题目：Assessment of safety profile and anti-obesity effects of innovative plant-based food formulations in a zebrafish diet-induced obesity model

原文链接：https://dx.doi.org/10.3389/fnut.2026.1867646

期刊：Frontiers in Nutrition

摘要

引言：肥胖是一种复杂代谢性疾病，会伴随糖代谢、脂代谢紊乱以及内脏脂肪过度蓄积问题。因此，研发有效的膳食干预方案（包括功能性食品）已成为当下研究热点。本研究以斑马鱼为动物模型，评价三种食品配方（F1、F2、F3）的安全性及其代谢调节作用。

方法：以斑马鱼胚胎和幼鱼为实验对象，通过检测存活率、孵化率、自发运动、形态畸形情况与心脏功能，评估活性复合物的安全特性；为探究配方对代谢的作用，在成年斑马鱼体内构建饮食诱导肥胖模型。

结果：补充 F1、F2、F3 任意一种配方均不会对斑马鱼早期发育产生毒性，也不会造成发育缺陷。与肥胖对照组相比，三种配方均可显著降低斑马鱼体重、血糖、甘油三酯及总胆固醇水平。此外，所有配方均能减少内脏脂肪含量，其中 F1、F2 还可显著降低皮下脂肪量。

讨论：上述结果证实，受试食品配方安全性良好，能够改善斑马鱼各项代谢指标、减少脂肪堆积。该研究表明，三款配方具备作为功能性膳食干预产品的潜力，可用于改善饮食性肥胖引发的代谢功能紊乱。

关键词：功能性食品、血糖、代谢紊乱、肥胖、植物基制品、斑马鱼

引言

肥胖是一种慢性、复杂的疾病，患病人数不断增加，已在全球范围内达到流行病规模。它会增加患2型糖尿病、血脂异常等代谢性疾病的风险；然而，代谢失调也可能是导致肥胖发生的关键因素。肥胖个体的内脏脂肪增大与代谢性和心血管疾病的发生发展密切相关，且与这些患者中普遍存在的胰岛素抵抗相关。此外，肥胖与血糖调节异常有关，并会导致糖耐量异常。血脂异常是肥胖患者中另一种高度流行的代谢性疾病，与胆固醇和甘油三酯水平异常相关。这些代谢紊乱凸显了饮食干预（包括功能性食品）作为预防和治疗肥胖及其代谢并发症的辅助手段的重要性。功能性食品被认为是因含有生物活性化合物而能提供超出基本营养价值的健康益处的产品。在肥胖领域，功能性食品可通过维持能量平衡、调节血糖和脂质代谢，帮助预防体重过度增加和代谢紊乱。这类产品通常包含低脂或低糖配方，以及具有潜在有益代谢作用的动植物来源成分。

由于斑马鱼在基因、解剖学和生理学方面与人类具有相似性，其已成为生物医学研究众多领域中重要的脊椎动物模式生物。该模式生物被广泛应用于发育生物学、毒理学、药物研发、人类遗传学以及各类人类疾病机制的研究中。近年来，这一模型在肥胖等代谢性疾病的研究领域也受到了越来越多的关注。斑马鱼的主要优势之一是其幼体阶段具有光学透明性，这使得研究人员能够通过尼罗红等染色技术直接观察整个机体的脂质沉积情况。此外，斑马鱼的脂质代谢和脂肪生成过程与哺乳动物中的相关过程高度相似。值得注意的是，成年斑马鱼也能被有效构建为肥胖模型。该物种中过量喂食引发的肥胖会导致与人类相似的代谢改变，包括高甘油三酯血症和肝脂肪变性，且涉及的病理生理机制也与人类相似。这些特性使斑马鱼成为研究肥胖发生发展机制，以及评估功能性食品和生物活性化合物在肥胖预防与治疗中潜在作用的宝贵实验体系。

研发了一种由活性成分组成的多组分复合物，包含槲皮素、芦丁、甜菜碱、锌和桑提取物，随后将其掺入三种营养基质中（制剂F1、F2、F3）。这些成分的选择基于文献综述，研究表明它们具有经证实的代谢、抗氧化和抗炎潜力，且存在产生互补及协同效应的可能性。选择槲皮素和芦丁是因其具有强效抗氧化特性，且可能调节与代谢疾病相关的氧化应激及炎症过程。添加甜菜碱是作为一种支持脂质代谢和肝功能的化合物，而添加锌则是因其作为重要的酶辅因子参与葡萄糖代谢的调节。以及抗氧化过程。添加桑椹提取物是因其有望通过影响碳水化合物代谢来辅助血糖控制。这些配方的新颖之处不仅在于使用了这些生物活性物质，更核心的是将它们靶向组合于三种不同的营养基质中，旨在为代谢紊乱患者提供全面支持。所研发的配方采用了整合不同作用机制成分的方法，以减轻氧化应激、辅助糖脂代谢，并提升产品的功能价值。

本研究的目的是利用斑马鱼模型评估所开发原型的安全性和有效性。研究在胚胎和幼体阶段对其安全性进行了评估。在饮食诱导肥胖（DIO）模型中，分析了血糖和血脂相关参数。采用荧光技术检测脂肪组织含量，并通过组织病理学评估测量皮下和内脏脂肪组织中最大脂肪细胞的表面积。

结果

活性物质复合物对斑马鱼胚胎/幼体发育的影响

胚胎：在暴露于100微克/毫升活性物质（AS）复合物后，分别在24、48、72和96小时评估存活率和早期胚胎发育情况。0至2小时受精后胚胎（0–2 hpf）未出现显著差异对照组与暴露于AS的胚胎之间未观察到存活率差异（图1）。与对照组相比，所有测试组的畸形发生率（包括心包水肿、卵黄囊水肿、尾部弯曲和脊柱侧凸）均未发生显著改变（图1）。在暴露于AS（8纳升）后24小时和48小时，还对注射后的胚胎进行了存活率和发育参数分析。E3处理的对照组与暴露于AS的胚胎之间，存活率未检测到显著差异（图1）。处理组与对照组的畸形发生率也无显著差异（图1）。

在受精后48小时和72小时，通过计数卵壳外的幼体数量来评估胚胎孵化率，因为孵化通常发生在这一时间窗口内。对照组中，约46%的胚胎在受精后48小时孵化，约93%在受精后72小时孵化。与对照组相比，暴露于AS并未显著影响孵化率（图2）。孵化24小时后记录早期自发运动。对照组胚胎在受精后24小时，体侧交替收缩的频率达到4.7±1.0次/分钟。所有处理组均观察到相似的弯曲频率，表明AS对早期自发活动无影响（图2）。孵化96小时后，与对照组相比，暴露于AS的胚胎中心率（HR）表示的心脏功能未发生改变。值得注意的是，经AS处理的胚胎表现出发育加速，体现为孵化96小时时其总体长增加（图2）。

幼体：研究人员基于此前的一项研究，在受精后72小时（72 hpf）的幼虫中进一步评估了AS的安全性。在整个实验过程中，未处理的对照组未出现任何死亡情况。同样，与对照组相比，在任何时间点，用100微克/毫升的AS进行孵育都未导致幼虫出现显著死亡（图1）。在形态学评估中，与对照组相比，处理组也未观察到明显的畸形或发育异常情况（图1）。

图1 经100 μg/mL活性物质（AS）复合物处理的胚胎（0–2小时胚胎期）和幼体（72小时胚胎期）的存活率（A、E）及亚致死改变发生率（B、F）。经注射AS处理的胚胎的存活率（C）和亚致死改变发生率（D）。数据以平均值±标准差表示。

图2 活性物质复合物（AS）100微克/毫升对斑马鱼胚胎发育及生理参数的影响。对照组（CON）与AS处理组胚胎随时间（受精后0-96小时，hpf）的孵化率（A）。受精后96小时测量的心率（B）、受精后24小时评估的早期自主运动率（C）以及受精后96小时测量的体长（D）。数据以平均值±标准差表示。(*p<0.05)

测试制剂对肥胖诱导型鱼体重、血糖水平及血脂谱的影响

三种所用配方的食品使DIO + F1组动物的体重显著降低（297.4 ± 70；^ (Lambda p<0.05)），DIO + F3组（279.9 ± 71；^^ (Lambda Lambda p<0.01)）和（362.5 ± 46）组也显著降低了空腹血糖水平（图3A）。DIO组的葡萄糖浓度显著升高（78.8 ± 19 mg/dL；*** (^{* * *} p<0.001)），高于对照组（46.8 ± 12 mg/dL）。F1干预组（51.9 ± 19 mg/dL；(Lambda Lambda Lambda p<0.001)）、(Lambda Lambda Lambda p<0.001)组和(^{Lambda} p<0.05)组的血糖水平较DIO组（78.8 ± 19 mg/dL）显著降低。DIO + F1组和DIO + F2组的血糖降幅相近，血糖值回落至接近对照组水平（图3B）。

与对照组相比，DIO 组的总胆固醇水平显著升高 ((^{* * *} p<0.001))）。补充 F1、F2 和 F3 可显著降低胆固醇浓度（113.2 ± 30；91.8 ± 30；110 ± 28；(Lambda Lambda Lambda p<0.001) (Lambda Lambda Lambda p<0.001)(Lambda Lambda Lambda p<0.001) 与 DIO 组相比（图3C）。DIO 组的甘油三酯水平显著升高（*** ((^{* * *} p<0.001)) 与对照组相比）。补充 F1、F2 和 F3 可显著降低甘油三酯浓度（158.2 ± 55；176.3 ± 89；124.3 ± 51 (Lambda Lambda Lambda p<0.001)、(Lambda Lambda Lambda p<0.001)、(Lambda Lambda Lambda p<0.001) 与 DIO 组相比）（图3D）。结果表明，所测试的食品对血糖、血脂谱和体重具有有益作用。

图3 F1、F2和F3补充剂对斑马鱼体重及代谢参数的影响。对照组（CON）、饮食诱导肥胖组（DIO）以及补充F1、F2或F3的饮食诱导肥胖组在喂食前后的体重测量结果（A）。右侧展示了各组斑马鱼的代表性图像。血糖水平（B）、总胆固醇水平（C）和甘油三酯水平（D）。数据以平均值±标准差表示(*p<0.05) (+p<0.01) (+++p < 0.001) 与CON组相比；(p<0.05) (Lambda Lambda p<0.01) (Lambda Lambda Lambda p<0.001) 与DIO组相比

测试配方对斑马鱼脂肪组织含量的影响

对腹部感兴趣区域内的荧光进行定量分析后发现，对照组的信号强度最高（104.9 ± 7.8）。所有实验组的信号强度均出现下降相对于对照组的荧光值：F1（71.7±4.5）、F2（61.6±7.9）和F3（63.5±3.2）。这表明与对照组相比，F1的荧光值降低了约32%，F2降低了41%，F3降低了40%。统计分析证实，与对照组相比，所有实验组的荧光值降低均具有显著性（F1、F2和F3 (^{* * *} p<0.001)；(^{* * *} p<0.001)；(^{* * *} p<0.001) 与 CON 相比）。总体而言，这些结果显示所有处理组的腹部区域荧光强度均持续且显著降低，其中F2和F3组的效果最为显著（图4A）。采用组织病理学技术，对皮下和内脏脂肪组织中最大脂肪细胞的表面积进行了评估。在皮下脂肪组织中，DIO组((^{*} p<0.05))的脂肪细胞表面积与对照组相比显著增加。在饮食中添加F1（^((Lambda p<0.05))）、F2（((Lambda p<0.05))）以及F3 减弱了这一效应，且与饮食诱导肥胖（DIO）组相比，脂肪细胞体积减小。在内脏脂肪组织中也观察到了类似趋势。((^{* *} p<0.01)) 组的脂肪细胞表面积相较于对照组显著增大。在饮食中添加 F1 ((Lambda Lambda p<0.01))、((Lambda Lambda p<0.01))、((Lambda p<0.05)) 后，脂肪细胞体积相较于 DIO 组减小。这些研究结果表明，饮食诱导的肥胖会促进两个脂肪库中脂肪细胞的肥大，而所测试的干预措施可缓解这一效应（图 4B、C）。

图4 F1、F2和F3处理对脂质积累及脂肪细胞形态的影响。显示脂质积累（红色信号）的斑马鱼幼虫代表性荧光图像（A）。平均荧光强度（MFI）的定量分析，反映CON组以及F1、F2、F3处理组的脂质水平（B）。各实验组皮下脂肪组织（C）和内脏脂肪组织（D）中最大脂肪细胞的表面积：对照组（CON）、饮食诱导肥胖组（DIO）以及补充F1、F2或F3的DIO组。右侧展示了皮下和内脏脂肪组织的代表性组织学图像。数据以平均值±标准差表示(*p<0.05) (*p<0.01) (***p<0.001) 与CON组相比；(Lambda p<0.05) (A p<0.01 vs) 与DIO组相比。

讨论

肥胖的特征是内脏脂肪增大以及葡萄糖和脂质代谢发生改变。新的治疗方法应涵盖所有这些挑战，以取得最显著的效果。本研究评估了新型食品配方（F1、F2和F3）对斑马鱼模型中生长发育、代谢参数和脂肪组织含量的影响。研究结果表明，受试食品在发育早期是安全的，并且在肥胖模型中具有有益的代谢效应，这表明其有望作为功能性饮食干预手段。

一种由多种活性成分（AS）组成的复合物被制备出来，并被添加到三种营养基质中（配方F1、F2、F3）。该复合物含有槲皮素，槲皮素具有充分证实的抗高血压作用，可支持脂质代谢的优化，改善内皮功能，并提供强效抗氧化保护。该配方还含有黄酮醇芦丁，它与槲皮素协同作用。芦丁有助于延长血管保护时间，通过降低空腹血糖水平来支持血糖控制，并进一步强化血管，这对于预防微循环障碍至关重要。该复合配方还进一步添加了甜菜碱（三甲基甘氨酸），它可降低同型半胱氨酸水平——同型半胱氨酸是一种与代谢紊乱相关的氨基酸。此外，甜菜碱能促进脂肪从肝脏转运，有助于预防脂肪肝，并帮助改善肌肉与脂肪的比例，从而提高胰岛素敏感性。同时，配方中还添加了标准化为1-脱氧野尻霉素（1-DNJ）的白桑提取物，作为天然的α-葡萄糖苷酶抑制剂。1-DNJ能延缓肠道内碳水化合物的消化，减轻餐后血糖反应。除了对碳水化合物代谢产生影响外，桑来源的亚氨基糖还会影响脂质代谢和炎症通路，这表明它们在调节与肥胖及葡萄糖稳态受损相关的代谢疾病方面具有潜在的辅助作用。AS配方中最后添加的成分是柠檬酸锌。锌参与众多与糖脂代谢及胰岛素信号传导相关的酶促过程。实验和临床研究表明，充足的锌摄入与代谢控制的改善以及脂质参数的调节相关，这说明锌可能有助于维持代谢稳态。

首先，活性物质复合物的安全性在胚胎和幼体中均得到了确认。接触活性物质不会影响存活率、孵化率、自发运动以及心脏功能方面，未观察到发育畸形的发生率上升。这些研究结果表明，黄芪皂苷（AS）在发育早期阶段无毒性。值得注意的是，在96小时胚胎期（hpf），黄芪皂苷与斑马鱼体长增加相关，这可能提示其对生长过程具有促进作用。这一观察结果需要进一步研究来确定其生物学意义及潜在机制。  这些研究结果与以往报道一致，即黄酮类化合物在斑马鱼模型的发育早期阶段具有低毒性。槲皮素和芦丁均被广泛认为是生物活性物质，在低至中等浓度下胚胎毒性极小，主要发挥抗氧化和抗炎作用。同样，甜菜碱通常被认为是安全的化合物，具有重要的生理功能，包括作为甲基供体和渗透保护剂的作用。  既往研究表明，甜菜碱可维持细胞稳态、抵御环境应激，并可能对生长和代谢过程产生积极影响。有趣的是，96小时胚胎期体长增加的现象可能提示其对生长相关过程具有潜在的促进作用。这一观察结果可能与黄酮类化合物和甲基供体的已知生物活性相关。  同时，甜菜碱通过参与一碳代谢，可能影响与生长通路（包括胰岛素样生长因子（IGF）轴）相关的表观遗传调控及基因表达。但需强调的是，对观察到的体长增加现象需谨慎解读。相关文献中既有这些化合物的促生长和中性效应取决于浓度、暴露时长以及实验条件。

成年斑马鱼DIO模型显示，受试食品给药后代谢状况显著改善。用卤虫过度投喂成功诱导出类肥胖表型，具体表现为体重增加及代谢参数改变。与肥胖组相比，补充F1、F2或F3可显著降低体重、葡萄糖、甘油三酯和总胆固醇水平。这些结果表明，受试配方可能调控能量代谢、葡萄糖稳态和脂质调节相关的关键通路。本研究结果与此前关于肥胖斑马鱼模型饮食干预的报道一致，已有研究证实天然植物成分橄榄醇、橙汁、肉桂、绿茶提取物和金巴利番茄等处理方式可防止体重增加。在肥胖斑马鱼模型中，肥胖预防的天然方法可降低甘油三酯和胆固醇水平。然而，甘油三酯水平的下降并非总是伴随胆固醇水平降低，也可能仅胆固醇水平发生显著变化而不影响甘油三酯水平。关于肥胖斑马鱼模型治疗中葡萄糖水平的相关数据更为有限。在一项研究中，补充肉桂可将葡萄糖水平显著降至与对照组相当的数值，而绿茶提取物以及白藜芦醇处理均不影响空腹血糖水平。

三种受试配方均含有标准化的生物活性化合物，包括槲皮素、芦丁和甜菜碱，这些化合物已知可调节脂质代谢、提高胰岛素敏感性并减轻氧化应激。槲皮素可能通过AMP活化蛋白激酶（AMPK）激活和葡萄糖摄取调节等途径发挥作。此外，白桑提取物衍生的1-脱氧野尻霉素（1-DNJ）的存在对葡萄糖稳态尤为重要。1-DNJ是一种特性明确的α-葡萄糖苷酶抑制剂，可延缓碳水化合物消化并降低餐后血糖水平，从而有助于改善血糖控制。这一机制可能部分解释了所有治疗组中观察到的血糖水平显著降低现象。配方中还含有大量膳食纤维，包括车前子壳、菊粉和葡甘聚糖（F1），以及亚麻籽、燕麦片和豆类等富含纤维的植物成分（F2和F3）。已知膳食纤维可调节肠道菌群组成、减缓营养吸收并改善脂质和葡萄糖代谢。此外，添加富含多酚的水果（如越橘、接骨木果、玫瑰果、西印度樱桃）可提供额外的抗氧化和抗炎化合物，尤其是花青素和维生素C，这些物质与降低肥胖率和改善代谢特征相关。其他生物活性植物提取物，如山羊豆（存在于F2中），传统上与降血糖作用相关，且被视为抗糖尿病药物研发的前体由于其对葡萄糖代谢的影响，相关疗法。同样，香料和植物来源的化合物（例如姜黄、大蒜）可能通过抗炎和代谢调节特性，对所观察到的效果产生作用。代谢参数方面观察到的改善，很可能是由类黄酮、甲基供体、α-葡萄糖苷酶抑制剂、膳食纤维以及富含抗氧化剂的植物成分等多种生物活性成分之间的协同相互作用所导致。以往的研究表明，这些生物活性化合物可能会影响能量平衡、葡萄糖稳态、脂质代谢和炎症相关的通路。

观察到的代谢指标改善与以往研究结果一致，这些研究表明膳食成分和生物活性化合物可影响斑马鱼的代谢过程。特别是，富含类黄酮的提取物、膳食纤维和含多酚的植物材料已被证实可调节斑马鱼及其他脊椎动物模型中的糖脂代谢，这支持了它们在代谢调节中具有潜在作用的观点。这些效应通常归因于抗氧化活性、能量平衡通路调节以及营养吸收调控的共同作用。本研究中观察到的血糖和血脂水平降低，可能反映了以往在其他实验模型中与胰岛素敏感性改善和脂肪生成减少相关的代谢效应。以往研究报告槲皮素可激活AMPK、抑制脂肪生成基因表达并促进葡萄糖生成，这一结论支持了上述解释。外周组织的摄取。同样，甜菜碱通过其在一碳代谢和甲基化依赖性基因表达调控中的作用，与改善胰岛素信号传导和脂质稳态相关。未来的研究应重点阐明相关的分子通路，包括对胰岛素信号级联反应（如PI3K/Akt通路）、脂质代谢基因（如SREBP-1c、PPARα和PPARγ）以及炎症过程的潜在影响，已知这些通路在斑马鱼模型的代谢调控中发挥核心作用。然而，本研究未包含直接的分子分析，因此所提出的机制仍属推测，需要通过基因和蛋白表达研究加以验证。

除了全身性的代谢效应外，尼罗红染色结果显示，所测试的制剂还显著减少了斑马鱼幼体的内脏脂肪堆积。脂质堆积的减少可能反映了脂质动员增强、脂质摄取减少或脂肪细胞分化的改变，而这些过程已知受生物活性膳食成分（包括类黄酮和膳食纤维）的调控。鉴于内脏肥胖与胰岛素抵抗、血脂异常等代谢疾病的发生发展密切相关，这一效应尤为重要。已有研究报道，斑马鱼经膳食多酚处理或接受富含膳食纤维的干预后，脂质沉积也出现类似减少，这表明其可调控脂肪生成和脂质储存相关通路。常见的红藻掌状蜈蚣藻被发现可减少饮食诱导肥胖斑马鱼的内脏脂肪组织体积，这一结果在小鼠模型中也得到了验证。绿茶提取物处理后也观察到了类似结果，但该提取物并未影响皮下脂肪体积。白葡萄汁提取物可通过调节饥饿素和瘦素的表达，减少过量喂食斑马鱼的脂肪堆积。

结论

总体而言，本研究表明，所测试的制剂（F1–F3）对成年斑马鱼饮食诱导肥胖模型中的代谢参数具有显著且多层面的有益作用。在所有实验组中，补充制剂有效抵消了卤虫过度投喂的致肥胖效应，使体重显著降低，血糖和脂质谱得到改善，包括葡萄糖、甘油三酯和总胆固醇水平的下降。值得注意的是，这些代谢益处伴随着幼虫内脏脂质沉积的显著减少，表明这些制剂改善了全身生化指标，并直接影响组织水平的脂质储存。尼罗红染色进一步证实了这一点，该染色结果显示脂肪沉积减少，提示制剂对脂肪生成和脂质动员具有功能性影响。观察到的这些效应很可能归因于制剂中多种生物活性成分的协同作用，包括黄酮类化合物（槲皮素和芦丁）、甜菜碱等甲基供体、膳食纤维以及植物源性抗氧化剂。已知这些化合物可调控参与葡萄糖稳态、脂质代谢、氧化应激和炎症的关键代谢通路，提示其作用机制具有多靶点特性。尽管斑马鱼是一种成熟的脊椎动物模型，与人类具有相当的转化相关性在代谢研究中，由于物种间固有的生理差异，将这些研究结果外推至人类时需谨慎。综上，研究结果表明，所测试的食品配方或可作为颇具前景的功能性饮食干预手段，能够在体内改善代谢健康并减轻与肥胖相关的表型。

材料与方法

材料

三种新型实验配方（F1-F3）的制备遵循标准化方案，以确保日粮的均一性。首先，将所有原料进行微粉化处理，使粒径均匀达到700微米。随后精确称量各组分，以制备最终的实验添加剂。首先配制活性物质复合物（AS），其组分为：白桑提取物（47.06%；标准化为(≥1.4%) 1-脱氧野尻霉素）、无水甜菜碱（27.43%；含99.7%甜菜碱）、槲皮素提取物（19.59%；标准化为98%槲皮素）、芦丁提取物（5.88%；标准化为95%芦丁）以及柠檬酸锌（0.05%；对应1.5672毫克元素锌）。将该配方整合至三种不同的日粮基质中。配方1（F1）包含冻干水果（越橘与柠檬）和果汁（越橘、苹果与红甜菜）、膳食纤维组合物（洋车前子壳、菊粉、葡甘聚糖）以及各类提取物（接骨木果提取物含至少5%花青素和7.5%多酚类化合物；玫瑰果提取物标准化为含至少70%天然维生素C，同时含98%莱鲍迪苷A的甜叶菊提取物）。配方2（F2）含有冻干果蔬（番茄、西葫芦、洋葱）、亚麻籽、荞麦片、鹰嘴豆蛋白、番茄浓缩物、巴西坚果和香料（盐、胡椒、姜黄、洋葱、甜椒、大蒜、番茄、营养酵母片、欧芹叶），以及E/D比为4/1的山羊豆提取物。配方3（F3）包含冻干及干果类原料（椰枣、白桑、草莓、李子、橙子）、燕麦片、植物蛋白（鹰嘴豆与葵花籽）、坚果（巴西坚果与杏仁）、角豆、菊粉、菜籽油以及标准化为含至少25%维生素C的针叶樱桃提取物。将每种混合物以10%（重量比）的添加量（90%基础日粮与10%实验产品）掺入商用基础鱼饲料中。为确保活性化合物分布均匀，最终日粮在投喂前经过了严格的机械均质处理。

方法

斑马鱼饲养

胚胎通过多对种鱼自然交配获得。受精后第5天（dpf）起，幼鱼置于循环水系统中饲养，温度为28℃±1℃，pH值6.5-8.5，光照周期为14小时光照/10小时黑暗，饲养在5升的水箱中，密度约为每升30尾幼鱼。需要说明的是，受精后5天内的斑马鱼胚胎依靠卵黄提供的物质生存，因此无需喂食，相关研究被归为体外研究。5日龄以上的斑马鱼幼鱼在实验开始前，会根据其发育阶段喂食标准饲料。实验方案启动前，将动物随机分配至各实验组。此外，进行数据分析的研究人员在数据收集和分析阶段对分组情况设盲，以最大程度减少潜在偏倚。实验流程结束后，所有动物均根据欧盟指令2010/63/EU的要求，通过过量注射甲磺酸三卡因（300毫克/升）实施安乐死。

斑马鱼毒性评估

依据OECD 236号指导原则（鱼类胚胎急性毒性试验，FET）对活性物质（AS）开展安全性评价。结合Gutierrez-Lover等人的研究结论，为准确评估其安全性谱，需在斑马鱼模型的两个发育阶段开展毒性研究。选取发育正常的AB品系斑马鱼新鲜受精胚胎（受精后0–2小时，hpf）以及受精后72小时的幼鱼，置于含标准E3培养基的24孔板中，同时加入100 μg/mL的活性物质（AS）复合物。在暴露24、48、72和96小时时，使用配备摄像头的体视显微镜对胚胎进行观察。所有实验均进行三次重复，每组设置20枚胚胎。每24小时评估四项关键致死性终点指标：受精卵凝固、无体节形成、尾芽无法从卵黄囊脱离以及无心跳。此外，还评估了24小时时的自主运动情况，以及48、72和96小时的孵化率。96小时时，进一步记录心率、体长等发育参数，以及心包水肿、卵黄囊水肿、尾部弯曲、体节形成受损、脊柱侧凸等形态异常情况。实验共进行三次独立重复。

斑马鱼显微注射

此外，为评估测试产品的安全性，将48小时 post-fertilization（hpf）的胚胎分为2组（((n=60 / group ))）：一组置于40毫克/升的间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（通常在2-5分钟内失去平衡且对轻柔触觉刺激无反应时完成麻醉）中麻醉，注射8纳升E3溶液（养鱼水）作为对照组；另一组注射100微克/毫升的活性物质（AS）复合物。使用显微注射器在显微镜下将物质显微注射至卵黄的特定位置。注射后的胚胎在5小时后进行观察，随后每24小时监测一次，以评估死亡率和发育缺陷。根据2010/63/EU指令，所有动物均通过过量注射间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（300毫克/升）实施安乐死。通过停止 （注：原文末尾未完整，翻译至现有内容结束）鳃盖运动、心脏活动消失以及反射反应缺失

斑马鱼致肥胖试验（ZOT）

在第一天（第0天），本研究中最常用的AB品系斑马鱼幼虫（购于卢布林实验医学中心，30日龄，体长10毫米；编号(n=40 /)的实验组）以0.1%蛋黄的形式喂食高脂饲料（13、14、20-23）。第二天（第1天），对照组幼虫禁食，而F1组与食品F1——配方1（250微克/克体重）共孵育，F2组与食品F2——配方2（250微克/克体重）共孵育，F3组与食品F3——配方3（250微克/克体重）共孵育。根据Zang等人的方法，在禁食（对照组）或接触三种配方（F1、F2、F3）前后，通过尼罗红（NR）染色法检测内脏脂肪组织（第3天）（24）。使用荧光显微镜记录NR信号。

斑马鱼的荧光图像是在完全相同的成像条件下（固定的曝光时间、增益和光照）采集的，并以TIFF格式保存。采用与ImageJ类似的方法进行定量分析。分析前，将图像转换为8位格式并分离为RGB通道。在主要的发射通道（红色通道）中对荧光强度进行定量。通过使用二值化的鱼体掩码，将分析范围限定在鱼组织对应的像素上，从而排除背景信号。利用参考图像中所示的固定解剖学标志，在标准化的腹部腹侧区域内定义感兴趣区域（ROIs）。所有样本和实验组均统一使用相同的感兴趣区域模板（尺寸、形状和解剖位置均一致）。因此，感兴趣区域的设置与荧光强度无关，也不根据信号分布进行调整。掩膜处理后，以每个感兴趣区域内的平均像素强度进行荧光测量。为进一步确保一致性，仅分析感兴趣区域与鱼体掩码的交集部分，排除了所有背景干扰。所有图像处理和定量分析均在对实验组分配不知情的条件下进行。对于每个实验组，数据以平均值±标准差（SD）表示，其中标准差反映个体间的差异（每组对应 (n=4)）。组间的统计学比较采用非配对双尾Student's t检验，以 (p<0.05) 为统计学显著性标准。

饮食诱导肥胖（DIO）

标准鱼粮按三种不同配方F1、F2、F3分别添加10%的营养成分进行强化。将测试配方研磨至颗粒直径700微米。成年斑马鱼（3月龄，(n=40 / group;)：购自波兰卢布林实验医学中心）分为五组：对照组饲喂标准饲料3周，从第二周起每日每尾鱼投喂5毫克卤虫；DIO组（阳性对照）饲喂标准饲料3周，从第二周起每日每尾鱼投喂60毫克卤虫以诱导肥胖。DIO+F1组（F1配方）、DIO+F2组（F2配方）和DIO+F3组（F3配方）饲喂含测试饲料的日粮3周，从第二周起额外每日每尾鱼投喂60毫克卤虫(23)。实验鱼每日每尾鱼接受约6毫克实验饲料，于投喂卤虫前30分钟单次投喂，以确保受试饲料的摄入量。由于实验饲料中含有10%的受试配方，每条鱼每日约摄入600微克配方，对应每条鱼每日估计摄入约250微克活性化合物。在喂食前及实验最后一天，测量鱼的体重。使用商业试剂盒检测葡萄糖水平、总胆固醇（日本富士胶片和光纯药株式会社的LabAssay™ 胆固醇试剂盒）和甘油三酯（日本富士胶片和光纯药株式会社的LabAssay™ 甘油三酯试剂盒）。在喂食前及实验最后一天，将鱼置于40毫克/升的间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（三卡因）溶液中进行麻醉（直至鱼失去平衡，对轻柔的触觉刺激无反应，通常需2至5分钟），随后测量其体重。实验第三周，对鱼进行24小时禁食，采集血样后（检测血糖和血脂谱），根据欧盟指令2010/63/EU，使用过量的三卡因甲磺酸盐（300毫克/升）对鱼实施安乐死。通过鳃盖运动停止、心脏活动消失以及无反射反应来确认鱼的死亡。

组织学

解剖后，将动物置于4%多聚甲醛中固定，包埋于石蜡块中，再用切片机进行切片。为评估脂肪分布，对皮下和内脏组织解剖学可比区域的切片进行苏木精-伊红染色，随后通过光学显微镜进行观察。手动统计每只动物每个视野下皮下和内脏脂肪细胞的数量及面积。

统计学分析

采用Shapiro-Wilk W检验评估数据正态性。对于正态分布数据，采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后多重比较检验，两组间比较则采用非配对Student t检验。数据以均值±标准差（SD）表示。采用Kaplan-Meier法进行生存分析。样本量的选取旨在保证足够的统计效能。对于包含五个组、每组40条鱼（共(n=200)）的实验设计，预先进行单因素方差分析的效能分析，设定统计效能至少为0.80，以检测中等效应量（Cohen’s (f ≈0.25)）。采用GraphPad Prism软件（10.5.0版）进行统计分析。当(p<0.05)时，差异被认为具有统计学意义。