标题：The impact of augmenter of liver regeneration in blunt liver trauma: An experimental model analysis

期刊：Turkish Journal of Trauma & Emergency Surgery (TJTES)

原文链接：https://www.tjtes.org/

摘要

背景：创伤性肝损伤是触发肝脏修复的急性事件。肝再生增强因子（ALR）已被确定为参与该过程的生长因子。本研究评估了ALR对离体肝钝性损伤的影响，并探讨了其与不同时间间隔的关系。

方法：将40只健康雌性Wistar白化大鼠随机分为5组，编号为((n=8 each))。除第1组外，其余各组均采用定制设计的创伤平台诱导单纯性钝性肝损伤。各组根据创伤后安乐死的时间进行划分：第2组（15分钟）、第3组（30分钟）、第4组（45分钟）和第5组（60分钟）。评估指标包括血浆肝再生增强因子水平、肝组织肝再生增强因子水平（完整组织与裂伤组织）、生化指标及肝组织学分析。

结果：第4组的血浆丙氨酸转氨酶（ALR）水平高于第1组和第2组((p<0.01))。第3组和第4组的完整肝脏ALR水平均超过第1组（分别为(p<0.05)、(p<0.01)）。第5组的完整肝组织ALR水平低于第3组和第4组（分别为(<0.05)、(p<0.01)，P均<0.05）。第5组的损伤肝组织ALR水平高于第2组和第3组。在第1组中，血浆ALR水平高于完整肝组织ALR水平((p<0.05))。在第2组中，血浆ALR水平超过完整肝组织ALR水平((p<0.01))。在第3组中，血浆ALR水平分别超过损伤肝组织和完整肝组织的ALR水平（分别为(p<0.05)、(p<0.001)）。在第4组中，血浆ALR水平高于完整肝组织ALR水平((p<0.01))，且损伤肝组织ALR水平高于完整肝组织ALR水平((p<0.001))。此外，第3、4、5组的炎症评分均高于第2组（分别为(p<0.05)、(p<0.01)、(p<0.01)）。

结论：本研究首次探讨了甲胎蛋白相关蛋白（ALR）在单纯钝性肝外伤中的作用。钝性肝外伤发生后，血浆和肝组织中的ALR水平会在数分钟内发生变化。

关键词：肝再生增强因子；钝性创伤；肝创伤

引言

创伤是全球范围内导致死亡的主要原因之一。肝脏是腹部钝性损伤中最常受累的器官。当受到外力撞击或挤压伤时，肝脏常因剧烈的加速 - 减速运动而发生损伤。钝性肝外伤的治疗。向非手术治疗的转变显著提高了钝性肝损伤后的生存率。这种方法使得大多数重症病例能够在无需手术的情况下得到治疗肝脏再生这一过程在希腊神话普罗米修斯的故事中早有提及，它由一系列复杂的机制构成，而在当代科学研究中，这些机制仍未被完全阐释。肝脏遭受损伤后，肝细胞死亡与代偿性增殖会伴随炎症过程一同发生。这些机制不仅能清除死亡的肝细胞，还能为组织修复所必需的细胞因子分泌提供支持。多种生长因子和细胞因子在肝脏再生过程中发挥着关键作用，这些因子会激活各类细胞内信号通路。

肝再生增强因子（ALR）是一种具有抗凋亡、抗氧化和抗炎特性的蛋白质。尽管ALR在肝脏、睾丸、肾脏和大脑等多个器官中均有表达，这凸显了其多样的生物学功能。但它在肝脏中的表达量远高于其他器官，并作为生长因子在肝脏修复与再生过程中发挥关键作用。因此，肝细胞对ALR的产生和分泌是肝脏生理和病理生理过程中的关键环节。ALR可促进关键炎症和调节分子的合成，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6和一氧化氮。

本研究旨在评估肝钝性挫伤对孤立性肝钝性创伤的影响及其与时间间隔的关系。

材料与方法

本研究的伦理审批由 SYLAB 动物实验室完成（审批号：18，日期：12月22日）。研究遵循《赫尔辛基宣言》中关于实验动物护理与使用的伦理原则。

研究设计

40只健康雌性Wistar白化大鼠（年龄：8-10周；体重：250-300克）被随机分为5个等数量的组（1-5组；(n=8 each)）。所有大鼠均单独饲养在可控环境中（温度：20℃-23℃；湿度：60%-70%；12小时明暗周期），可自由获取标准食物和水。2-5组通过定制设计的创伤装置进行单纯钝性肝损伤，1组作为对照组。2、3、4、5组的大鼠分别在肝损伤后15、30、45和60分钟被实施安乐死。比较各组大鼠血浆及肝组织（完整和损伤部位）中肝再生素（ALR）的水平，同时对比各组的组织病理学表现。

建模

大鼠接受腹腔注射盐酸氯胺酮（40毫克/千克，Ketalar®，辉瑞公司，土耳其伊斯坦布尔奥尔塔柯伊区）以诱导麻醉。随后使用定制设计的创伤平台（图1）诱导闭合性肝钝性损伤。具体操作是将一个50克的圆柱形重物从100厘米高度坠落到大鼠右上腹象限，大鼠被牢固地固定在平台上。结合减重后的重量（0.1千克）、重力加速度（9.8米/秒²）以及下落高度，利用公式(E=(m) times(g) times(h))计算得出，此次撞击的动能为0.49焦耳。

图1. 定制设计的创伤平台

30分钟组中有一只大鼠死亡，需对其进行替换。安乐死之前，未进行纵隔解剖，经心内采血2毫升。随后通过一个无菌的3厘米正中垂直切口开腹。一名对分组情况不知情的研究人员检查了腹部和胸腔器官是否存在损伤迹象。尸检结果均显示，根据美国创伤外科协会评分标准，为II级肝裂伤，其特征为存在特定的血肿和裂伤特征，且不伴随其他器官的损伤。

啮齿动物的肝脏重量因物种和品系而异，大鼠的肝脏重量通常在4至5克之间（占体重的2%至3%）。安乐死后，取出肝脏。约三分之一的肝脏出现了明显损伤。研究人员对约1克撕裂的肝组织进行了精准解剖，取材部位为靠近纵隔间隙的区域。占总量约三分之二的周围未受损肝组织被用手术刀仔细切除并取出。

实验参数

酶联免疫吸附试验（ELISA）分析

在受伤后15、30、45和60分钟采集血样，随后将其放入黄盖试管中离心。所得血浆分装后于-80℃保存。取自肝脏完整区域和撕裂区域的组织样本被放入微量离心管中。将样本在与组织体积成比例的磷酸盐缓冲盐溶液中匀浆，随后进行超声处理。接着将组织匀浆在4℃条件下以14000转/分钟的速度离心15分钟。

使用 Pierce™ BCA 蛋白定量检测试剂盒（赛默飞世尔科技；货号 23225）对肝脏样本中的总蛋白进行定量。按照试剂盒操作流程，每个样本均进行双份检测以确保测量准确。使用 CLARIOstar 酶标仪在 450 纳米波长下测定光密度值，通过测定每个孔的光密度，并将其与试剂盒提供的预先建立的 ALR 浓度标准曲线（范围：0.02-4.5 微克/升）进行比对，从而计算出样本中的蛋白含量。

组织病理学评估

取自完整区域和撕裂区域的肝组织片段立即浸入10%福尔马林缓冲液中，用于组织病理学检查。固定后，样本经梯度酒精脱水，并在二甲苯中透明20分钟。随后将组织包埋于石蜡中三小时。接着制备4微米厚的组织切片，并在60摄氏度的烤箱中脱蜡过夜。随后将切片用苏木精-伊红染色以进行组织病理学检查。炎症程度按0至3分分级：0分（无炎症）、1分（轻度炎症）、2分（中度炎症）和3分（重度炎症）。评分由组织学与胚胎学专家完成对分组身份不知情。

生化分析

采用雅培Alinity C系统（货号0-AB-ALINITYC，美国）进行生化检测。使用与雅培Alinity C设备兼容的商业试剂盒测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、乳酸脱氢酶（LDH）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）、直接胆红素和间接胆红素水平。酶水平以单位/升（U/L）为单位进行定量。

统计学分析

使用 IBM SPSS 20.0 版软件（美国伊利诺伊州芝加哥市）进行统计分析。连续变量以均数±标准差或中位数（范围）表示。采用 Kruskal-Wallis 方差分析分析不同组织类型中 ALR 表达的差异以及各组间生化指标的差异。采用与 Kruskal-Wallis 方法相关的多重比较检验评估特定组间的差异。使用 Friedman 检验评估不同组织内组内变异，并通过 Friedman 多重比较检验确定显著的区域差异。以 (p<0.05) 为标准确定统计学显著性

结果

所有实验组均保持每组8只模型动物，各组创伤后均无动物流失情况（图2）。第4组的血浆ALR水平显著高于第一组和第二组的数值 ((p<0.01))。同样，与第一组相比，第三组和第四组完整肝组织中的ALR水平更高，分别对应 (p<0.05) 和 (p<0.01)。相反，第五组完整肝组织的ALR水平低于第三组和第四组，分别对应 (p<0.05) 和 (p<0.01)。此外，第五组肝裂伤组织的ALR水平高于第二组和第三组。第一组的血浆ALR水平显著高于其完整肝组织的水平 ((p<0.05))（表1）。

在第2组中，血浆ALR水平显著高于损伤后完整肝组织中的ALR水平（p<0.01）。((p<0.01)) 在第3组中，血浆ALR水平超过了撕裂肝组织和完整肝组织中的水平（分别为(p<0.05)和(p<0.001)）。在第4组中，血浆ALR水平高于完整肝组织中的水平((p<0.01))。此外，第4组撕裂肝组织中的ALR水平显著高于完整肝组织中的水平((p<0.001))（图3）。第2组和第4组的丙氨酸氨基转移酶水平显著高于第1组（两者均为(p<0.001)）。第3组的丙氨酸氨基转移酶水平也高于第2组((p<0.001))。天门冬氨酸氨基转移酶水平第2组和第3组的数值显著高于第1组（(p<0.001)，两组均p<0.001），且第2组的天门冬氨酸氨基转移酶（AST）水平高于第5组（((p<0.001))）。第2组和第4组的乳酸脱氢酶（LDH）水平显著高于第1组（(<0.001)，两组均p<0.001），且第2组的LDH水平也高于第5组（((p<0.001))）。此外，第3组的γ-谷氨酰转肽酶（GGT）水平4、5组的数值显著高于1、2组（均为(p<0.05)）（表2）。各组间的炎症评分 ((p<0.01)) 存在显著差异。第3、4、5组的炎症评分显著高于第2组（分别对应 (p<0.05)、(p<0.01)、(p<0.01)）（表3，图4）。

图2. 创伤后15、30、45和60分钟时裂伤肝脏的连续图像（蓝色箭头）

图3. 不同组别血浆、完整肝脏及肝裂伤组织中肝再生增强因子（ALR）水平的对比分析

图4. 裂伤肝组织的组织病理学评估。a、b：1组的200倍和400倍放大图像；c、d：2组的200倍和400倍放大图像；e、f：3组的200倍和400倍放大图像；g、h：4组的200倍和400倍放大图像；ı、j：5组创伤后60分钟肝脏的200倍和400倍放大图像。黑色箭头标记有红细胞覆盖的裂伤区域；蓝色箭头指向中性粒细胞；星号标记瘢痕组织。

讨论

肝脏再生过程涉及多种因素和信号通路。ALR具有多种细胞内和细胞外功能，在维持肝脏稳态以及促进损伤后肝脏再生方面发挥着关键作用。据我们所知，这是首次开展的研究评估钝性肝孤立性损伤后不同时间点肝组织和血浆中丙氨酸转氨酶水平的动态变化。

ALR 存在不同的同工型；长链型 ALR 定位于线粒体膜ALR 参与铁稳态和胞质蛋白的成熟过程，这对维持线粒体的结构与功能完整性至关重要。此外，ALR 通过 Mia40/ALR 二硫键传递系统参与线粒体蛋白的氧化折叠，这一过程对细胞存活和肝脏整体健康至关重要。这些功能有助于防止三磷酸腺苷（ATP）生成快速下降，并在应激状态下维持细胞活力，这在肝损伤与修复的相关场景中尤为关键。[8]短链型 ALR 主要定位于细胞质中，由肝细胞分泌。

肝损伤会引发以促炎细胞因子释放为特征的炎症反应。ALR 积极它通过G蛋白偶联受体机制刺激库普弗细胞中关键促炎细胞因子（如肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6）的合成来调节这一反应。 此外，ALR被认为是一种嗜肝生长因子，能够促进肝细胞增殖并支持肝脏再生，这对于肝损伤后的恢复至关重要。同时，ALR具有抗凋亡特性，可保护肝细胞免受缺血再灌注损伤（肝损伤的常见后果）。这种保护作用通过诱导自噬和激活PINK1/Parkin通路实现，而该通路是线粒体质量控制和细胞存活的关键。

肝细胞是血浆中ALR的主要来源，这凸显了它们在肝脏生理功能和全身健康中的关键作用。 这一点强调了肝细胞在维持循环ALR水平方面的重要性，进一步说明了ALR在能量平衡和细胞存活中的意义，尤其是在ALR活性显著的肝细胞中。在第1组（对照组）中，血浆中的ALR水平高于完整肝组织中的水平，这表明健康状态下肝脏内部的ALR释放仍在持续。

Wang等人观察到，与健康对照组相比，乙型肝炎病毒相关（HBV相关）肝炎和肝硬化患者的血浆肝再生增强因子（ALR）水平升高。他们提出，血浆ALR水平可作为评估肝脏相关疾病的灵敏且特异的诊断标志物。值得注意的是，血浆ALR水平或可用于肝脏疾病的早期检测和监测。洪波等人发现，在慢加急性肝衰竭病例中，存活患者的血浆ALR水平显著高于非存活患者，尤其是在疾病早期阶段。这表明血浆ALR水平可能成为慢加急性肝衰竭的预后生物标志物。Polimeno等人报道，部分肝切除术后血清ALR水平显著升高，这说明ALR不仅会循环至肝脏的不同区域，还能到达远端组织。这表明ALR可对肝脏局部之外的细胞活动产生影响。这种相互作用可能对远端组织的细胞具有重要意义，尤其是那些参与全身再生和修复过程的细胞。此外，血清ALR水平与外周血自然杀伤细胞的活性呈负相关，说明ALR具有全身免疫调节作用[8]。肝衰竭患者血清ALR水平升高还与临床结局改善相关，凸显了其作为生物标志物和治疗靶点的潜力[7]。在本研究中，伤后45分钟评估的4组与对照组及伤后早期的2组相比，血浆ALR水平显著升高。这种显著升高表明机体对肝损伤产生了急性全身反应，表现为ALR水平快速上升，而ALR在肝脏的即时修复机制中发挥着关键作用。

在败血症大鼠模型中，出现了快速且显著的升高两小时内血浆中肝再生增强因子（ALR）水平升高；该水平在约八小时达到峰值，并在二十四小时时持续处于升高状态。此外，肝再生增强因子（ALR）水平的升高与炎症细胞因子的升高呈平行趋势。 在本研究中，第4组大鼠在创伤后45分钟观察到的血浆肝再生增强因子（ALR）峰值水平，可能反映了损伤后炎症阶段的终结或肝脏再生过程的启动。肝再生增强因子（ALR）在促进肝脏再生和减轻细胞死亡方面的作用，对于维持肝脏功能至关重要，且可能影响肝酶的水平。在李等人的研究中，过表达肝再生增强因子（ALR）的大鼠相较于野生型大鼠，肝脏损伤程度更轻，表现为肝再生增强因子（ALR）转染小鼠的血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平更低，且肝脏组织学病变更少。

我们的生化研究结果证实了这一点，显示创伤后初期丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）显著升高，提示存在急性肝损伤。这些酶水平的升高（在中期尤为明显）与肝脏对损伤的快速炎症反应相符。乳酸脱氢酶（LDH）水平早期达到峰值，表明发生了即时的细胞损伤；而γ-谷氨酰转肽酶（GGT）水平在后期升高，则提示肝脏持续修复以及胆道再生。

在对完整肝组织内丙氨酸转氨酶（ALR）水平的分析中也观察到了平行趋势，其中第3组和第4组（分别为创伤后30分钟和45分钟）的ALR水平显著高于对照组。这些数据表明肝脏微环境内存在显著的再生活性，与丙氨酸转氨酶（ALR）在全身水平的升高相呼应。

有趣的是，在创伤后60分钟对第5组完整的肝组织进行评估时，其ALR水平相较于其他创伤后组出现了下降。这种下降可能反映出肝再生进入了消退阶段，此时增殖活性开始减弱。对撕裂肝组织中ALR水平的检测显示，与第2组和第3组相比，第5组的ALR浓度显著升高。这表明持续的再生反应一直持续到恢复的后期阶段。该组内撕裂组织与完整组织之间的ALR表达差异表明ALR出现了局部上调。对创伤后不同时间点炎症评分的评估，进一步揭示了肝脏炎症反应的进展过程。第3、4、5组的炎症评分呈逐步升高趋势，与第2组相比具有统计学显著性。这种炎症评分的渐进性升高与肝再生相关蛋白（ALR）水平的变化模式相关，提示肝再生相关蛋白可能在介导肝脏创伤的炎症反应与再生反应中发挥作用。

ALR 在肝脏和睾丸中的主要表达证明了本研究选用雌性大鼠的合理性，有效实现了最大限度减少睾丸ALR表达的混杂效应。 然而，本研究存在一个局限性，即未对其他炎症标志物进行分析。此外，在钝性创伤场景中，脾脏等其他器官也可能发生损伤，而本研究未对此类情况纳入考量。这一点对于全面理解创伤的影响至关重要。

结论

本研究探讨了肝再生增强因子（ALR）在单纯性钝性肝外伤中的作用，从而填补了肝脏创伤后炎症、修复及再生过程认知中的关键空白。研究结果表明，ALR 有望成为一种生物标志物，这体现在肝损伤后其水平发生改变并呈上升趋势。然而，还需开展进一步的细胞水平深入研究，以阐明血浆和肝脏中 ALR 水平升高背后的潜在机制。这些研究成果可为未来减少肝脏继发性损伤、促进创伤后恢复的研究提供理论基础。