题目：Zebrafish Model in Ophthalmology to Study Disease Mechanism and Drug Discovery

原文链接:https://www.mdpi.com/1424-8247/14/8/716

期刊:Pharmaceuticals

摘要 

视力受损和失明是全球范围内的常见疾病，严重影响人们的工作与生活质量。因此，眼部疾病的有效治疗方法研究具有极高的优先级。斑马鱼（斑马拟丽鱼）是一种极具价值的脊椎动物替代模型，可作为研究白内障、青光眼、糖尿病性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、光感受器变性等多种眼部疾病的致病机制及药物研发的有效工具。斑马鱼的遗传操作与胚胎发育可及性，结合其视觉功能的行为学评估，使其成为眼科学领域备受青睐的模型。斑马鱼也被广泛应用于眼部药物研发，包括新型抗血管生成化合物或神经保护药物的筛选，以及眼毒性测试。本综述总结了斑马鱼作为眼部疾病模型在研究疾病机制及探索新型药物治疗方案方面的应用。

关键词：斑马鱼；眼睛；疾病模型；机制；候选药物

引言

截至2020年，全球估计有2.95亿人患有中度至重度视力障碍，其中约4330万人甚至失明。全球致盲的主要原因是白内障，其次是青光眼、年龄相关性黄斑变性（AMD）和糖尿病视网膜病变（DR）。视力障碍是全球公共卫生领域的一大重点问题。深入了解眼部疾病的病理机制对于开发新的治疗方法至关重要。同样，能够精准模拟眼部病理特征并支持中等通量药物筛选的现有动物模型也备受需求。因此，生理特征与人类相似的模式生物，对于理解发育过程、确定人类眼部疾病的潜在致病基因和致病因素，以及研发新型药物治疗方案具有关键意义。

斑马鱼（Danio rerio）是一种原产于印度的常见观赏鱼，现已成为研究疾病的重要脊椎动物模型。斑马鱼在系统发育上与人类的距离比啮齿动物更远，但其拥有82%的人类疾病相关基因同源物。此外，斑马鱼的世代周期短，仅为2-4个月，繁殖能力强，一对亲鱼每周可产生约200尾后代，且易于低成本饲养。重要的是，透明的斑马鱼胚胎在体外发育，这使得早期器官发生过程的可视化成为可能。斑马鱼的体型整体较小，但眼睛相对较大，这使其能够在胚胎发育早期进行眼芽操作。因此，斑马鱼基因和胚胎的易获取性，以及其眼睛与人类眼睛的相似性，使其成为研究多种眼部疾病、阐明其发病机制并探索新疗法的主要模型。

在本综述中，我们重点阐述了斑马鱼在眼部疾病建模中的应用，具体包括：（i）介绍斑马鱼眼睛的特征性解剖结构与发育过程；（ii）总结眼部疾病的斑马鱼模型，如角膜营养不良、白内障、青光眼、眼血管疾病、光感受器变性，以及（iii）阐述这些模型在眼部疾病候选新药研发研究中的贡献。

斑马鱼眼睛的解剖结构与发育

尽管斑马鱼的眼睛与人类的相比非常小，但它们几乎拥有人类眼睛的所有基本结构。首先，我们重点研究斑马鱼眼睛的解剖结构和发育情况，以解释为何斑马鱼是研究人类眼部疾病的理想模型。

斑马鱼眼睛的解剖结构

角膜

斑马鱼和人类的角膜均包含五个主要层次：上皮层、鲍曼层、基质层、德斯cemet膜和内皮层。在成熟状态下，斑马鱼角膜上皮层厚度为12.5微米，由四至六层细胞构成。基质层厚度约为6微米，包含34至40层。内皮层、鲍曼层和德斯cemet膜均发育良好。斑马鱼角膜上皮层或基质层中高度富集的多种多肽是角膜分化的优良标志物。尽管存在这些相似之处，斑马鱼的眼表与人类却存在显著差异，例如斑马鱼角膜缺乏神经纤维、基质层更薄，且存在杆状细胞。

虹膜角膜角

虹膜角膜角是角膜与虹膜相接的区域，这里分布着专门用于维持眼内压（IOP）的细胞。眼内压通过房水的生成和引流达到平衡。尽管斑马鱼的睫状上皮不存在皱褶和突起，但其仍能生成房水。 servo-null 电生理技术可按以下方法测量麻醉成年斑马鱼的眼内压：当拉制玻璃微电极穿透角膜进入前房时，即可记录到压力传导信号。虽然斑马鱼的小梁网和房水动力学与人类存在显著差异，但二者平均眼内压和房水流出组织结构的整体相似性，使斑马鱼成为研究人类青光眼复杂遗传机制的优质模型。

晶状体

斑马鱼的眼睛中几乎可以观察到人类晶状体的所有形态学特征[9]。斑马鱼的晶状体比人类的晶状体更呈球形，由覆盖在细长纤维细胞上的外层上皮细胞构成。大多数晶状体上皮细胞处于静止状态，唯有环绕边缘赤道的一圈细胞除外，这些细胞最终会增殖并分化为纤维细胞。晶状体纤维细胞的分化发生在过渡区，在此区域，伸长的纤维细胞会失去内部细胞器，从而提升晶状体的透明度。人类和斑马鱼的晶状体中均存在三种晶状体蛋白：α、β和γ型。斑马鱼晶状体与人类晶状体的相似性，使其成为通过活体胚胎成像技术研究活体动物晶状体蛋白的理想模型。

视觉系统

斑马鱼在受精后72小时（hpf）便具有视觉反应能力，此时其视网膜的形态和功能与成体人类视网膜一致。斑马鱼视网膜由外核层（ONL）、外网层（OPL）、内核层（INL）、内网层（IPL）和神经节细胞层（GCL）构成。它也拥有与人类相同的大类视网膜神经元，如视网膜神经节细胞（RGC）、双极细胞、水平细胞和无长突细胞，以及相同的胶质细胞成分，包括米勒细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞（图1）。此外，斑马鱼视网膜富含视锥细胞，与人类黄斑结构相似，这使其具备良好的色觉和高敏度视觉。同时，斑马鱼拥有四种视锥细胞：蓝色（sws2）、紫外（sws1）、绿色（rh2）和红色（lws），其中绿色和红色视锥细胞以物理融合的双锥细胞形式存在。光感受器产生的视觉信号通过整个视网膜传递到神经节细胞，随后再传递到大脑。

图1. 人类与斑马鱼视网膜的横截面视图，显示出视网膜各层具有相似的结构特征。

斑马鱼的视敏度通常通过行为学测试进行测量，包括视动反射和视运动反射。视动反射是一种稳定的行为，移动的物体会引发眼球追踪运动。由于其可靠性以及即使在固定幼体中也能表现出良好的反应，该行为是研究最广泛的行为之一。此外，视运动反射是斑马鱼幼体的一种稳定视觉反应，由红/绿色视锥细胞通路介导。当受到全视野移动刺激时，斑马鱼会转向并朝着感知到的运动方向游动。幼体既可以在自由游动时完成该行为，也可以将头部嵌入琼脂中固定后完成。

脉管系统

发育中斑马鱼胚胎的基础血管生物学与其他脊椎动物相似，血管生成在斑马鱼玻璃体血管中也发挥着至关重要的作用，而斑马鱼玻璃体血管的发育过程与哺乳动物胚胎视网膜血管的发育类似。斑马鱼视网膜初级血管由视网膜中央动脉在受精后24至29小时通过血管生成分支形成。眼动脉以腹侧方向通过视裂进入眼球，并形成玻璃体袢，该结构随后作为玻璃体血管从脉络膜裂穿出。在穿过脉络膜裂后，该动脉系统会在受精后5天内于晶状体表面形成血管网络。到受精后30天，玻璃体血管会不断分支并贴附在幼鱼视网膜的内界膜上，这与人类视网膜血管的退化过程形成了鲜明对比。敲低一些编码血管生成关键蛋白的基因（如cldnh），会导致玻璃体血管的管腔形成过程中断（图2）。近年来，针对血管特异性基因的原位杂交技术、基于染料注射的血管可视化技术，以及对斑马鱼胚胎血管系统的功能操控技术等新型成像手段的出现，使斑马鱼成为研究人类眼部血管疾病的极具价值的模型。此外，越来越多能在血管系统中表达荧光报告蛋白的转基因品系也应运而生，为血管疾病的研究提供了有力工具，例如Tg(fli1:EGFP)品系，该品系在(fli1)调控序列的控制下表达EGFP。

图2. 5天龄斑马鱼玻璃体血管的管腔形成分析。与错配吗啉寡聚核苷酸注射组或cldnh mRNA回补组的斑马鱼相比，注射cldnh吗啉寡聚核苷酸的斑马鱼其玻璃体血管出现更严重的充盈缺损（非灌注区域更多），表明cldnh敲低组斑马鱼的玻璃体血管存在管腔形成缺陷。比例尺：50微米。

斑马鱼眼睛的发育

斑马鱼眼睛的发育与人类及其他脊椎动物高度相似。二者均由三个不同的胚胎层发育而来：表面外胚层形成晶状体，随后形成角膜上皮；神经外胚层形成神经视网膜、视网膜色素上皮（RPE）、视柄和睫状体；神经嵴细胞起源的间充质形成角膜内皮和基质、虹膜基质、脉管系统以及巩膜。本文根据文献中的相关研究绘制了一张斑马鱼眼睛发育的示意图（图3）。

图3 斑马鱼眼睛发育示意图。16小时胚胎（hpf）时，中央视区分裂形成视泡和晶状体基板（A）。20小时胚胎（hpf）时，视泡远端内陷，形成由内外神经外胚层构成的双壁杯状结构（B）。视杯沿周向生长。22小时胚胎（hpf）时，表面外胚层细胞逐步分层，晶状体基板形成实心晶状体团（C）。28小时胚胎（hpf）时，视杯内层分化为神经视网膜，外层分化为视网膜色素上皮（RPE）（D）。最终，晶状体基板中央细胞移至晶状体团后部，形成初级晶状体纤维细胞（紫色）；周边晶状体基板细胞迁移至晶状体团前部，形成前上皮（橙色）；晶状体团形成后，晶状体基板与表面外胚层分离并闭合，角膜（黄色）随之发育。

斑马鱼眼睛的发育速度相当快。神经发生始于28小时胚胎期，斑马鱼胚胎早在72小时胚胎期就具备视觉功能。视泡最终分化为神经视网膜和视网膜色素上皮的视泡，在受精后约12小时从前脑向外突出，并通过一种名为视柄的暂时性结构与前脑保持连接。经过一系列形态发生事件，视泡在受精后16至20小时形成视杯，到24小时腹侧形成视裂，随后在48小时闭合。晶状体基板于受精后16小时从覆盖于视杯上方的表面外胚层细胞分层形成，约在24小时形成实心的晶状体团块，并在28小时通过中间细胞的凋亡完全与表面外胚层分离。受精后30小时，未形成晶状体的表面外胚层开始获得角膜上皮特性，并在30至36小时从视杯周边区域迁移入角膜，形成迁移性眼周间充质细胞。

最终分化为神经视网膜和视网膜色素上皮的视泡，在受精后约12小时从前脑向外突出，并通过一种名为视柄的暂时性结构与前脑保持连接。经过一系列形态发生事件，视泡在受精后16至20小时形成视杯，到24小时腹侧形成视裂，随后在48小时闭合。晶状体基板于受精后16小时从覆盖于视杯上方的表面外胚层细胞分层形成，约在24小时形成实心的晶状体团块，并在28小时通过中间细胞的凋亡完全与表面外胚层分离。受精后30小时，未形成晶状体的表面外胚层开始获得角膜上皮特性，并在30至36小时从视杯周边区域迁移入角膜，形成迁移性眼周间充质细胞。

斑马鱼作为研究眼部疾病机制的模型

得益于斑马鱼的基因可及性、与人类眼部发育相似的特征以及其生存环境的易调控性，斑马鱼已成为研究眼部疾病的热门模式生物。在过去数十年中，许多人类眼部疾病，如白内障、青光眼、糖尿病视网膜病变（DR）和年龄相关性黄斑变性（AMD），均已在斑马鱼中建立了疾病模型。本文简要介绍了从眼前段到眼后段的几种重要斑马鱼眼部疾病模型。

角膜营养不良

角膜营养不良的发病年龄不一、遗传方式多样，且会对角膜透明度和视力造成进行性损害。由于斑马鱼角膜基质更薄且存在杆状细胞，其很少被用于研究正常或病理性人类角膜。与此同时，得益于斑马鱼良好的遗传可操作性，它被用于研究那些突变会引发角膜营养不良的基因功能。一些导致人类角膜营养不良的基因，如pip5k3、col17a1和keratocan，也会在斑马鱼角膜中表达。其中pip5k3和col17a1具有高度保守性且不会引发眼部异常，而keratocan对角膜的透明度和结构至关重要。同样，编码重要基底膜蛋白的lama1基因缺失会导致斑马鱼出现局灶性角膜发育异常。总体而言，可能由于斑马鱼与人类角膜存在某些结构差异，上述基因中仅有四种被报道用于斑马鱼模型的角膜营养不良研究，这一数量与小鼠模型相比少之又少。因此，利用斑马鱼研究人类角膜疾病时需格外谨慎。

白内障

白内障以晶状体混浊导致视力模糊为特征，主要分为先天性白内障和年龄相关性白内障（ARC）。遗传学研究已发现30余种导致先天性或其他早发型白内障的致病突变基因，而与年龄相关性白内障相关的基因变异则仅有少数。然而，仍有许多白内障病例的致病基因尚未明确。在斑马鱼胚胎中敲低人类白内障致病基因后，往往会出现白内障或其他晶状体异常（表1）。因此，斑马鱼是揭示白内障形成特定机制的极具潜力的动物模型。斑马鱼白内障模型的应用主要集中于先天性白内障。在已知的致白内障基因突变中，晶状体晶体蛋白基因突变占多数，其次是各类生长因子、转录因子、连接蛋白、膜蛋白及脂质代谢相关基因的突变。因此，晶体蛋白在白内障形成中的作用机制得到了深入研究。近期，科研人员借助斑马鱼模型明确了某一致白内障基因的功能。作为α-晶体蛋白家族成员的CRYAB基因发生突变，会通过激活糖皮质激素受体信号通路引发先天性白内障。无独有偶，斑马鱼中的cloche突变体表现出白内障症状，这与γ-晶体蛋白的不溶性及晶状体纤维细胞分化异常相关。同时，在cloche突变体中过表达αA-晶体蛋白可逆转白内障表型。因此，cloche 突变可用于研究晶状体晶体蛋白的聚集并预防白内障。此外，作为在发育中的神经系统和眼睛内表达的配对盒和同源盒结构域蛋白的 Pax6 过度表达，会导致晶状体纤维细胞缺陷和人类先天性白内障。斑马鱼中的 Pax6 突变体表现出眼睛大小改变和晶状体分化异常。Pitx3 和 Foxe3 基因的突变可导致人类眼前段间质发育不全和白内障，而通过反义吗啉代在斑马鱼中敲低 Pitx3 和 Foxe3 会导致晶状体形态发育异常。有趣的是，作为热休克转录因子家族成员的 Hsf4 突变，会通过阻断晶状体纤维细胞的终末分化，导致人类单纯性白内障，以及斑马鱼晶状体早发性白内障并伴随多种发育缺陷。

ARC 还存在遗传成分，这使得携带该变异的个体更容易受到环境损伤和衰老的影响。由于极老龄斑马鱼（甚至2.5岁的斑马鱼）的晶状体完全不浑浊，因此斑马鱼并非构建 ARC 模型的主要模式生物。不过，斑马鱼是研究晶状体蛋白相关 ARC 机制的绝佳工具。α-晶状体蛋白的分子伴侣能力被认为会因受损晶状体蛋白的结合以及小分子热休克蛋白的截短和不溶而被耗尽；因此，斑马鱼被用于建立α-晶状体蛋白分子伴侣的体外机制模型与其在晶状体衰老中作用之间的关联。此外，CRYGC 基因（γC-晶状体蛋白）发生突变会导致γC-晶状体蛋白的热稳定性显著下降，在受热和紫外线照射胁迫时会增加晶状体混浊的风险，最终引发白内障。

表1.先天性白内障斑马鱼模型的基因突变

青光眼

青光眼是一种以视网膜神经节细胞（RGC）丢失继发进行性、不可逆的视野缺损和视力损害为特征的视神经病变。无明确器质性病因的原发性开角型青光眼（POAG）占青光眼病例的75%至90%，其存在视网膜神经节细胞丢失这一特征，也是其他青光眼表型的共同标志。青光眼还被分为其他类型，包括原发性闭角型青光眼（POCG）、发育性青光眼、色素性青光眼、类固醇性青光眼等。

斑马鱼为验证与青光眼相关的特定假说提供了绝佳机会。例如，研究人员利用斑马鱼证实，SIX6基因变异会干扰神经视网膜的发育，导致视网膜神经节细胞数量减少，并增加青光眼相关视力损伤的风险。又如，斑马鱼被用于研究FOXC1基因的功能，该基因是与原发性开角型青光眼相关的少数已被充分证实的基因之一。转录因子FOXC1被发现是应对氧化压力的关键介质，能够抑制房水动力学相关细胞的凋亡。此外，凸眼突变体表现出高眼内压、眼球增大、形态异常和视网膜功能缺陷等特征，已被确定为近视和青光眼的研究模型[。近年来，研究人员已基于人类青光眼构建了多种斑马鱼青光眼模型（表2）。然而，上述所有突变均与原发性闭角型青光眼无关，这可能是因为原发性闭角型青光眼是一种复杂的异质性疾病，无法通过单基因突变来构建模型。

青光眼疾病中以视网膜神经节细胞（RGC）死亡为表现的神经退行性病变已有充分文献记载。化学或氧化应激诱导的视网膜损伤与RGC损伤相关，该机制也被应用于斑马鱼研究。例如，N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）作为L-谷氨酸的类似物，是哺乳动物中枢神经系统中的兴奋性神经递质，可诱导细胞兴奋性毒性和RGC丢失，进而引发青光眼及视网膜神经退行性病变。然而，NMDA诱导的神经毒性模型仅聚焦于青光眼病理过程中谷氨酸兴奋性毒性这单一机制。由于人类青光眼的发病机制更为复杂，该模型可能无法全面阐释疾病进程，但NMDA注射仍是正常眼压性青光眼研究中可行的选择。此外，氧化损伤在青光眼发病中也发挥着关键作用，其与促氧化和抗氧化能力之间的失衡密切相关。因此，研究人员通过在5天龄（dpf）斑马鱼幼虫玻璃体内注射过氧化氢来构建青光眼模型。不过，利用斑马鱼研究青光眼的一个主要缺陷是其视网膜细胞（包括神经节细胞层，GCL）具有显著的再生能力。综上，斑马鱼青光眼模型主要用于研究与基因突变相关的原发性开角型青光眼（POAG）以及RGC损伤机制。

表2.青光眼的斑马鱼模型

血管疾病

病理性视网膜血管生成是导致各年龄段不可逆视力损伤的重要原因，例如早产儿视网膜病变（ROP）、糖尿病视网膜病变（DR）以及年龄相关性黄斑变性（AMD）。鉴于斑马鱼与人类的血管系统存在显著相似性，斑马鱼胚胎已被用于筛选病理性视网膜血管生成相关的基因及作用机制。

糖尿病性视网膜病变

糖尿病视网膜病变（DR）导致失明的粗患病率在2020年呈现全球年龄标准化患病率上升的趋势。糖尿病视网膜病变是糖尿病常见的微血管并发症，表现为视网膜血管受损导致视力下降甚至失明。小鼠模型、大鼠模型等动物模型已被用于研究糖尿病视网膜病变的发病机制并开发新型药物。由于斑马鱼视网膜血管病变和葡萄糖代谢与人类相似，糖尿病视网膜病变斑马鱼模型的研究价值日益受到关注。

高血糖斑马鱼的视网膜异常与糖尿病患者的异常一致。将斑马鱼交替浸泡在葡萄糖溶液和水中28天后，其内核层（INL）和内网状层（IPL）显著变薄。此外，高血糖会影响视锥光感受器神经元层。进一步研究表明，长期高血糖会对斑马鱼视网膜电生理产生不利影响，在远端和近端视网膜均产生独立作用。另外，近期一项研究介绍了一种新型短期体内筛选方法，通过将成年斑马鱼暴露于高血糖环境来筛选影响糖尿病视网膜病变（DR）的化合物。斑马鱼胚胎在3至6天胚胎期（dpf）用130毫摩尔葡萄糖处理后，其玻璃体视网膜血管出现扩张，且在受精后6天，血管内皮生长因子（VEGF）的水平升高。斑马鱼中的pdx1突变体是目前已知唯一可用于研究高血糖诱导的视网膜血管生成的模型。因此，这些斑马鱼模型在筛选糖尿病视网膜病变治疗的新药物候选物方面具有现实前景。

早产儿视网膜病变

ROP是早产儿的一种视网膜血管增生性疾病，也是儿童失明的主要诱因之一。由于ROP是一种发育性疾病，斑马鱼胚胎可作为潜在模型，在短时间内以大样本量快速评估药物治疗效果。斑马鱼ROP模型的构建方法如下：用缺氧诱导剂处理Tg(fli1:EGFP)斑马鱼，随后在24小时胚胎期（hpf）加入GS4012（一种血管内皮生长因子诱导剂）；此时视网膜中央血管干的出芽数和血管分支数会显著增多。此外，成年Tg(fli1:EGFP)斑马鱼在10%空气饱和水中暴露3至12天，也会出现严重的视网膜血管增生现象。

年龄相关性黄斑变性

年龄相关性黄斑变性（AMD）会导致中心视力模糊，其发病机制为多因素性，包括血管生成、补体系统失调、脂质代谢异常、炎症反应以及细胞外基质通路异常等。新生血管性AMD是造成大部分视力丧失的亚型，其特征是黄斑区出现脉络膜新生血管。成熟斑马鱼的缺氧诱导视网膜病变模型可用于研究新生血管性AMD。同样，希佩尔-林道（VHL）基因的失活会促进缺氧诱导因子信号通路的激活，进而引发血管内皮生长因子（VEGF）的表达。因此，VHL基因敲除斑马鱼胚胎中已观察到严重的脉络膜和玻璃体血管新生，以及视网膜脱离和黄斑水肿等现象。由此可见，VHL突变体斑马鱼可作为新生血管性AMD的研究模型。

干性年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种以视网膜色素上皮（RPE）病变为特征的亚型，可导致光感受器细胞丢失。值得注意的是，gnn 突变体斑马鱼在受精后约5天（5 dpf）会出现与AMD相关的视锥细胞退化现象。此外，HTRA1蛋白（一种参与AMD病理生理学的蛋白质）的过表达可导致斑马鱼光感受器层与RPE层之间出现脂褐素和黑素脂褐素的沉积。在斑马鱼中转基因过表达人类HTRA1，会引发RPE的某些形态学改变、光感受器细胞死亡以及脂褐素沉积，这些都是早期AMD的特征。近期，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的RP1L1突变斑马鱼，成为首个出现视网膜下玻璃膜疣沉积（AMD的标志性特征）的光感受器退化斑马鱼模型。

光感受器变性

光感受器变性疾病种类繁多，给预防或逆转视力丧失带来了挑战。由于斑马鱼与人类在视网膜解剖结构和功能上具有相似性，斑马鱼模型已成为研究光感受器发育及疾病的主流模型。本文聚焦于两种主要的视网膜变性疾病——色素性视网膜炎（RP）和莱伯先天性黑蒙（LCA）。

视网膜色素变性

RP是一种以进行性光感受器细胞死亡和光感受器功能异常为特征，表现为夜视力下降和周边视野丧失的疾病。人类常染色体显性RP最常见的病因是视杆细胞特异性视蛋白基因——视紫红质（RHO）发生突变。近年来，已成功构建出多种与显性或隐性RP相关的RHO突变斑马鱼模型，这些模型均出现视杆细胞进行性变性。值得注意的是，斑马鱼的视锥光感受器不受RHO突变体的影响，这与RHO突变导致的人类RP特征相符。

X连锁型视网膜色素变性（X-linked RP）的主要病因是视网膜色素变性2（RP2）基因突变，其特征为人类患者在40岁前发病，视力下降且进展迅速。在斑马鱼中敲低RP2会导致小眼表型、光感受器外节（OSs）逐渐丧失以及光感受器功能异常，模拟了人类X连锁型视网膜色素变性的症状。此外，向斑马鱼中注射人类RP2信使核糖核酸（mRNA）可挽救其突变表型，这表明RP2在X连锁型视网膜色素变性的发病机制中起着至关重要的作用。另外，斑马鱼模型能够很好地模拟人类视网膜色素变性的多种表型（表3），这一特性已被证实对鉴定视网膜色素变性的致病基因具有重要价值。

表3.视网膜色素性变疾病的斑马鱼模型

莱伯先天性黑蒙症

LCA是一种遗传性视网膜变性疾病，会导致儿童早期失明，且具有高度的遗传异质性[130]。目前已知至少有15种与LCA相关的基因，包括CEP290、RPE65、CRB1、KCNJ13、GUCY2D、AIPL1、CRX、IMPDH1、LCA5、LRAT、RPGRIP1、SPATA7、RD3、RDH12和TULP1。CEP290突变的斑马鱼会出现细胞内运输延迟和视觉感知下降的现象，这与人类LCA患者的情况相似。同样，利用斑马鱼敲除LCA5基因CRISPR/Cas9技术会导致OS蛋白运输受损，进而引发视锥-视杆营养不良，该病症模拟了人类视锥-视杆营养不良的表型。

参与纤毛发生起始以及纤毛组分运输的突变基因，在小鼠模型中可导致LCA或类LCA表型。鞭毛内运输蛋白在纤毛内的货物运输中发挥关键作用，而这一过程可由驱动蛋白马达蛋白促进。例如，斑马鱼的ift28、ift88和ift172突变体表现出光感受器快速退化，且无法形成发育成熟的光感受器外节。斑马鱼的kif3a（驱动蛋白家族3a）突变体可导致光感受器显著退化且无法形成外节，最终使斑马鱼幼体的视网膜电图消失。

斑马鱼作为眼部疾病药物研发的模型

由于候选药物可添加至水培养基中而非注入鱼体内，斑马鱼已成为多种基于表型的药物发现研究的理想模型，相关研究已取得诸多成功成果。本文主要探讨了斑马鱼在抗血管生成化合物、神经保护药物以及眼毒性研究中的应用。

抗血管生成化合物

斑马鱼化学检测可用于眼部疾病新型抗血管生成药物的筛选，其作用与体外/体内外平台类似。因此，斑马鱼已成为一种极具潜力的新型模式生物，用于眼部疾病抗血管生成药物的研发。例如，对约2000种化合物的筛选发现，有4种小分子可影响视网膜血管形态，却不会使斑马鱼躯干血管及视网膜神经元结构发生明显变化。同样，研究人员对465种药物组成的生物活性化学库进行筛选，以寻找斑马鱼幼虫透明血管血管生成的小分子抑制剂，最终发现10种有效化合物，其中维生素D受体激动剂的效果最为显著。

在一项利用斑马鱼开展的小型化学筛选实验中，PI3K抑制剂LY294002被确定为一种有效且具有选择性的眼部血管生成抑制剂，无全身性副作用，也不会损害视觉功能。此外，通过研究抗血管生成药物对斑马鱼血管生成的影响及其细胞毒性，斑马鱼可作为抗血管内皮生长因子（VEGF）药物的早期筛选模型。成纤维细胞生长因子受体（FGFR）与血管内皮生长因子受体（VEGFR）抑制剂布里瓦尼布，可抑制斑马鱼胚胎的血管生成，且不影响神经发育。此外，抗VEGF药物舒尼替尼和ZM323881均能有效阻断斑马鱼体内缺氧诱导的新生血管生成。同时，VEGFR2抑制剂（如舒尼替尼和676475）可阻断vhl斑马鱼的视网膜新生血管生成。近期一项研究还证实，正交药物组合筛选策略是发现斑马鱼幼鱼眼部血管生成新型抑制剂的一种成本效益高、省时且无偏倚的方法。

神经保护药物

光感受器疾病的斑马鱼模型为发现新型神经保护药物提供了平台。斑马鱼可作为表型模型，用于筛选光感受器变性相关的神经活性化合物。在斑马鱼常染色体显性视网膜色素变性模型上开展的ENZO SCREEN-WELL氧化还原库研究发现，β受体阻滞剂卡维地洛可增加视杆细胞数量并改善视觉功能[。从中药五味子中分离得到的活性成分五味子乙素，被证实可改善视网膜变性斑马鱼pde6c模型的光感应能力。

在光感受器变性模型中已检测到组蛋白去乙酰化酶（HDACs）的过度激活，而抑制HDAC6可能阻止神经变性。此外，值得注意的是，HDACs抑制剂还能防止光感受器因光损伤而死亡。在ATP6V0E突变斑马鱼模型（一种视锥光感受器变性疾病模型）中，HDAC6抑制剂成功减少了凋亡细胞的数量，并改善了光感受器的外节（OS）面积及视觉功能。此外，HDAC6 抑制和过氧化物酶活性的调节可能在保护视网膜细胞及特定光感受器方面发挥重要作用，这表明它们足以挽救视网膜细胞死亡并恢复视觉功能。

药物眼毒性

可以想象，许多药物都具有眼毒性。长期或大剂量接触某类药物可能会造成眼部损伤和视力下降。鉴于脊椎动物的眼睛具有高度保守性，斑马鱼可成为研究药物眼毒性的有效模型。作为一种高效的动物模型，斑马鱼能够在临床前阶段预测药物对眼部的不良影响。本研究中，研究人员用药物处理一批3天龄（3-dpf）的斑马鱼幼体2天，随后通过视觉运动反应和视动反应评估其视觉行为。地高辛、庆大霉素、布洛芬、米诺地尔和奎宁这六种已知的眼毒性药物中，有五种也对斑马鱼的视觉反应产生了一定的不良影响。然而，针对一些典型的视网膜毒物（如碘化钠和N-甲基-N-亚硝基脲），斑马鱼视网膜在组织病理学方面的反应模式与哺乳动物存在差异。总体而言，斑马鱼检测法在检测眼毒性化学物质时，灵敏度和特异度分别为68%–83%和75%–100%。此外，长期暴露于醋酸甲羟孕酮（一种孕激素类药物）会导致斑马鱼眼部过度生长以及视觉功能缺陷。这些研究结果表明，斑马鱼模型在模拟人类药物的眼毒性特征、预测新型药物的眼毒性谱方面具有强大的应用价值。

结论

斑马鱼因其眼部结构与人类相似且便于进行基因操作，成为眼科机制研究和药物发现的便捷动物模型。近年来，基于Crispr/Cas9的基因组编辑技术使得快速构建目标基因突变的斑马鱼品系变得十分容易。因此，我们期待在不久的将来，斑马鱼这一模型能得到更广泛的应用，以全面阐明眼部疾病的遗传基础。斑马鱼已广泛应用于眼科药物发现领域，例如新型抗血管生成化合物或神经保护药物的筛选，以及眼毒性检测。高通量表型分析技术的快速发展为斑马鱼在药物发现中的应用展现出广阔前景。斑马鱼已成为研究各类人类眼部疾病和筛选新药的日益重要的模型，其优缺点总结于表4中。

斑马鱼模型有望成为研究各类人类眼部疾病机制及探索新型药物疗法的更主流、更有效且更具前景的工具。

表4.常见眼部疾病斑马鱼模型的优势与不足