题目：Selective targeting of kinesin on lipid droplets in the liver reduces plasma lipids

原文链接:https://doi.org/10.1073/pnas.2528332123 1 of 12

期刊:CELL BIOLOGY

摘要

肝脏通过向血液中分泌富含脂质的极低密度脂蛋白（VLDL）来调控血浆脂质。在肝脏的肝细胞内部，脂滴（LDs）通过驱动蛋白-1马达被转运至滑面内质网，在此处脂滴被分解代谢，为极低密度脂蛋白的组装提供脂质原料。本研究发现，驱动蛋白-1利用其尾部结构域结合脂滴的单层磷脂膜，而以另一种机制结合具有双层膜的细胞器。因此，一段对应驱动蛋白-1尾部结构域的肽段可与脂滴上的驱动蛋白-1竞争性结合并将其选择性移除，对其他细胞器的影响微乎其微。这使得用于极低密度脂蛋白组装的脂质递送过程随之减少，导致细胞培养体系中分泌的脂质（甘油三酯和胆固醇）显著降低约50%。值得注意的是，该肽段并未导致细胞内脂质的异常积累，反而使脂滴在细胞内重新分布，促进了脂滴向线粒体的脂质转运，以满足线粒体的脂质利用需求。此外，研究还证实卵脂体可用于口服向斑马鱼递送驱动蛋白尾部结构域肽段。该肽段会在斑马鱼肝脏中富集，并逆转饮食诱导的高脂血症，使斑马鱼恢复至正常血脂状态。与在细胞培养中的作用一致，该肽段不会导致斑马鱼肝脏内脂质异常蓄积，也无毒性作用，更不会引发发育或行为缺陷。利用肽段将蛋白质（如驱动蛋白）从脂滴上选择性置换下来，为治疗脂质代谢紊乱疾病提供了一种全新的策略。这种“单层膜-双层膜”的作用机制有望拓展应用于靶向其他与脂滴结合的脂质代谢关键调控蛋白。

脂滴 | 脂蛋白 | 极低密度脂蛋白 | 高脂血症 | 驱动蛋白

脂质以三酰甘油（TG）和胆固醇酯（CE）的形式储存在细胞内，这些物质构成了脂滴（LDs）的中性脂质核心。脂滴还含有脂质合成酶、脂肪酶和囊泡运输马达，这表明脂滴是动态枢纽，脂质在此储存或消耗，以为代谢需求提供能量。脂滴与内质网（ER）共享许多常见的磷脂和蛋白质，但脂滴的不同之处在于其边界膜是单层磷脂膜（图1A）。这种单层膜具有独特的生物物理特性，使得特定蛋白质能响应代谢和免疫信号被靶向至脂滴。与其他细胞器不同，目前尚未发现脂滴特有的蛋白质靶向机制。相反，蛋白质可能通过三酰甘油短暂暴露于细胞质时脂滴膜上出现的堆积缺陷与脂滴结合。因此，脂滴蛋白可能分为两类。I类蛋白从内质网转移至脂滴，并通过发夹结构与脂滴结合（如GPAT4、DGAT2）。II类蛋白从细胞质转移至脂滴，与脂滴相互作用时通常会两亲螺旋（如周脂素、CCT1）。

由于脂滴结合蛋白是生物体获取能量/脂质储备的关键，其功能在脂滴生物发生、分解代谢和代谢性疾病的研究中被广泛讨论。令人意外的是，我们发现目前尚无研究探讨**可通过操控蛋白质在脂滴上的定位来治疗相关代谢性疾病**的可能性。考虑到全球高脂血症和肥胖症的发病率不断上升，而现有治疗手段十分有限，这一研究空白具有重要意义。基于此背景，且脂滴是唯一由单层膜包被的胞质细胞器，我们提出以下假说（图1A）：假设某一蛋白质通过两个不同结构域分别结合单层膜和双层膜，那么模拟该蛋白质单层结合结构域的肽段，相较于双层膜囊泡，应能更高效地与该蛋白质竞争结合位点，并将其从脂滴上解离。因此，该肽段可在对该蛋白质在双层膜上的细胞功能造成最小干扰的前提下，抑制脂滴驻留蛋白所介导的脂滴特异性下游通路膜。据我们所知，在针对脂滴生物学和代谢紊乱的研究背景下，这种可能性从未被讨论过或证实过。

每个数据点代表独立细胞的分布情况。数据为平均值±标准差。图1 利用KTDP对脂滴转运进行选择性靶向。(A) 二聚体驱动蛋白-1（常规驱动蛋白）马达的示意图。KHC基因编码N端马达结构域、卷曲螺旋茎和C端KTD。KLC由KLC基因表达。两个KHC和两个KLC亚基组装形成二聚体马达。研究假设表明，驱动蛋白-1通过其尾部结构域与脂滴结合，因此KTDP可与脂滴上的驱动蛋白-1竞争并将其移除。KTDP对使用替代机制（如KLC）结合驱动蛋白-1的其他（双层）细胞器影响极小。由此可实现对脂滴转运的选择性靶向，以减少肝细胞中脂质向脂蛋白组装的递送。(B) 人KTDP的详细结构，包含预测的N端螺旋（NH1和NH2）、“转折”区域和C端内在无序区（C端IDR）。同时展示了PA结合结构域及其氨基酸序列。还标注了阻断KTD与PA结合的碱性氨基酸突变（与KTDP突变体相关）。此外展示了斑马鱼中PA结合结构域的KTD序列。(C) 通过I-TASSER建模获得的KTDP预测二级结构。(D) McARH-7777肝癌细胞的共聚焦图像（未处理对照组；过表达GFP-KTDP、GFP-KTDP突变体和GFP-KLC1E构建体）。脂滴（黄色假彩色：MDH染料染色）和溶酶体（红色：LAMP1抗体染色）分别在不同通道展示。部分细胞轮廓在脂滴通道中标出。（比例尺，10微米）(E) 利用参数(D_{F})（定义见图）量化过表达KTDP和KLC肽对脂滴的影响。(D_{F}=1)和(D_{F}=0)分别代表脂滴的外周和核周定位。数据为平均值±标准差。(F) 过表达KTDP和KLC肽对溶酶体分布的影响。通过测量细胞外周感兴趣区域内的LAMP1强度，并与全细胞水平的LAMP1强度进行比较，对溶酶体进行定量，随后计算外周与全细胞LAMP1强度的比值（见正文）。

在此，我们将针对驱动蛋白-1马达与脂滴（LDs）的结合，以及其与其他（非脂滴）双层囊泡的结合这一假设展开验证。驱动蛋白-1由两条驱动蛋白重链（KHCs）和两条轻链（KLCs）组成，这些链由不同基因编码，并组装成二聚体马达蛋白（图1A）。驱动蛋白重链包含一个马达结构域、一个卷曲螺旋茎部以及一个C端驱动蛋白尾结构域（KTD）。驱动蛋白-1通过蛋白复合物（如Miro-Milton）和/或与驱动蛋白轻链相互作用的衔接蛋白被招募到多种双层囊泡上。在果蝇胚胎和大鼠肝脏中，驱动蛋白-1也能与脂滴结合并对其进行运输。我们的研究表明，胰岛素信号通路会激活肝脏内的磷脂酶D，在肝细胞内的脂滴上生成磷脂酸（PA）。随后，驱动蛋白-1直接与磷脂酸结合，促使脂滴被运输至肝细胞外周的光面内质网。在在平滑内质网中，这些脂滴为极低密度脂蛋白颗粒提供约70%的脂质含量。驱动蛋白-1敲低会减少细胞的甘油三酯分泌，同时也会降低动物（大鼠）体内的血清甘油三酯水平，这是因为驱动蛋白介导的富含甘油三酯的脂滴向极低密度脂蛋白组装位点的递送过程受到了抑制。事实上，在蔗糖梯度分级组分中，载脂蛋白B-100（极低密度脂蛋白的标志物）的峰值向更高密度区域偏移，这表明驱动蛋白-1敲低后，大鼠血液中存在甘油三酯缺乏的高密度极低密度脂蛋白颗粒。

虽然敲除驱动蛋白-1确实能降低动物的血清甘油三酯，但这并非调控血浆脂质的可行策略，因为驱动蛋白-1在细胞内还具有许多其他关键功能。不过，我们后续研究发现，过表达C端KTD结构域（驱动蛋白重链的854-963位氨基酸——见图1B和C）形成的肽段，仅会破坏细胞内脂滴的外周分布，而不会影响溶酶体、早期内体和线粒体的定位(7)。为解释这些发现，本研究提出如下假说：驱动蛋白-1通过KTD结构域与脂滴结合（图1A）。因此，KTD肽段（以下简称 KTDP）可竞争性地将内源性驱动蛋白-1 从脂滴上取代，从而扰乱脂滴运输并降低极低密度脂蛋白颗粒内的脂质含量。若 KTDP 在将驱动蛋白从驱动蛋白的其他（双层膜）货物上移除方面效果有限，那么脂滴-极低密度脂蛋白轴之外的细胞功能应不会受到 KTDP 的显著干扰。我们通过体外实验、分子动力学模拟和细胞培养实验验证了这一假设。我们还进一步证实，从鸡蛋中制备的脂质体是一种新颖且简便的斑马鱼幼体和成体肝脏体内肽类递送系统。KTDP 能完整递送至肝脏，在广泛用于脂质代谢研究的斑马鱼模型中，可显著降低血清脂质（甘油三酯和胆固醇）水平。KTDP 不会在细胞培养体系或斑马鱼幼体中引发有害的脂质蓄积，斑马鱼幼体仍能正常发育并表现出正常的生理行为。这种通过抑制肝脏内驱动蛋白介导的脂递送来阻碍极低密度脂蛋白组装、进而降低血清脂质的策略，或许能为日益流行的高脂血症流行病提供一种截然不同的防治手段。

结果

KTD肽特异性破坏细胞内脂滴的外周分布。我们首先测试了过表达GFP标记的KTDP对McA-RH7777大鼠肝癌细胞脂滴分布的影响，该细胞已知可分泌极低密度脂蛋白。本研究中我们将使用对应于人KTD序列的KTDP。补充信息附录图S1A（左）展示了本研究相关物种（人、大鼠、斑马鱼）中KTD的序列比对。KTD的螺旋区域（氨基酸854至913；补充信息附录图S1A右图）与膜结合相关，该区域高度保守，因此证明在所有实验中使用人KTDP是合理的。McA-RH7777细胞呈细长形态（图1D），光滑内质网位于细胞外周（补充信息附录图S1B），此处存在微管（MTs）的正端。这与大鼠肝切片中观察到的光滑内质网外周定位现象极为相似。对照组（未处理）细胞的大多数脂滴位于细胞外周（图1D），表明脂滴上存在高活性的驱动蛋白。过表达GFP标记的KTDP（GFP-KTDP）会导致脂滴在细胞内重新分布，但无法与脂滴上磷脂酸（PA）结合的突变型GFP-KTDP（GFP-KTDP-mut；图1B）对脂滴分布无影响（图1D）。我们验证了GFP-KTDP和GFP-KTDP-mut在细胞中的表达水平相等（补充信息附录图S1C），这与此前对这些质粒的研究结果一致。如前文所述，我们使用分数距离参数量化脂滴的位置（补充信息附录图1E）。编号分别为(D_{F}=1)和(D_{F}=0)的参数分别代表位于细胞外周和细胞中心的脂滴。经GFP-KTDP处理的细胞，其脂滴的编号为(D_{F})的参数值更低，而GFP-KTDP-mut不会导致编号为(D_{F})的参数值降低（图1E）。重要的是，GFP-KTDP对McA-RH7777细胞中溶酶体的分布无肉眼可见或可量化的影响（图1D和F）。我们已证实，KTDP对这些细胞中的线粒体和早期内体分布也无影响。与KTDP相反，过表达GFP标记的驱动蛋白轻链（GFP-KLC1E）对脂滴分布无影响（图1E），但会导致溶酶体呈外周分布（图1F），这与此前的研究报道一致。

基于这些观察结果，KTDP 对驱动蛋白介导的脂滴向细胞外周区域的运输具有显著且具有选择性的作用。如果驱动蛋白-1 利用其 KTD 与脂滴结合，同时通过其他结构域与双层膜细胞器结合（例如驱动蛋白轻链与溶酶体结合），那么这种选择性就可以得到解释。体外研究表明，KTD 既与驱动蛋白的马达结构域结合，也与微管结合。KTD 会抑制 ATP 酶活性，使驱动蛋白切换至“关闭状态”。因此，稳定过表达 KTDP 的 McA-RH7777 细胞并未出现表型正常且生长状态良好，对溶酶体、内体和线粒体在这些细胞内的定位没有影响。为什么过表达的 KTDP 不会与双层膜细胞器上驱动蛋白-1 的马达结构域结合，从而导致驱动蛋白-1 活性全面关闭？如果双层膜细胞器上与 KLC 的结合能使驱动蛋白-1 处于不受 KTDP 影响的激活状态，这一现象便可以得到解释。我们将在**讨论**部分回到这些问题。

KTD肽与单层及双层膜的体外亲和力。上述数据表明KTDP在脂滴上抑制驱动蛋白-1，但无法（或能力较弱）抑制其他囊泡上驱动蛋白的功能。对这一现象最简单的解释是，过表达的KTDP与内源性驱动蛋白-1的KTD竞争结合脂滴，从而将驱动蛋白-1从脂滴上移除。然而，KTDP既不会移除也不会阻断驱动蛋白-1在其他（双层）囊泡上的功能，原因在于：i）KTDP对双层膜的亲和力更低；ii）驱动蛋白-1并非通过KTD结合双层膜（假说；图1A）；iii）KTDP不会抑制结合双层膜囊泡的驱动蛋白-1的ATP酶活性，因为KLC将驱动蛋白-1维持在不受KTDP影响的激活状态。

我们首先在一个最小重组系统中，利用脂质体（具有双层膜）和围绕三酰甘油核心的单层磷脂膜人工脂滴（ALDs）测试了KTDP的结合亲和力。由于KTD与磷脂酸（PA）结合，脂质体和人工脂滴均使用95%的磷脂酰胆碱（PC）和5%的磷脂酸（PA）制备。通过薄层色谱法检测脂质体和人工脂滴上的磷脂酰胆碱含量，对二者进行归一化处理（补充信息附录，图S1E）。对于相同的总表面积，单层脂滴的磷脂酰胆碱含量约为双层脂质体的一半。因此，我们采用适当稀释的方式制备磷脂酰胆碱含量为脂质体一半的人工脂滴样品，预期这些样品可提供与KTDP结合的膜表面积大致相同（补充信息附录，图S1E）。将这些样品与在细菌中制备的谷胱甘肽S-转移酶标签KTDP（GST-KTDP；补充信息附录，图S1D）孵育后，通过离心分离人工脂滴和脂质体。针对谷胱甘肽S-转移酶的蛋白质印迹实验显示，人工脂滴上GST-KTDP的信号强度是脂质体的四倍（图2A）。我们将在下一节通过光学显微镜在单囊泡水平上验证KTDP对单层膜的这种偏好性。

我们首先在一个最小重组系统中，利用脂质体（具有双层膜）和围绕三酰甘油核心的单层磷脂膜人工脂滴（ALDs）测试了KTDP的结合亲和力。由于KTD与磷脂酸（PA）结合，脂质体和人工脂滴均使用95%的磷脂酰胆碱（PC）和5%的磷脂酸（PA）制备。通过薄层色谱法检测脂质体和人工脂滴上的磷脂酰胆碱含量，对二者进行归一化处理（补充信息附录，图S1E）。对于相同的总表面积，单层脂滴的磷脂酰胆碱含量约为双层脂质体的一半。因此，我们采用适当稀释的方式制备磷脂酰胆碱含量为脂质体一半的人工脂滴样品，预期这些样品可提供与KTDP结合的膜表面积大致相同（补充信息附录，图S1E）。将这些样品与在细菌中制备的谷胱甘肽S-转移酶标签KTDP（GST-KTDP；补充信息附录，图S1D）孵育后，通过离心分离人工脂滴和脂质体。针对谷胱甘肽S-转移酶的蛋白质印迹实验显示，人工脂滴上GST-KTDP的信号强度是脂质体的四倍（图2A）。我们将在下一节通过光学显微镜在单囊泡水平上验证KTDP对单层膜的这种偏好性。

上述描述的脂滴/脂肪体/微粒体适用于批量生化实验，但其尺寸较小（小于1微米），无法用于光学成像。为通过直接成像在单囊泡水平验证KTDP的作用，我们参照补充信息附录图S1G所述开发了一种体外检测方法。我们使用了大尺寸乳胶微球，分别为疏水性（二乙烯基苯涂层；直径6.4微米）和亲水性（羧化；直径5.7微米）两种类型。制备了具有特定脂质组成（95%磷脂酰胆碱 + 5%磷脂酸）的脂质体，并掺入微量荧光BODIPY-C12。随后将这些脂质体沉积在疏水性或亲水性微球表面，分别构建支撑脂质单分子层（SLMs）和支撑脂质双分子层（SLBs）。BODIPY-C12荧光成像证实SLMs上存在致密的环形膜结构，SLBs上也形成了相应的环形膜（图2C）。沿环形轮廓测得的荧光强度结果显示，SLMs上单分子层的平均荧光强度低于SLBs上双分子层的平均荧光强度（补充信息附录图S1H）。随后通过稀释调节SLMs和SLBs，获得光密度相同的样品，即单位体积内的微球数量一致。我们使用血细胞计数板对SLMs和SLBs进行人工计数，验证了这种归一化处理的有效性。由于这些两种珠子的直径大致相同，且在标准化样品中的数量相等，因此可用于 KTDP 结合的总膜表面积在 SLM 样品和 SLB 样品中应相近。

图2. KTDP在体外优先结合并从单层膜上移除驱动蛋白-1。(A) 对脂质体（ALDs）和脂质体样本进行归一化处理，使其表面积大致相等（详见正文）。样本与谷胱甘肽S-转移酶-KTDP（GST-KTDP）孵育后，通过离心分离未结合的GST-KTDP。使用GST抗体进行免疫印迹分析显示，GST-KTDP与ALDs的结合度高约四倍。数据为三次独立实验的平均值±标准差。(B) 从大鼠肝脏中制备脂滴（LD，单层膜）和内质网富集微粒体（双层膜）样本。将每个样本均分为两部分，一部分不做处理，另一部分用绿色荧光蛋白-KTDP（GFP-KTDP）处理。通过离心分离未结合的GFP-KTDP与LD或微粒体。针对GFP的免疫印迹分析显示，KTDP与LD有显著结合，但未检测到与微粒体的结合。周脂素-2（Perilipin-2）和KDEL的免疫印迹分别验证了LD和微粒体样本的纯度。这些免疫印迹结果还表明，未处理组和KTDP处理组的LD与微粒体上样量一致。(C) 将疏水或亲水微珠与硼二吡咯烷甲酰基（BODIPY）标记的脂质体（由95%磷脂酰胆碱（PC）+5%磷脂酸（PA）制备）孵育，微珠周围会形成带有荧光（BODIPY）膜的单层脂质体膜（SLMs）或双层脂质体膜（SLBs）。SLMs由直径6.4微米的二乙烯基苯（DVB）包被乳胶微珠制备，SLBs由直径5.7微米的羧化乳胶微珠制备。随后将SLMs和SLBs与绿色荧光蛋白标记的驱动蛋白-1（GFP-KIF5B）孵育，在共聚焦显微镜图像中检测驱动蛋白-1在膜结构上的募集。再用Alexa Fluor 647标记的KTDP（A647-KTDP）处理SLMs和SLBs，对经KTDP处理的结构成像，以检测这些结构上的A647-KTDP和GFP-KIF5B。（比例尺，6微米）(D) SLMs上的A647-KTDP荧光强度显著高于SLBs，表明KTDP对SLMs的亲和力更高。每个数据点代表单个SLB或SLM周围圆形区域内A647荧光的积分强度。误差棒为平均值±标准差。(E) A647-KTDP处理前后，SLMs和SLBs上的GFP-KIF5B荧光强度。每个数据点代表单个SLB或SLM周围圆形区域内GFP荧光的积分强度。误差棒为平均值±标准差。

随后从过表达绿色荧光蛋白标记的驱动蛋白-1（GFP-KIF5B）的细胞中制备细胞溶质。将单层脂质膜（SLMs）和双层脂质膜（SLBs）分别与细胞溶质孵育以招募GFP-KIF5B，随后通过离心从细胞溶质中分离出来。共聚焦图像显示，GFP-KIF5B被招募至SLMs和SLBs上（图2C，第二列）。随后，这些SLMs和SLBs用Alexa-647标记的谷胱甘肽S-转移酶-KTDP（GST-KTDP）处理，经离心分离后再次进行成像。SLMs上的Alexa-647信号显著高于SLBs（图2C，第三列）。定量分析结果显示，SLMs单位表面积的Alexa-647荧光强度是SLBs的约四倍（图2D）。这一发现与通过蛋白质印迹法在脂质单层（ALDs）上检测到的KTDP含量（相较于脂质体）高出约四倍的结果高度一致（图2A）。

因此，经 KTDP 处理后，仅有约 23% 的驱动蛋白-1 保留在 SLM 上（77% 被去除）。相比之下，约 72% 的驱动蛋白-1 保留在 SLB 上（仅 28% 被去除）。我们采用这些比例是因为 KTDP 处理前 SLB 上的 GFP 信号略低于 SLM（图 2C 和图 2E）。

KTD肽可减少McA-RH7777细胞的脂质分泌。如果KTDP能高效地从脂滴（LDs）中移除驱动蛋白-1，那么它是否也会减少细胞的脂质分泌？为验证这一点，我们检测了过表达KTDP或PA结合缺陷型KTDP突变体后，McA-RH7777肝癌细胞分泌到培养基中的甘油三酯（TG）和胆固醇酯（CE）含量。已知这类细胞能够分泌极低密度脂蛋白（VLDL）。两种肽在这些细胞中的表达水平均相同（SI附录，图S1C），这与此前的研究结果一致。首先用油酸（OA）处理细胞，为脂滴形成提供底物。移除含油酸的培养基后，将细胞置于无血清培养基中培养。孵育后通过抽吸收集培养基，洗涤细胞并单独收集。对收集的培养基进行液相色谱-质谱（LC-MS）脂质组学分析，结果显示，与未处理组和过表达KTDP突变体组相比，KTDP显著减少了特定长链甘油三酯种类的分泌（图3A及图3A上方插图）。使用商用甘油三酯检测试剂盒测定发现，培养基中的甘油三酯含量约降低了50%（图3A下方插图）。液相色谱-质谱分析还证实，分泌到培养基中的胆固醇酯含量大幅下降（图3B及图3B上方插图）。使用商用胆固醇检测试剂盒（可检测酯型和游离型胆固醇）测定显示，过表达KTDP后，培养基中分泌的胆固醇含量显著降低（图3B下方插图）。

KTDP的表达不会使McA-RH7777细胞中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性升高，这表明KTDP不会产生任何毒性（补充信息附录，图S2A1）。我们也未检测到KTDP表达后细胞形态出现任何明显变化（图1D及补充信息附录，图S2A2）。我们此前已通过BrdU染色观察到，在未处理、KTDP处理和KTDP突变体处理的条件下，细胞增殖情况无变化。用油酸脉冲处理12小时后，未处理细胞和KTDP处理细胞内检测到的甘油三酯（TG）水平相近，这说明KTDP对脂滴（LD）的生成无显著影响（补充信息附录，图S2B1）。此外，KTDP处理也未引起细胞内磷脂（如磷脂酰胆碱（PC）和溶血磷脂酰胆碱（Lyso-PC））含量发生变化（补充信息附录，图S2B2）。

KTD 肽不会在 McA-RH7777 细胞中导致脂质积累。非常有趣且出人意料的是，液相色谱-质谱联用（LC-MS）检测和商业检测试剂盒均显示，KTDP 不会使 McA-RH7777 细胞内的甘油三酯（TG）含量增加（图3C及图3C的插图），也不会使胆固醇酯（CE）含量增加（图3D及图3D的插图）。为了探究这一结果，我们研究了这些条件下细胞脂质的代谢去向。值得注意的是，经 KTDP 处理的细胞耗氧率（OCR）更高（补充信息附录图S2C），这表明线粒体中的β-氧化作用增强。液相色谱-质谱联用（LC-MS）检测显示，KTDP 还能使游离脂肪酸含量增加脂肪酸（FFAs）在细胞内仅有少量滞留（补充信息附录，图S2D），但不会导致细胞分泌的脂肪酸发生变化（补充信息附录，图S2E）。这些结果或许表明，KTDP会诱导脂解通路，使甘油三酯分解为脂肪酸，这些脂肪酸会在细胞内短暂积累，随后被转运至线粒体进行β-氧化。为验证这一可能性，我们采用脉冲追踪法对脂滴与线粒体之间的脂质流动进行了定量分析（33）。未处理或表达KTDP的细胞先用微量Bodipy-C12（与BODIPY 558/568荧光团结合的12碳脂肪酸）进行脉冲标记，随后追踪16小时，对活细胞进行成像。在未处理（对照）细胞中，追踪后Bodipy-C12荧光定位于脂滴，表明标记的脂肪酸保留在中性脂质库中（补充信息附录，图S3A）。相比之下，KTDP过表达细胞中与脂滴结合的Bodipy-C12显著减少，同时线粒体内的荧光大量富集（补充信息附录，图S3A）。共定位分析显示，KTDP过表达时，Bodipy-C12与MitoTracker标记的线粒体结构高度重叠（补充信息附录，图S3B），这与该条件下脂质从脂滴向线粒体的转运增强相符。

如果表达KTDP的细胞确实通过将脂质从脂滴重定向到线粒体来阻止脂滴积累，那么即使存在KTDP，阻断脂质摄取进入线粒体也应导致脂质积累。为验证这一点，用肉碱棕榈酰转移酶-1（CPT-I）抑制剂依托莫司处理未处理（对照）或表达KTDP的细胞，该抑制剂可阻断线粒体脂肪酸摄取。依托莫司使对照细胞的脂滴数量增加约1.5倍，而在KTDP过表达细胞中则增加约2.5倍（SI附录，图S3 C和D）。经依托莫司处理的表达KTDP的细胞还拥有最大尺寸的脂滴（SI附录，图S3C）。所有这些发现表明，KTDP过表达下脂质未积累的原因可能是脂滴来源的脂肪酸被重定向至线粒体脂肪酸氧化，线粒体氧化活性的增加也反映了这一点（SI附录，图S2C）。对这种重定向最简单的解释是，KTDP使脂滴转运失活，从而将脂滴从肝细胞外周重新分布至整个细胞，使脂滴与同样分布于整个细胞的线粒体紧密相邻（关于这一点的进一步思考见讨论部分）。如果这种重定向在体内成立，那么这意味着KTDP可降低循环血清甘油三酯和胆固醇，且不会使动物出现脂肪肝这一不良副作用。我们将在后续章节中探讨这一极具价值的可能性。

KTD 肽可通过卵脂质体递送至斑马鱼幼虫的肝脏。接下来，我们在整体生物模型中测试了 KTDP 的作用。我们选择了斑马鱼（斑马鱼属），这是研究高脂血症和代谢疾病的成熟模型。近乎透明的幼虫可通过体内成像观察内脏器官（如肝脏、肠道）和血管系统中的脂质分布。此外，仅有少数物种（斑马鱼、人类、兔子、仓鼠）拥有胆固醇酯转移蛋白（CETP）的同源物，而啮齿类动物中不存在该基因。由于CETP在血浆脂蛋白颗粒（极低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白）之间转运中性脂质，斑马鱼体内的循环脂蛋白在组成和丰度上与人类的极为相似。因此，在研究脂蛋白失调的不良影响方面，斑马鱼可能比啮齿动物更合适。事实上，喂食高胆固醇饮食的斑马鱼会形成动脉粥样硬化病变，但这在啮齿动物中更难观察到。

图3. KTDP对脂质分泌和滞留的影响（McARH-7777肝癌细胞）。(A) 未处理、GFP-KTDP和GFP-KTDP-突变体过表达细胞分泌培养基中甘油三酯（TG）的液相色谱-质谱（LC-MS）分析。展示了检测到的主要甘油三酯种类。上方插图为液相色谱-质谱分析中检测到的甘油三酯种类总和。误差已传播计算。KTDP处理细胞的分泌型甘油三酯整体减少约50%，这一现象十分明显。下方插图：使用商用甘油三酯检测试剂盒也观察到了类似的减少趋势。误差线为均值标准误（SEM）。(B) 未处理、GFP-KTDP和GFP-KTDP-突变体过表达细胞分泌培养基中胆固醇的液相色谱-质谱（LC-MS）分析。展示了检测到的主要胆固醇酯种类（预期存在于脂蛋白颗粒内）。KTDP处理细胞分泌的胆固醇酯含量低于液相色谱-质谱数据的背景水平。上方插图为液相色谱-质谱分析中检测到的胆固醇酯种类总和。误差已传播计算。KTDP处理细胞的胆固醇酯分泌量大幅减少，这一现象十分明显。下方插图：使用可检测酯化+游离胆固醇的商用胆固醇检测试剂盒，也观察到了分泌型胆固醇的减少趋势。误差线为均值标准误（SEM）。(C) 未处理、GFP-KTDP和GFP-KTDP-突变体过表达细胞内滞留甘油三酯（TG）的液相色谱-质谱（LC-MS）分析。展示了检测到的主要甘油三酯种类。上方插图为液相色谱-质谱分析中检测到的甘油三酯种类总和。误差已传播计算。不同处理条件下细胞内甘油三酯的滞留量无显著差异。下方插图：甘油三酯检测试剂盒也未检测到不同条件间存在显著差异。误差线为均值标准误（SEM）。(D) 未处理、GFP-KTDP和GFP-KTDP-突变体过表达细胞内滞留胆固醇的液相色谱-质谱（LC-MS）分析。展示了检测到的主要胆固醇酯种类。上方插图为液相色谱-质谱分析中检测到的胆固醇酯种类总和。误差已传播计算。不同处理条件下细胞内胆固醇的滞留量无差异。下方插图：使用可检测酯化+游离胆固醇的商用胆固醇检测试剂盒，也未检测到不同条件间存在差异。误差线为均值标准误（SEM）。

制备了三种脂质体：不含肽的空脂质体、负载GFP-KTDP的脂质体以及负载GFP-KTDP突变体的脂质体无法结合PA。后两种条件在制备脂质体时，溶液中肽的浓度为250微克/毫升。后两类脂质体中几乎所有都出现了强烈的绿色荧光蛋白信号，表明肽成功掺入脂质体内（补充信息附录，图S4A）。这些脂质体用微量的硼二吡咯亚甲基-C12标记，这是一种与脂肪酸链结合的荧光团，该脂肪酸链会掺入甘油三酯中，从而可在斑马鱼幼虫中实现脂质可视化。斑马鱼胚胎在受精后5天（5天龄）之前依靠卵黄脂肪获取营养，之后则以外部食物为食。因此，我们选用6天龄的幼虫开展研究。将脂质体混入幼虫游动的水中（即幼虫培养基），预期幼虫会连同脂质体内的KTDP一起吞食富含营养的脂质体。脂质体包裹KTDP递送实验的示意图见补充信息附录，图S4B。

脂质体按上述方式在6小时内给药，期间轻轻振荡。该时间段结束后，在整个幼虫水平和肠道内部，不同条件下均观察到相似的BODIPY-C12信号（补充信息附录，图S4C）。因此，我们认为幼虫以相似的方式摄取了脂质体不同条件下的数量。我们接下来探究脂质体是否真的有助于将 KTDP 递送至幼虫。对梯度稀释的 GFP-KTDP 进行绿色荧光蛋白（GFP）荧光测定，以绘制标准曲线（补充信息附录，图 S4D）。随后，我们测定了两种幼虫裂解物中的 GFP 荧光：一种幼虫喂食了包裹在脂质体内的 GFP-KTDP，另一种幼虫则喂食了仅与水混合、不含任何脂质体的 GFP-KTDP（两种处理的浓度均为 250 微克/毫升）。图 4A 依据补充信息附录图 S4D 的标准曲线，估算出了整个幼虫裂解物中的 KTDP 浓度。不含脂质体的 KTDP 几乎检测不到荧光。由此可见，卵脂质体确实是向幼虫递送肽类的有效载体。我们接下来使用表达肝脏特异性标记物 FABP10a-樱桃红色荧光蛋白（mCherry）的转基因斑马鱼，对幼虫肝脏进行成像（图 4B）。通过脂质体递送 GFP-KTDP 或其突变体后，观察到强烈的 GFP 信号与 FABP 共定位。因此，部分递送的肽被递送至幼虫肝脏时未发生明显降解，因为如果肽被降解且/或其结构发生显著改变，绿色荧光蛋白（GFP）的荧光本应消失。

KTD肽可降低斑马鱼幼虫的循环脂质

由于幼虫尾部没有内脏器官，尾部的BODIPY-C12成像使我们能够观察到分泌到血管系统中的脂质。与空脂质体或KTDP突变体处理的幼虫相比，KTDP使尾部的BODIPY-C12荧光降低了约50%（图4C和E）。通过尼罗红染色对幼虫肝脏进行共聚焦成像发现，喂食KTDP后，脂滴未出现积累或形态异常，脂滴数量也无变化（图4D和F）。因此我们认为，KTDP对斑马鱼肝脏中脂滴的生成没有显著影响。这些发现让人联想到未发生变化的接下来，我们通过生化方法检测了斑马鱼幼虫头部（包含内脏器官）和尾部（包含脉管系统）中的甘油三酯（TG）。具体操作如下：给斑马鱼幼虫喂食脂质体5小时，随后清洗幼虫，将单个幼虫切成两半，分离出头部和尾部（图4G）。我们收集30个幼虫头部和30个幼虫尾部组成一个重复样本，随后检测每个样本中的甘油三酯和胆固醇。液相色谱-质谱联用（LC-MS）检测结果以及甘油三酯检测试剂盒的检测结果均显示，经KTDP处理的幼虫尾部甘油三酯含量降低了约50%（图4H及方框内插图）。同理，KTDP使幼虫尾部的胆固醇酯含量降低了约50%（图4I），但对尾部的游离胆固醇含量无影响（图4L）。这些发现与通过BODIPY荧光法评估的幼虫尾部中性脂质减少的结果高度一致（图4C、E）。此外，与在McA-RH7777细胞中的观察结果类似，KTDP并未导致幼虫头部的甘油三酯（图4J）或胆固醇（图4K）含量增加。

图4. KTDP脂质体递送至斑马鱼幼鱼：对尾部和头部脂质含量的影响。(A) 从喂食不含脂质体的GFP-KTD（250微克/毫升）或封装在鸡蛋脂质体中的GFP-KTD的幼鱼（6天龄）制备的斑马鱼裂解物中GFP荧光的定量分析。通过校准曲线根据GFP荧光估算KTDP含量（见正文）。误差棒为平均值±标准误均值。(B) GFP-KTDP脂质体喂食后斑马鱼幼鱼的共聚焦图像。在表达FABP10a-mCherry（红色；肝脏标志物）的鱼中，肝脏被标记为红色。（比例尺，100微米）(C) 喂食三种类型BODIPY-C12标记脂质体的幼鱼尾共聚焦z-stack图像：空脂质体、含KTDP的脂质体、含KTDP-突变体的脂质体。（比例尺，100微米）(D) 上述脂质体喂食后幼鱼肝脏尼罗红染色的共聚焦图像。（比例尺，10微米）(E) KTDP处理的幼鱼尾BODIPY-C12荧光定量分析（平均值±标准误均值，n=6）。(F) 幼鱼肝脏肝细胞内尼罗红染色脂滴计数显示KTDP无影响。(G) 喂食脂质体（空脂质体、含KTDP脂质体、含KTDP-突变体质粒）的幼鱼被对半切开。将头部（包含肝脏、肠道等内脏器官）和尾部（脉管系统）区域分离并合并用于脂质测定。每30个幼鱼头和30个尾合并为一个重复样本。每种脂质体处理条件均设置三个重复样本。因此，不同重复和处理条件下共使用30×3×3（=270）个幼鱼头和270个幼鱼尾。(H) 合并幼鱼尾分泌甘油三酯（TG）的液相色谱-质谱（LC-MS）分析。插图：显示检测到的TG种类总和。误差为误差传递结果。KTDP喂食的幼鱼中分泌TG总体显著降低。方框插图：使用TG检测试剂盒也观察到类似的降低趋势。数据以喂食空脂质体的幼鱼TG值为基准进行归一化。蓝色虚线代表未处理幼鱼（无脂质体；无KTDP）的TG测定值。误差棒为标准误均值。(I) 合并幼鱼尾分泌胆固醇的液相色谱-质谱（LC-MS）分析。插图：所有检测到的胆固醇酯种类总和。误差为误差传递结果。KTDP喂食的幼鱼中分泌胆固醇总体降低超过50%。方框插图：使用胆固醇检测试剂盒在尾部也观察到类似的降低趋势。数据以喂食空脂质体的幼鱼胆固醇值为基准进行归一化。蓝色虚线代表未处理幼鱼（无脂质体；无KTDP）的胆固醇测定值。误差棒为标准误均值。(J) TG检测试剂盒测定显示KTDP对幼鱼头部（含内脏器官）的TG含量无影响。误差棒为标准误均值。(K) 胆固醇检测试剂盒测定显示KTDP对幼鱼头部胆固醇无影响。误差棒为标准误均值。(L) 液相色谱-质谱（LC-MS）分析显示KTDP对幼鱼尾部（脉管系统）游离胆固醇无影响。误差棒为标准误均值。

KTDP 喂食后幼鱼的脂质降低时间进程、表型、死亡率和运动能力 KTDP 的降脂效应能持续多久？在此期间之外是否存在不良副作用？为探究这一问题，我们用空脂质体、填充 KTDP 的脂质体或填充 KTDP 突变体的脂质体喂食 6 天龄（dpf）的幼鱼。在脂质体给药后 6、12、24、48 和 120 小时固定幼鱼，随后用尼罗红染色以对中性脂质进行成像。我们未使用 BODIPY-C12 标记的脂质体，因为该染料会被代谢，且在 12 小时后便无法被观测到。补充信息附录图 S5A 展示了染色结果，补充信息附录图 S5B 则量化了不同时间点尼罗红荧光的变化。与喂食空脂质体或 KTDP 突变体脂质体的幼鱼相比，喂食 KTDP 脂质体的幼鱼尾（脉管系统）在 6 小时和 12 小时时脂质含量显著降低，随后脂质含量恢复至基线水平（补充信息附录图 S5B）。

与喂食空载体或KTDP突变体的斑马鱼幼虫相比，喂食KTDP的幼虫在喂食后48小时内未出现可观察到的畸形或异常（补充信息附录，图S6A）。在喂食KTDP后的120小时内，各实验组幼虫的死亡率无显著差异（补充信息附录，图S6B）。为探究KTDP对幼虫运动是否存在潜在长期影响，我们在幼虫喂食KTDP后的120小时，用移液枪尖端在培养皿中心对其进行刺激，随后统计幼虫在刺激后首次停止的位置所处的同心区域（补充信息附录，图S6C）。结果显示，不同实验条件下幼虫首次停止的区域无显著差异（补充信息附录，图S6D）。我们还在喂食KTDP后的120小时对自由游动的幼虫进行成像，并对其6分钟内的运动轨迹进行追踪（补充信息附录，图S6E）。轨迹分析表明，不同条件下幼虫的总游动距离（补充信息附录，图S6F）以及运动过程中的角速度（补充信息附录，图S6G）均无差异。综上，未观察到KTDP对斑马鱼幼虫的表型、死亡率和运动能力存在明显影响。

口服KTDP给成年斑马鱼：对血清和肝脏脂质的影响。因为口服是药物输送的首选方法，我们试图通过口服管饲将含有KTDP的鸡蛋脂质体输送给成年（1岁）斑马鱼。向斑马鱼输送传染性病原体的管饲程序被调整为输送包装在鸡蛋脂质体中的KTDP（每条鱼5μL脂质体；见材料和方法）。标有BODIPY-C12（空对照，或装载KTDP）的鸡蛋脂质体通过管饲连续三天，KTDP浓度为250µg/mL，与幼体研究中使用的剂量相同。表现出出血、痛苦或异常行为的鱼被排除在进一步的实验之外。根据机构规定，鱼在最终给药后4小时被安乐死指导原则。将尾部（脉管系统）解剖分离并离心，以收集血液和血清。同时解剖肝脏和前肠组织，用于成像和生化研究。

图5A展示了经空脂质体灌胃的成年鱼解剖出的肠道和肝脏组织。这些组织中的BODIPY信号证实，卵脂质体通过口服途径被递送至肠道和肝脏。图5B展示了含有GFP-KTDP的脂质体对应的组织，其中GFP荧光表明KTDP被递送至这些组织。与空脂质体组相比，图5C和图5D显示KTDP可降低成年鱼血清中的甘油三酯和胆固醇水平。这些图表中的每个数据点均对应一条成年鱼。图5E和图5F证实，KTDP不会导致成年斑马鱼肝脏中甘油三酯或胆固醇异常积累，这与细胞培养（图3）和幼鱼（图4）中的类似观察结果一致。我们发现，未处理（对照组）、喂食KTDP和喂食KTDP突变体的成年斑马鱼血清中AST/ALT比值无显著差异，表明KTDP对斑马鱼无肝毒性（补充信息附录，图S6H）。

KTD 与膜结合后的结构变化。如上所述，KTDP 可将内源性驱动蛋白-1 从脂滴上移除，从而减少细胞中甘油三酯/胆固醇的分泌。因此，我们探究了 KTD 与膜相互作用的结构层面。尽管目前尚无晶体结构，但早期分析表明，KTD 中存在大量卷曲螺旋结构，该结构终止于 KTD 的第 900-910 位氨基酸之间。通过 I-TASSER 进行的建模（材料与方法）预测，KTD 包含两个 N 端螺旋（NH1 和 NH2）以及一个 C 端内在无序区（C-IDR），如图 1B 和图 1C 所示。KTD 的螺旋区（第 854-913 位氨基酸）高度保守，因此可能具有功能相关性。利用 Heliquest 对该区域进行的螺旋轮分析显示，疏水性和亲水性氨基酸分别在两侧聚集（SI 附录，图 S1A，右侧）。由此推测，KTD 的一个保守功能是通过在膜上形成两亲性螺旋，将驱动蛋白-1 招募至脂滴上。值得注意的是，KTD 的 NH2 结构域还包含一段富含带正电残基的序列（第 901-909 位氨基酸），该序列被认为可与膜上带负电的磷脂酸结合（图 1B 及 SI 附录，图 S1A）。

基于这些信息，我们开展了KTDP与含磷脂酸（PA）的单层及双层膜结合的分子动力学（MD）模拟（材料与方法）。借鉴前期研究，我们构建了一种单层模型，该模型在由1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸（DOPA；磷脂酸）以95:5比例组成的磷脂双小叶之间，嵌入了一层3纳米厚的TG层（图5G）。双层模型则采用了相同的磷脂组成（图5G）。单层和双层膜磷脂小叶的俯视图见SI附录图S7A。与前期研究结果一致，单层膜表面暴露的TG分子可能导致了堆积缺陷，这也体现在单层膜更高的每个脂质占比面积（APL）上（SI附录图S7B）。将KTDP置于上小叶附近，生成1.25微秒的MD轨迹，以探究KTDP与单层及双层体系的相互作用。KTDP与单层、双层体系相互作用的动态过程见视频S1和S2。

平均而言，在单分子层存在的情况下，KTDP 的高阶二级结构（SS）含量更高（图5H）。螺旋区域的畸变加剧证实了单分子层的结构柔性（SI附录，图S7C）。单分子层上螺旋含量的损失被β折叠和转角的出现所抵消（图5H）。KTDP 的主链均方根偏差（rmsd）有所增加双层结构表明，与单分子层相比，KTDP 与双层结构的相互作用具有更大的波动和瞬时性（SI 附录，图 S7D）。我们接下来计算了脂质占有率（((O_{i j}))），即 KTDP 的第 j 个氨基酸残基与索引为 i 的脂质（i = DOPC 或 DOPA）接触的时间占比。图 5I 展示了单分子层和双层结构系统中脂质占有率的差异随 (j :)、 [Delta<O>_{j}=<O>_{j}^{Monolayer }-<O>_{j}^{Bilayer } .]  的变化情况。此处 (<O>_{j}) 为 KTDP 的 (jth) 残基在 DOPC-DOPA 体系中的平均占有率（材料与方法）。仅报告占有率为 (>5%) 的残基。数值 (Delta<O>_{j}) 为正（负）表示对单分子层（双分子层）的亲和力更高(jth) 残基的膜。单分子层偏好残基的 (Delta<O>_{j}) 平均值约为 23%，双分子层偏好残基的该值约为 11%。因此，总体而言，单分子层体系中 KTDP 与膜的相互作用更强。我们将脂质分数定义为 (L_{f}=frac{1}{N} ×L_{n})，其中 N 是在 0.7 纳米的截止距离内与 (dot{L}_{n}) 脂质（DOPC 或 DOPA 或 TG）相互作用的 KTDP 残基数量。概率分布 (P(L_{f})) 表明，单分子层偏好残基与脂质的相互作用比双分子层偏好残基更强（图 5J）。仅考虑非零的脂质占据值，约 68% 与 TG 相互作用的 KTDP 残基同时也被 DOPC/DOPA 高度占据（支持信息附录，图 S7E），这凸显了 TG 在单分子层中调控脂质与 KTDP 相互作用的作用。总之，交错排列的 TG 分子的存在提高了脂质的平均分子面积（APL）。单层膜以产生表面缺陷。结构较不致密的膜会发生相互作用，导致 SS 增加以及 KTDP 与单层膜的结合。

图5. KTDP对成年斑马鱼的降脂作用及KTDP-膜相互作用的分子动力学模拟。(A) 从1岁斑马鱼体内解剖出的肠道（小肠）和肝脏的共聚焦图像。通过灌胃法，用空卵脂质体（不含肽）对斑马鱼投喂3天。脂质体用微量BODIPY-C12标记以实现可视化。(B) 与A处理方式相同，但使用含GFP-KTDP的脂质体。与BODIPY共定位的GFP信号表明，该肽完整递送至斑马鱼的肠道和肝脏组织。(C) 从经空脂质体或含KTDP脂质体处理的成年斑马鱼尾部（脉管系统）采集的血液（血清）中甘油三酯（TG）含量。使用商用TG检测试剂盒进行测定，每个数据点代表一条斑马鱼，误差棒为均值标准误（SEM）。(D) 从经空脂质体或含KTDP脂质体处理的成年斑马鱼尾部（脉管系统）采集的血液中胆固醇含量。使用商用TG检测试剂盒进行测定，每个数据点代表一条斑马鱼，误差棒为SEM。(E) 经空脂质体或含KTDP脂质体处理的成年斑马鱼解剖肝脏中的TG含量。使用商用TG检测试剂盒进行测定，每个数据点代表一条斑马鱼，误差棒为SEM。(F) 经空脂质体或含KTDP脂质体处理的成年斑马鱼解剖肝脏中的胆固醇含量。使用商用胆固醇检测试剂盒进行测定，每个数据点代表一条斑马鱼，误差棒为SEM。(G) 分子动力学模拟中KTDP-单分子层和KTDP-双分子层构象的示意图。展示了上下小叶（半透明橙色）、磷原子（橙色球）、TG（紫色）以及KTDP的二级结构（品红色螺旋、黄色转角、绿色β折叠），并标注了平均膜厚度（单位：纳米）。(H) 单分子层和双分子层体系中KTDP的平均二级结构含量。(I) 单分子层与双分子层体系中KTDP残基的脂质占据率差异（((Delta<0>_{j}))）（见正文）。Y轴数值表示给定残基在磷脂（DOPC或DOPA）附近停留的时间占整个模拟时间的百分比（以百分数表示），该计算未区分DOPC或DOPA的头部基团与尾部，并标注了KTDP中与膜结合相关的特定区域。(J) KTDP残基在单分子层和双分子层周围的((L))概率分布（见正文）。

讨论

血浆脂质升高与糖尿病、心血管疾病及代谢综合征相关。降低致动脉粥样硬化性血浆脂蛋白是对抗这些疾病最被广泛认可的策略。贝特类药物、ω-3多不饱和脂肪酸（PUFAs）和烟酸被用于治疗高脂血症，但其不良反应已广为人知。贝特类药物可激活过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα），这是一种调控线粒体脂肪酸氧化中众多基因的转录因子。多不饱和脂肪酸能下调SREBP-1c转录因子并激活PPARα，同时还能刺激脂蛋白脂酶（LPL）介导的脂肪分解以及载脂蛋白B的降解，从而提高极低密度脂蛋白（VLDL）的清除效率。烟酸可抑制脂肪组织的脂肪分解，抑制二酰基甘油酰基转移酶2（DGAT2），并降低载脂蛋白C-Ⅲ的表达，以加快富含甘油三酯（TG）脂蛋白的清除。然而，烟酸也会引发肝损伤和胃肠道问题。他汀类药物能有效降低胆固醇（在一定程度上也能降低甘油三酯），但患者仍存在较高的心血管疾病风险，需要联合治疗。洛美他派是微粒体甘油三酯转移蛋白抑制剂，可减少甘油三酯向极低密度脂蛋白和乳糜微粒的同化，但也会导致肝脂肪变性。脂肪酶抑制剂已问世数十年，奥利司他是该类别中唯一获批的药物。奥利司他仅能使总胆固醇和脂蛋白得到小幅改善。综上，大多数降脂疗法通过多种已知/未知的细胞途径发挥作用，且疗效有限。因此，联合治疗往往是必要的，这也会放大其不良反应。这一情况凸显了开发高脂血症替代治疗策略的必要性。

我们近年来发现了驱动蛋白依赖的脂滴递送参与极低密度脂蛋白组装的机制，因此该机制从未被针对高脂血症展开过研究。一种肽类能够从脂滴单层膜上移除内源性蛋白，同时对双层囊泡造成最小干扰，这一概念性突破可用于靶向其他脂滴相关蛋白。特别是，其他通过两亲性螺旋与脂滴结合的胞质脂滴相关蛋白也可成为靶向对象。驱动蛋白介导的脂滴转运参与甘油三酯和胆固醇向极低密度脂蛋白组装的过程，已在人肝癌细胞、小鼠原代肝细胞及大鼠肝脏内得到证实。本研究表明，KTDP 可通过卵脂递送至斑马鱼幼鱼和成鱼肝脏，显著降低血清甘油三酯和胆固醇水平（图4和图5）。KTDP 是内源性驱动蛋白-1的组成部分，因此即使剂量较高，该肽也不太可能引发不良免疫反应。与会导致脂肪肝的微粒体甘油三酯转移蛋白抑制剂洛美他派不同，KTDP 不会使 McA-RH7777 细胞和斑马鱼肝脏内的脂滴增多。KTDP 对脂滴生成无影响，因为细胞内保留的甘油三酯含量未发生变化（图3C及补充信息附录图S2-B1）。线粒体，以及通过线粒体脂质利用实现的脂质滴（LD）的后续清除。KTDP 的这一作用得到了以下证据支持：耗氧量增加（SI 附录，图 S2C）、脂质滴与线粒体之间的脂质转运增加（SI 附录，图 S3A），以及在表达 KTDP 的细胞经依托莫司治疗后脂质滴积累增加（SI 附录，图 S3D）。KTDP 重新引导脂质滴内容物被线粒体摄取，这很可能阻止了肝细胞中的脂质积累。KTDP 的这种作用在斑马鱼模型中似乎同样有效，在该模型中，KTDP 不会导致肝脏出现脂质积累（图 4 D-F）。进一步令人放心的是，喂食 KTDP 后，斑马鱼在相当长的一段时间内均未出现发育、表型或运动方面的缺陷（SI 附录，图 S6）。

细胞内未与货物结合的Kinesin-1可能以折叠状态存在，此时KTD会与驱动蛋白的马达结构域结合并阻断其ATP酶活性。因此，KTD肽在体外也能阻断驱动蛋白的ATP酶活性。本实验中过表达的GFP-KTDP约占细胞总蛋白含量的1%（补充信息附录，图S1C）。即便浓度如此之高，KTDP为何对双层膜细胞器没有影响？已有研究巧妙证实，KLC作为激活因子可阻止KTD抑制驱动蛋白。因此，KLC介导的驱动蛋白在双层膜细胞器上的激活可能使其对KTDP不敏感。由于KLC过表达对脂滴分布无影响（图1E），可见KLC似乎与驱动蛋白在脂滴上的功能无关。此外，在进食状态下，肝脏脂滴上的磷脂酶D1活性会显著增强磷脂酸（PA）的生成，进而驱动Kinesin-1介导的脂滴向内质网平滑面剧烈运动。当KTDP的PA结合结构域中的带电残基发生突变时，KTDP无法结合脂滴。由此可见，PA是KTD/Kinesin-1结合脂滴的关键。肝脏脂滴上通过磷脂酶D1活性生成的PA，可能是KTD结合并激活脂滴上驱动蛋白的信号。而双层膜细胞器上可能不存在此类信号，它们通过其他机制（如KLC）招募并激活Kinesin-1，因此几乎不受KTDP过表达的影响。

一个10个氨基酸的PA结合区域内的突变（图1B）会使KTDP无法有效阻断脂滴运输和脂质分泌（图3和图4）。由于KTD的这一10个氨基酸区域是脂滴结合的关键区域，该区域附近的短肽也可能有效减少脂质分泌。我们改造了卵脂质体系统，用于向斑马鱼肝脏递送KTDP（带有额外的绿色荧光蛋白标签）。递送的KTDP具有功能，因为它能非常有效地降低这些斑马鱼体内的脂质含量。KTDP也可能通过摄入脂质体被递送至肠道。因此，约50%的整体脂质减少可能源于肝脏（以极低密度脂蛋白形式）和肠道（以乳糜微粒形式）的甘油三酯/胆固醇酯分泌减少。KTDP对乳糜微粒组装所需甘油三酯/胆固醇酯供应的影响（如果存在）仍有待探究。令人鼓舞的是，已有研究证明利用工程化脂质体向肝脏靶向递送胰岛素（41）。工程化脂质体可进一步增强KTDP的递送效果，且可在啮齿类动物和灵长类动物中进行测试。模拟KTDP的小分子也可实现这一目的。

总而言之，我们此前已证实，驱动蛋白-1会在肝细胞中递送脂滴（LDs）以组装极低密度脂蛋白（VLDL）颗粒。我们推测，驱动蛋白-1或许可通过KTD结构域结合脂滴，却通过其他结构域与双层囊泡结合。因此，利用KTDP作为竞争性抑制剂，有可能从脂滴上选择性地去除驱动蛋白-1（图1A）。实际上，将KTDP递送至肝癌细胞后，脂滴的转运受到了抑制；用该肽处理的斑马鱼幼虫，其血浆甘油三酯（TG）和胆固醇水平显著降低了约50%。鉴于卵脂质体递送系统可将KTDP递送至斑马鱼肝脏，我们认为这表明KTDP及其拟肽小分子是极具研究价值的探索方向。我们的研究成果不仅限于KTDP及其对脂质分泌的影响。内源性蛋白能否从脂滴中选择性去除以调控代谢（或其他）过程，这一可能性此前从未被探索过，而针对脂质代谢/脂滴生物学的其他通路，这一思路或许能带来潜在的应用价值。