题目：Hydroxyflavone-Modified Aza-BODIPY Derivatives for Combined Photodynamic and CO Therapy against Neuroblastoma

原文链接:https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.5c03231 J. Med. Chem.

期刊:Journal of Medicinal Chemistry

摘要

羟基黄酮修饰的氮杂二吡咯甲川硼（aza-BODIPY）衍生物被开发为无金属光敏剂，该类光敏剂将光动力治疗（PDT）与单线态氧触发的一氧化碳（CO）释放相结合，用于神经母细胞瘤的治疗。这类化合物具有近红外吸收特性，能高效产生单线态氧，并可通过羟基黄酮脱羰基作用实现光控一氧化碳释放。在该系列化合物中，在相同条件下，AF-I 相较于不释放一氧化碳的类似物以及参考光动力治疗/一氧化碳体系，展现出更优异的光疗活性。机理研究表明，光动力治疗是主要的细胞毒性途径，而局部一氧化碳释放则作为增敏组分，增强氧化应激诱导的细胞凋亡。AF-I 在低氧条件下仍保持较好的光毒性，这说明在氧气供应有限时，其光动力治疗效果得到部分保留。斑马鱼生物分布研究显示，该化合物对血脑屏障的穿透性有限，这为其在颅外神经母细胞瘤治疗中的潜在应用提供了支持。本研究构建了一种将可控气体递质释放与光动力治疗相结合的无金属策略，并为新一代光激活联合光疗剂提供了分子框架。

引言

神经母细胞瘤（NB）是一种起源于交感神经系统的异质性胚胎肿瘤，最常发生于肾上腺。作为最常见的儿童实体肿瘤，它约占儿童癌症相关死亡病例的15%。神经母细胞瘤显著的遗传、形态和临床异质性，往往限制了现有治疗的效果。在亚洲、非洲和拉丁美洲部分地区等中低收入国家，由于诊断较晚、获得专科医疗服务的渠道有限以及风险分层方案不完善，更多病例表现为高风险。因此，中低收入国家的生存率仍显著低于高收入地区，这凸显了对新型治疗方法的迫切需求儿童癌症的治疗策略。

神经母细胞瘤（NB）目前的治疗方式包括化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗。然而，长期治疗往往会导致治疗耐药、复发和临床预后不佳。尽管多种单一疗法和联合疗法（如化疗联合基于微小RNA（miRNA）的治疗）正在研究中，但针对复发性或难治性神经母细胞瘤的有效策略仍然有限。值得注意的是，侵袭性神经母细胞瘤通常含有驱动肿瘤进展、治疗耐药和复发的克隆性癌症干细胞（CSCs）。近期研究表明调节癌症干细胞特性，包括分化、自我更新、凋亡、自噬和免疫原性，可能改善治疗效果。

光动力疗法（PDT）作为一种微创且高选择性的癌症治疗手段，已获得广泛认可。该疗法依赖光敏剂（PSs）在光的激活下（通常处于红光或近红外区域）产生活性氧（ROS），主要是单线态氧（((^{1} O_{2}))），进而引发氧化损伤，癌细胞中的凋亡。 光的空间精准性激活作用以及光敏剂在肿瘤中的优先积累是光动力疗法治疗选择性的基础。尽管其具有优势，光动力疗法的疗效常因肿瘤缺氧而受限，因为(^{1} O_{2})的生成需要分子氧。因此，能够引入可增强细胞对氧化应激易感性的互补治疗机制的策略正受到越来越多的关注。

在光动力治疗光敏剂中，氮杂-硼二吡咯亚甲基（氮杂-BODIPY）衍生物因其强近红外吸收、高光稳定性和可调控的光物理特性而备受关注¹²。它们在650-800纳米范围内的激活特性使其能实现更深的组织穿透，从而为用于治疗乳腺癌、胶质母细胞瘤、 以及宫颈癌等深部恶性肿瘤的结构修饰（如引入重原子，例如碘、溴）能够增强系间窜越（ISC）过程，提高(^{1} O_{2})量子产率（((Phi_{Delta}))），从而提升活性氧（ROS）生成效率。然而，即便经过优化光敏剂方面，氧气可用性仍是影响光动力治疗（PDT）效果的重要因素，这推动了能够补充活性氧（ROS）的联合疗法的探索。

与此同时，一氧化碳（CO）曾被认为只是一种有毒气体，如今已被证实是一种具有抗炎、抗增殖和促凋亡作用的治疗剂在受控低剂量下对癌细胞发挥作用。 为了利用其 治疗潜力治疗潜力，已开发出多种一氧化碳释放分子（CORMs）已被开发出来，包括含钌或锰的过渡金属配合物。尽管这些体系方面表现出功效在临床前癌症模型中，与金属积累、长期毒性和生物相容性相关的担忧已成为限制因素其临床转化受到了限制。

因此，近期的研究探索了将光动力疗法与一氧化碳释放相结合 光动力疗法可产生活性氧介导的细胞毒性，而一氧化碳可调节线粒体功能和细胞应激反应，从而使癌细胞对氧化损伤更敏感，并有可能在缺氧条件下提高治疗的稳定性。然而，大多数已报道的光动力疗法-一氧化碳体系均依赖于金属基一氧化碳释放分子，这凸显了对无金属且生物相容性平台的需求，此类平台需能在单一分子框架内实现光触发的活性氧与一氧化碳生成。

本研究提出一种新型设计，将氮杂氟硼二吡咯的光治疗能力与无金属释一氧化碳组分3-羟基黄酮（3-HF）整合至单一平台。3-羟基黄酮可与单线态氧发生反应，进而释放一氧化碳通过脱羰基作用释放。与传统的一氧化碳释放分子不同，这类黄酮类化合物具有生物相容性、结构可调性，且有望实现一氧化碳的无金属光控清洁释放³⁹。通过将3-羟基黄酮（3-HF）片段与氮杂二吡咯甲川氟硼酸盐（aza-BODIPY）核心共轭，我们旨在构建具备双重功能的探针分子，能够生成用于光动力治疗的(^{1} O_{2})，同时释放一氧化碳在光照激活下（图1）。研究人员对由此得到的系统在神经母细胞瘤细胞中的光疗应用进行了评估，这为将可控气体递质释放与光动力疗法（PDT）相结合提供了一种无金属策略，有望应用于儿童癌症治疗。

图1. 功能、光动力疗法（PDT）和光热疗法（CO）。3-羟基黄酮（3-HF）：3-羟基黄酮。图1 单一化合物兼具双重治疗作用的整体概念

结果与讨论

合成

通过将3-羟基黄酮引入氮杂二吡咯甲川硼（aza-BODIPY）染料骨架，合成了三种新型荧光化合物AF、AF-I和AF-2I。化合物1和4参照文献方法制备（方案S4）。化合物2和3通过对化合物1的前体进行碘化反应制得，其详细合成步骤见支持信息（方案S2和S3）。随后，以N-(3-(二甲氨基)丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）和4-二甲氨基吡啶（DMAP）为偶联试剂，与1-己炔酸发生酰胺化反应，将炔基引入氮杂二吡咯甲川硼1-3中，以中等至较高收率得到AY、AY-I和AY-2I（方案1）。接着，氮杂二吡咯甲川硼衍生物AYs与3-羟基黄酮衍生物4之间发生铜(I)催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC），以中等收率制得目标AF染料（方案S1）。所有合成化合物的结构均通过核磁共振（NMR）光谱和高分辨质谱（HRMS）进行了表征。经高效液相色谱（HPLC）分析，所有待测化合物的纯度均不低于95%（支持信息，SI，图S1-S29）。

光物理性质

分析了AF系列化合物（AF、AFI和AF-2I）在二甲基亚砜、甲醇、乙腈、氯仿和磷酸盐缓冲液等不同溶剂中的吸收光谱和发射光谱（图2和表1）。这三种化合物的最大吸收波长均在671至716纳米之间。与有机溶剂相比，磷酸盐缓冲液中化合物的吸收峰出现红移，同时伴随谱带展宽，表明其在水介质中发生聚集（图2A-C）。与这一现象一致的是，AF系列化合物在磷酸盐缓冲液中几乎不发射荧光，荧光量子产率也极低（图2D-F）。荧光减弱归因于水相条件下的聚集诱导猝灭；不过，与细胞内脂质膜及生物大分子的相互作用有望部分恢复分子的分散状态，这与观察到的细胞光毒性相符。在有机溶剂中，AF系列化合物在氯仿中荧光发射最强，发射强度顺序为AF-2I＞AFI＞AF，这与重原子效应一致。AY系列也表现出相似的消光系数和荧光量子产率变化趋势（详见支持信息图S30）。 

单线态氧生成

利用1,3-二苯基异苯并呋喃评估了AY和AF系列的单线态氧（((^{1} O_{2}))）生成效率(DPBF) 作为 <(^{1} O_{2})> 清除剂置于二甲基亚砜（DMSO）中。在 660 纳米光照射下在417纳米处的吸光度，证实了(^{1} O_{2})的有效产生（表2、图S31）。相比之下，非碘化衍生物（AF和AY）的单线态氧量子产率极低（((Phi_{Delta}))）。值得注意的是，与AF-I和AF-2I（分别为0.25和0.26）相比，AY-I和AY-2I的(Phi_{Delta})值显著更高（分别为0.46和0.57）。这种差异很可能是因为在AF系列中，生成的(^{1} O_{2})有一部分会与黄酮部分发生竞争性副反应，从而释放一氧化碳，导致整体(^{1} O_{2})产率降低。综合来看，这些研究结果表明AF-I、AF-2I、AY-I和AY-2I是光动力疗法中极具潜力的光敏剂治疗方面，AY 衍生物具有更优异的 (^{1} O_{2})

一氧化碳释放研究

利用合成的烯丙基荧光素醚探针的荧光响应，评估了AF系列化合物的一氧化碳释放能力。在(CO ,)存在下，该探针发生(Pd^{0})介导的Tsuji−Trost反应，释放出荧光素并产生荧光信号。通过记录发射光谱（500−在660纳米LED照射后，于490纳米激发下呈现850纳米（图3及图S32-S33）((450 ~mW cdot cm^{-2}))

将518纳米处的荧光强度（I）归一化至其初始值（((I_{0}))），并绘制其随照射时间的变化曲线（图3和图S33）。对照实验证实，ALFlu、(PdCl_{2})、黄酮4以及AY系列化合物在避光和光照条件下均不释放一氧化碳（图S33）。同样，AF-I和AF-2I在未进行光激活的情况下也无活性，其稳定的比值（(I / I_{0})）可证明这一点（图3）。

在光照下，AF 系列的 (I / I_{0}) 出现了显著升高（图 3B）。照射 20 分钟后，AF-2I 增加了 4.5 倍，而 AF-I 增加了 6 倍，证实了一氧化碳的大量释放。与 AF ((Phi_{Delta} ≤0.01)) 相比，AF-I 和 AF-2I 的单线态氧量子产率（((Phi_{Delta})) 分别为 0.25 和 0.26）更高，这一增强效应与之相关。碘代衍生物中的重原子效应促进了系间窜越以及(^{1} O_{2})的生成，从而加速了该物质中一氧化碳的释放黄酮部分。此外，经计算，AF-I 和 AF-2I 释放的 CO 分别为 11.15 和 8.69 纳摩尔，对应分子中 3-羟基黄酮的活化率分别为 27.9% 和 21.7%（图 S34）。与此一致的是机制，添加叠氮化钠（Na ((NaN_{3}))，a (^{1} O_{2}) 清除剂，照射时一氧化碳的释放受到抑制，导致荧光素信号显著降低（图3）。这些研究结果表明 AF 系列中的一氧化碳释放是通过 (^{1} O_{2}) 进行的黄酮部分的氧合作用介导。由于未能实现光产物的直接结构鉴定由于系统的复杂性以及中间体丰度较低、CO释放具有光依赖性、单线态氧清除剂会对其产生抑制作用，同时该结果与文献中报道的羟基黄酮光化学性质相符，这些证据均支持一种由单线态氧介导的脱羰基反应机制。 

尽管 AF-I 和 AF-2I 的 (Phi_{Delta}) 低于 AY 系列，但它们展现出双重功能：既能产生光动力活性所需的 (^{1} O_{2})，又能释放一氧化碳作为潜在的调节成分，这凸显了它们作为光动力/一氧化碳联合释放剂的应用前景。尽管 AF-I 和 AF-2I 的单线态氧量子产率相近，AF-I[to frac{pi}{to}] 在细胞研究中表现出更高效的一氧化碳释放和更优异的光疗活性。这种差异可能源于重原子诱导的系间窜越与竞争性非辐射失活过程之间的平衡。尽管额外的碘化反应能增强三线态的形成，但过度的重原子取代可能会增加非生产性衰变路径或聚集效应，从而降低生物环境中的整体光化学效率。因此，AF-I 似乎能在活性氧生成与一氧化碳释放之间实现更优的平衡，进而提升其治疗效果。

体外研究

本研究采用人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y作为体外模型，以评估AF-I和AY-I的治疗潜力。通过激光扫描共聚焦显微镜在多个孵育时间点（0、1、3、6和24小时）对细胞内摄取情况进行评估。如图4A所示，AF-I和AY-I均在孵育的前3小时内快速被细胞摄取。值得注意的是，AF-I的细胞内积累量显著高于AY-I，尤其是在6小时后（图4B），这表明黄酮基团的引入增强了细胞膜通透性和细胞摄取效率。

本研究采用人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y作为体外模型，以评估AF-I和AY-I的治疗潜力。通过激光扫描共聚焦显微镜在多个孵育时间点（0、1、3、6和24小时）对细胞内摄取情况进行评估。如图4A所示，AF-I和AY-I均在孵育的前3小时内快速被细胞摄取。值得注意的是，AF-I的细胞内积累量显著高于AY-I，尤其是在6小时后（图4B），这表明黄酮基团的引入增强了细胞膜通透性和细胞摄取效率。线粒体的脂质含量可促进疏水性光敏剂优先在该细胞器中积累，即便缺乏特异性靶向基团亦是如此。在线粒体和溶酶体中的定位对光动力疗法尤为关键，因为在这些区域产生的活性氧会破坏线粒体功能、诱导膜通透性改变并激活凋亡通路。42,43

此外，AF-I中的黄酮部分可经(^{1} O_{2})介导的脱羰基反应释放一氧化碳（CO），这为其增添了额外的治疗成分。有研究表明，在可控的亚细胞毒性浓度下，CO可使癌细胞对氧化应激更敏感、抑制癌细胞增殖，并调控细胞凋亡通路44。因此，AF-I在细胞内细胞器中兼具(^{1} O_{2})生成与CO释放的双重能力，或可改善光疗效果——光动力疗法（PDT）诱导的氧化损伤是主要的细胞毒性机制，而CO则作为致敏和调控因子，提升细胞对氧化应激的易感性。

为探究光动力疗法（PDT）与一氧化碳（CO）疗法的联合作用，接下来在光照和黑暗条件下对SH-SY5Y细胞中探针的治疗效果进行了评估。细胞经AY-I或AF-I处理后，要么接受660纳米的可控光照（10分钟），要么置于黑暗中。与先前的结果一致，该结果表明更高的(^{1} O_{2})在AF-I的生成和细胞内积累过程中，与AY-I相比，在相同光照条件下用AF-I处理的细胞表现出显著更高的活力损失（图5A）。重要的是，在未进行光照射的情况下，用任一探针处理的细胞均表现出极低的细胞毒性，这证实了AY-I和AF-I在黑暗条件下具有良好的生物相容性。

图4. 活细胞成像。(A) SH-SY5Y细胞与AF-I或AY-I（2 μM）共孵育不同时间（0、1、3、6和24小时）后的共聚焦显微镜和荧光显微镜图像。(lambda_{ex} / lambda_{em})：Hoechst 33342的激发/发射波长为408/425−475 nm，AF-I和AY-I的激发/发射波长为643/600−650 nm。比例尺(bars =20 mu m)。(B) 荧光强度定量以校正总细胞荧光（CTCF）表示，通过ImageJ定量，结果以平均值±标准误均值（((n=3,30 cells / set ))）呈现。各时间点的统计比较采用Student’s t检验（((* p<)，P<0.05；(* * P<0.001)）。(C) AF-I与细胞器探针的共定位分析：用于高尔基体的BODIPY FL C5-神经酰胺、用于溶酶体的Lyso Tracker Green DND 26以及用于线粒体的MitoTracker Green FM。

观察到concentration-dependent效应。在0.025至0.50μM的探针浓度下，AF-I与AY-I相比表现出显着增强的光疗效果，与PDT的联合贡献一致诱导 (^{1} O_{2}) 的生成以及一氧化碳的释放。在特定浓度下浓度超过1微摩尔时，治疗反应似乎越来越由光动力疗法（PDT）活性主导，这可能是由于(^{1} O_{2})的生成水平降低了其相对贡献定量地，在相同的照射条件下，AF-I（0.085M）的半最大抑制浓度（((IC_{50}))）比AY-I（0.275μM）低3倍以上（图5C和S37），强调AF-I的光治疗效力提高。

为了进一步评估AF-I的联合PDT和CO释放能力是否提供了优于传统方法的功能优势，进行了比较实验，使用锌酞菁（ZnPc）作为代表性的PDT光敏剂和CORM-2作为经典的CO释放分子。SH-SY5Y细胞在相同的照射条件下单独用ZnPc、单独用CORM-2或ZnPc和CORM2的组合处理（图S35）。在光敏剂浓度为2μM，ZnPc+CORM-2联合处理将细胞存活率降低至约50%，而AF-I在相同条件下将细胞存活率降低至低于10%。这一结果表明AF-I增强的光疗功效不仅仅来自独立作用的单线态氧产生或一氧化碳释放，而是来自能够同步产生活性氧和一氧化碳的集成分子设计。光敏剂和一氧化碳释放部分的共价键可能有助于同一细胞隔室内的时空耦合激活，与单独的PDT和一氧化碳剂联合给药相比，导致更有效的凋亡诱导。

随后，为了评估一氧化碳释放后生成的光降解产物是否对细胞毒性有贡献，研究人员在细胞处理前对AF-I进行了预辐照，然后在黑暗条件下将其应用于SH-SY5Y细胞。MTT检测中未观察到明显的毒性（图S36），这表明残留的黄酮类光产物不会显著影响细胞活力。这些研究结果表明，所观察到的抗癌活性主要源于光触发的光动力治疗（PDT）和一氧化碳介导的致敏作用，而非有毒的降解产物。

为评估一氧化碳（CO）释放是否有助于在氧限制条件下实现光疗效果，研究人员在缺氧条件下通过光激活开展了细胞毒性实验。正如预期的那样，两种化合物的光动力治疗（PDT）效力均因氧气可用性降低而下降（图5B）。不过，与AY-I相比，AF-I保留了更高的活性，其半最大效应浓度（(IC_{50})）分别为0.28 μM和0.46 μM（图5C和图S37）。延长的暗毒性评估结果证实，AF-I在浓度高达10 μM时几乎无毒性，在缺氧条件下的光毒性指数（PI）超过36（图S37D）。这些结果表明，AF-I治疗效果的提升源于光激活效率的增强，而非其本身的细胞毒性。由于光动力作用和一氧化碳释放均源自单线态氧的激活，缺氧条件下其效力下降与(^{1} O_{2})的可用性降低相一致。这种活性的保留在缺氧条件下，AF-I的作用因此反映的是协同光动力疗法（PDT）和一氧化碳（CO）机制，而非非氧依赖通路。

图5. AY-I和AF-I对SH-SY5Y细胞的光毒性。在常氧（A）和低氧（B）条件下，用不同浓度的AY-I或AF-I处理细胞，分别进行10分钟光照和避光处理后，评估细胞活力。在每个时间点采用Student t检验（(* P<0.05)、(* * P<0.01)、(* * * P<0.001)）对AY-I（光动力治疗，PDT）处理组与AF-I（PDT+CO）处理组的细胞进行比较。（C）AY-I和AF-I在常氧、低氧条件下，有无近红外光照射时的半数最大抑制浓度（((IC_{50}))）。（D）细胞经AY-I或AF-I处理并暴露于660 nm光下10分钟后的活死共染色图像。活细胞用钙黄绿素AM染成绿色（(lambda_{ex} :)：488 nm激发，535 nm发射；(lambda_{em} :)：500-550 nm发射），死细胞用碘化丙啶（PI）染成红色（600-650 nm发射）。比例尺：(=100 mu m)

尽管一氧化碳的释放无法消除(^{1} O_{2})这一要求，但以往研究表明，一氧化碳能够调节线粒体呼吸作用、细胞氧化还原平衡以及缺氧相关信号通路，其中包括缺氧诱导因子-1α的调控机制⁴⁵。通过影响线粒体功能和氧化应激反应，在缺氧条件下，局部一氧化碳的释放可能会增加细胞对光动力疗法所致损伤的易感性。与这一解释相符，缺氧条件下AF-I性能的提升表明一氧化碳释放通过作为致敏辅助治疗成分而非独立的细胞毒性方式，有助于部分保留光疗疗效。

为了进一步评估细胞选择性，还在代表非癌细胞的永久人类内皮细胞系EA. hy926中进行了时间依赖性内化研究。AF-I表现出与神经母细胞瘤细胞中观察到的类似的摄取行为（图S38A，B），表明细胞内化不受活性肿瘤靶向机制的支配。这一观察结果与AF-I的分子设计一致，它不包含靶向配体，并反映了光动力治疗剂的共同特征，其中治疗选择性主要来自空间控制的光激活，而不是差异细胞摄取。重要的是，尽管摄取水平相似，但AF-I在正常细胞中表现出与神经母细胞瘤细胞相比更低的光毒性（图S38C），这表明了一个有利的治疗窗口，并支持局部光激活作为治疗选择性的主要决定因素的作用。

活死双染实验进一步证实了这些发现（图5D）。与经AY-I处理的细胞相比，先用AF-I处理再进行光照射的细胞呈现出大量红色荧光（碘化丙啶，死细胞）；而所有对照组——包括未处理细胞、单独光照射组以及在黑暗条件下仅用探针处理的细胞——则主要表现出绿色荧光（钙黄绿素AM，活细胞）。综上，这些结果证实AF-I可高效诱导光依赖性细胞死亡。AF-I 增强的光疗活性归因于其高效的细胞摄取、多细胞器定位、有效的单线态氧生成以及单线态氧触发的一氧化碳释放，其中光动力疗法（PDT）是主要的细胞毒性机制，而一氧化碳则作为增敏组分，增强氧化应激诱导的细胞凋亡。这些研究结果凸显了将可控的一氧化碳释放与光动力疗法相结合的优势，该策略可提升神经母细胞瘤细胞的光疗效力。

图6.(A) 采用FITC-膜联蛋白V和碘化丙啶染色进行的细胞凋亡流式细胞术分析。(B) 流式细胞术分析中细胞凋亡率的定量数据 (((* * * P<0.001)))。(C) 细胞经AY-I或AF-I处理并在光激活下，对细胞内活性氧和SOSG荧光的检测。(D) 活的SH-SY5Y细胞中AF-I释放一氧化碳的共聚焦成像。(Scale bar =20 mu m)

为进一步阐明光动力/一氧化碳辅助癌细胞凋亡的潜在机制，我们采用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）和碘化丙啶（PI）染色法进行流式细胞术分析。在凋亡早期，Annexin V-FITC会选择性结合质膜外侧的磷脂酰丝氨酸；而PI则能穿透膜受损的细胞，这一现象提示细胞处于凋亡晚期或坏死状态。荧光激活细胞分选（FACS）分析结果显示，光照射显著提高了探针处理组细胞的凋亡率（图6A）。具体而言，光照条件下AF-I处理组的细胞凋亡率较避光条件下提升了47.3%在相同光照条件下，AF-I 诱导的细胞凋亡显著多于 AY-I，而 AY-I 仅诱导了 23.6% 的细胞凋亡增加（图 6B）。这些结果证实，兼具光动力治疗（PDT）和一氧化碳释放特性的 AF-I，在相同光照条件下触发的细胞凋亡远多于 AY-I。

为了确定细胞内活性氧（ROS）是否参与了这种细胞毒性，我们使用(2',7') -二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）和单重态氧传感器绿色荧光探针（SOSG）分别检测总活性氧和(^{1} O_{2})。探针孵育24小时后，经AF-I或AY-I处理的SH-SY5Y细胞先用DCFH-DA或SOSG进行共染色，再暴露于660纳米红光下10分钟，随后进行共聚焦成像。正如预期的那样，仅在经AF-I或AY-I处理的细胞中观察到强烈的绿色荧光。暴露在光下，证实了光触发的活性氧以及 (^{1} O_{2})生成（图6C）。在缺少探针或光暴露的对照组中没有检测到明显的荧光，证实了这两种成分对ROS生产的需求。

随后利用 AL-Flu 探针探究了 AF-I 中一氧化碳的细胞内释放情况，该探针在一氧化碳存在的情况下，通过 (Pd^{0}) 介导的 Tsuji−Trost 反应释放荧光素并产生绿色荧光信号。通过共聚焦显微镜监测了活的 SH-SY5Y 细胞内一氧化碳的生成情况。如图 6D 所示，仅在与 AF-I、AL-Flu 以及 (PdCl_{2}) 共孵育后经光照射的细胞中观察到明亮的绿色荧光，这证实了细胞内一氧化碳的释放。相比之下，对照组（仅 AF-I、(AF-I+PdCl_{2}) 以及 AF-I + AL-Flu）未检测到荧光，表明未产生一氧化碳。同样，改用 AY-I 重复实验时（图 S39），也未检测到荧光信号，这与该系统中不含一氧化碳释放基团的情况一致。这些结果表明 AF-I 可在细胞内高效地经光触发释放一氧化碳，为一氧化碳作为整合光动力系统中的协同治疗组分这一设想提供了支持。

结合上述的光毒性及对比研究，实验结果表明光动力疗法（PDT）是AFI系统中主要的细胞毒性机制，而一氧化碳（CO）释放则作为次要的增敏组分发挥作用。(^{1} O_{2})的生成会引发氧化损伤和细胞凋亡，而局部产生的一氧化碳被认为可调节线粒体功能和细胞应激反应，从而增强细胞对光动力疗法诱导的细胞死亡的易感性。这一解释与AF-I比非一氧化碳释放类似物以及光动力疗法与一氧化碳外部联合系统均具有更高光毒性的观察结果相符，凸显了两种治疗方式在细胞内同步生成的优势。

神经母细胞瘤是一种主要的颅外儿科恶性肿瘤，最常起源于肾上腺髓质或其他交感神经系统部位（颈部、胸部、腹部、骨盆），也是儿童中最常见的颅外实体瘤。鉴于其颅外发病部位，那些无法穿透血脑屏障（BBB）的全身用药，在集中于原发肿瘤或中枢神经系统以外的转移灶时，仍能在临床上发挥高效作用。我们的体外血脑屏障预测（基于 Enalos 云平台；48 表S1）将AF-I归为难以穿透血脑屏障的类别，这与醚键和羟基中多个氧原子赋予其较高的极性相符，而这种极性会阻碍其被动扩散穿过富含脂质的血脑屏障。这一特性并非神经母细胞瘤治疗的劣势，反而具有优势：现代大多数神经母细胞瘤的治疗手段——手术、多药化疗、放疗以及抗GD2免疫治疗——均通过全身给药靶向治疗颅外病变，无需穿透血脑屏障即可发挥疗效。49 即便是有效的神经母细胞瘤免疫治疗，也会在神经组织中引发显著的靶向毒性：抗GD2抗体（如迪妥昔单抗）可通过在表达GD2的神经纤维处激活补体，引发严重的神经性疼痛，这反映出其对肿瘤外组织的作用神经组织。

为评估AF系列化合物的药代动力学行为，我们采用了两个互补的基于网络的预测平台ICDdrug（表S2）和pkCSM（表S3）。这两个模型均一致表明，AF-I具有相似的理化性质，包括高氢键受体数（24个）、适中的氢键供体数（4个）以及较高的正辛醇-水分配系数（5.8）。这些性质表明，尽管口服生物利用度可能受限，但该类化合物非常适合通过非肠道途径进行全身给药是光动力疗法和癌症治疗的标准方式。重要的是，这两种工具均预测血脑屏障通透性可忽略不计（血脑屏障值=0.0；((BBB=0.0 ;)、(log BB=-4.534)、AF-I），这支持了我们此前的结论，即这些探针适用于颅外神经母细胞瘤的治疗，同时能最大程度降低与穿过血脑屏障的药物相关的中枢神经毒性风险。

分布分析进一步显示，AF-I 呈现低至中等的稳态分布容积（VDss = (VDSs) −0.002 log L/kg），且未结合比例中等（((Fu=) (0.381 ))），这表明其分布于全身水腔（((VDss=0.995 ~L / kg))），且血浆滞留与组织可及性达到平衡。两种模型均证实了AF-I与P-糖蛋白转运体的预测相互作用，且AF衍生物被确定为P-糖蛋白抑制剂而非底物，这意味着药物外排减少且全身滞留时间延长。代谢预测显示AF-I可能是CYP3A4的底物，且根据pkCSM分析，其对其他CYP同工型的抑制潜力较低。这与ICDdrug输出结果中提示的更广泛的CYP抑制作用存在部分差异。这凸显了开展实验验证以明确潜在药物-药物相互作用的必要性。

毒性预测整体较为理想：AF-I 无致突变性、无肝毒性且低致敏性。通过 hERG 抑制作用发现了其存在 QT 间期延长性心律失常的风险，这一结果需要开展进一步的体外心脏毒性研究。综合来看，AF-I 具备与适用于颅外神经母细胞瘤治疗的全身给药方式相匹配的理化性质和药代动力学特性。其血脑屏障通透性有限、毒性特征良好，且体外治疗效力高，这些特点为 AF-I 采用优化的给药剂量和递送策略开展进一步的临床前研究提供了潜力。

为初步在体内探究AF-I的生物分布特性，开展了斑马鱼成像实验。共聚焦荧光成像显示AF-I分布于外周组织，而在所有分析样本的脑部区域均未观察到高于背景的可检测荧光信号（图S40A-C）。这一发现与AF-I有限的血脑屏障通透性预测相符，也支持其适用于颅外神经母细胞瘤的潜力——此类应用中避免中枢神经系统暴露可降低脱靶毒性风险。尽管斑马鱼幼虫仅能提供生物分布的初步指示，但这些结果为AF-I的药理学特性提供了初步体内证据。在观察期内，未暴露于光照的AF-I处理斑马鱼未出现急性毒性可观察迹象，如死亡、运动异常或明显的形态异常。虽然这并非全面的毒性评估，但与体外观察到的可忽略不计的暗细胞毒性一致，也佐证了AF-I的光依赖性激活机制。

尽管计算ADMET预测能为AF-I的药代动力学及安全性相关特性提供初步见解，但进一步的开发仍需实验验证。因此，未来的研究将聚焦于评估哺乳动物模型中的代谢稳定性、血浆蛋白结合率以及体内药代动力学和毒性，以验证预测的特性并指导临床前应用的优化。

结论

总之，研究人员开发了羟基黄酮修饰的氮杂-BODIPY衍生物，将光动力疗法（PDT）与单线态氧触发的一氧化碳（CO）释放整合为无金属平台。在合成的化合物中，AF-I展现出良好的光物理性质、高效的活性氧生成能力以及光控CO释放特性，从而提高了其在神经母细胞瘤细胞中的光疗疗效。机理研究表明，PDT是主要的细胞毒性途径，而局部CO释放则作为增敏性联合治疗手段，增强氧化应激诱导的细胞凋亡。这种整合式分子设计实现了细胞内活性氧与(CO ,)及CO的同步生成，相比外部联合PDT和CO系统，其性能得到了提升。斑马鱼初步研究显示该衍生物血脑屏障穿透性有限，加之其在正常细胞中几乎无暗毒性且光毒性降低，证明了由空间可控光激活所决定的良好治疗窗口。此外，ADMET计算预测表明其具备良好的药代动力学和安全性相关特性，为在哺乳动物模型中开展进一步实验评估提供了支撑。综上，本研究为将可控气体递质释放与PDT整合用于光激活联合光疗提供了无金属设计框架。