相 B 为含 0.1%（体积比）甲酸的乙腈溶液。timsTOF Pro 以数据依赖型 PASEF 模式运行，双 TIMS 分析器的累积时间和斜坡时间均设为 100 毫秒，离子淌度范围设定为 0.85 至 (1 / K_{0}) 至 (1.40 ~V ×s ×cm^{-2})。CaptiveSpray 离子源的毛细管电压设为 1500 伏。每个 topN 采集周期进行 10 次 PASEF 扫描，总周期时间为 1.17 秒。质荷比范围设为 100 至 1700。仅强度达到 1750 任意单位的前体离子被纳入碎裂分析；强度达到 14500 任意单位的前体离子则被动态排除 0.4 分钟。对于(m / z<700)，四极杆隔离宽度设为2 m/z；对于(m / z>800)，设为3 m/z。碰撞能量根据迁移率呈线性梯度变化，从(1 / K_{0}=1.6 ~V ×s ×cm^{-2})对应的59 eV降至(1 / K_{0}=0.6 ~V ×s times)以及(cm^{-2})对应的20 eV。利用加在CaptiveSpray源入口滤膜上的三种Agilent ESI-L调谐混合离子（质荷比622、922和1222），对TIMS洗脱电压进行线性校准，以得到约化离子迁移率系数((1 / K_{0}))。

使用MaxQuant软件（2.0.3.0版）分析质谱原始数据，并在人类UniProt数据库（分类号：9606，2022年3月11日下载，含标准序列且经审核）中检索肽段。将半胱氨酸的氨甲酰甲基化设为固定修饰，甲硫氨酸的氧化及N端乙酰化设为可变修饰。设定胰蛋白酶为蛋白水解酶，最大允许2个漏切位点。主检索中前体质量误差设为4.5 ppm，碎片质量误差设为0.5 Da。启用无标记定量（LFQ）模式，LFQ最小比值计数为2。开启第二肽段鉴定功能，通过构建反向数据库进行错误发现率（FDR）评估，在肽段-谱图匹配及蛋白水平均将FDR阈值设为1%，并启用“运行间匹配”功能（匹配时间窗0.7分钟，比对时间窗20分钟）。从MaxQuant结果表proteinGroups.txt中提取的标准化LFQ强度，使用Perseus软件（2.03.1版）进行进一步分析。

HeLa-CCL-2 与 HEK293 蛋白质组的液相色谱-质谱检测

样本分析按先前描述的方法进行¹³。使用配备 timsTOF Pro 质谱仪（德国布鲁克公司）的 nanoElute 纳升流速液相色谱系统（德国布鲁克公司）对样本进行分析。将样品上样至捕集柱（赛默飞捕集柱 5 毫米），随后以 10 微升/分钟的流速用 6 微升 0.1% 甲酸溶液冲洗。将肽段样品转移至分析柱（Aurora Ultimate CSI 25 厘米×75 微米内径，1.6 微米 FSC C18，IonOpticks 公司），并通过梯度洗脱进行分离（洗脱液A：水+0.1%甲酸，洗脱液B：乙腈+0.1%甲酸；1分钟内从0%升至3%，57分钟内从3%升至17%，21分钟内从17%升至25%，13分钟内从25%升至34%，1分钟内从34%升至85%，维持85% 8分钟），流速为400纳升/分钟。采用 Captive Spray 纳升电喷雾离子源（德国布鲁克公司）对肽段进行电离，电离电压为1.5千伏，干燥气温度为180摄氏度，气体流速为3升/分钟。  timsTOF Pro 质谱仪（德国布鲁克公司）采用默认的 dia-PASEF 长梯度模式运行，离子淌度迁移率（1/K₀）范围设置为起始值 (0.6 ~V ~s / cm^{2}) 至终止值 (1.6 ~V ~s / cm^{2})，梯度累积时间和累积时间均为100毫秒，梯度速率为9.43赫兹。质量检测范围设为100.0道尔顿至1700道尔顿，采用正离子模式。dia-PASEF 质量范围设置为400.0道尔顿至1201.0道尔顿，离子淌度迁移率范围为0.60 1/K₀至1.43 1/K₀，循环时间为1.80秒。离子淌度为0.60 1/K₀时的碰撞能量固定为20.00电子伏特，离子淌度升至1.6 1/K₀时碰撞能量梯度升至59.00电子伏特。使用 Tuning MIX ES-TOF 校准液（安捷伦公司）对质荷比和离子淌度进行校准。  原始数据使用 DIA-NN 软件（1.8.1版本）处理，蛋白鉴定基于 UniProt 人类参考蛋白质组（蛋白质组编号：UP000005640，2023年12月27日下载）。除前体电荷范围设为2至4外，其余均采用默认设置。半胱氨酸氨基甲酰化设为固定修饰。为便于使用 Perseus 软件进行后续数据处理，在附加选项中添加了“--relaxed-prot-inf”参数。后续数据分析在 Perseus 软件（2.0.5.0版本）中进行，将数值转换为以2为底的对数值，并对生物学重复样本进行分组。为实现全部数据集的对比，采用默认设置对缺失值进行插补，使用双尾Student t检验评估不同处理方案间的差异蛋白丰度。(-log _{10} P) 的阈值设为1.3，((P=0.05)) 的阈值设为t检验差异值大于2。符合上述阈值的蛋白被视为相较于仅用二甲基亚砜处理的对照组显著富集。通过对比 CN-861-2 共处理样本与仅用 Cysto-354 处理的样本，评估显著的竞争效应¹³。

表面等离子体共振（SPR）

采用 SPR（Biacore X100，Cytiva）对 CYS 与 SCARB1 的结合进行分析。因此，使用生物素化的 SCARB1（Acrobiosystems）将其固定在流通池（FC）2上的SPR传感器芯片SA（Cytiva）上。随后，将CYS（20微摩尔）溶解于运行缓冲液中并离心处理。通过在已固定SCARB1的参比流通池FC1和FC2上进行相互作用分析，对CYS进行检测。为确定结合情况，对FC2与FC1的差值进行分析。含1%二甲基亚砜（DMSO）的HBS-EP+缓冲液（Cytiva）作为运行缓冲液使用。

HCVpp 细胞进入实验

按照先前所述的方法71，通过293T细胞转染制备慢病毒假型。将293T细胞以(3 ×10^{6})个细胞的密度接种于10厘米培养皿中，在37摄氏度、5%的(CO_{2})条件下培养。24小时后，用2微克慢病毒Gag-Pol表达构建体pCMV (AR8.74)、2微克编码荧光素酶的报告质粒pWPI (F-Luc-BLR )^{73,74})，以及2微克pcDNA3_CMV_dcE1E2_Con1（(pcDNA3_CMV_dcE1E2_IFH ^{75})）或pczVSV-(G^{76})（编码目标糖蛋白），或2微克空载体对照（pcDNA3）对细胞进行转染。转染时，将质粒在Opti-MEM培养基中混合，使聚乙烯亚胺（PEI）的最终浓度达到0.035毫克/毫升，随后将混合物加入细胞中。过夜培养后，加入丁酸钠使其最终浓度为10毫摩尔。培养6小时后更换培养基，继续过夜培养后，收集含有假型颗粒的上清液，通过0.45微米孔径的滤膜过滤以去除细胞碎片，将其用于进入实验。

对化合物对细胞进入效果的评估在 Huh-7.5 细胞上进行。将 Huh-7.5 细胞以每孔 7.2×10³ 个的密度接种于 96 孔板中，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳浓度条件下孵育 24 小时。将化合物进行六次连续 3 倍稀释，最终二甲基亚砜（DMSO）浓度为 1%，随后加入新鲜制备的假病毒颗粒并转移至细胞中。孵育 72 小时后，用裂解缓冲液（1% 曲拉通 X-100、25 毫摩尔/升甘氨酰甘氨酸、15 毫摩尔/升氯化镁、4 毫摩尔/升乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸、1 毫摩尔/升二硫苏糖醇）裂解细胞，并于 -20 摄氏度冷冻。荧光素酶活性检测的操作如下：将 72 微升检测缓冲液（25 毫摩尔/升甘氨酰甘氨酸、5 毫摩尔/升氯化镁、50 毫摩尔/升氯化钾、10 毫摩尔/升乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸、2% 三磷酸腺苷、1 毫摩尔/升二硫苏糖醇）转移至白色 96 孔板，加入 20 微升细胞裂解悬液，接着加入 40 微升 D-荧光素，立即使用 Berthold LB960 Centro XS3 微孔板发光检测仪进行检测。

分子对接

对于分子对接，将清道夫受体B类成员1的AlphaFold结构（AF-Q8WTV0-F1）以PDB文件格式下载并加载到MOE软件（2022.02版）中。使用“结构准备”工具修正结构问题，并通过“Protonate3D”工具将蛋白质质子化，设定pH值为7.4。在使用“位点查找”工具筛选潜在结合位点前，先对结构进行能量最小化处理。在潜在结合位点中加载原子虚拟位点。在MOE中制备半胱氨酸衍生物Cysto180、CN-861-2和CN-DM-861（完成质子化和能量最小化），并以.mdb文件格式加载到化合物数据库中。利用该.mdb文件将化合物与此前制备的SCARB1结构进行对接。选择原子虚拟位点作为靶标位点，采用三角形匹配器（评分：伦敦dG）作为构象生成方法，诱导拟合（评分：GBVI/WSA dG）作为精修方法。通过质子化和能量最小化对潜在构象进行浏览与优化。

大型语言模型（LLMs）

在本研究的撰写过程中，作者使用了ChatGPT（GPT-4）对部分段落的措辞进行润色。使用该工具后，作者对内容进行了必要的审阅和编辑，并对出版物的内容承担全部责任。