题目：A novel water-soluble near-infrared fluorescent probe for monitoring viscosity fluctuations in plants and zebrafish sh under abiotic stresses

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdfdirect/10.1002/smo2.70043

期刊：Smart Molecules

摘要

黏度是非生物胁迫的重要微环境参数之一。研究表明，黏度的异常变化与植物的病理活动及疾病相关。然而，现有探针因疏水性以及植物自身存在的植物色素，可能并不适用于植物体内的黏度检测。本研究成功构建了一种结构简单、水溶性的近红外荧光探针HJA-MQ-D，该探针可同时监测植物和动物体系中的动态黏度变化。该探针发射波长较长（近700纳米）、斯托克斯位移大（88纳米），且具有优异的黏度响应性能，荧光强度提升了140倍。更重要的是，HJA-MQ-D能够对植物细胞水平（洋葱内表皮和绿豆切片）以及整株水平（绿豆和花生幼苗）的黏度波动进行成像。此外，HJA-MQ-D还被用于监测制霉菌素诱导的斑马鱼休克模型中的黏度变化。基于这些优异特性，我们期望该探针能为跨物种黏度检测提供一种强有力的新工具。

关键词：生物相容性、大斯托克斯位移、近红外探针、植物成像、粘度检测

引言

植物是地球上不可或缺的资源，在维持人类生存、促进碳循环、提升生物多样性以及改善生态系统质量方面发挥着至关重要的作用。然而，人类工业发展的加速导致极端气象条件出现，植物尤其是农作物更频繁地遭受干旱、盐胁迫、温度波动、涝害和重金属污染等各类非生物逆境胁迫，这不仅阻碍植物生长，导致部分植物物种濒危，还会造成农业生产力下降。 植物的非生物胁迫响应是一个极为复杂的生物学过程，其背后的分子机制目前仍未被完全阐明。 因此，对植物非生物胁迫进行早期且精准的监测，是保障植物高效生长、维持植物健康以及提高作物产量的有效手段。研究表明，活性氧（ROS）、活性氮物种、活性硫物种、酶以及微环境参数（黏度、极性、pH值）等部分活性物质在植物体内处于动态平衡状态。 但当植物遭遇非生物胁迫时，这种平衡会被打破，进而导致这些活性物质在植物体内的含量发生波动。 基于此，这些活性物质可作为衡量植物非生物胁迫程度的生物标志物。正因如此，研发一套能够实时、快速且原位监测植物体内活性物质波动的平台，对于更深入地探究植物的生理过程与作用机制具有重要意义。

黏度作为一项极为重要的微环境参数，在维持生物体正常生理功能方面发挥着关键作用，其变化与植物的非生物胁迫密切相关，会影响植物的生长、发育和生理功能，例如病原感染会导致汁液黏稠，阻碍物质运输，而干旱胁迫则会增加细胞质黏度，干扰代谢过程。 尽管已开发出多种黏度检测方法，如毛细管黏度计、旋转黏度计、超声黏度计、落球黏度计和振动黏度计等， 但这些分析技术无法用于监测生物体内的黏度变化。因此，基于荧光的成像技术已成为生物医学研究中用于活体研究的宝贵工具， 这得益于其操作简便、灵敏度高、选择性好、无创监测以及实时成像等诸多优势。在各类荧光探针中，近红外（NIR）荧光探针凭借其长波长发射（650-900 nm）的特性展现出更优异的成像性能（表S1）。这一特性使这类荧光探针在对植物中的活性物质进行成像时具备显著优势，例如组织透明度更高、组织穿透深度更深、组织吸收与散射作用更弱，同时还能降低光毒性和叶绿素自身荧光的干扰。

干扰。 近年来，研究人员已采用多种方法开发新型近红外荧光探针：增强给电子/吸电子基团的给电子/吸电子能力以及扩展π共轭体系。这些策略显著降低了荧光探针的水溶性。这意味着这类探针在动物体系中能更好地发挥作用，但由于疏水性较强，无法应用于植物体系。因此，设计一种可实时、快速且原位监测植物中粘度变化的水溶性近红外探针至关重要。

用于粘度监测的近红外荧光探针的构建主要基于分子内扭曲电荷转移（TICT）机制。此类探针通常由通过双键连接的荧光团部分和受体基团组成。在不同粘度环境中，荧光强度取决于整个荧光团-受体部分的旋转自由度。在低粘度体系中，快速旋转会导致荧光强度较弱，而在高粘度体系中，受限旋转则会使荧光发射增强。基于这一原理，我们选择8-羟基久洛利定作为荧光基团，以尽可能使发射波长接近近红外波长（表S2）。通过双键将其与喹啉三甘醇单甲醚阳离子结合，合成了一种新型近红外粘度敏感型荧光探针HJA-MQ-D。喹啉基团的引入增强了HJA-MQ-D的共轭结构。同时，喹啉阳离子和三甘醇单甲醚显著提高了其水溶性和细胞膜通透性。正如预期的那样，与此前报道的粘度探针相比，HJA-MQ-D具有更优异的水溶性、更强的光稳定性和更广泛的适用范围，能够实时动态监测多种模式生物（包括动植物细胞）的粘度变化，有望成为跨物种粘度监测研究的有力工具。

实验部分

HJA-MQ-D的合成

探针HJA-MQ-D的合成路线如方案1所示。

化合物2、化合物3和化合物5：合成化合物2的原料为间氨基苯酚和1-溴-3-氯丙烷。化合物3是由化合物2与三氯氧溴在N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中反应制得。合成化合物5的原料为4-甲基喹啉和二乙二醇2-溴乙基甲醚。化合物2、3和5的合成参考了先前报道的文献。具体的合成步骤及相应的结构表征详见支持信息（方案S1和图S1–S6）。

HJA-MQ-D：将化合物3（123.13毫克，0.567毫摩尔）和化合物5（209.95毫克，0.567毫摩尔）溶解于无水乙醇（10毫升）中。将该混合物在90摄氏度下回流14小时。冷却至室温后，粗产物经减压浓缩，随后以二氯甲烷/甲醇（体积比50:1）的混合溶剂体系为洗脱剂，通过制备型薄层色谱进行纯化。最终产物HJA-MQ-D以深蓝色固体的形式得到并收集（102毫克，产率32%）。(^{1} H) 核磁共振氢谱（400兆赫兹，氘代甲醇，图S7）δ：8.45（双峰，(J=8.6 ~Hz)，1氢），8.40（双峰，(J=6.9 ~Hz)，1氢），8.08（双峰，(J=15.2 ~Hz)，1氢），8.00（双峰，(J=8.8 ~Hz)，1氢），7.88-7.82（多重峰，1氢），7.68-7.61（多重峰，2氢），7.44（双峰，(J=15.1 ~Hz)，1氢），7.16（单峰，1氢），4.70（三重峰，(J=4.8 ~Hz)，2氢），3.85（三重峰，(J=4.7 ~Hz)，2氢），3.49（双二重峰，(J=5.6)，2.9赫兹，2氢），3.43-3.40（多重峰，2氢），3.35（双二重峰，(J=6.0)，3.3赫兹，2氢），3.31-3.28（多重峰，2氢），3.21（双三重峰，(J=4.0)，2.0赫兹，4氢），3.17（单峰，3氢），2.61（三重峰，(J=6.2 ~Hz)，2氢），2.51（三重峰，(J=6.4 ~Hz)，2氢），1.84（三重峰，(J=6.1 ~Hz)，4氢）。(^{13} C) 核磁共振碳谱（100兆赫兹，氘代甲醇，图S8）：(delta 155.26)，154.41，148.35，145.08，141.30，138.46，133.92，127.49，126.62，126.06，125.82，117.85，116.00，112.75，111.10，109.75，106.65，71.51，70.32，70.08，69.91，67.94，57.71，55.05，50.04，49.25，27.05，21.58，20.77，20.67。电喷雾电离质谱（质荷比m/z）(C_{30} H_{37} ~N_{2} O_{4}^{+}[M]^{+})：计算值489.2748，实测值489.2740（图S9）。

植物成像

洋葱表皮细胞的成像：以洋葱内表皮细胞为实验模型，首先剥离洋葱内表皮组织并使用探针HJA-MQ-D进行染色，随后构建不同模型以改变环境黏度，最后进行共聚焦荧光成像。

绿豆幼苗切片的成像：以切片的绿豆幼苗细胞作为实验模型；首先将绿豆种子水培至萌发，再制备绿豆幼苗茎组织切片。 采用探针 HJA-MQ-D 对切片进行标记，随后利用蔗糖溶液改变细胞微环境的黏度，最后进行共聚焦荧光显微成像。

整株植物成像：为了系统评估探针HJA-MQ-D在植物根茎系统中的追踪性能，本研究构建了基于绿豆的对比模型以大豆和花生为对象的相关研究已确立。通过设置重金属和盐胁迫两种处理条件，研究人员利用活体成像系统进行了动态监测。

斑马鱼成像

所有动物实验方案均遵守许昌大学实验动物护理与使用指南。本实验经许昌大学医学伦理委员会（中国河南，伦理声明参考编号2025014）批准。斑马鱼购自南京易泽林卡生物科技有限公司，先将5日龄斑马鱼幼鱼置于含10 μM制霉菌素（Nys）的培养基中，于28℃预孵育30分钟。随后加入10 μM探针HJA-MQ-D，继续孵育30分钟。孵育结束后，用新鲜的、提前在28℃平衡的培养基洗涤3次（每次1分钟），以去除未结合的探针和代谢物，最后使用共聚焦显微镜进行活体成像。

结果与讨论

探针水溶性的比较

为了设计出具有更好水溶性的荧光探针，我们在喹啉上引入了甲基、乙基和三乙二醇单甲醚基团，合成了三种不同结构的探针，分别为HJA-MQ-M、HJA-MQ-E和HJA-MQ-D（图1a）。相应的合成方法和结构表征数据详见支持信息，如图S10-S13和方案S2所示。将这些探针制备成不同浓度的水溶液，进行荧光强度实验。结果表明，HJA-MQ-M、HJA-MQ-E和HJA-MQ-D分别在250、200和400 μM浓度下达到最大荧光强度（图1b），说明HJA-MQ-D的水溶性最佳（表S3）。同时，我们还分析了每种探针从低浓度到荧光峰值浓度时荧光强度与浓度的线性关系。所有探针均表现出良好的线性响应（图1c），证实了荧光强度与单体状态下的浓度成正比。HJA-MQ-D 较宽的线性范围进一步证明了其优异的水溶性和实用性。

图1 (a) HJA-MQ-M、HJA-MQ-E和HJA-MQ-D的化学结构。(b) 三种探针的荧光强度随浓度变化曲线（溶剂：(H_{2} O)）。(c) 三种探针在低浓度区间（0–400 μM）内荧光强度随浓度变化的线性拟合结果。激发波长为610 nm。(Slits =10 / 10 ~nm)

HJA-MQ-D的光谱响应

样品处理：将HJA-MQ-D溶解于二甲基亚砜（DMSO）中制备1毫摩尔每升的储备液，随后分装至避光容器中，于-30摄氏度避光保存，以确保其长期稳定性。

HJA-MQ-D 对黏度的响应：基于 HJA-MQ-D 合成简便、水溶性良好、生物相容性优异的特性，以及由于8-羟基久洛尼定与喹啉阳离子衍生物之间存在双键而产生的TICT特性，我们系统研究了探针HJA-MQ-D在不同黏度溶液（0%–100% 甘油-磷酸盐缓冲盐水（PBS））中的光谱响应行为。实验结果表明，随着甘油百分比的增加，探针HJA-MQ-D的紫外吸收光谱发生显著红移，最大吸收峰从606 nm位移至638 nm（图S14）。荧光强度显著增强在荧光光谱中观察到，随着黏度的增加，697.6纳米处的荧光强度有所提升，且在最高黏度条件下的荧光强度达到最低黏度时的140倍（图2a）。这是因为在低黏度溶液中，转子可自由旋转，这在一定程度上抑制了荧光发射；而在高黏度溶液中，转子的旋转受到限制，能量只能以荧光的形式释放（图2c）。进一步的定量分析表明，log (I_{697.6})与log η之间存在良好的线性相关性（图2b），这些结果充分证实了HJA-MQ-D探针对介质黏度变化具有高灵敏的响应特性。

  为了系统评估探针HJA-MQ-D对黏度的特异性响应，我们开展了一系列对照实验。首先，通过测量探针在不同极性溶剂（包括二甲基亚砜（DMSO）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷、四氢呋喃、丙酮、甲醇、乙醇、乙腈和乙酸乙酯）中的荧光光谱（图3a），发现溶剂极性对探针HJA-MQ-D的荧光响应影响极小。为了探究探针HJA-MQ-D对细胞中常见干扰物质的响应情况，我们评估了探针HJA-MQ-D在含有不同阳离子、阴离子的PBS体系中的荧光光谱和氨基酸（1.(Zn^{2+})，2.(Ni^{2+})，3.(K^{+})，4.(Co^{2+})，5.(Ba^{2+})6.(Mn^{2+})，7.(Fe^{3+})，8.(Cu^{2+})，9.(Cd^{2+)，(10. Na^{+})，11.(Ca^{2+})，12.(N_{2} H_{4})，13.(S^{2-})，14.(F^{-})，15.(Cl^{-})，16.(Br^{-})，17.(ClO^{-})，18.(HSO_{3}^{-})，19。脯氨酸，20。谷氨酸，21。赖氨酸，22。精氨酸，23。色氨酸，24。苯丙氨酸，25。半胱氨酸，26。谷胱甘肽，27。同型半胱氨酸，28。甘油（99%））结果表明，该探针对甘油表现出良好的选择性（图3b），且不受上述物质的显著干扰（图S15）。探针HJA-MQ-D在低黏度和高黏度条件下均能保持稳定的荧光性能（图3c）。此外，通过构建pH值在2至13范围内的甘油-磷酸盐缓冲液（30%、50%、80%）混合溶剂体系，系统研究了pH值对探针HJA-MQ-D性能的影响。实验结果显示，探针HJA-MQ-D的荧光强度在生理相关的pH值范围（2-7）内保持稳定，证实其具有优异的pH耐受性。

图 2(a) 浓度 10 μM 的 HJA-MQ-D 探针在不同粘度甘油 - 磷酸盐缓冲液（PBS）混合体系中的荧光光谱（激发波长(lambda_{ex})=610 nm，狭缝宽度 = 10/10 nm）。 (b) 探针 697.6 nm 处荧光强度对数值(log I_{697.6})与体系粘度对数值(log eta)的线性拟合关系。 (c) HJA-MQ-D 探针的分子结构及其对粘度的响应机理。激发波长为 610 nm，狭缝宽度 10/10 nm

图 3(a) 浓度为 10 μM 的 HJA-MQ-D 探针在多种不同溶剂中的荧光光谱。 (b) HJA-MQ-D 探针分别对甘油、以及 20 μM 各类待测物质的荧光响应光谱（1. 锌离子、2. 镍离子、3. 钾离子、4. 钴离子、5. 钡离子、6. 锰离子、7. 三价铁离子、8. 铜离子、9. 镉离子、10. 钠离子、11. 钙离子、12. 肼、13. 硫离子、14. 氟离子、15. 氯离子、16. 溴离子、17. 次氯酸根、18. 亚硫酸氢根、19. 脯氨酸、20. 谷氨酸、21. 赖氨酸、22. 精氨酸、23. 色氨酸、24. 苯丙氨酸、25. 半胱氨酸、26. 谷胱甘肽、27. 同型半胱氨酸、28.99% 甘油）。 (c) HJA-MQ-D 探针在高粘度、低粘度体系中的荧光稳定性测试结果。 (d) 不同粘度条件（不同配比甘油 - 磷酸盐缓冲液混合体系）下，HJA-MQ-D 探针荧光光谱随 pH 变化的曲线。 实验激发波长为 610 nm，分光狭缝宽度设置为 10/10 nm。

理论计算

本研究借助高斯16软件，对探针分子HJA-MQ-D开展了系统性理论模拟，以探究其构型依赖的电子结构特征与光学行为。研究基于密度泛函理论（DFT）及含时密度泛函理论（TD-DFT）对该分子进行几何优化，并计算了前线分子轨道的能级分布。结果表明，当8-羟基久洛尼定与喹啉部分呈近乎共面构象时，该分子在激发态下呈现最优结构。此构型下，两片段间的二面角为0°，电荷分布更为均匀，最高占据分子轨道（HOMO）与最低未占据分子轨道（LUMO）电子云的空间重叠程度显著提升，这大幅提高了荧光振子强度（((f=1.1767))）。这表明该分子在这种平面构型下展现出优异的荧光发射能力，其最高占据分子轨道-最低未占据分子轨道（HOMO-LUMO）能隙为2.3076电子伏特。然而，当二面角增大至90°时，分子转变为扭曲分子内电荷转移态（TICT态）。在此状态下，最低未占据分子轨道（LUMO）的电子密度主要集中在喹啉部分，而最高占据分子轨道（HOMO）则定域在久洛尼定单元上，使得轨道能隙降至1.0660电子伏特。由于最高占据分子轨道与最低未占据分子轨道之间存在显著的空间分离，轨道重叠程度大幅降低，导致荧光振子强度急剧下降（((f=0.0005))）。荧光发射受到强烈抑制，分子能量主要通过非辐射跃迁途径耗散。这些结果表明，HJA-MQ-D的发光行为强烈依赖于分子构象：平面构象有利于辐射跃迁，而TICT态则促进非辐射衰减。这种对构象敏感的荧光特性使其能够高效响应微环境黏度的变化，成为一种极具潜力的黏度敏感性荧光探针（图4）。

植物中的粘度检测

植物培养方案与评价条件：植物细胞黏度受多种因素调控，包括环境胁迫（干旱、高盐、重金属和氧化胁迫）、生物胁迫（病原菌侵染）、发育阶段（细胞分裂与分化）以及代谢活动（活性氧爆发和细胞骨架）重组）。在环境胁迫中，细胞质凝胶化会显著提高黏度，其具体表现包括由高浓度引发的蛋白质聚集盐浓度、氧化应激促进的二硫键交联（((H_{2} O_{2}))），以及重金属引发的氧化还原稳态破坏（((Cd^{2+}))）。为了系统地评估这一为了评估和量化红色通道的相对荧光强度，我们构建了不同的模型，所有实验均进行三次重复以确保数据可靠性。为验证探针的响应为了明确复杂生物环境中的特异性，开展了模拟大分子拥挤和蛋白质富集体系的正交对照实验。通过系统评估和排除非特异性c蛋白结合干扰，经确认探针的荧光增强信号对粘度变化表现出高选择性（表S4、图S16-S18）。使用徕卡DMI 8激光扫描共聚焦显微镜进行细胞成像，激发波长为638纳米，检测范围为680-730纳米。

图4 对HJA-MQ-D的计算分析：基态和激发态的几何结构优化；激发态下二面角为0°时的前线分子轨道；激发态下二面角为90°时的前线分子轨道。（所有计算均在PBE0/6-311G(d, p)理论水平下，通过Gaussian 16完成。）

图5 (A) 洋葱内表皮用5微摩尔荧光探针HJA-MQ-D染色5分钟，随后用不同浓度的氯化钠（0、30、50、100毫摩尔）处理5分钟。(a) 为图(A)红色通道中相对荧光强度的定量分析。(B) 洋葱内表皮用5微摩尔荧光探针HJA-MQ-D染色5分钟，随后用不同浓度的(Cd^{2+})（0、30、50、70、100微摩尔）处理5分钟。(b) 为图(B)红色通道中相对荧光强度的定量分析。(C) 洋葱内表皮用5微摩尔荧光探针HJA-MQ-D染色5分钟，随后用不同浓度的(H_{2} O_{2})（0、5、10、20、50毫摩尔）处理。(c) 为图(C)红色通道中相对荧光强度的定量分析。红色通道：(lambda_{ex }=638 ~nm) (lambda_{cm}=680-730 ~nm)、(scale bar =100mu m)

图6（A）对照组和实验组细胞的放大图像。（a）图（A）中红色通道相对荧光强度的定量分析。红色通道：(lambda_{ex}=638 ~nm)、(lambda_{em}=680-730 ~nm)、(scale bar =50mu m)

图7 (a) 绿豆种子重金属胁迫处理的实验流程。(b, c) 分别经不同浓度的(Cd^{2+})（0、30、50、70、100 μM）孵育10小时和5天后的整株荧光成像。(d, e) 整株成像荧光强度的定量分析。(lambda_{ex}=630 ~nm)、(lambda_{em}=699 ~nm)

洋葱表皮细胞：本研究以洋葱内表皮细胞为模型系统，系统探究了经5微摩尔每升的HJA-MQ-D染色5分钟后，细胞在不同环境胁迫下的荧光响应特征。实验对染色后的表皮组织分别采用梯度浓度的氯化钠溶液（0、30、50、100毫摩尔）、(Cd^{2+})溶液（0、30、50、70、100微摩尔）、0.3克每毫升蔗糖溶液、(H_{2} O_{2})溶液（0、5、10、20、50毫摩尔）进行处理，并设置空气暴露条件。实验结果显示，氯化钠处理组细胞的荧光强度随浓度升高和处理时间延长而增强（图5a），但处理超过10分钟后，探针荧光发生淬灭，且出现质壁分离现象（图S19a）。蔗糖处理组也观察到类似的荧光增强与淬灭效应（图S19b）。在此外，(Cd^{2+}) 和 (H_{2} O_{2}) 两个处理组的荧光强度均有所升高（图5b、c），且在空气暴露条件下，荧光强度随暴露时间的延长而增强（图S19c）。这些结果表明HJA-MQ-D探针能够有效监测细胞微环境的变化。

绿豆切片细胞：将购买的绿豆种子用75%乙醇灭菌30秒，用蒸馏水冲洗三次，于25℃培养7天获得幼苗。对培养出的幼苗进行切片处理，对照组切片用5微摩尔的探针HJA-MQ-D储备液处理5分钟，实验组切片先用5微摩尔的探针HJA-MQ-D预处理5分钟，再用0.3克/毫升蔗糖溶液处理5分钟，以此评估蔗糖诱导的细胞内黏度变化。实验结果表明，与对照组相比，经0.3克/毫升蔗糖溶液预处理的绿豆幼苗切片细胞内黏度显著升高（图6和图S20），对红色通道荧光强度的定量分析显示，处理组的相对荧光强度提升了约4倍。

图8 (a) 花生重金属胁迫处理的实验流程。(b, c) 分别用不同浓度的(Cd^{2+})（0、30、50、70、100 μM）孵育10小时和7天后的整株荧光成像图。(d, e) 整株荧光成像的荧光强度定量分析。(lambda_{ex }=630 ~nm)、(lambda_{em}=699 ~nm)

图9 (a) 重金属NaCl胁迫处理绿豆种子的实验流程。(b, c) 分别经不同浓度NaCl（0、100、150、200、250 mM）处理10小时和7天后的整株荧光成像。(d, e) 整株成像荧光强度的定量分析。(lambda_{ex}=630 ~nm)，(lambda_{em}=699 ~nm)

绿豆根：为探究盐胁迫对植物细胞微黏度的影响，我们对不同盐浓度梯度下的绿豆幼苗根尖进行了成像分析。选取生长状态一致的绿豆根根尖，制备成根尖切片。实验组切片先用5微摩尔的探针HJA-MQ-D孵育5分钟，随后转移至含有0（对照组）、30、50或100毫摩尔氯化钠的缓冲溶液中处理30分钟；对照组切片同时置于无盐缓冲液中孵育。共聚焦成像结果（图S21）显示，随着盐浓度升高，根尖细胞的红色通道荧光信号呈浓度依赖性增强。这些结果表明，盐胁迫可快速诱导细胞内黏度升高，且具有浓度依赖性效应，同时验证了探针HJA-MQ-D可用于动态监测盐胁迫下细胞微环境的变化。

整株植物成像：为评估探针HJA-MQ-D在监测植物重金属胁迫和盐胁迫中的适用性，我们通过施用建立了以绿豆（中绿1号）和花生（鲁花14号）为材料的双模型系统采用外源重金属和盐胁迫模拟植物组织中动态黏度变化，以未处理组作为空白对照。实验中，绿豆和花生种子用75%酒精消毒30秒，用无菌水冲洗三次，于室温暗培养。首先，将绿豆和花生种子置于蒸馏水中培养萌发，随后直接在不同浓度的(Cd^{2+})（0、30、50、70、100 μM）和NaCl（0、100、150、200、250 mM）胁迫条件下培养不同时间。培养结束后，将所有植物材料统一浸入5 μM 荧光探针HJA-MQ-D溶液（溶于pH 7.4的PBS缓冲液）中，暗孵育1小时，成像前用水洗去表面残留的探针溶液。

图7b、c展示了绿豆在不同浓度的(Cd^{2+})（0、30、50、70、100微摩尔）溶液中萌发10小时和5天后的性能变化，而图8b、c则展示了花生在相同的(Cd^{2+})浓度梯度下培养10小时和7天后的生长情况。整株植物荧光成像结果显示（图7d、e和图8d、e），两种植物均表现出明显的浓度和时间依赖性响应：随着(Cd^{2+})浓度升高（30→100微摩尔）以及暴露时间延长（10小时→5/7天），植物组织中荧光信号的强度随之增强。这表明(Cd^{2+})胁迫通过提高植物细胞的黏度水平激活了探针响应，且荧光强度的升高与重金属胁迫及处理时长呈正相关。图9b、c展示了绿豆在不同浓度氯化钠溶液（0、100、150、200、250毫摩尔）中萌发10小时和7天后的状态变化；而图10b、c则呈现了花生在相同盐浓度梯度下培养10小时和9天后的生长情况。整株植物的荧光成像结果显示（图9d、e和图10d、e），两种植物均表现出显著的浓度和时间依赖性响应：随着盐浓度升高（100→250毫摩尔）和暴露时间延长（10小时→7/9天），植物组织的荧光信号强度显著增强。这说明氯化钠胁迫通过提高植物细胞内的黏度水平激活了探针响应，且荧光强度的升高与盐胁迫强度及处理时长呈正相关。

图10 (a) 重金属NaCl胁迫处理花生的实验流程。(b, c) 分别经不同浓度NaCl（0、100、150、200、250 mM）处理10小时和9天后的整株荧光成像图。(d, e) 整株荧光成像的荧光强度定量分析。(lambda_{ex}=630 ~nm)，(lambda_{em}=699 ~nm)

斑马鱼中的粘度检测

斑马鱼胚胎因其独特优势被视为荧光标记研究的理想模式生物，这些优势包括胚胎透明便于观察、与人类高度相似以及器官发育迅速。然而，由于低细胞毒性是细胞内可视化的前提条件，我们在开展斑马鱼胚胎荧光成像实验前，采用MTT法评估了HJA-MQ-D的生物相容性，并检测了其在0、5、10、15和20 μM浓度下的细胞毒性。结果显示，即使用20 μM的HJA-MQ-D处理24小时后，HeLa细胞的存活率仍保持在85%以上（图S22），这表明HJA-MQ-D的毒性极低，可安全用于斑马鱼胚胎的体内荧光成像研究。基于这些特性，本研究以5日龄斑马鱼胚胎为模型，验证了该荧光探针对细胞内黏度变化的动态监测能力。研究设置了三个实验组：空白对照组为正常培养的5日龄斑马鱼胚胎；实验组Ⅰ为将斑马鱼胚胎置于10 μM的荧光探针HJA-MQ-D溶液中孵育30分钟；而实验组Ⅱ的斑马鱼SH先经10 μM制霉菌素（Nys）预处理30分钟，随后转移至10 μM荧光探针HJA-MQ-D溶液中继续孵育30分钟。所有处理均在28℃的培养基中进行。实验结果显示，空白对照组（未处理）的斑马鱼SH幼虫未检测到明显的荧光信号；仅用10 μM荧光探针HJA-MQ-D处理的实验组Ⅰ表现出微弱荧光；而在加载探针前经10 μM制霉菌素预处理的实验组Ⅱ，荧光信号显著增强。这种梯度响应（空白组＜探针组＜探针+制霉菌素组）系统验证了该探针监测细胞黏度变化的能力（图11）。

图11 通道：(lambda_{ex}=638 ~nm)、(lambda_{em}=680-730 ~nm)、(scale bar =100 mu m) 图11（A）三组斑马鱼的成像图。（a）图（A）中红色通道相对荧光强度的定量分析。

结论

总之，本研究通过简便高效的方法成功合成了一种新型水溶性近红外荧光探针HJA-MQ-D，该探针具有优异的水溶性。基于分子内扭曲分子内电荷转移（TICT）机理，该探针展现出高灵敏度和高选择性，能够对粘度变化实现特异性响应。在多种生物模型系统中开展的验证实验证实，HJA-MQ-D可精准监测动植物细胞中粘度的动态变化，涵盖洋葱表皮细胞、绿豆苗切片等植物细胞模型，以及斑马鱼等动物模型。尤为值得注意的是，该探针在整株植物成像中表现出极佳性能。这些研究结果充分证明，HJA-MQ-D是一种极具应用前景的细胞粘度可视化研究工具，为生物系统微环境的评估提供了新的技术手段。