文章信息

期刊：Atherosclerosis（《动脉粥样硬化》，Elsevier 出版，欧洲动脉粥样硬化学会会刊之一）

影响因子：7.1（2025 年度 JCR），5 年 IF 5.9

分区：JCR 心脏与心血管系统 Q1；中科院大类医学 2 区（Top 期刊），小类外周血管病 2 区

卷期页码：2019 年第 280 卷，第 99–108 页，DOI: 10.1016/j.atherosclerosis.2018.11.016

收稿/接收：2018 年 4 月 26 日收稿，2018 年 11 月 8 日接收，11 月 16 日在线发表

通讯作者：赵明、吴伟（南方医科大学病理生理学教研室，广东省休克微循环重点实验室）

合作单位：广州医科大学附属第三医院心血管内科

模式动物：转基因斑马鱼幼鱼（血管/髓系细胞荧光报告系）

导读

降脂"第二张王牌"依折麦布（ezetimibe）通过抑制肠道胆固醇吸收来抗动脉粥样硬化，但其确切机制仍不完全清楚。本研究利用血管内皮和粒/巨噬细胞分别表达不同荧光蛋白的转基因斑马鱼，喂以荧光胆固醇酯标记的高胆固醇饲料，结合 iTRAQ 定量蛋白质组学，发现依折麦布的抗动脉粥样硬化作用还有"第二条腿"：上调肝细胞 Apo A-II 表达（经 HNF4 与 PPARα 转录因子），增强巨噬细胞胆固醇外流与胆固醇逆向转运；用 morpholino 敲低斑马鱼 Apo A-II 后，依折麦布减少血管脂质沉积和巨噬细胞招募的保护作用即告失效。这为临床"他汀+依折麦布"联合用药提供了新的机制依据。

研究亮点

依折麦布通过上调 Apo A-II 表达减轻高胆固醇饮食诱导的斑马鱼前动脉粥样硬化病变。

在 HepG2 细胞中，依折麦布经 HNF4 与 PPARα 转录因子上调 Apo A-II 表达。

Apo A-II 升高有助于巨噬细胞胆固醇外流的恢复，从而降低动脉粥样硬化风险。

摘要

背景与目的：依折麦布阻断胆固醇吸收以防止高脂饮食对动脉粥样硬化的不良影响，这一点已被充分确立，但其确切机制未知。本研究使用内皮细胞与粒/巨噬细胞分别表达不同荧光蛋白的转基因斑马鱼，探索依折麦布的特异性机制及其在减轻动脉粥样硬化相关高胆固醇血症中的作用。

方法：斑马鱼幼鱼分别暴露于对照饲料、高胆固醇饲料（HCD）或 HCD 加依折麦布。对照与高胆固醇饲料均混入红色或绿色荧光标记的胆固醇酯以追踪脂质分布。用 iTRAQ 同重标签法检测各组幼鱼的蛋白表达谱。用 morpholino 靶向斑马鱼 Apoa2 mRNA 敲低 Apo A-II，研究其在依折麦布抗动脉粥样硬化功能中的作用。为确认依折麦布对 Apo A-II 表达的调控作用，将靶向 HNF4、PPARα 和 SREBP1 的 siRNA 转染入 HepG2 细胞。

结果：敲低 Apo A-II 后，依折麦布虽然仍上调 Apo A-II 表达，但已无法减少 HCD 引起的血管脂质沉积和巨噬细胞招募。最终我们发现依折麦布通过 HNF4 与 PPARα 转录因子增加 Apo A-II 的表达。

结论：我们的数据表明，依折麦布不仅通过抑制肠道胆固醇吸收预防动脉粥样硬化，还通过增加肝细胞 Apo A-II 的表达、增强胆固醇逆向转运、清除外周多余胆固醇来发挥保护作用。

引言

动脉粥样硬化是一种主要由高脂血症诱导的慢性血管炎症性疾病，如今大多数临床治疗都以脂质代谢为靶点延缓疾病进展。例如，他汀类药物阻断胆固醇的内源性合成，依折麦布阻断小肠对脂质的吸收。除了脂质作为机体代谢燃料的消耗和胆固醇作为细胞膜基本结构成分的利用外，机体还有一个重要通路来排除外周多余脂质、平衡脂质代谢，即胆固醇逆向转运通路（RCT）。RCT 通路包括外周细胞膜上的胆固醇转运蛋白（如 ABCA1），以及肝细胞膜上的 HDL 和 HDL 受体。RCT 利用 HDL 受体摄取 HDL 脂质以合成胆汁，并将脂质随胆汁从肝脏分泌至小肠。HDL 由载脂蛋白组成，如 Apo A-I、A-II、Apo D 和 Apo E 等。高脂血症可能通过两种方式损害 RCT：一是减少外周细胞上 ABCA1 的表达，使多余脂质无法转运至 HDL 或载脂蛋白；二是降低肝细胞胆汁合成限速酶的表达，使肝细胞无法接收和处理脂质以供排泄。RCT 通路受损是高脂血症的关键原因之一。

依折麦布被认为靶向 Niemann-Pick C1-Like 1（NPC1L1）固醇受体——一种表达于小肠上皮细胞和肝脏的细胞蛋白，紧密调控膳食和胆汁胆固醇的吸收。在用依折麦布作对照研究某种中草药调脂功能时，我们惊讶地发现它还能调控 Apo A-II 的表达。肝细胞中 Apo A-II 的表达受一系列转录因子调控：apo A-II 基因启动子区存在复杂近端、中端和远端调控元件（A 至 N，可分为八个近中端元件 AIIA–AIIH 和六个远端元件 AIII–AIIN）。孤儿核受体如肝核因子 4（HNF-4）、v-Erb 相关受体 2（EAR-2）、EAR-3 和载脂蛋白调控元件 1（ARP-1）可与 apo A-II 启动子的 J 位点互作：HNF-4 结合后诱导转录，EAR-2、EAR-3 和 ARP-1 则降低转录。apo A-II 启动子还可被维甲酸 X 受体（RXR）与过氧化物增殖物激活受体 α（PPARα）反式激活，强烈提示异二聚体 RXR/PPAR 可能是 apo A-II 转录速率的正性生理调控因子。另有研究显示固醇调节元件结合蛋白 1（SREBP-1）识别调控元件 AIIB、AIICD、AIIDE、AIIK 和 AIIHI。因此，我们探索了 HNF-4、PPARα、SREBP-1 siRNA 的作用，验证其中哪个靶点参与了依折麦布对 Apo A-II 表达的上调及随之而来的巨噬细胞向 HDL 的脂质外流。

研究方法概要

斑马鱼：Tg(fli1:eGFP)（内皮细胞绿色荧光）、Tg(flk1:mCherry)、Tg(lyz:DsRed)（粒细胞红色荧光）、Tg(coronin1a:eGFP)（髓系细胞绿色荧光），由南方医科大学张译月、张文清教授惠赠。高胆固醇饲料（HCD）将胆固醇溶于乙醚配成 4%（w/w）拌入饲料；依折麦布 40 μg/ml 加入饲养水体。对照与 HCD 饲料均掺入 10 μg/g 红色或绿色荧光胆固醇酯（BODIPY 标记）。

活体共聚焦成像：0.02% tricaine 麻醉、0.5% 低熔点琼脂糖包埋，Olympus FV1000 共聚焦，每 200 nm 扫一层。

iTRAQ 分析：每组 50 尾幼鱼匀浆，胰酶酶解后 8 重 iTRAQ 试剂标记，SCX 柱分离后 LTQ Orbitrap Velos LC-MS/MS，Mascot 检索 Ensembl 斑马鱼数据库；FDR≤0.01，倍数变化 ≥1.2 或 ≤0.833 且 p<0.05 为差异蛋白阈值。

显微注射：apoa2-MO（5 ng/胚胎）靶向 apoa2 基因第 2 外显子与第 2 内含子交界处。

细胞实验：HepG2 与 THP-1 细胞常规培养；HNF4/PPARα/SREBP1 siRNA 经 Lipofectamine 转染（1 μg/ml）；胆固醇外流实验用 Sigma 试剂盒，THP-1 来源巨噬细胞经 PMA 诱导，外流率=(Fm/(Fc+Fm))×100%。

统计：数据以 mean±SE 表示，单因素方差分析，p<0.05 为显著（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

结果

1. 依折麦布减少 HCD 诱导的斑马鱼幼鱼血管脂质沉积

转基因斑马鱼幼鱼是合适的高脂血症模型——出生后 30 天内身体透明，而 Fli1:eGFP 系在内皮细胞中特异表达 GFP，可动态观察血管脂质沉积过程。本研究中，Fli1:eGFP 幼鱼从开始自由摄食的 5 dpf（days post fertilization，受精后天数）起喂以正常饲料或含 4% 胆固醇的高胆固醇饲料（HCD），并加或不加依折麦布。两种饲料均混入红色荧光胆固醇酯。图 1A 显示，与正常饲料相比，HCD 幼鱼尾静脉出现更多红色荧光脂质沉积；除尾静脉外，HCD 幼鱼的背主动脉和血管分叉处也有沉积。这与 Miller 等人的报道一致，可能与该发育阶段斑马鱼大动脉与静脉直接相连有关。

图 1. 依折麦布减少 HCD 诱导的斑马鱼血管脂质沉积。Tg(fli1:eGFP)、Tg(coronin1a:eGFP) 和 Tg(coronin1a:eGFP/fli1:mCherry) 幼鱼自 5 dpf 起喂正常饲料或 HCD（4% 胆固醇），加或不加依折麦布，共 10 天。(A) 饲料中混入红色荧光胆固醇酯（10 μg/g）追踪脂质，活体成像显示尾静脉和背主动脉红色荧光脂质沉积。(B) 红色荧光（脂质沉积）统计分析（n=5）。(C-D) 5 dpf 的 coronin1a:eGFP/fli1:eGFP 幼鱼喂对照、HCD 或 HCD+依折麦布 10 天，沿尾静脉聚集的绿色荧光巨噬细胞成像与统计分析。(E) HCD 以绿色荧光胆固醇酯标记，活体尾血管成像显示脂质沉积（绿）与巨噬细胞（红）及明场背景下二者的共定位。(F) 尾静脉 50 μm 范围内（虚线圈出）红色荧光巨噬细胞与绿色胆固醇酯的共定位计数与统计分析。

2. 依折麦布减少 HCD 诱导的血管髓系细胞聚集

巨噬细胞向血管募集并吞噬脂质是人类动脉粥样硬化发病的早期事件。给巨噬细胞表达 eGFP、内皮细胞表达 mCherry 的 Coronin1a:eGFP/Fli1:mCherry 幼鱼喂 HCD，导致绿色荧光巨噬细胞向尾静脉和背主动脉募集（图 1C）。我们还给 Coronin1a:mCherry 幼鱼喂绿色荧光胆固醇标记的饲料，研究血管脂质沉积与巨噬细胞黏附的关系：HCD 组尾静脉中红色荧光巨噬细胞与绿色脂质的共定位多于对照和依折麦布组（图 1E）。依折麦布有效减少了 HCD 诱导的巨噬细胞募集和黏附，依折麦布组脂质与巨噬细胞的共定位也弱于 HCD 组。

3. 依折麦布减轻 HCD 幼鱼内皮层的紊乱与通透性

湍流处内皮细胞层的明显增厚和大空泡样 EC 边界的形成提示内皮细胞失去正常排列，随后可能发生巨噬细胞浸润。在 HCD 幼鱼中，我们观察到尾部血管内皮层形态不规则、EC 层明显增厚（图 2C），以及脂质物质可能的血管渗漏。值得注意的是，依折麦布处理减轻了 HCD 引起的外周血管 EC 紊乱和脂质渗漏，并缓解了尾静脉 EC 层的增厚。新近证据表明中性粒细胞在动脉粥样硬化的起始阶段发挥重要作用。给单核/巨噬细胞和粒细胞表达 DsRed2 的 lyz:DsRed2 幼鱼喂 HCD，导致尾静脉旁红色荧光髓系细胞扩展，提示血管壁炎症和血管屏障功能障碍（图 2A）；给 lyz:DsRed2/coronin1a:eGFP 幼鱼喂 HCD，发现尾血管外中性粒细胞和巨噬细胞扩展（图 2B），而依折麦布有效减少了血管外中性粒细胞和巨噬细胞的数量。

图 2. 依折麦布减轻 HCD 幼鱼内皮层紊乱与中性粒细胞募集。Tg(fli1:eGFP)、Tg(fli1:eGFP/lyz:DsRed2) 或 Tg(coronin1a:eGFP/lyz:DsRed2) 幼鱼自 5 dpf 起喂正常饲料或 HCD（红色荧光胆固醇酯标记），加或不加依折麦布，共 10 天。(A) Tg(fli1:eGFP/lyz:DsRed2) 幼鱼尾鳍血管活体成像：内皮细胞（绿）与浸润中性粒细胞（红）。(B) Tg(coronin1a:eGFP/lyz:DsRed2) 幼鱼尾鳍血管成像：巨噬细胞（绿）与中性粒细胞（红）。(C) Tg(fli1:eGFP) 幼鱼尾鳍血管细节：脂质（红）与内皮细胞形态（绿）。(D) 图 C 中浸润的红色荧光细胞计数与统计分析（n=5）。(E) 浸润巨噬细胞（绿色荧光细胞）计数与统计分析（n=5）。(F-I) 3 月龄斑马鱼总胆固醇（TC）和总甘油三酯（TG）检测（n=4）。

4. HCD 降低斑马鱼 Apo A-II 蛋白表达，依折麦布恢复其表达

我们用 iTRAQ 法比较正常饲料、单纯 HCD 和 HCD+EZE 各组间斑马鱼幼鱼的蛋白谱。iTRAQ 标记样品质谱分析共鉴定 2765 条肽段，匹配 908 个蛋白。用 GO 和 COG 分析对鉴定蛋白的特性和功能进行分类，并筛选出脂质转运与代谢相关候选蛋白。最终发现三组两两比较中共有 288 个蛋白显著上调或下调。差异蛋白交集聚类后，12 个候选蛋白在所有 3 组比较中均显著变化（图 3A；表 4），其中载脂蛋白 A-II（Apo A-II）是唯一来自载脂蛋白家族的成员——Apo A-I、Apo A-IV、Apo-C1 等 HDL 相关载脂蛋白虽也在部分比较中变化，但只有 Apo A-II 在每一次比较中都发生显著变化（表 5）。我们用免疫印迹和定量 PCR 验证了这一发现（图 3B-F），结果与 iTRAQ 一致。

图 3. 对照饲料、HCD 及 HCD+依折麦布喂养斑马鱼差异蛋白谱的 iTRAQ 分析。每组 50 尾幼鱼（同图 1 分组）匀浆后行 iTRAQ 定量，比较蛋白表达谱差异。(A) 维恩图显示三次 iTRAQ 实验蛋白鉴定的重叠。(B) Western blot 检测各组斑马鱼 Apo A-II 表达。(C-D) 目的蛋白条带灰度经内参归一化后统计分析（n=3）；r.u.，相对强度。(E-F) qPCR 检测正常饲料、HCD 和 HCD+依折麦布幼鱼中 apo A-I 和 apo A-II 相对 mRNA 表达。

5. 依折麦布通过 HNF4 和 PPARα 增加 Apo A-II 表达

为验证依折麦布诱导 apo A-II 的功能，我们用不同剂量的依折麦布处理人 HepG2 细胞。图 4A-B 显示依折麦布以剂量依赖方式增加 Apo A-II 的 mRNA 和蛋白水平。我们还在人肠上皮细胞系 FH 中考察了依折麦布对 Apo A-II 表达的影响，结果显示依折麦布对 FH 细胞的 Apo A-II 表达无显著影响（图 4D）。胆固醇超载细胞以剂量依赖方式表达更少的 Apo A-II 蛋白，而依折麦布处理逆转了这一现象。根据文献，apoa2 基因的转录受 HNF4、PPARα、SREBP1 等转录激活因子调控。我们用 siRNA 阻断 HepG2 细胞中这些转录激活因子的表达并用依折麦布刺激，结果显示 HNF4 siRNA 和 PPARα siRNA 均有效降低了 Apo A-II 的表达（图 4F）。

图 4. 依折麦布增加 HepG2 细胞 apo A-II 表达并增强人巨噬细胞胆固醇外流。(A) HepG2 细胞经不同剂量依折麦布处理 48 h，提取 mRNA 逆转录为 cDNA，qPCR 检测 apo A-II 转录水平。(B) 不同剂量依折麦布处理 48 h 后收集细胞裂解物行 Western blot 检测 Apo A-II 表达。(C) 图 B 结果统计分析，r.u.，相对强度。(D) 人肠上皮细胞系 FH 经不同剂量胆固醇处理 48 h，Western blot 检测 Apo A-II 表达。(E) 图 D 结果统计分析。(F) HepG2 细胞分别经 HNF4、PPARα、SREBP1 siRNA 预处理后暴露于 40 μg/ml 依折麦布 48 h，Western blot 检测各组 Apo A-II 表达。(G) 图 F 结果统计分析。(H) HepG2 细胞分为对照、依折麦布、HNF4+PPARα siRNA、HNF4+PPARα siRNA+依折麦布四组，收集培养液用 ELISA 测定 Apo A-II 浓度。(I) 用图 F 收集的培养液刺激分化的 THP-1 细胞，计算并统计分析巨噬细胞胆固醇外流。

6. 依折麦布逆转胆固醇超载导致的胆固醇外流下降

胆固醇外流缺陷是泡沫细胞形成的主要原因。为研究 Apo A-II 在巨噬细胞胆固醇外流中的作用，我们用 HNF4 siRNA 阻断 HepG2 细胞的 Apo A-II 表达，收集培养液处理胆固醇超载的 THP-1 细胞（图 4H-I）。结果显示，与对照组相比，依折麦布提高了人 HepG2 细胞培养液中的 Apo A-II 水平；HNF4 siRNA 组的 Apo A-II 浓度较对照和依折麦布组显著降低；对 HNF4 siRNA 预处理的 HepG2 细胞加入依折麦布也不能提高培养液中的 Apo A-II 表达（图 4H）。图 4I 显示，富含 Apo A-II 的培养液可显著增加 THP-1 细胞的胆固醇外流，而贫 Apo A-II 培养液则不能。

7. 敲低 Apo A-II 削弱依折麦布的保护作用

为研究 Apo A-II 在依折麦布保护功能中的作用，我们用针对斑马鱼 apoa1 和 apoa2 mRNA 翻译起始位点的反义 morpholino 敲低其表达。鉴于 morpholino 的作用时效较短，我们在向胚胎注射 Apo A-II MO 后，从 5 dpf 起喂 HCD 或 HCD+依折麦布 3 天。结果发现 3 天的 HCD 已足以诱导血管脂质沉积（图 5A）。如图 5 所示，敲低 apo A-II 加重了血管脂质沉积；而即便加入依折麦布处理，这些效应也无法被抑制——即依折麦布的保护作用在 Apo A-II 缺失时失效。

图 5. 敲低 Apo A-II 削弱依折麦布对斑马鱼脂质沉积的预防作用。Tg(Fli1:eGFP) 或 Tg(coronin1a:eGFP/fli1:mCherry) 胚胎注射靶向斑马鱼 apoa1 和 apoa2 mRNA 翻译起始位点的 morpholino（MO）敲低其表达。MO 注射的幼胚自 5 dpf 起分为四组喂 3 天：对照 MO+HCD、对照 MO+HCD+依折麦布、apoa2 MO+HCD、apoa2 MO+HCD+依折麦布。所有 HCD 均混入红色荧光胆固醇酯。(A) Tg(Fli1:eGFP) 幼鱼尾血管活体成像：血管脂质沉积（红）与内皮细胞（绿）。(B) 图 A 血管脂质沉积的统计分析（n=5）。

讨论

包括美国心脏病学会（ACC）在内的多个主要临床实践组织推荐依折麦布作为他汀不耐受或单用他汀无法达到目标 LDL 胆固醇水平者的二线治疗。虽然一线治疗他汀类药物已减少约三分之一的动脉粥样硬化相关事件，但其众多副作用是许多患者的主要限制。此后，针对胆固醇逆向转运通路的新疗法——PCSK9 抑制——也被开发出来。我们的数据提示，依折麦布的降脂功能可能也涉及 RCT，并且是 Apo A-II 依赖的。许多 PPARα 和 LXR 激动剂因调控 RCT 蛋白表达而被讨论，因为 PPARα/LXR 复合物靶向 RCT 通路相关基因，包括编码膜脂质转运蛋白的基因（ABCA1、ABCG1、ABCG5、ABCG8）、载脂蛋白基因（apo A-I、apo A-II、apo E），以及脂质转移蛋白和胆固醇代谢酶基因，如胆汁合成限速酶胆固醇 7α-羟化酶（CYP7A1）和 HDL 受体（清道夫受体 BI）基因。

我们的结果表明，依折麦布可同时增加斑马鱼和人 HepG2 细胞中 apo A-II 的表达。已有报道 apoa2 基因转录受 HNF-4、EAR-2、EAR-3、ARP-1 以及 RXR 和 PPARα 等转录因子调控。虽然我们发现依折麦布经 HNF4 和 PPARα 通路调控 Apo A-II 表达，但其潜在分子机制仍需进一步探索。至少，我们已经证明依折麦布不仅可以抑制小肠对胆固醇的吸收，还可以激活胆固醇逆向转运通路来降低血脂。临床他汀与依折麦布联合治疗，可能不仅阻断胆固醇的合成与摄取，还激活 RCT 通路清除外周多余胆固醇，有望产生协同效应，降低高脂血症并阻止动脉粥样硬化进展。

载脂蛋白 A-II 是高密度脂蛋白（HDL）家族中丰度第二高的蛋白。HDL 因其抗氧化、抗炎作用及执行胆固醇逆向转运的能力而具有抗动脉粥样硬化作用。表达人 apo A-I 或人 apo A-II 的转基因小鼠以及 Apo A-I 或 Apo A-II 缺陷小鼠曾被用于研究 HDL 各组分的贡献及其抗动脉粥样硬化保护作用。小鼠 HDL 是均一的大颗粒群体；表达人 apo A-I 后出现 resembling 人 HDL 的较小 HDL 群体，血浆 HDL 水平升高。适度表达人 apo A-II 也出现更小尺寸的 HDL，其比例随人 apo A-II 表达水平升高而增加，但 HDL 水平并未升高。鉴于 apo A-I 对 HDL 合成的重要性，Apo A-I 敲除小鼠血浆 HDL 急剧降低，但令人惊讶的是，喂食致动脉粥样硬化饮食后并未发生主动脉病变。出乎意料的是，Apo A-II 敲除小鼠的血浆 HDL 甚至低于 Apo A-I 敲除小鼠，并发生了动脉粥样硬化。看来人 apo A-I 和人 apo A-II 对人 HDL 的尺寸异质性很重要，而 apo A-I 和 apo A-II 对 HDL 的形成和/或结构稳定性都很重要。因此，载脂蛋白 A-II 可能是 HDL 抗动脉粥样硬化的关键调控因子。

我们的数据显示，依折麦布刺激肝细胞表达 apo A-II；而通过干扰其翻译敲低斑马鱼 Apo A-II 表达，会削弱依折麦布对血管脂质沉积和斑块区巨噬细胞黏附的预防作用。因此，依折麦布诱导的载脂蛋白 A-II 表达对预防高胆固醇饮食诱导的动脉粥样硬化至关重要。总之，我们发现依折麦布不仅通过抑制小肠胆固醇吸收预防动脉粥样硬化，还通过激活胆固醇逆向转运发挥保护作用——其激活肝细胞 apo A-II 表达及抗动脉粥样硬化效应都是 Apo A-II 依赖的。我们提出，临床他汀与依折麦布联合治疗可能具有更好的疗效。

注：缩写表、附表 1–5 及补充材料（Supplementary Figs. 1–5）详见原文。DOI: 10.1016/j.atherosclerosis.2018.11.016

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