题目：Zebrafish oligodendrocyte lineage cells use the postsynaptic protein Gephyrin to myelinate GABAergic axons and limit myelin sheath growth

原文链接:https://doi.org/10.1038/s41467-026-74902-3

期刊：Nature Communications

摘要

轴突髓鞘化可通过在不同类型轴突上放置和调节髓鞘的不同模式来调控神经元回路。目前，不同轴突类别上髓鞘形成的协调机制仍 largely 未知。近期研究表明，神经元活动和囊泡释放可促进髓鞘形成，产生髓鞘的少突胶质细胞表达典型的突触后因子，这些因子可能促进少突胶质细胞-轴突相互作用以实现髓鞘包裹。本研究探讨了抑制性突触后支架蛋白Gephyrin（Gphn）是否介导斑马鱼幼体特定轴突类别的选择性髓鞘化。与这一可能性相符的是，Gphn在GABA能和甘氨酸能轴突的髓鞘中富集。在Gphn缺陷型幼体的少突胶质细胞中，髓鞘更长，且GABA能轴突上髓鞘放置的频率降低。综上，本研究结果表明，少突胶质细胞系细胞利用Gphn促进GABA能轴突的髓鞘形成，并限制髓鞘长度。

引言

少突胶质细胞（OLs）是中枢神经系统（CNS）中的胶质细胞，负责生成髓鞘——一种富含脂质的膜结构，它包裹在轴突周围，既能提供代谢和营养支持，又能提高动作电位传导速度。单个少突胶质细胞可同时对数十个轴突形成髓鞘¹，包括由不同神经传递特征定义的不同类型轴突。由于不同神经元类型的轴突长度、放电频率和能量需求存在差异，轴突上髓鞘的数量与组成差异可能对特定神经环路的功能产生影响²。因此，少突胶质细胞及其髓鞘或许具备独特优势，可通过调节神经环路信号的时序、强度或频率，来调控神经环路的输出³⁻⁵。

神经回路需要兴奋性与抑制性影响的平衡来实现受调控的输出，例如脊髓产生的协调运动。传统上，谷氨酸能神经元为回路输出提供兴奋性输入，而γ-氨基丁酸能（GABA能）和甘氨酸能神经元则提供抑制性影响6-8。关键的是，谷氨酸能、GABA能和甘氨酸能神经元通过独特的分子机制传递信号，其轴突末梢与相应的突触后末梢形成突触。突触后支架蛋白通过锚定在特定突触上富集的受体和细胞黏附分子，为突触形成提供特异性。突触后密度蛋白95（PSD95）是兴奋性谷氨酸能突触的主要支架蛋白，而盖菲林蛋白（Gphn）则是抑制性GABA能和甘氨酸能突触的突触后支架蛋白9-13。在复杂回路中，这种突触传递的特异性对于协调神经元放电并产生运动等功能性行为至关重要。

值得注意的是，少突胶质细胞（OLs）会在单个轴突上生成长度和厚度各异的髓鞘14-15，且不同类型轴突上的髓鞘模式会因神经元类型和脑区不同而存在差异16-20。那么，是何种机制能让不同轴突类别在髓鞘形成过程中具备特异性呢？一种可能性是，少突胶质细胞可能通过类似的机制与轴突相互作用髓鞘形成发生在髓鞘与轴突在轴-髓鞘接触界面形成突触的位置。多项研究结果支持这一可能性。首先，神经元活动通过沿轴突释放囊泡促进髓鞘形成19,21-23。这种囊泡释放会在髓鞘后续生长的位点伴随轴突(Ca^{2+})事件发生19。其次，基因表达谱研究表明，少突胶质细胞系细胞（OLCs）表达许多编码突触后蛋白的基因，如PSD95和Gphn24-27。第三，干扰少突胶质细胞中突触后蛋白的功能会破坏髓鞘的形成与维持28-29。第四，GABAAR γ2的少突胶质前体细胞（OPC）特异性敲除改变了快速放电型GABA能PV中间神经元的髓鞘形态及其后续放电频率，却未影响邻近谷氨酸能棘星状细胞中间神经元的髓鞘或放电频率30。因此，我们旨在探究不同的轴突类型是否采用独特的髓鞘化机制。为此，我们提出假设：少突胶质细胞及其单个髓鞘利用突触后信号传导机制，协调依赖轴突身份的髓鞘化过程。

本研究利用斑马鱼幼体探究Gphn的功能是否介导由神经递质表型定义的特定类别轴突上髓鞘的形成。研究人员首先使用谷氨酸能、γ-氨基丁酸能和甘氨酸能神经元的转基因报告基因，证实发育阶段脊髓中每类神经元均有髓鞘形成。与研究假设一致，Gphn蛋白在发育过程中定位于髓鞘，并在包裹γ-氨基丁酸能和甘氨酸能轴突的髓鞘中富集。当gphnb功能丧失时，髓鞘长度异常增加，表明Gphn参与限制髓鞘生长的机制。此外，在gphnb突变体幼体中，髓鞘从γ-氨基丁酸能轴突转移至谷氨酸能轴突，且这一差异在髓鞘形成的早期阶段即可显现。同时，少突胶质细胞特异性敲除gphnb也会减少有髓鞘的γ-氨基丁酸能轴突数量。延时成像结果显示，野生型与突变体幼体的新生髓鞘更新速率无差异，但γ-氨基丁酸能轴突上的新生髓鞘总数更少，这提示Gphn还参与引导γ-氨基丁酸能轴突被选择形成髓鞘的过程。

这些观察结果共同表明，Gphn 在选择抑制性γ-氨基丁酸能轴突进行髓鞘形成以及随后调节髓鞘长度方面发挥着重要作用。此前利用电生理学开展的研究证实，少突胶质前体细胞（OPCs）中可检测到与神经元形成的功能性突触，而少突胶质细胞中则无法检测到31-32。我们的研究结果提出了一种可能性：随着少突胶质细胞的分化，它们会重新利用突触后蛋白来构建独特的、轴突类型特异性的髓鞘特征，进而可能对神经回路功能起到协调作用。

结果

发育中的脊髓中甘氨酸能、GABA能和谷氨酸能轴突均有髓鞘包裹

作为研究特定轴突类别髓鞘形成的第一步，我们基于神经递质表型对斑马鱼幼鱼脊髓轴突的髓鞘形成情况进行了检测。为此，我们结合使用转基因报告基因，同时对特定类别的轴突和髓鞘进行可视化观察（图1）。通过这一方法，我们发现谷氨酸能轴突（图1a）、γ-氨基丁酸能轴突（图1b）和甘氨酸能轴突（图1c）均发生了髓鞘化。对于每一种神经元类别，有髓轴突同时分布于脊髓的背侧（图1a-c的背侧及正交视图）和腹侧（图1a-c的腹侧视图）。此外，大型有髓谷氨酸能轴突和甘氨酸能轴突分布在脊髓中线附近（图1a和图1c）。有髓γ-氨基丁酸能轴突的直径通常更小，且多分布于更靠外侧的位置（图1b）。由此可见，少突胶质细胞会对斑马鱼幼鱼脊髓背侧和腹侧白质束中不同类别的轴突进行髓鞘化。

图1. 脊髓发育过程中，甘氨酸能、γ-氨基丁酸能和谷氨酸能轴突均有髓鞘包裹。4天龄斑马鱼幼虫脊髓横切面的代表性图像，其中幼虫表达转基因Tg(sox10:mRFP)（髓鞘，紫色），同时分别表达Tg(slc17a6:eGFP)（谷氨酸能轴突，绿色）、c Tg(gad1b:eGFP)（γ-氨基丁酸能轴突，绿色）或e Tg(slc6a5:eGFP)（甘氨酸能轴突，绿色）。b、d和f为框选区域的放大图，显示背侧和腹侧髓鞘束中的单个有髓鞘轴突，并展示各类神经元背侧有髓鞘轴突的正交视图。虚线轮廓标注正交视图和放大图中的有髓鞘轴突。a、c、e的比例尺=5微米。b、d的比例尺=20微米；f的比例尺=20微米

甘氨酸受体蛋白定位于部分而非全部髓鞘

少突胶质前体细胞（OLCs）表达许多编码突触后蛋白的基因，其中一些蛋白对髓鞘形成至关重要28。近期研究表明，突触后支架蛋白Gphn定位于少突胶质前体细胞（OPC）的突起29，且少突胶质细胞在髓鞘形成阶段仍持续表达Gphn24-25。我们推测，若Gphn通过髓鞘膜介导轴突包裹，那么它会出现在新生髓鞘中。为验证这一推测，我们利用免疫组织化学技术，在表达膜锚定髓鞘报告基因的转基因幼鱼中检测Gphn的表达（补充图1a-f）。结果显示，在背侧束（补充图1a、d，背侧视图）和腹侧束（补充图1a、d，腹侧视图）的髓鞘内均检测到了Gphn的定位。此外，我们发现从受精后4天（4 dpf）到受精后7天（7 dpf），髓鞘内单个Gphn斑点的体积及斑点总密度均有所增加（补充图1g-h）。这些数据表明，Gphn在发育过程中，它逐渐在髓鞘中积累，这支持了Gphn参与髓鞘形成的观点。

为了在活体动物中检测 Gphn，我们改造了一种基因编码的 Gphn 胞内抗体33，以分析 4 天龄（图 2a 和 c）和 7 天龄（图 2b 和 d）少突胶质细胞中的亚细胞定位。重要的是，缺乏 Gphn 功能的幼虫的少突胶质细胞（见下文）数量明显更少与野生型幼虫的少突胶质细胞（OLs）相比，Gphn.FingR 斑点数量更多，这验证了该标记方法的特异性（补充图2）。与我们通过Gphn免疫组织化学得到的结果一致，每个少突胶质细胞的Gphn.FingR斑点数量从受精后4天（4 dpf）增加到受精后7天（7 dpf）（图2e），这一效应不受少突胶质细胞髓鞘数量的影响（图2f）。在受精后4天和7天，并非所有髓鞘都含有Gphn.FingR信号，因此，为了检测亚细胞定位模式，我们对每个髓鞘的Gphn.FingR斑点数量进行了定量分析。结果显示，单个髓鞘的Gphn.FingR标记量存在差异（图2a-d），部分髓鞘含有高密度斑点（黄色框），而另一些髓鞘的斑点数量较少（品红色框）。斑点的频率分布在受精后4天到7天之间发生了显著变化，反映出到受精后7天时Gphn.FingR的表达整体有所上调（图2g）。值得注意的是，部分髓鞘在受精后4天和7天均未检测到Gphn报告基因信号（图2g）。这些结果表明，Gphn在新生髓鞘中的积累具有差异性，这提示其可能介导不同类型轴突的髓鞘形成。

图2. 发育过程中Gphn在髓鞘中的可变定位。a-b 为4天受精后（4 dpf）和7天受精后（7 dpf），分别表达mbpa:eGFP-CAAX（髓鞘，紫色）和基因编码的Gphn胞内抗体（zfmbpa:Gphn.FingR-mScarlet-IL2RGTC-KRAB(A)，橙色）的单个少突胶质细胞的荧光图像。c-d 分别为a和b中单个少突胶质细胞的三维表面模型，展示了4 dpf和7 dpf时mbpa:eGFP-CAAX标记的膜（紫色）内的Gphn胞内抗体信号。黄色框标注了Gphn胞内抗体信号丰富的单个髓鞘，品红色框标注了Gphn胞内抗体信号微弱的单个髓鞘。e 每个少突胶质细胞的Gphn斑点计数定量分析（4 dpf：(min =165.0)、(1^{st } quartile =265.5)、(median =536.0)、(mean =499.7)、(3^{rd } quartile =715.5)、(max =841.0)、(min =445.0)、(1^{st } quartile =877.8)、(median =1277.0)、(mean =1370.7)、(3^{rd } quartile =1821.5)、(max =2674.0)），(p-value =0.0011)，95%置信区间：-1301~-291。f 每个少突胶质细胞的髓鞘数量定量分析（(4 dpf min =8.0)、(1^{st } quartile =15.5)，中位数(=17.0)、(mean =17.6)、(3^{rd } quartile =22.0)、(max =23.0)），(7 dpf min =7.0)、(1^{st } quartile =10.3)、(median =13.0)、(mean =14.1)、(3^{rd } quartile =19.0)、(max =22.0)。g 4 dpf（橙色）和7 dpf（紫色）时每个髓鞘的Gphn斑点数量，虚线代表平均值（4 dpf 平均值±标准差=28.5±20.7，7 dpf 平均值±标准差=97.2±83.5）。少突胶质细胞斑点数量的显著性通过双侧威尔科克森秩和检验确定，少突胶质细胞髓鞘数量通过双侧学生t检验确定，p<0.05为(p<0.05)、(n=11)、(n=10 OLs)、(Scale bars =5 mu m)、(dpf =)。dpf：受精后天数；Gphn：甘氨酸受体相关蛋白；OL：少突胶质细胞；SD：标准差。源数据以源数据文件形式提供。

此前，我们已证实谷氨酸能突触处的经典突触后支架蛋白PSD95定位于新生髓鞘。由于Gphn定位于GABA能和甘氨酸能突触，这些独特的支架在少突胶质前体细胞特定突起和髓鞘中的存在28-29，可能为轴突类别特异性髓鞘形成的选择性机制提供基础。因此，为确定Gphn和PSD95是否分布于同一髓鞘或不同髓鞘，我们检测了同时表达Gphn和PSD95胞内抗体的背侧少突胶质细胞（补充图3a-d）。在受精后7天（7 dpf），不同髓鞘中这两种支架的密度存在差异。具体而言，部分髓鞘同时包含PSD95和Gphn斑点，部分髓鞘的PSD95斑点多于Gphn斑点（补充图a-d，蓝色方框），且其他少突胶质细胞的Gphn斑点数量多于PSD95斑点（补充图3a-d，橙色框）。总体而言，Gphn水平较高的少突胶质细胞，其PSD95水平也较高（补充图3e）。每个髓鞘中Gphn和PSD95的含量也存在相关性，但单个髓鞘内以及不同少突胶质细胞之间的表达水平差异极大（补充图3f）。综上，这些数据表明Gphn和PSD95并非均匀分布于新形成的髓鞘中。相反，不同髓鞘中这些支架蛋白的含量各不相同，这支持了它们可能具备介导髓鞘与不同轴突亚型相互作用的可能性。

能抑制性和甘氨酸能轴突上的髓鞘含有的Gphn比谷氨酸能轴突上的髓鞘多

由于Gphn在抑制性神经元突触处发挥作用，我们预测它定位于能释放γ-氨基丁酸（GABA）和甘氨酸的轴突髓鞘上。为验证这一预测，我们通过转基因报告基因表达标记了谷氨酸能、γ-氨基丁酸能和甘氨酸能神经元，进而研究了Gphn在这些神经元髓鞘内的定位情况（图3a-c）。我们采用免疫组织化学技术，在对应各类神经元的轴突髓鞘中识别出了Gphn斑点（图3a-c，黄色箭头）。值得注意的是，γ-氨基丁酸能和甘氨酸能轴突的髓鞘中含有的Gphn数量显著多于谷氨酸能轴突的髓鞘（图3d）。这一结果进一步支持了我们的模型，即突触后蛋白介导少突胶质细胞（OL）与特定类型轴突的相互作用。

图3. Gphn蛋白在GABA能和甘氨酸能轴突髓鞘中的富集。7 dpf时，对Tg(slc17a6:eGFP); Tg(mbp:mCherry-CAAX)幼虫、b Tg(gad1b:eGFP); Tg(mbp:mCherry-CAAX)幼虫和c Tg(slc6a5:eGFP); Tg(mbp:mCherry-CAAX)幼虫进行处理以检测Gphn的代表性横向图像。框选区域的放大图显示了相应轴突报告基因（绿色）上髓鞘（紫色）中的Gphn斑点（橙色）。所有放大图中，黄色箭头指向标记轴突类别上髓鞘内的Gphn斑点。d 对包裹每个轴突类别的髓鞘中Gphn斑点百分比进行定量分析，采用Kruskal-Wallis检验进行整体显著性分析，随后进行Bonferroni校正的Wilcoxon多重比较（谷氨酸能 (min =17.8)、(1^{st } quartile =21.2)、(median =23.2)、(mean =24.5)、(3^{rd } quartile =28.3)、(max =30.9)；GABA能 (min =36.0)、(1^{st } quartile =38.6)、(median =39.9)、(mean =40.6)、(3^{rd } quartile =42.7)、(max =47.9)；甘氨酸能 (min =34.0)、(1^{st } quartile =37.0)、(median =39.5)、(mean =39.9)、(3^{rd } quartile =42.0)、(=47.3 ))、(p-value =2.03 e-05)、(p-value =8.5 e-06)、(p-value =8.5 e-06)、(p-value =1)、(p<0.05)、(n=11)、(bars =1 mu m)）。Gphn = 甘氨酸受体相关蛋白。源数据已作为源数据文件提供。

Gphn 调控髓鞘长度

为研究Gphn在髓鞘形成中的功能，我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了功能缺失的gphn突变体。斑马鱼拥有2个gphn旁系同源基因，即gphna和gphnb，这两个基因很可能源自一次祖先基因组复制事件34-35。我们同时靶向gphna和gphnb，构建了两个在两个基因上均发生突变的品系：gphnaco91; gphnbco94和gphnaco92; gphnbco95（补充图4）。纯合双突变斑马鱼幼鱼无法存活至4天龄（dpf）之后，原因可能为由于Gphn在全身钼辅因子（MoCO）生物合成中所起的作用36。因此，我们通过回交分离了gphna和gphnb等位基因，随后使用免疫组织化学技术检测每个旁系同源基因纯合突变幼虫中的Gphn表达。gphna突变幼虫在脊髓中表达Gphn，而gphnb突变幼虫的Gphn表达量极低（补充图4d-f）。这与RNA原位杂交数据一致，后者显示斑马鱼中gphnb的表达仅限于中枢神经系统，而gphna则呈全局表达37-38。这些数据表明，gphnb突变主要使斑马鱼神经系统中的Gphn表达消失，因此我们将gphnb突变幼虫用于实验研究。

为验证盖菲林是否对髓鞘形成有作用，我们利用mbpa:eGFP-CAAX表达标记gphnb突变体和野生型斑马鱼幼体中的单个少突胶质细胞，并在不同发育阶段对其进行分析（图4a-f）。我们重点研究背侧少突胶质细胞，因为可以从单个细胞层面分析其髓鞘的所有特征。在3天胚胎期（dpf）和4天胚胎期，纯合gphnb突变体与野生型幼体的髓鞘长度和数量均无差异（图4g-h）。然而到了7天胚胎期，gphnb突变体幼体的髓鞘长度显著长于野生型幼体（图4g-h）。为确认该髓鞘表型是由Gphnb功能缺失导致，而非脱靶诱变事件引起，我们使用两个来自不同建系者的gphnb等位基因进行互补实验（补充图4g）。在7天胚胎期，反式杂合gphnbco94/95突变体幼体与纯合gphnbco95突变体幼体的髓鞘长度和数量均无差异（补充图4h-i）。综上，这些数据表明Gphn会限制髓鞘的生长。

由于神经元表达Gphn，我们开展了两项互补实验，以检测少突胶质细胞中Gphn的功能是否限制髓鞘长度。首先，我们利用mbpa:GPHN-2A-mApple-CAAX在gphnb突变体幼虫的少突胶质细胞中表达人源GPHN（补充图5a-b）。这一操作恢复了单个髓鞘的长度（补充图5），但髓鞘数量未发生变化（补充图5d）。其次，我们向胚胎中注射质粒经工程改造，可在U6启动子的调控下表达两种靶向外显子1和外显子2的gphnb单链向导RNA（sgRNA）；同时表达由mbpa调控DNA驱动的、与膜锚定的mScarlet荧光蛋白偶联的Cas9蛋白²⁹。本实验中，被mScarlet标记的少突胶质细胞（OLs）亚群会表达Cas9蛋白，以介导sgRNA引导的gphnb基因诱变。作为对照，我们注射了一种质粒，该质粒与实验用质粒序列完全一致，仅缺失编码sgRNA的序列。表达gphnb sgRNA质粒的少突胶质细胞，其髓鞘长度长于表达对照质粒的少突胶质细胞，这有力证实了少突胶质细胞中的Gphn蛋白功能会限制髓鞘长度（图4i-k）。与gphnb突变体幼鱼的少突胶质细胞不同，表达gphnb sgRNA质粒的少突胶质细胞形成的髓鞘数量少于对照少突胶质细胞（图4l）。综上，这些数据充分证明Gphn蛋白在少突胶质细胞中发挥作用，介导髓鞘的形成。

图 4.敲除 gphnb 会导致斑马鱼发育全程髓鞘鞘长度异常变长。a、c、e 图分别为受精后 3 天、4 天、7 天野生型幼鱼体内马赛克标记少突胶质细胞（OL）的代表性成像图； b、d、f 图（原文笔误写为 c）分别为受精后 3 天、4 天、7 天 gphnb 突变幼鱼中单根少突胶质细胞的代表性成像图。g 图为髓鞘单根长度统计学对比（青色 = 野生型，紫色 = gphnb 突变体）：受精后 3 天 野生型：最小值 2.2，下四分位数 18.8，中位数 26.9，平均值 28.8，上四分位数 37.1，最大值 65.2； gphnb 突变体：最小值 1.2，下四分位数 18.8，中位数 27.8，平均值 29.0，上四分位数 38.6，最大值 77.4； 两组 P 值 = 0.879，无统计学差异。受精后 4 天 野生型：最小值 2.0，下四分位数 24.2，中位数 33.3，平均值 35.3，上四分位数 44.5，最大值 81.4； gphnb 突变体：最小值 4.6，下四分位数 25.6，中位数 35.7，平均值 37.7，上四分位数 48.0，最大值 94.8； 两组 P 值 = 0.075，无显著统计学差异。受精后 7 天 野生型：最小值 6.0，下四分位数 27.1，中位数 38.2，平均值 39.1，上四分位数 49.9，最大值 94.9； gphnb 突变体：最小值 8.0，下四分位数 30.4，中位数 40.8，平均值 42.6，上四分位数 51.9，最大值 111.7； 两组 P 值 = 0.009，存在显著统计学差异。h 图为单个少突胶质细胞生成的髓鞘总数量统计：受精后 3 天 野生型：最小值 8.0，下四分位数 11.0，中位数 12.0，平均值 13.1，上四分位数 14.0，最大值 23.0； gphnb 突变体：最小值 7.0，下四分位数 11.0，中位数 1（受精后 4 天野生型）最小值 10.0，下四分位数 13.5，中位数 16.0，平均值 16.1，上四分位数 18.5，最大值 22.0； gphnb 突变体：最小值 6.0，下四分位数 11.0，中位数 13.0，平均值 14.0，上四分位数 16.8，最大值 25.0；P 值 = 0.192。（受精后 7 天野生型）最小值 7.0，下四分位数 9.0，中位数 12.5，平均值 13.1，上四分位数 15.5，最大值 25.0； gphnb 突变体：最小值 8.0，下四分位数 11.0，中位数 16.0，平均值 15.4，上四分位数 17.0，最大值 29.0；P 值 = 0.126。图 i、j 为受精后 7 天，分别表达无向导 RNA 对照组 Cas9、靶向 gphnb 向导 RNA+Cas9的单个少突胶质细胞代表性成像。图 k、l 为定量统计结果，青色代表对照组，紫色代表 gphnb 向导 RNA 处理组：k 单根髓鞘长度；对照组：最小值 3.9，下四分位数 22.0，中位数 30.3，平均值 31.1，上四分位数 38.8，最大值 76.4； gphnb 敲低组：最小值 6.1，下四分位数 27.6，中位数 37.7，平均值 38.4，上四分位数 47.4，最大值 71.6；P 值 = 0.006。l 单个细胞髓鞘总数。对照组：最小值 8.0，下四分位数 13.5，中位数 18.0，平均值 18.3，上四分位数 22.0，最大值 32.0； gphnb 敲低组：最小值 7.0，下四分位数 10.3，中位数 13.0，平均值 12.5，上四分位数 14.8，最大值 17.0；P 值 = 0.024。样本量说明（图 a–h）受精后 3 天：野生型共 13 个少突胶质细胞 / 幼鱼，gphnb 突变体共 30 个； 受精后 4 天：野生型 15 个少突胶质细胞 / 幼鱼，gphnb 突变体 18 个； 受精后 7 天：野生型 16 个少突胶质细胞 / 幼鱼，gphnb 突变体 21 个；图 i、l 实验组样本量：对照组 14 个少突胶质细胞 / 幼鱼，gphnb 向导 RNA 组 14 个。统计学方法：图 g、h 显著性检验采用III 型平方和检验，并经邦弗伦尼校正多重比较； 图 k 采用非线性混合效应模型分析显著性； 图 l 采用双侧威尔科克森秩和检验分析显著性； 统计学判定标准：P＜0.05 视为差异显著。标注说明：dpf = 受精后天数； 标尺长度 = 10 微米； 原始数据已随论文配套原始数据文件提供。统计名词释义：min = 最小值，1st quartile = 下四分位数，median = 中位数，mean = 平均值，3rd quartile = 上四分位数，max = 最大值

gphnb突变体幼虫的髓鞘长度过长并非由活动过度引起

甘蛋白锚定抑制性神经元突触处的GABA受体和甘氨酸受体。由于抑制作用对抑制兴奋性输出至关重要，我们预测gphnb突变体幼虫会因运动回路的抑制作用减弱而表现出过度活跃的行为。因此，我们对其游泳行为进行了追踪，发现在受精后7天（图5a），与野生型对照幼虫相比，gphnb突变体幼虫的运动时间更长（图5b），且游泳速度更快（图5c）。由于神经元活动会促进髓鞘形成¹⁹,²²⁻²³,³⁹⁻⁴⁹，我们检测了神经元活动是否会促使gphnb突变体幼虫形成长髓鞘的可能性。为此，我们使用河豚毒素（TTX）阻断神经元活动，该毒素可抑制电压门控钠通道。我们向卵黄囊注射了河豚毒素或对照溶液，并在受精后7天选取河豚毒素组中瘫痪的鱼进行成像观察（图5d）。在野生型幼虫中，河豚毒素诱导的神经沉默减少了髓鞘数量，同时增加了单个髓鞘的长度（图5e-f、i-j）。相比之下，与对照组相比，河豚毒素诱导的神经沉默并未改变gphnb突变体幼虫的髓鞘数量或长度（图5g-h、i-j）。我们得出结论，gphnb突变体幼虫过长的髓鞘并非由神经元活动增强引起。此外，这些数据表明，Gphn 功能丧失可能会损害神经元活动依赖性的髓鞘特征调节。

图5. gphnb突变体的过度活跃并不能解释长髓鞘的形成。a 7天龄（dpf）时，6条野生型（左侧，青绿色框选）和6条gphnb突变体（右侧，紫色框选）幼鱼的行为试验追踪数据。红色线条为单条幼鱼在10分钟视频录制期间的游动路径轨迹。对b运动时间（秒）（野生型 (min =0.00)、(median =3.80)、(mean =7.62)、(max =33.28)；gphnb (min =0.00)、(median =16.76)、(mean =26.38)、(max =91.44)：(p-value =0.0001)）和c游动速度（毫米/秒）（野生型 (min =0.0007)、(median =0.072)、(mean =0.107)、(max =0.381)；5119e8d1-02bf-4fc0-838b-a0943f5a70c、中位数 (=0.145)、(mean =0.222)、(max =0.792)：(p-value =0.0003)）进行定量分析。d 河豚毒素（TTX）实验的时间线：1）单细胞阶段mbpa:eGFP-CAAX的嵌合表达；2）6天龄（dpf）时分选eGFP并注射TTX或对照试剂；3）7天龄（dpf）时进行共聚焦成像。e野生型对照、f野生型+TTX、g gphnb突变体对照和h gphnb+TTX条件下少突胶质细胞（OLs）的代表性图像。i 每个少突胶质细胞髓鞘数量的定量分析（野生型对照 (min =9.0)、(1^{st } quartile =13.0)、(median =15.0)、(mean =16.2)、(3^{rd } quartile =18.0)、最大值）599b；野生型(median =12.0)，(mean =12.2)，(3^{rd } quartile =14.0)，(max =)18.0；(p-value =0.0115)）（gphnb(min =9.0)，(1^{st } quartile =11.5)，(median =16.0)，(mean =14.9)，(3^{rd } quartile =62.6)(max =114.2)，(p-value =0.020)： gphnbTTX(min =9.0)，(1^{st } quartile =12.0)，(median =15.0)，(mean =14.7)，(3^{rd } quartile =)17.0，(= 28.0)：(min =8.0)j单个鞘长度的量化（野生型对照最小=5.2，599bTTX(p-value =0.5246)，(min =5.2)(1^{st } quartile =26.6)，(median =38.8)(mean =39.3)，(3^{rd } quartile =50.7)，(max =90.8)；野生型TTXcontrol(min =7.1)，第一(quartile =33.8)，(median =48.0)，(mean =49.2)，(3rd)，quartile(=17.0)：(max =21.0)）（gphnb对照(min =3.0) (1^{st } quartile =33.3)，中位数=44.7,(mean =46.2) d75fb94d-0b13-4913-498,91b0 (max =110.8)：1b20b-f845f301c744；gphnb对照(n=14)；gphnb+TTXn=13。(p<0.05)被认为是重要的。(Scale bars =10 mu m)。dpf=受精后天数，TTX=河豚毒素。源数据作为源数据文件提供。

少突胶质细胞中的 Gphn 有助于选择能形成髓鞘的γ-氨基丁酸能轴突

在神经元中，Gphn 特异性地作用于参与GABA能和甘氨酸能信号传导的突触。Gphn 是否也能在新生髓鞘中发挥类似功能，以介导与GABA能和甘氨酸能轴突的特异性相互作用？为验证这一问题，我们使用转基因报告基因来检测gphnb突变体幼虫的髓鞘长度表型是否对轴突类型具有特异性（图6a-d）。该分析显示，在谷氨酸能轴突上，野生型与gphnb突变体幼虫的髓鞘长度无差异（图6e）；在GABA能轴突上，二者髓鞘长度也无差异，尽管我们观察到在gphnb突变体幼虫的GABA能轴突上，髓鞘有变长的趋势((p=0.076))（图6f）。

图6. gphnb突变体幼鱼谷氨酸能轴突和GABA能轴突上的髓鞘形成。a-b 野生型幼鱼中，a Tg(slc17a6:eGFP)谷氨酸能神经元和b Tg(gad1b:eGFP)GABA能神经元（绿色）中，用mbpa:mApple-CAAX（紫色）镶嵌标记的单个少突胶质细胞的代表性图像。c-d 7天龄（dpf）时，c 谷氨酸能和d GABA能gphnb突变体幼鱼中单个少突胶质细胞的代表性图像。黄色箭头指向包裹标记轴突类的单个髓鞘边缘，虚线轮廓表示该轴突类上髓鞘的周长。e-f 轴突类髓鞘长度的比较，e 谷氨酸能轴突（野生型谷氨酸能：(min =5.0)、(1^{st } quartile =28.5)、(median =35.2)、(mean =38.7)、(3^{rd } quartile =47.4)、(max =97.2)；gphnb谷氨酸能：(min =13.9)、(1^{st } quartile =28.9)、(median =)、35.5、(mean =37.6)、(3^{rd } quartile =43.8)、(max =81.1)；(p-value =0.431)）和f GABA能轴突（野生型GABA能：(min =10.1)、(1^{st } quartile =22.5)、(median =33.0)、(mean =36.5)、(3^{rd } quartile =48.1)、(max =70.1)；gphnb GABA能：(min =8.4)、(1^{st } quartile =35.2)、(median =43.77)、(mean =43.9)、(3^{rd } quartile =53.7)、(max =)、70.1；(p-value =0.076)）。采用非线性混合效应模型进行统计学比较；(p<0.05)被认为具有显著性；野生型谷氨酸能：(n=10 OLs)及幼鱼；gphnb谷氨酸能：(n=)10；野生型GABA能神经元 (n=12)：gphnb GABA能神经元 (n=9)。(Scale bars =5 mu m)。源数据已作为源数据文件提供。

我们随后探究了Gphn是否会影响特定轴突类别髓鞘化的过程。对脊髓横切面中有髓谷氨酸能轴突（图7Aa-b）和γ-氨基丁酸能轴突（图7c-d）的定量分析显示，与野生型对照幼虫相比，gphnb突变体幼虫在背侧脊髓（图7f）和腹侧脊髓（图7g）中均拥有更多的有髓谷氨酸能轴突，且有髓γ-氨基丁酸能轴突数量更少（图7e）。值得注意的是，gphnb突变体幼虫与野生型幼虫的髓鞘体积并无差异（补充图6）。这表明gphnb功能的整体缺失会使髓鞘的分布从γ-氨基丁酸能轴突转移至谷氨酸能轴突，而不会显著改变髓鞘的总量。有趣的是，我们发现gphnb突变体幼虫髓鞘内的PSD95斑点数量多于野生型（补充图7），这可能反映了髓鞘从γ-氨基丁酸能轴突向谷氨酸能轴突的位移。

图7. gphnb的缺失会使谷氨酸能轴突的髓鞘形成出现偏差。展示了7天龄（dpf）野生型和gphnb突变体幼鱼中谷氨酸能神经元（TgBAC(slc17a6:eGFP)，绿色）与髓鞘（Tg(sox10:mRFP)，紫色）的转基因标记图像，以及野生型和gphnb突变体幼鱼中γ-氨基丁酸能神经元（TgBAC(gad1b:eGFP)，绿色）与髓鞘的转基因标记图像。黄色框选的放大区域被放大，以详细显示背侧和腹侧区域。放大图中的虚线轮廓代表单个有髓鞘的轴突。e-g为脊髓单侧有髓鞘轴突数量的定量分析结果：e为总髓鞘轴突数量（野生型γ-氨基丁酸能：最小值=63.00，四分位数1=(median =67.83)，四分位数3=(mean =68.54)，最大值=(3^{rd } quartile =69.75)；gphnb突变体γ-氨基丁酸能：四分位数1=(min =56.00)，四分位数3=(quartile =57.67)，最大值=(median =58.67)；野生型谷氨酸能：最小值=(min =81.00)，四分位数1=(1^{st } quartile =89.08)，四分位数3=(median =94.50)，最大值=(mean =92.54)；gphnb突变体谷氨酸能：最小值=93.33，四分位数1=(quartile =97.58)，四分位数3=(median =100.83)，最大值=(mean =)）；f为背侧髓鞘轴突数量（野生型γ-氨基丁酸能：最小值=(GABAergic min =28.33)，四分位数1=(1^{st } quartile =29.33)，四分位数3=(median =29.67)，最大值=(mean =31.46)；gphnb突变体γ-氨基丁酸能：最小值=24.33，四分位数1=(quartile =24.67)，四分位数3=(median =25.50)，最大值=(mean =25.58)，p值=0.00089；野生型谷氨酸能：最小值=(min =19.00)，四分位数1=(1^{st } quartile =21.08)，四分位数3=(mean =22.79)，最大值=(3^{rd } quartile =24.08)；gphnb突变体谷氨酸能：最小值=(min =24.00)，四分位数1=(1^{st } quartile =)，四分位数3=(median =26.33)，最大值=(mean =27.12)）；g为腹侧髓鞘轴突数量（野生型γ-氨基丁酸能：最小值=(min =32.00)，四分位数1=(1^{st } quartile =34.17)，四分位数3=(median =38.67)，最大值=(mean =)；gphnb突变体γ-氨基丁酸能：最小值=(min =29.67)，四分位数1=(1^{st } quartile =32.25)，四分位数3=(mean =32.96)，最大值=(3^{rd } quartile =34.17)；野生型谷氨酸能：最小值=(max =34.67)，四分位数1=(p-value =0.035)，四分位数3=(1^{st } quartile =66.25)，最大值=(median =70.83)；gphnb突变体谷氨酸能：最小值=(mean =69.75)，四分位数1=(3^{rd } quartile =73.42)，四分位数3=(max =76.33)，最大值=(min =68.00)）

尽管我们针对细胞特异性缺失gphnb的方法重现了gphnb功能缺失的幼虫中形成的长单个髓鞘的表型，但与我们对纯合gphnb突变体的分析相比，我们发现这些细胞形成的髓鞘数量存在差异。因此，我们使用少突胶质细胞特异性的gphnb CRISPR/Cas9质粒来降低少突胶质细胞中Gphn的功能。并统计了单个少突胶质细胞在γ-氨基丁酸能轴突和谷氨酸能轴突上形成的髓鞘数量（图8a-d）。少突胶质细胞特异性缺失gphnb功能会减少发生髓鞘化的γ-氨基丁酸能轴突数量（图8c-e），这支持了我们的结论，即少突胶质细胞表达的Gphn促进γ-氨基丁酸能轴突的髓鞘化。相比之下，发生髓鞘化的谷氨酸能轴突数量无差异（图8a-b、e）。我们解读这些数据的含义是，少突胶质细胞中的Gphn功能增强了对γ-氨基丁酸能轴突而非谷氨酸能轴突的髓鞘化选择。此外，突变体幼虫中升高的神经元活性可能会增加单个少突胶质细胞形成的髓鞘总数（图5），这与先前的研究结果一致，即神经元活性和囊泡释放可调控少突胶质细胞的髓鞘数量²³，从而在谷氨酸能轴突上形成更多的髓鞘。

图8. 少突胶质细胞特异性缺失gphnb会减少能化能轴突的髓鞘形成。a-b 表达Cas9且无gRNA对照的谷氨酸能轴突和单个背侧少突胶质细胞的代表性图像，以及b 表达gphnb gRNA的图像。c-d 7天龄时表达Cas9且c无gRNA对照、d表达gphnb gRNA的单个少突胶质细胞与能化能轴突的代表性图像。正交y-z视图位于每张代表性图像右侧。x-y视图为单个0.19微米z层切片。黄色虚线轮廓表示包裹报告轴突的单个髓鞘。e 每个少突胶质细胞在报告轴突上的髓鞘数量定量分析（对照能化能 (min =5.0)、(1^{st } quartile =7.8)、(=9.0)、(mean =8.7)、(3^{rd } quartile =10.0)、(max =12.0)、(min =2.0)、(1^{st } quartile =3.6)、(median =)、(mean =4.6)、(3^{rd } quartile =5.3)、(max =8.0)、(p-value =1.339 e-09))、(min =6.0)、(1st)、(quartile =8.0)、(median =9.0)、(mean =10.0)、(3^{rd } quartile =12.0)、(max =16.0)、(min =7.0)、(1^{st } quartile =9.0)、(median =10.5)、(mean =11.2)、(max =18.0)、(p-value =0.2142)、(p<0.05)、(n=20)；gphnb组 (n=20)；谷氨酸能对照组 (n=17)；gphnb组 (n=22)；(Scale bars =5 mu m)）。源数据已作为源数据文件提供。

这种选择偏差是由于不同轴突类别上的髓鞘稳定性差异导致的，还是在轴突初始髓鞘化过程中形成的？我们推断，如果Gphn对于稳定新生髓鞘至关重要，那么在3天胚胎期（髓鞘化启动后不久），突变体幼鱼的髓鞘在各轴突类别中的分布应正常。然而，我们发现到3天胚胎期，gphnb突变体幼鱼的髓鞘化GABA能轴突数量更少，而髓鞘化谷氨酸能轴突数量更多（补充图8），这与我们在7天胚胎期的观察结果相似。我们接下来通过从受精后55小时开始进行延时成像直接研究髓鞘稳定性，该时期是髓鞘启动和生长的阶段（图9）。为量化观察结果，我们统计了沿轴突启动生长后被移除的髓鞘数量，将其定义为髓鞘化失败。分析显示，野生型和gphnb突变体幼鱼的髓鞘化失败总数无差异（图9i，补充视频1和2，橙色轨迹）。此外，我们发现GABA能轴突上的髓鞘化失败数量也无差异（图9b-c、e-f、j）。然而，与野生型幼鱼相比，gphnb突变体幼鱼GABA能轴突上的稳定髓鞘数量更少（图9k，补充视频3和4，蓝色轨迹）。因此，我们得出结论：Gphn的缺失不会降低新生髓鞘的稳定性，也不会降低GABA能轴突上髓鞘的稳定性。相反，这些数据表明，Gphn 促进少突胶质前体细胞突起对γ-氨基丁酸能轴突的识别，进而促成髓鞘形成。值得注意的是，近期一项研究发现，少突胶质前体细胞突起内的Gphn斑点聚集与髓鞘形成位点存在关联²⁹。综合来看，我们将这些数据解读为：突起内定位的Gphn会偏向选择γ-氨基丁酸能轴突进行髓鞘形成，这揭示了Gphn在髓鞘形成过程中具有依赖神经递质类型的功能。

图9. gphnb基因敲除会减少能抑制性轴突上新生髓鞘的数量。a和d为髓鞘形成开始前，野生型和gphnb突变体Tg(sox10:mRFP)幼虫的代表性z-stack图像。框选区域为放大图（b-c、e-f）中代表性髓鞘起始形成的位置，这些髓鞘随后无法在能抑制性轴突上稳定存在。b-c为能抑制性轴突上新生野生型髓鞘的代表性0.5微米单切片，该髓鞘在下一成像帧c中无法稳定存在。e为能抑制性轴突上新生的gphnb突变体髓鞘，其在下一成像帧f中无法稳定存在。黄色虚线轮廓表示新生髓鞘，橙色虚线轮廓表示新生髓鞘在前一成像帧中的位置（sox10:mRFP阳性突起仍清晰可见）。T值表示从约55小时受精后（hpf）开始成像，每30分钟为一个连续成像帧的增量。对能抑制性轴突上发生的髓鞘包裹失败数量进行定量分析（野生型：……；突变体：……；p值(=0.3618) k 为能化GABA能轴突上的稳定髓鞘数量（野生型 (min =1.0)，第一四分位数=3.3；(median =5.0)、(mean =4.4)、(3^{rd } quartile =6.0)、(max =6.0)：(gphnb min = 1.0)、(1^{st } quartile =1.0)，中位数=(1.0)；(mean =1.6)、(3^{rd } quartile =2.0)、(max =4.0)：(p-value =0.0029)）。显著性通过双侧t检验确定i，双侧秩和检验确定j和k (p<0.05) 被认为具有显著性；野生型 (n=10) 幼虫、gphnb (n=10) 幼虫。a和d的比例尺为(bar =10 mu m)；b-c、e-f和g-h的比例尺=5微米。源数据作为源数据文件提供。

讨论

少突胶质细胞在体外可对固定轴突和合成底物形成髓鞘48-50，这表明少突胶质细胞对轴突的髓鞘化无需依赖能区分轴突的特定分子或细胞信号。然而，在体内并非所有轴突都会形成髓鞘，且不同类型的轴突被髓鞘包裹的模式也各不相同14-18。此外，少突胶质细胞优先对电活性更高的轴突形成髓鞘19,22-23,45-46,48-49。这些观察结果提示，少突胶质细胞能够在发育中的神经系统中对其接触的多种不同轴突进行识别，但其背后的机制仍未明确。本研究旨在探究少突胶质细胞是否通过独特的分子机制，选择性地对不同神经递质类别的轴突进行髓鞘化。基于突触样机制可促进髓鞘形成的先前证据，我们将研究重点放在Gphn蛋白上——这是一种在接收抑制性信号的神经元突触后末端发挥作用的支架蛋白。综上，我们的研究数据支持如下模型：形成髓鞘的少突胶质前体细胞重新利用经典的突触后机制，以实现对特定轴突类别的髓鞘化，且这一过程具有神经元突触特有的特异性（补充图9）。

电生理测量显示，神经元与少突胶质前体细胞（OPCs）形成谷氨酸能和γ-氨基丁酸能突触连接，这种连接可介导少突胶质前体细胞内的兴奋性反应53-58。值得注意的是，少突胶质前突突起中的钙活性与Gphn的定位相关，这先于并预测了哪些突起最终形成髓鞘29。因此，神经元活动可能通过Gphn介导的突触相互作用向少突胶质前体细胞传递促髓鞘形成信号。在髓鞘形成过程中，突触机制是否也介导轴突与少突胶质细胞（OLs）的相互作用，目前尚不清楚。尽管在(OLs ^{32})中未检测到电活动，但在新生髓鞘中存在活性依赖性钙瞬变59-60。少突胶质细胞从少突胶质前体细胞分化后会表达编码突触后蛋白的基因24-25，我们先前的研究28结合本文提供的数据表明，突触后蛋白Cadm1b、Caska、PSD95和Gphn存在于斑马鱼的新生髓鞘中。因此，新分化的少突胶质细胞可能在髓鞘形成过程中与轴突上呈现的突触前分子相互作用的能力

与之前在小鼠中开展的研究结果一致¹⁵⁻¹⁸，我们证实少突胶质细胞（OLs）会在斑马鱼脊髓中对抑制性γ-氨基丁酸能（GABAergic）轴突、甘氨酸能轴突以及兴奋性谷氨酸能轴突形成髓鞘。神经元会借助不同的分子复合物组装不同类型的突触，尤其是兴奋性与抑制性突触。这些由抑制性突触处的支架蛋白Gphn和兴奋性突触处的支架蛋白PSD95锚定的复合物，是神经传递特异性的关键所在。神经元通过将这些分子复合物分配至不同的突触后末端，同时接收抑制性和兴奋性信号输入。本研究发现，GABA能和甘氨酸能轴突上的髓鞘所含Gphn数量多于谷氨酸能轴突上的髓鞘。这一发现引出了一个有趣的可能性：与神经元类似，单个髓鞘内不同的突触后复合物能够促进与特定类型轴突的相互作用。那么少突胶质细胞是如何利用突触后因子参与髓鞘形成的呢？本研究发现，Gphn功能的全局缺失会导致髓鞘包裹GABA能轴突的频率降低，包裹谷氨酸能轴突的频率升高，但髓鞘的总含量并未改变。少突胶质细胞特异性的gphnb基因突变同样减少了GABA能轴突上形成的髓鞘数量，这表明髓鞘形成过程中对GABA能轴突的选择是由少突胶质细胞中的Gphn功能驱动的。结合我们观察到的Gphn在GABA能轴突髓鞘中的富集程度高于谷氨酸能轴突髓鞘的现象，这些数据或许能为此前一项研究发现提供机制层面的解释——部分少突胶质细胞会优先在小鼠皮层中对抑制性轴突形成髓鞘¹⁸。此外，早在斑马鱼受精后3天（3 dpf），GABA能轴突的髓鞘形成减少现象就已显现，说明Gphn在髓鞘形成的早期阶段就参与了轴突靶标的选择。我们的延时成像数据显示，这一选择机制并非基于新生髓鞘的稳定化，因为gphnb基因缺失后，髓鞘的初始更新速率未发生变化，且GABA能轴突上的髓鞘丢失率也没有改变。不过，我们确实发现，在髓鞘形成的初始阶段，gphnb突变体斑马鱼GABA能轴突上稳定存在的髓鞘数量更少。这表明Gphn这会使初始髓鞘形成出现偏差，即在缺乏 gphnb 的情况下，被包裹的 GABA 能轴突数量更少。与此一致的是，定位于少突胶质前体细胞突起中的 Gphn 与髓鞘形成位点相关29。综上，这些研究结果表明，存在这样一种模型：突触后蛋白可协助不同类型轴突的髓鞘靶向定位与形成过程。

我们还发现，在缺乏Gphn功能的情况下，髓鞘长度异常变长。这种对髓鞘长度的影响仅在7天胚胎期（dpf）才显现，而此时斑马鱼幼鱼脊髓中的髓鞘延伸过程通常已完成61。先前的研究也表明，突触后蛋白功能的破坏会对髓鞘形成产生影响。例如，我们曾证实，突触发生黏附蛋白Nlgn2b、Cadm1b和Lrrtm1的显性负性形式在少突胶质细胞（OLs）中的特异性表达，会导致髓鞘变长（Nlgn2b）或变短（Cadm1b、Lrrtm1）28。研究人员采用瞬时、细胞类型特异性CRISPR/Cas9诱变技术，在斑马鱼少突胶质前体细胞（OPCs）中敲低编码PSD95的dlg4a/b、gphnb以及nlgn3b，结果发现5 dpf时髓鞘总长度减少29,62。此外，少突胶质细胞（OLC）特异性的(gamma 2-G A B A_{A})受体亚基敲除小鼠，其桶状皮层的髓鞘也出现变长现象30。这种影响在抑制性、γ-氨基丁酸能（GABAergic）小白蛋白（PV）+中间神经元上表现明显，而相邻的兴奋性、谷氨酸能棘星细胞（SSC）则保留了正常的髓鞘结构。值得注意的是，上述这些功能操作均未阻止髓鞘形成，但始终改变了髓鞘的长度。神经元活动也可调节髓鞘长度22,45-46，而髓鞘长度又会影响神经元放电模式3-5,63-64。因此，少突胶质细胞表达的突触后蛋白可能是髓鞘可塑性的关键介导因子，就像它们在突触可塑性中所起的作用一样。为支持这一推测，我们发现gphnb突变体幼鱼的髓鞘对TTX介导的神经元活性抑制无响应，而野生型幼鱼的髓鞘则存在该响应。

我们的全球gphnb突变体与细胞特异性gphnb缺失的结果之间的一个差异是有髓鞘谷氨酸能轴突的数量。在gphnb突变体幼虫中，与对照组相比，谷氨酸能轴突更频繁地被髓鞘化（图7和补充图8），而细胞特异性gphnb突变则无此差异（图8）。先前的研究研究表明，神经元活性的药理学升高会增加少突胶质细胞髓鞘的数量，这一过程依赖于突触小泡的释放²³。由于gphnb突变体幼虫表现出过度活跃的表型，且缺乏选择性GABA能轴突的相关机制，我们推测突变体幼虫的过度活跃状态（图5a-c）促使额外的髓鞘形成，并将其沉积在谷氨酸能轴突上。支持这一解释的证据是，gphnb突变体幼虫的髓鞘总含量并未发生变化（补充图6），且其髓鞘中PSD95的含量更高（补充图7），这很可能是由整体神经元活性的提升以及谷氨酸能神经元髓鞘化增加所导致的。综上，这些数据与神经元活性和少突胶质细胞突触后蛋白共同调控髓鞘数量及轴突选择的观点相符。

本研究中我们采用的少突胶质细胞（OL）特异性CRISPR/Cas9方法存在重要局限性。首先，利用瞬时表达技术难以验证少突胶质细胞中功能丧失突变的产生。尽管如此，该方法再现了gphn突变体幼虫的髓鞘长度表型和GABA能轴突选择表型，且在gphn突变体幼虫中，少突胶质细胞特异性表达人源GPHN可将髓鞘长度恢复至正常水平，这表明该方法能有效降低少突胶质细胞中Gphn的功能，为研究结论提供了依据。未来，这种细胞类型特异性瞬时表达方法可借助RNA靶向的Cas13系统进行优化，结合RNA定量技术可评估基因敲低效率65。其次，我们未能建立稳定的转基因品系以在所有少突胶质细胞中灭活Gphn功能，这使得我们无法研究神经回路的髓鞘形成过程，也无法开展行为学相关实验。由于我们常规构建其他转基因表达品系，推测Cas9转基因极易发生基因组沉默。利用pIGLET位点特异性重组系统66将Cas9转基因插入安全位点，或可克服这一局限性。

本研究的另一项局限性是，我们未对脊髓中所有主要轴突类别上髓鞘模式的潜在变化进行全面表征。具体而言，我们未检测甘氨酸能轴突。在神经元中，Gphn 与甘氨酸受体（GlyR）和 GABAA 受体存在差异性相互作用67-68。例如，Gphn 定位于所有甘氨酸能突触，并且是GlyR 会发生聚集36,67，但Gphn并不会定位于所有能释放γ-氨基丁酸的突触，且它仅对(GABAAR)亚基的聚集是必需的69。这或许可以解释为何在能释放γ-氨基丁酸和谷氨酸的轴突上未出现明显的髓鞘长度表型（图6），而在轴突类型难以区分的情况下该表型却十分显著（图4）。推测在缺乏Gphn功能时，最长的髓鞘形成于能释放甘氨酸的轴突上。在后续研究中，我们计划对比能释放γ-氨基丁酸和甘氨酸的轴突上的髓鞘形成情况。

综合来看，我们的研究数据揭示了经典突触后蛋白在特定神经递质轴突类别髓鞘化过程中的作用。我们有证据表明，Gphn 会偏向性地选择抑制性轴突进行髓鞘靶向，并影响髓鞘的生长。由于髓鞘能够改变轴突传导速度3-5，髓鞘靶向性与可塑性可通过微调发育中神经回路内单个轴突的活性，对神经回路发育产生重要影响70-72。相关证据也支持了这一点：少突胶质细胞中(gamma 2)型GABAA亚基的特异性缺失，会改变PV+神经元的放电频率，却不影响相邻兴奋性SSC神经元的频率30。因此，少突胶质细胞缺失gphnb导致GABA能轴突髓鞘丢失，以及我们在gphnb突变体幼鱼中观察到的特定轴突类别髓鞘模式的重新分布，可能会通过破坏兴奋性与抑制性信号的平衡（E/I平衡），对神经回路功能产生重要影响70-75。这也意味着，与自闭症、精神分裂症等神经精神疾病显著相关的突触基因遗传变异，可能会改变髓鞘形成，进而成为这些疾病中E/I失衡特征的诱因之一。

实验方法

斑马鱼品系与饲养管理

本研究所有成鱼及幼鱼操作均严格遵循科罗拉多大学实验动物伦理委员会（IACUC）第 0370 号实验方案规范。

本文使用的既往构建转基因品系如下： TgBAC (slc17a6b:eGFP)、Tg (slc6a5:eGFP)、TgBAC (gad1b:eGFP)、Tg (sox10:mRFP) vu234、Tg (mbpa:eGFP-CAAX) co58、Tg2 (mbpa:mCherry-CAAX) co13（各品系 Zfin 编号详见补充表 1）。鱼卵收集或显微注射完成后，将胚胎置于 28.5 ℃培养皿中培养；胚胎培养液配方为每 20 升超纯水添加 6 克人工海盐，每皿胚胎密度控制在 60 枚及以内。胚胎破膜孵化后的幼鱼转移至筛选培养液（1×E3 溶液，含 60 μg/mL 碳酸氢钠、145 μg/mL 氯化钙）中，同等密度饲养至受精后 7 天（dpf）。

胚胎显微注射操作

杂交产卵后 30 分钟内收集鱼卵，于单细胞阶段完成注射。Tol2 转座子转基因注射体系中，每枚卵注射 2–3 纳升质粒混合液，质粒终浓度 6–25 纳克 / 微升。成像前筛选脊髓携带转基因荧光标记的幼鱼用于后续实验。

需基因型鉴定的固定样本：将幼鱼麻醉后快速剪取尾部组织裂解用于基因分型，鱼身主体置于 4% 多聚甲醛（PFA）固定；无需分型的固定实验样本，直接用 4% 三卡因甲磺酸酯麻醉处死，再进行固定处理。

基因诱变

本研究采用 CRISPR/Cas9 系统构建 gphn 基因功能缺失突变体。 借助 CRISPOR 在线工具设计靶向 gphna、gphnb 基因 1 号外显子编码区的向导 RNA（gRNA 序列详见补充表 1，对应结果见图 5）。 参照《Alt-R CRISPR-Cas9 体系：核糖核蛋白复合物体外切割靶 DNA》标准方案合成各向导 RNA（方案链接见原文，2017 年版）。 注射前现配核糖核蛋白（RNP）复合物，Cas9 蛋白终浓度为 0.5 微克。将（IDT 公司合成的向导 RNA）稀释于 Cas9 工作缓冲液（20 mM 4 - 羟乙基哌嗪乙磺酸、150 mM 氯化钾，pH 值 7.5）中，gphna、gphnb 两种向导 RNA 各取 100 纳克，混合后置于 37 ℃条件孵育 10 分钟。配制好的混合液室温存放备用，在野生型斑马鱼胚胎单细胞阶段共注射 2–3 纳升该混合液，构建双基因突变体。数尾注射后的 F0 代幼鱼，采用跨向导 RNA 靶向位点的 PCR 引物进行扩增筛选，检测 DNA 切割修复产生的插入、缺失突变（引物及序列详见补充表 1）。将阳性 F0 个体饲养至性成熟，分别与野生型斑马鱼回交。麻醉单尾 F1 幼鱼，使用 50 mM 氢氧化钠溶液提取基因组 DNA，随后加入 1 M、pH9 的三羟甲基氨基甲烷溶液中和；从至少 2 个独立 F0 亲本繁育得到的 F1 子代中各选取若干个体，通过 TA 克隆与测序鉴定突变等位基因，并与参考基因组序列比对验证。筛选携带 gphna^co91、gphna^co92、gphnb^co94、gphnb^co95 突变等位基因的 F1 成鱼，再次与野生型回交，繁育得到 F2 代幼鱼用于后续全部实验。所有开展突变表型实验的野生型、突变幼鱼均经过基因型分型，确认携带对应突变等位基因。

行为学实验

将7天龄的斑马鱼幼鱼分别放入24孔板的单个孔中，每孔加入等体积的筛选培养基。随后将24孔板转移至科罗拉多大学安舒茨医学校区神经技术动物行为室，置于带盖盒子中，让幼鱼在该环境中适应10分钟。进行行为记录时，将培养板放置在DanioVision（Noldus）记录箱内，幼鱼先在记录箱中适应10分钟，再启动记录，持续10分钟。行为学实验结束后，对幼鱼进行麻醉并裂解，以进行基因型鉴定。

TTX 注射

在神经元活性实验中，于受精后第6天向卵黄囊注射电压门控钠通道阻滞剂河豚毒素（TTX）。所有动物均用三卡因麻醉，并在配备立体显微镜的设备下按荧光报告基因表达情况进行分选落射荧光光学系统。麻醉后，将幼鱼放入由2%琼脂糖溶于卵水制成的模具中，模具内设有单个幼鱼孔。将幼鱼置于孔中，使其卵黄囊朝上，向鳔下方的卵黄囊注射3-4纳升缓冲四溴菊酯溶液（含0.6毫摩尔四溴菊酯、0.4摩尔氯化钾、0.05%酚红及水）或对照溶液（含0.4摩尔氯化钾、0.05%酚红及水）。随后将幼鱼从模具中取出，放入新鲜卵水中，在成像前充分恢复24小时。

克隆

本研究使用Gateway系统和Tol2试剂盒84构建了补充表1中列出的多种质粒。为构建Gephyrin胞内抗体中间载体，我们以pCAG_GPHN.FingR-mKate2-IL2RGTC（Addgene质粒#46297；RRID: Addgene_46297）为模板，在计算机模拟中将mKate2荧光蛋白替换为mScarlet。以该质粒为模板，我们从VectorBuilder定制订购了pEXPR-zfmbpa:GPHN.FingR-mScarlet-IL2RGTC-KRAB(A)-pA-CC2-Tol2质粒，以及我们此前发表的PSD95胞内抗体改良版28（用于共表达实验，质粒为pEXPR-zfmbpa:PSD95.FingR-EGFP-CCR5TC-KRAB(A)-pA-CC2-Tol2）（载体ID见补充表1）。为构建编码人GPHN蛋白的入门质粒，我们以pECE-M2-GPHN（Addgene质粒#31665；RRID: Addgene_31665）为模板，设计了能在编码序列两侧引入Kozak序列和attB位点的引物。使用Phusion聚合酶扩增人GPHN编码序列后，与pDONR-221进行Gateway BP反应，构建中间载体pME-GPHN。我们还构建了含mApple-CAAX序列的中间载体和3'端载体：通过Gateway克隆构建pME-mApple-CAAX载体，通过InFusion克隆（Takara Bio, 638944）构建p3E-mApple-CAAXpA载体（克隆引物和入门质粒见补充表1）。后续利用Gateway系统将这些中间载体及其他载体与5'端入门载体p5E-mbpa共同克隆至表达质粒，该5'端载体可提供顺式调控元件，且T2A序列后连接3'端报告荧光蛋白（表达载体见补充表1）。

为构建细胞特异性CRISPR质粒，我们对Li等人2024年发表的10xUASE1b:myrmScarletP2A-Cas9polyA;U6-ctrl-sgRNA1;U6-ctrl-sgRNA2-pA质粒（由Kelly Monk博士惠赠）进行了改造29。我们将带有与质粒骨架互补的4个碱基突出端的单链寡核苷酸进行退火，以生成各双链gRNA（单链寡核苷酸序列见补充表1；突出端序列已加下划线）85。寡核苷酸在IDTE缓冲液（10 mM 三羟甲基氨基甲烷（pH 8.0）、0.1 mM 乙二胺四乙酸）中退火，热循环仪条件如下：95℃孵育5分钟，以0.1℃/秒的速率降温至50℃，并在50℃保持10分钟。随后用BsaI酶切质粒骨架，按照制造商说明书，用NEB快速连接酶连接退火的gphnb gRNA1寡核苷酸，并对所得质粒进行转化。后续使用BsmBI对gphnb gRNA2重复上述过程。我们通过限制性克隆技术，用XmaI和XhoI将mbpa调控DNA替换10xUASE1b序列。简要而言，通过引入XmaI和XhoI酶切位点的引物对mbpa调控DNA进行PCR扩增（引物序列见补充表1）。随后对该PCR产物和10xUASE1b:myrmScarlet-P2A-Cas9polyA;U6-ctrl-sgRNA1;U6-ctrl-sgRNA2-pA质粒进行酶切，使用NEB快速连接试剂盒连接载体与插入片段，再进行转化。通过全质粒测序验证了质粒构建的正确性。

免疫组织化学

在每个时间点将幼虫固定在4%多聚甲醛中，24小时后用1×磷酸盐缓冲液洗涤。随后将幼虫包埋在含蔗糖的1.2%琼脂糖中，切成小块，置于30%蔗糖溶液中浸泡过夜。将小块干燥后在干冰上冷冻，于-80℃保存至切片。使用徕卡1950冰冻切片机将小块切成20微米厚的切片，贴片至极化载玻片上。将载玻片置于Sequenza染色架中，随后按照先前描述的方法28,77进行免疫染色（赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆市）。简要步骤如下：用1×含0.1% Triton-X 100的磷酸盐缓冲吐温溶液洗涤载玻片3次，每次5分钟。然后加入封闭液（1×磷酸盐缓冲吐温溶液中含2%山羊血清和2%牛血清白蛋白）封闭1小时。将一抗（抗体种类和浓度见补充表1）稀释于封闭液中并滴加至将载玻片置于4℃环境下过夜保存。次日，将载玻片置于1×PBSTx中洗涤，每10分钟更换一次，共洗涤1.5小时；随后将二抗稀释于封闭液中，加入载玻片并在室温下孵育2小时（抗体种类及浓度详见补充表1）。二抗洗涤步骤同样使用1×PBSTx，每10分钟更换一次，持续1.5小时；之后用DAPI染色5分钟（可选，按1:2000的比例稀释于1×PBSTx中）。若进行DAPI标记，需将载玻片用1×PBSTx洗涤3次，每次5分钟，随后进行封片处理。滴加两滴Vectashield（Vector Laboratories公司，货号H-1000-10），覆上1号盖玻片。用透明指甲油密封载玻片，室温下放置15分钟使其干燥，最后置于4℃环境保存，直至成像。轴突类型髓鞘形成实验，以及野生型和突变体总髓鞘量实验，均采用固定的横切面样本；该类样本仅用PBSTx洗涤后直接封片，不进行免疫染色处理。

成像

活体动物荧光成像

对经转基因报告基因筛选或脊髓荧光报告基因表达呈阳性的麻醉幼虫，分别在受精后3天（3 dpf）、4天（4 dpf）和7天（7 dpf）进行成像。将幼虫侧卧于含0.6%三卡因的0.9%琼脂糖中，贴在盖玻片上，在转盘式共聚焦显微镜（德国奥尔滕堡卡尔蔡司公司）或激光扫描共聚焦显微镜（卡尔蔡司公司）上，使用40倍水镜进行成像。在卵黄囊延伸部上方对单个背侧少突胶质细胞（OLs）进行成像。采用标准共聚焦成像技术，以0.5微米的步距采集Z轴堆叠图像，用于髓鞘分析。在蔡司880共聚焦显微镜上采用超高分辨率Airyscan共聚焦成像技术，对携带转基因神经元报告基因的gphnb突变体和野生型幼虫的单个少突胶质细胞采集Z轴堆叠图像，以0.225微米的步距分析不同轴突类型上突变体与野生型的髓鞘长度。Airyscan成像技术也以0.5微米的步距采集所有抗体内成像图像。在gphnb髓鞘化轴突数量的细胞特异性缺失实验中，将幼虫置于Andor Dragonfly 200转盘式共聚焦显微镜（英国牛津仪器公司）搭配徕卡DMi8倒置显微镜的系统中，使用25倍水镜，以0.19微米的步距进行成像。若需对幼虫进行基因型鉴定，需从琼脂糖中取出单个幼虫。完成成像后，用氢氧化钠和三羟甲基氨基甲烷裂解幼虫，并按上述方法进行基因分型。否则，幼虫在成像后被实施安乐死。

延时成像

按照上述方法，将经荧光报告基因分选的麻醉幼虫矢状固定在50×7 mm的WillCo-dish玻璃底培养皿中（货号#GWST3512），培养皿内铺有含0.6%三卡因的卵水，并用培养皿盖覆盖，以防止成像过程中幼虫脱水。成像开始前，让幼虫在显微镜下适应2小时，使琼脂糖凝固并达到温度平衡。适应完成后，选取成像位置以捕捉脊髓的一半区域，特意对Z轴堆栈进行过采样，以应对可能出现的漂移。成像从受精后约55小时开始，以0.5微米的步距间隔每30分钟拍摄一次Z轴堆栈图像，持续19小时。成像结束后，按上述方法进行基因型鉴定。

固定组织成像

使用配备40倍油镜且至少1.8倍变焦的蔡司LSM 880 Airyscan共聚焦显微镜，或配备63倍油镜的安道尔Dragonfly 200转盘共聚焦显微镜，对厚度为20微米的固定冷冻切片组织进行横断成像。免疫染色实验中，所有图像均在染色后两周内采集。每尾幼体在卵黄延伸部上方连续采集3-5张脊髓图像，每尾幼体的数据进行求和或取平均处理。实验内所有成像参数（包括Z轴步长、帧尺寸、位深、激光功率和增益）均保持一致。

数据分析

图像盲化

所有图像均在分析前进行了盲化处理。我们使用了由尼克·乔治（Nick George）和温迪·麦克林（Wendy Macklin）开发的FIJI（斐济就是ImageJ）86图像盲化插件Lab-utility-plugins/blind-files（网址：https://github.com/Macklin-Lab/imagej-microscopy-scripts），或是Blind Analysis Tools这款FIJI插件中的File Name Encrypter，仅在分析完成后才进行解盲。

鞘分析

鞘长度使用 FIJI 软件结合神经解剖学插件 SNT（简单神经突示踪剂）87 进行测量，方法如先前所述22,28,81,88。分析前先进行背景扣除，滚球半径设为 50 微米。简要来说，针对单个少突胶质细胞，追踪每个鞘的路径并测量其微米级长度。每个长度测量值均计为单个鞘，随后汇总每个细胞的鞘数量。绘制所有分析的少突胶质细胞的单个鞘长度分布图，并按细胞绘制鞘数量图。 对于野生型和 gphnb 突变体幼虫的轴突类型鞘长度分析，首先使用 Zen Black 软件（卡尔·蔡司，2.3 SP1 版本）对图像进行 Airyscan 处理。使用 Imaris x64 软件（牛津仪器，9.9.1-10.2.0）追踪鞘并对已报告轴突上的鞘进行分类。使用丝状体工具并通过手动追踪功能完成鞘的追踪。手动追踪单个鞘，并获取每个丝状体长度的详细统计数据。随后评估每个鞘是否包裹报告轴突。最后按基因型和神经元报告条件，绘制报告轴突上单个鞘的长度分布图。

免疫组织化学分析

我们使用 Imaris 对所有免疫染色结果进行定量分析。针对野生型和突变体幼虫的 Gphn 抗体染色，先在 Zen Black 软件中对图像进行 Airyscan 反卷积处理。随后进行背景扣除，半径设为 15 微米，再将图像堆栈裁剪至 20 微米。接着创建表面对象以定量分析斑点，背景扣除参数设为 0.5 微米，阈值设为最大值的 5%，随后进行基于强度的对象分割，并应用体积≥0.00125 微米的最终过滤。通过手动创建功能构建脊髓表面：在最后一个切片上沿脊髓轮廓绘制，将该表面复制到第一个切片，再基于绘制的感兴趣区域（ROI）生成表面对象。随后将 Gphn 表面对象筛选为脊髓内的信号信号。最后收集每种基因型的总斑点体积和单斑点体积的具体详细统计数据。共采集三张图像对每只幼虫进行了分析，并针对每张图像的脊髓体积对Gphn斑点数量进行了校正。随后计算每条鱼的平均值，并以每100个斑点的形式绘制，对应(100 mu m^{3})。

针对髓鞘实验中的Gphn和PSD95斑点，图像先在Zen Black软件中进行Airyscan反卷积处理，随后在Imaris软件中对所有通道进行半径为15微米的背景扣除。接着将图像从Z轴堆叠中裁剪至内部20微米的切片。与上述单个少突胶质细胞的处理方式类似，为髓鞘通道创建表面模型，采用最大球体直径为1微米的背景扣除，随后通过人工调整阈值，并设置2微米的物体分割滤波器，以最佳匹配荧光信号。手动删除多余的背景表面。然后，按照上述野生型和突变型条件，为Gphn或PSD95通道创建表面模型。随后，将该Gphn或PSD95表面模型按与髓鞘表面的距离进行筛选，保留距离≤0微米的区域，并复制为新的表面模型。该髓鞘距离筛选会捕获髓鞘表面内的斑点，同时手动删除所有明显仅接触髓鞘外表面的斑点。最终生成具体的详细体积统计数据，以提供髓鞘中Gphn（及PSD95）的斑点总数和每个斑点的体积。

为量化轴突类别髓鞘中的Gphn斑点，我们在Imaris中进行了10次迭代去卷积，随后对Gphn通道进行了15微米半径的背景扣除。接着，我们按照上述髓鞘中Gphn分析的方法，创建了髓鞘和Gphn表面对象。将髓鞘中的斑点复制到新的表面对象后，启用切片视图选项并打开神经元和髓鞘荧光通道，手动评估每个斑点是否位于报告轴突的髓鞘内。选定位于报告轴突髓鞘内的斑点并将其复制到新的表面对象，随后生成具体的详细体积统计数据。通过汇总报告轴突髓鞘内的斑点数量并除以髓鞘内的总斑点数，计算出轴突类别中髓鞘内斑点的比例（图3d）。

体内结构分析

体内图像经Airyscan反卷积处理后，在Imaris软件中进行分析。先进行半径为15微米的背景扣除，随后裁剪图像以分离单个背侧少突胶质细胞。为少突胶质细胞创建表面模型，采用最大球体直径为1微米的背景扣除方式，接着手动调整阈值以最佳匹配荧光信号。同时使用2微米的分割对象过滤器，更精准地捕捉少突胶质细胞表面。 为体内结构创建表面模型时，采用最大球体直径为0.35微米的背景扣除方式，手动调整阈值以最佳匹配荧光信号，使用0.5微米的分割对象过滤器，随后通过体素过滤器进一步消除背景表面的生成。 随后将体内信号筛选至少突胶质细胞表面范围内，手动删除大部分体积位于少突胶质细胞表面外、仅少量体积位于表面内的斑点，以及恰好接触少突胶质细胞外表面的斑点。接着手动将单个髓鞘中的斑点复制为新的表面对象，利用详细的具体统计数据进行每髓鞘斑点数量的定量分析。通过汇总单个髓鞘中的斑点数量，计算出每个少突胶质细胞的总斑点数，这一方法排除了细胞体中明亮的自调控表达。 为定量每个少突胶质细胞的Gphn和PSD95体内结构，按上述方法为斑点创建表面模型，手动选取单个髓鞘内的所有斑点，将两种体内结构的斑点分别复制为新对象。随后收集详细统计数据，计算出每个髓鞘的Gphn和PSD95总斑点数。

髓鞘轴突计数分析

在Fiji软件中对横切面图像进行处理和分析。首先，采用15微米滚球半径进行背景扣除。随后，提取内部20微米切片的新子堆栈，并使用多点工具识别脊髓一侧的所有髓鞘轴突。对计数进行汇总并按区域（背侧白质束、内侧白质和腹侧白质束）分类。每条幼虫分析3张图像并取平均值。选取0.5微米的单张切片作为代表性图像，同时分离野生型和gphnb突变体幼虫的相同区域以进行放大观察。针对Gphnb细胞特异性缺失的有髓轴突计数，每条斑马鱼仅分析一个少突胶质细胞。我们进行了0.75微米的高斯滤波处理，合并髓鞘和神经元通道，并使用细胞计数插件标记报告基因轴突上的髓鞘。若在z平面中轴突信号两侧均能观察到髓鞘信号，且在x和y平面中髓鞘信号环绕轴突信号，则对该髓鞘进行计数。

延时分析

我们使用 Imaris 软件（10.2 版）分析延时数据。在19小时的成像窗口内，将图像裁剪至白质区域。随后对所有图像进行背景减除处理，采用50微米的半径，接着施加0.1的高斯滤波。之后使用丝状体工具，在每30分钟的时间点手动追踪单个少突胶质细胞（OL）形成的所有髓鞘。选取未成功形成或消失的追踪轨迹，并将其复制到新的对象中。保存详细的长度统计数据，汇总单个少突胶质细胞的轨迹失败数量。接着通过切片视图手动判断失败的轨迹是否位于γ-氨基丁酸能轴突上；将这些轨迹复制到新对象并保存详细统计数据。最后，通过切片视图手动评估稳定的髓鞘是否位于γ-氨基丁酸能轴突上，将这些轨迹复制到新对象并保存详细统计数据。

行为分析

DanioVision 软件（Noldus）录制了10分钟的视频，并借助EthoVision TX自动追踪单个幼体的运动轨迹。研究统计了幼体的总运动时长与运动速度，以此对野生型和gphnb突变体幼体展开对比分析。

统计分析

所有数据分析、统计和绘图均在 RStudio（v 2024.04.2+764）中的 R 软件中完成，行为分析除外，该部分在 GraphPad 中进行使用 Prism（10 版）进行分析。数据和统计分析借助 ggpubr、emmeans 以及 nlme 软件包完成。图表通过 dplyr 和 ggplot2 软件包生成。采用 Shapiro-Wilkes 检验对每个实验的数据进行正态性检验。若数据符合正态分布了 ((p>0.05))，采用参数检验对各组进行比较。若数据不满足正态分布，则使用非参数检验。对于两组检验，采用学生t检验、威尔科克森秩和检验或曼-惠特尼U检验。对于存在多重比较的数据集，采用单因素方差分析、克鲁斯卡尔-沃利斯检验，或针对非平衡设计的Ⅲ型双因素方差分析检验整体显著性，随后进行经邦费罗尼校正的配对t检验或威尔科克森秩和检验。对于单个鞘长度的比较，采用非线性混合效应模型以考虑单个鞘来自少突胶质细胞（OL）的相关性。在单个鞘分析的体内双重相关性检验中，数据不满足线性回归假设，因此采用斯皮尔曼相关分析。行为学实验中，通过Prism软件的ROUT方法识别异常值，最大错误发现率为(Q=1 %)。所有实验均在斑马鱼性别尚未确定的7天龄（dpf）时开展，所有样本量（n）标注于图例中，代表每组实验中斑马鱼幼鱼的数量。所有实验均至少进行了三次生物学重复。