文章信息

期刊：Development（《发育》，The Company of Biologists 出版，发育生物学经典老牌期刊）

影响因子：4.0（2025 年度 JCR），5 年 IF 4.6

分区：JCR 发育生物学 Q1（8/39）；中科院大类生物学 2 区，小类发育生物学 2 区

论文编号：dev205141（2026 年第 153 卷），DOI: 10.1242/dev.205141

收稿/接收：2025 年 7 月 30 日收稿，2026 年 9 月 9 日接收

通讯作者：何鑫宇、王强（华南理工大学医学院，教育部发育与疾病创新中心）；第一单位为中科院动物研究所器官再生与重建全国重点实验室

处理编辑：Steve Wilson（Development 资深编辑）

模式动物：斑马鱼（泄殖腔发育模型）

导读

泄殖腔（cloaca）是消化道、泌尿道和生殖道共同的"总出口"，它的打开依赖腔内细胞的凋亡，但调控机制一直不清。本研究发现：泄殖腔自身表达的 Wnt2bb 通过 Wnt/β-catenin 通路刺激周围的邻居细胞增殖，细胞拥挤产生的机械压力挤压增殖较慢的泄殖腔细胞，通过"细胞竞争"（cell competition）触发其凋亡，从而打开泄殖腔开口。wnt2bb 突变体泄殖腔闭锁、排泄受阻；LAPS 机械力 FRET 生物传感器直接记录到泄殖腔细胞压力下降；仅在泄殖腔周围（而非腔内）激活 β-catenin 即可挽救表型。这项工作首次在体内生理环境下证明了跨细胞类型的机械性细胞竞争驱动器官成形。

摘要

泄殖腔是多种物种中消化、泌尿和生殖系统的唯一对外开口。细胞凋亡对泄殖腔的塑造至关重要，但其潜在机制在很大程度上仍不清楚。本研究发现，Wnt2bb 触发的邻居细胞增殖通过诱导泄殖腔细胞凋亡（很可能是通过机械性细胞竞争）对斑马鱼泄殖腔的形成至关重要。wnt2bb 在泄殖腔形成全过程中强表达；wnt2bb 失活下调 β-catenin 核积累及下游靶基因 cyclin D1 的表达，严重抑制泄殖腔周围细胞的增殖。局部细胞密度的随之下降与生物传感器指示的泄殖腔细胞机械压力降低相关，阻止了它们的竞争性消除，最终导致泄殖腔梗阻。此外，CDK4/6 抑制剂 palbociclib 不仅抑制泄殖腔周围细胞的增殖，还消除泄殖腔的凋亡，在野生型胚胎中产生类似的缺陷。组成型活性 β-catenin 仅在泄殖腔周围的细胞中（而非泄殖腔内部）过表达，即足以挽救泄殖腔梗阻。因此，我们揭示了 Wnt2bb 调控的细胞竞争在泄殖腔发育中的重要作用。

关键词：Wnt2bb；Wnt/β-catenin 信号；细胞竞争；泄殖腔；斑马鱼

引言

泄殖腔是消化、泌尿和生殖道共同的唯一开口。鉴于其与人类结构的相似性，以及斑马鱼胚胎的高繁殖力、快速发育和光学透明性，斑马鱼已成为研究泄殖腔发育及相关先天性畸形的重要的非哺乳类脊椎动物模型。斑马鱼泄殖腔起源于原肛（proctodeum）——约受精后 24 hpf（hours post fertilization，受精后小时数）时围绕前肾管尾端的一团细胞。原基泄殖腔逐渐与前肾管融合，形成对外开口。与此同时，斑马鱼肠道启动快速形态发生，后肠在 48 hpf 开始与泄殖腔融合。到 96 hpf，肠道在泌尿开口前方的泄殖腔开口形成，开始排泄废物。

细胞凋亡在泄殖腔形成中起关键作用。抑制泄殖腔的细胞凋亡会导致前肾管和肠道梗阻，伴随严重的排泄功能障碍。然而，泄殖腔发育过程中细胞凋亡的调控因子和机制仍很大程度上未知。

细胞竞争是一种内在程序：细胞不断与邻居"攀比"， viable 但"不合格"的细胞被淘汰。该概念由 Morata 和 Ripoll 于 1975 年首次提出——果蝇翅盘中携带核糖体蛋白基因突变的细胞被周围的野生型细胞竞争淘汰，这一消失过程被证实由程序性细胞死亡触发。细胞竞争是跨物种保守的过程，用于维持稳健的器官发生和组织稳态。在小鼠中，TEAD 活性低、无法激活多能性因子表达的细胞被内源性细胞竞争淘汰，以确保高质量上胚层的形成；在小鼠脑发育过程中，神经前体细胞亚群之间的生理性细胞竞争使 Axin2-低的细胞群倾向于凋亡。在斑马鱼脊髓和肌肉的模式化中，细胞竞争通过消除信号活性异常的"不合格"细胞来纠正 Sonic hedgehog（Shh）或 Wnt 形态发生素梯度中的噪声。数十年的研究已鉴定出多种诱发细胞竞争的因子。值得注意的是，细胞拥挤诱导的机械力可以触发竞争性凋亡：增殖速率较高的细胞对邻居施加挤压，最终促进慢生长群体的消除。尽管体外遗传操作下的机械性细胞竞争已被充分描述，但其在器官发生等生理环境中的作用尚缺乏研究。

经典 Wnt 通路通过 β-catenin 的核转位发挥作用，经 TCF/LEF 蛋白激活靶基因转录。Körberg 等人在膀胱外翻（一种由泄殖腔发育缺陷导致的先天性异常）患者中鉴定出 WNT 通路组分（WNT3、WNT6、WNT7A、WNT8B、WNT10A、WNT11、WNT16、FZD5、LRP1 和 LRP10）的突变；他们还发现斑马鱼 wnt3 敲低导致泄殖腔畸形，提示 Wnt/β-catenin 信号可能在该过程中发挥关键作用。已知经典 Wnt 通路促进细胞增殖、迁移和侵袭，但其在细胞凋亡中的作用尚无共识。在本研究中，我们揭示 Wnt2bb 触发的邻居细胞增殖对泄殖腔开口的形成至关重要，很可能是通过机械性细胞竞争诱导泄殖腔细胞凋亡。wnt2bb 失活显著减少泄殖腔周围的增殖细胞和泄殖腔周围的细胞密度，与生物传感器指示的泄殖腔细胞机械压力降低相关，进而抑制泄殖腔凋亡并导致泌尿道和消化道阻塞。我们的研究为器官发生过程中生理环境下的机械性细胞竞争提供了新见解。

结果

wnt2bb 在泄殖腔中强烈富集

在我们此前关于咽弓动脉发育的研究中，我们用全 mount 原位杂交（WISH）表征了包括 wnt2bb 在内的多个 Wnt 基因的时空表达模式。我们注意到，在原肛/泄殖腔区域，wnt2bb 转录本从 24 hpf 到 48 hpf 高度富集，之后逐渐下降并持续检测到 72 hpf（图 1A）。鉴于泄殖腔至少由三种细胞类型组成，我们试图在细胞水平上细察 wnt2bb 的表达。双色荧光原位杂交（FISH）显示 wnt2bb 与标志基因 cldnc（消化道）和 cdh17（前肾管）几乎无重叠，表明 wnt2bb 并非来源于肠道或前肾组织；相反，wnt2bb 转录本在 48 和 72 hpf 与泄殖腔标志物 aqp3a 共定位（图 1B-D），提示 wnt2bb 在泄殖腔发育中的潜在作用。

图 1. wnt2bb 转录本在泄殖腔区域富集。(A) WISH 分析野生型胚胎各时期 wnt2bb 的表达。方框标示原肛/泄殖腔区域，右侧放大。代表性图像来自 40 个样本。标尺：100 μm（左）；20 μm（右）。(B) 48 hpf 时，FISH 检测 wnt2bb 与消化道（上）、前肾管（中）和泄殖腔（下）标志基因的共表达。橙色虚线为泄殖腔、品红色虚线为泄殖腔周围区域。代表性图像来自 5 个样本。标尺：10 μm。(C) 72 hpf 时，FISH 检测 wnt2bb 与消化道（左上）、前肾管（右）和泄殖腔（左下）标志物的共表达。(D) wnt2bb 在泄殖腔中表达的示意图。

Wnt2bb 是泄殖腔形成所必需的

高分辨率活体成像显示，野生型胚胎的前肾管向尾部延伸、到达原肛并于 24 hpf 开口；相比之下，wnt2bb 功能缺失突变体的前肾管尾端被阻断（图 2A）。随着后肠管向后延伸开始与泄殖腔融合，野生型胚胎在 96 hpf 融合完成时可观察到未来的肛门开口，而半数突变体胚胎的泄殖腔末端呈封闭状（图 2A）。野生型胚胎 120 hpf 泄殖腔形成内陷结构，而 40% 的 wnt2bb−/− 胚胎表现出缺乏泌尿生殖和肠道开口的畸形泄殖腔。aqp3a 的表达模式也清楚地显示这些突变体胚胎的泄殖腔闭锁（图 2B）。此外，wnt2bb morphants（ morpholino 敲低胚胎）重现了 wnt2bb−/− 突变体的泄殖腔梗阻表型。

泄殖腔发育缺陷通常伴随排泄功能障碍。为动态评估泄殖腔排除废物的功能，我们在 96 hpf（肠管连接泄殖腔并开始蠕动收缩的时期）向野生型和 wnt2bb−/− 胚胎的前肠注射荧光罗丹明葡聚糖。注射后，野生型胚胎中染料沿肠道下行并最终经泄殖腔开口排出；而突变体虽然肠道蠕动似乎正常，却未观察到泄殖腔的荧光外流（图 2C），表明 wnt2bb 失活导致泄殖腔梗阻、排泄功能受损。

图 2. Wnt2bb 对泄殖腔的发育至关重要。(A) 野生型与 wnt2bb−/− 胚胎在各时期的代表性图像。颜色标示前肾管（绿）、后肠（蓝）和泄殖腔（黄）。标尺：10 μm。(B) 120 hpf 时 aqp3a 表达显示野生型与 wnt2bb−/− 胚胎的泄殖腔结构。标尺：10 μm。(C) 96 hpf 时通过罗丹明排泄实验评估泄殖腔功能。10 kDa 罗丹明葡聚糖注射入胚胎前肠，示意图标示注射位置。标尺：50 μm。WT，野生型。

Wnt2bb 通过激活 β-catenin 依赖通路支持泄殖腔形成

Wnt2bb 已被证实是参与软骨细胞成熟、咽动脉发育和肝脏特化的经典 Wnt 配体。为验证 Wnt2bb 介导的泄殖腔发育也依赖 β-catenin，我们首先用免疫荧光染色评估野生型和 wnt2bb−/− 胚胎的 β-catenin 水平，发现突变体的核与胞质 β-catenin 均急剧下降（图 3A-B）。随后在 Tg(7xTCF:GFP) 背景下检测 Wnt 信号活性，wnt2bb morphants 的泄殖腔和泄殖腔周围区域 GFP 信号显著降低（图 3C）；Tg(TOPflash:GFP) 背景下的 WISH 得到类似结果。这些数据都表明缺失 Wnt2bb 时 Wnt/β-catenin 信号显著下调。

Wnt/β-catenin 信号激活后，β-catenin 核转位并与 TCF/LEF 家族成员互作启动靶基因转录。我们发现著名的促增殖 Wnt 靶基因 cyclin D1 在 wnt2bb−/− 突变体的泄殖腔和泄殖腔周围区域表达显著降低（图 3D-E）；共激活因子兼下游靶基因 lef1 的表达也明显下降（图 3F）。我们用 CRISPR/Cas9 构建 lef1 突变体（7 碱基缺失导致提前终止），三分之一 lef1−/− 胚胎的泌尿道和消化道尾端闭合（图 3G），排泄功能严重受损。这些结果有力地说明 Wnt2bb 激活 β-catenin 通路以支持泄殖腔发育。

随后用 β-catenin 拮抗剂 CCT036477（CCT）处理野生型胚胎（36–48 hpf），胚胎在前肾管与泄殖腔之间无法形成开口，重现 wnt2bb−/− 表型（图 3H）；而用 GSK3β 抑制剂 BIO 激活 wnt2bb−/− 突变体的 Wnt/β-catenin 信号（36–48 hpf），成功恢复了泌尿与直肠开口的正常形成（图 3I-K）。综上，我们的发现为"Wnt2bb 经典贝塔-连环蛋白通路调控泄殖腔发育"提供了坚实的证据。

图 3. Wnt2bb 通过 β-catenin 依赖的信号通路促进泄殖腔发育。(A-A′) 野生型与 wnt2bb−/− 胚胎 β-catenin 免疫荧光染色。DAPI 标记细胞核。方框标示泄殖腔及前后泄殖腔周围区域（A′ 放大）。标尺：10 μm（A）；1 μm（A′）。(B) 野生型与 wnt2bb−/− 胚胎泄殖腔及前后泄殖腔周围区域核 β-catenin 相对荧光强度（双尾非配对 t 检验；****P<0.0001；n=5；核 β-catenin 荧光强度除以 DAPI 荧光强度归一化）。(C) 一细胞期注射 cMO 或 wnt2bb MO 的 Tg(7xTCF:GFP) 胚胎代表性图像。标尺：20 μm。(D) FISH 显示 48 hpf 野生型与 wnt2bb−/− 胚胎 cyclin D1 表达。标尺：10 μm。(E) cyclin D1 FISH 定量（**P<0.01，***P<0.001；n=5）。(F) 48 hpf lef1 表达，箭头示泄殖腔位置。标尺：20 μm。(G) 野生型与 lef1−/− 胚胎代表性图像。标尺：10 μm。(H) DMSO 或 10 μM CCT（36–48 hpf）处理的野生型胚胎明场图像。(I-K) wnt2bb−/− 胚胎经 DMSO 或 5 μM BIO（36–48 hpf）处理后的成像（I、J 标尺分别为 10 μm、20 μm）及 aqp3a 表达模式（K，标尺 10 μm）。

Wnt2bb/β-catenin 信号失活导致的泄殖腔梗阻源于泄殖腔凋亡减少

泄殖腔梗阻已被证明与泄殖腔凋亡受损相关。我们推测细胞凋亡的扰动会抑制泄殖腔开口的形成。用泛 caspase 抑制剂 Z-VAD-FMK（36–48 hpf）培养野生型胚胎，48 hpf 时泄殖腔凋亡显著减少、泌尿开口阻塞（图 4A-C），表明泄殖腔的正常形态发生确实需要凋亡。为确定 wnt2bb 失活是否通过影响细胞凋亡破坏泄殖腔发育，我们用 caspase-3/7 报告基因 VC3AI 转基因系监测凋亡信号：与野生型同胞相比，wnt2bb−/− 胚胎泄殖腔的报告荧光从 36 到 120 hpf 明显降低，提示 Wnt2bb 缺失时细胞凋亡减少（图 4D-E）。TUNEL 实验在 24 hpf 无显著差异，但在 36 和 48 hpf 显示突变体泄殖腔细胞凋亡急剧减少（图 4F-G）；吖啶橙染色结果类似。泄殖腔周围区域也检测到少量凋亡，但野生型与突变体间无显著差异。此外，CCT 处理抑制野生型胚胎泄殖腔凋亡，BIO 处理则恢复 wnt2bb−/− 突变体的泄殖腔凋亡（图 4H-K）。这些结果提示，Wnt2bb/β-catenin 信号受抑时泄殖腔畸形可归因于泄殖腔内细胞凋亡的减少。

图 4. wnt2bb 失活显著减少泄殖腔凋亡细胞。(A) 野生型胚胎 36 hpf 起经 DMSO 或 300 μM Z-VAD-FMK 处理，48 hpf 行 TUNEL 实验。橙色虚线标示泄殖腔。标尺：20 μm。(B) TUNEL 阳性细胞百分比（****P<0.0001；n=10）。(C) 处理后胚胎明场图像。标尺：20 μm。(D) Tg(actb1:VC3AI) 背景的野生型与 wnt2bb−/− 胚胎各时期代表性图像。标尺：20 μm。(E) 泄殖腔 Venus 阳性细胞百分比（****P<0.0001；ns，不显著；n=5）。(F) TUNEL 检测各时期凋亡细胞。标尺：10 μm。(G) 泄殖腔与泄殖腔周围 TUNEL 阳性细胞百分比（****P<0.0001；n=10）。(H-I) DMSO 或 10 μM CCT 处理野生型胚胎后泄殖腔 TUNEL 结果（****P<0.0001；n=5）。(J-K) DMSO 或 5 μM BIO 处理 wnt2bb−/− 胚胎后泄殖腔 TUNEL 结果（****P<0.0001；n=5）。

Wnt2bb 依赖的邻居细胞增殖诱导泄殖腔周围的细胞拥挤

局部组织拥挤可作为细胞凋亡的触发因素。有趣的是，我们发现野生型胚胎泄殖腔周围的细胞密度显著高于 wnt2bb−/− 突变体（图 5A-D）。鉴于 Wnt2bb 存在时 cyclin D1 表达的激活，我们假设 Wnt2bb 在泄殖腔发育过程中促进细胞增殖，直接导致组织拥挤。为此我们在野生型和突变体胚胎中进行了 BrdU 掺入实验：与泄殖腔中凋亡的发生一致，野生型胚胎泄殖腔细胞的 BrdU 掺入率显著低于周围细胞（图 5E-F），提示泄殖腔细胞是细胞竞争中应被邻居淘汰的"输家"细胞。此外，wnt2bb 失活后泄殖腔周围和泄殖腔细胞的增殖均严重降低（图 5E-F）。相应地，CCT 处理显著消除野生型胚胎的细胞增殖（图 5G-H），BIO 处理则部分恢复 wnt2bb−/− 胚胎的细胞增殖（图 5I-J），证实 Wnt2bb/β-catenin 信号介导的细胞增殖促进泄殖腔周围的细胞拥挤。

图 5. wnt2bb 失活显著抑制泄殖腔周围细胞增殖并降低泄殖腔周围局部细胞密度。(A) 野生型与 wnt2bb−/− 胚胎 36 hpf DAPI 染色，Imaris 生成 3D 体积及代表细胞的虚拟点。橙色虚线为泄殖腔、品红/青色虚线为泄殖腔周围定量区域。标尺：10 μm。(B) 36 hpf 细胞密度定量（****P<0.0001；ns；n=5）。(C-D) 48 hpf 同上（****P<0.0001；n=5）。(E) 各时期 BrdU 掺入实验检测增殖细胞。标尺：10 μm。(F) 泄殖腔与泄殖腔周围 BrdU 掺入细胞百分比（组间：非配对双尾 t 检验；野生型内部泄殖腔 vs 泄殖腔周围：配对双尾 t 检验；***P<0.001，****P<0.0001；n=10）。(G-H) DMSO 或 10 μM CCT 处理野生型胚胎后 BrdU 结果（**P<0.01，****P<0.0001；n=5）。(I-J) DMSO 或 5 μM BIO 处理 wnt2bb−/− 胚胎后 BrdU 结果（*P<0.05，****P<0.0001；n=5）。

Wnt2bb 促进对泄殖腔细胞的机械挤压

增殖细胞造成的细胞拥挤可对慢生长的邻居施加机械压力，最终驱动它们发生竞争性凋亡。我们假设 Wnt2bb/β-catenin 信号失活时，增殖抑制应导致机械压力（尤其是作用于泄殖腔细胞的）减少。为监测机械力变化，我们将检测 Lamin A 第 22 位丝氨酸（pSer22）磷酸化的 FRET 生物传感器 LAPS 引入野生型和突变体胚胎。免疫荧光显示 GFP 信号广泛分布于多种组织，并与核周的 Lamin A/C 清晰共定位（图 6A），表明生物传感器定位于核膜。由于 Lamin A 的 pSer22 修饰在低机械压力下升高、高机械应力下减弱，野生型胚胎中泄殖腔细胞略低的 FRET 比值反映出泄殖腔细胞承受着比邻居更高的机械压力（图 6B-C）；相比之下，wnt2bb−/− 胚胎泄殖腔区域的 FRET 信号大幅升高，提示 wnt2bb 失活后泄殖腔的机械压力显著降低（图 6B-C）。我们还向 wnt2bb−/− 突变体及其野生型同胞引入磷酸化不敏感的 R605A 突变型生物传感器，两组间 FRET 比值无差异，进一步确认了传感器的特异性。此外，用 Rho 激酶抑制剂 Y-27632（36–48 hpf）降低肌动球蛋白收缩力和细胞张力，泄殖腔 FRET 信号急剧升高（提示机械挤压下调），同时 48 hpf 胚胎凋亡减少、泌尿开口阻塞（图 6D-H）。这些发现共同表明，Wnt2bb 诱导的泄殖腔细胞凋亡归因于作用于这些细胞的机械挤压。

图 6. Wnt2bb 是促进泄殖腔细胞机械挤压所必需的。(A) 一细胞期注射 Tol2 转座酶 mRNA 和 Tol2-LAPS 质粒的胚胎泄殖腔区域 LAPS（抗 GFP 抗体识别 CFP 和 YPF）与 Lamin A/C 免疫荧光。代表性图像来自 5 个样本。标尺：20 μm。(B) 野生型与 wnt2bb−/− 胚胎 48 hpf FRET 成像，可视化 Lamin A pSer22 修饰。橙色虚线为泄殖腔、品红色虚线为泄殖腔周围定量区域。标尺：20 μm。(C) FRET 比值定量（组间：非配对双尾 t 检验；野生型内部泄殖腔 vs 泄殖腔周围：配对双尾 t 检验；*P<0.05，***P<0.001，****P<0.0001；n=5；FRET 比值=FRET 通道荧光强度/ECFP 通道荧光强度）。(D-E) 野生型胚胎 36–48 hpf 经 DMSO 或 200 μM Y-27632 处理后 48 hpf FRET 成像与定量（****P<0.0001；n=5）。(F-G) DMSO 或 Y-27632 处理野生型胚胎后 48 hpf TUNEL 实验与定量（****P<0.0001；n=9）。(H) 处理后胚胎明场图像，颜色标示前肾管（绿）、后肠（蓝）和泄殖腔（黄）。标尺：20 μm。

邻居细胞中激活 Wnt2bb 对泄殖腔形成至关重要

为进一步验证泄殖腔内凋亡的出现归因于 Wnt2bb 触发的邻居细胞增殖，我们用 CDK4/6 选择性抑制剂 palbociclib（36–48 hpf）抑制野生型胚胎的细胞增殖。处理后几乎检测不到 BrdU 掺入，泄殖腔周围细胞密度大幅降低（图 7A-D）。相应地，LAPS 生物传感器检测到泄殖腔 FRET 比值明显升高，提示作用于泄殖腔细胞的机械压力降低（图 7E-F）。此外，TUNEL 实验显示 palbociclib 处理后泄殖腔细胞凋亡显著受抑，Tg(actb1:VC3AI) 活体成像也证实了这一点（图 7G-H）。处理后的胚胎也无法在泄殖腔形成前肾管和肠道的外部开口（图 7I）。

接下来我们确定 Wnt 信号在泄殖腔内还是其周围细胞的激活对泄殖腔形成重要。利用此前报道的空间受限热休克系统 IR-LEGO，在 wnt2bb−/− 胚胎的泄殖腔或泄殖腔周围诱导镶嵌过表达组成型活性 β-catenin（ΔN-β-catenin）：将含 hsp70 启动子驱动 ΔN-β-catenin 与 IRES-GFP 盒、EF1α 启动子驱动 mCherry 的 Tol2 质粒与 Tol2 转位酶 mRNA 共注射入一细胞期胚胎；36 hpf 对 mCherry 阳性胚胎的泄殖腔或泄殖腔周围进行激光照射，通过相应区域 GFP 信号的出现监测 ΔN-β-catenin 表达（图 7J）。我们发现，在泄殖腔周围细胞（而非泄殖腔内部）过表达 ΔN-β-catenin 可挽救 wnt2bb−/− 突变体的泄殖腔梗阻（图 7K）。

综上，我们的研究提出如下模型：泄殖腔来源的 Wnt2bb 激活邻近泄殖腔周围细胞的经典 Wnt 信号，促进其增殖并导致泄殖腔周围的细胞拥挤，这可能增加作用于泄殖腔细胞的机械挤压，驱动它们发生凋亡，从而促进泄殖腔开口的形成（图 7L）。

图 7. 邻居细胞中激活 Wnt2bb 对泄殖腔的形成至关重要。(A) 野生型胚胎 36 hpf 起经 DMSO 或 10 μM palbociclib（PAL）处理，48 hpf 行 BrdU 掺入实验。标尺：10 μm。(B) BrdU 掺入细胞百分比（**P<0.01，****P<0.0001；n=5）。(C) 处理后 48 hpf DAPI 染色与 Imaris 3D 重建。标尺：10 μm。(D) 细胞密度定量（****P<0.0001；ns；n=5）。(E) 一细胞期注射 LAPS 的野生型胚胎经 DMSO 或 palbociclib（36–48 hpf）处理后 48 hpf FRET 成像。标尺：20 μm。(F) FRET 比值定量（****P<0.0001；n=5）。(G-H) 处理后 48 hpf TUNEL 实验与定量（****P<0.0001；n=7）。(I) DMSO 或 palbociclib 处理的野生型胚胎代表性图像，颜色标示前肾管（绿）、后肠（蓝）和泄殖腔（黄）。标尺：10 μm。(J) IR-LEGO 系统镶嵌过表达实验示意图。(K) 在泄殖腔或泄殖腔周围进行空间受限热休克的 wnt2bb−/− 胚胎代表性图像。标尺：10 μm。(L) 示意图：泄殖腔来源的 Wnt2bb 促进邻居泄殖腔周围细胞的增殖，通过诱导泄殖腔细胞凋亡促进泄殖腔形成。

讨论

程序性细胞死亡对器官形态发生至关重要。它既可以作为"雕塑家"通过简单移除多余细胞来塑造器官，也可通过调节细胞外基质重分布、机械力产生和生化信号分泌参与组织重塑。在泄殖腔发育中，细胞凋亡促进尿直肠分隔和排泄开口的形成。异常凋亡与肛门直肠及泌尿生殖畸形密切相关：例如，原肠胚后期以后 Bmp 信号减弱会损害泄殖腔特化并抑制原基泄殖腔区域的凋亡，导致泄殖腔梗阻；敲低肾病蛋白 4（nephronophthisis 4）会消除管上皮细胞向泄殖腔的定向迁移，阻止外胚层细胞的程序性死亡，导致前肾管阻塞。在本研究中，我们发现 Wnt2bb 触发的邻居细胞增殖通过增加泄殖腔周围对泄殖腔细胞的机械挤压确保斑马鱼泄殖腔的形成，最终触发其凋亡。

细胞竞争常发生于增殖速率不同的细胞之间。最初在果蝇中被描述为一种稳态过程：细胞比较自身与邻居的分裂速率，慢分裂的突变细胞被凋亡淘汰。营养剥夺会抑制野生型与突变细胞之间的竞争，因为野生型群体的生长优势受损。随着增殖细胞密度增加，被快生长邻居包围的慢生长细胞承受更大挤压，变得紧压和拉伸，这先于它们的消除。本研究中，与泄殖腔周围的邻居相比，泄殖腔细胞表现出更低的增殖速率，并可能承受更高的机械应力，从而展现出"输家"细胞的特征。用 CDK4/6 抑制剂消除增殖、或用 Rho 激酶抑制剂释放机械应力，均导致生物传感器指示的泄殖腔细胞机械挤压减少、泄殖腔内凋亡减少和泄殖腔开口阻塞。至关重要的是，在泄殖腔周围（而非泄殖腔内部）激活 β-catenin 信号恢复了泄殖腔的正常形成。我们的数据支持这样一个模型：快增殖的泄殖腔周围细胞对泄殖腔内慢增殖的邻居施加机械压力，驱动后者发生竞争性凋亡，从而促进泄殖腔的形成。由于泄殖腔细胞表达 aqp3a 和 wnt2bb，而泄殖腔周围细胞不表达，这两个群体代表不同的细胞类型。与此前报道的通常发生于同一细胞类型内（竞争状态存在异质性）的细胞竞争不同，我们的研究为不同细胞群体之间的细胞竞争提供了证据。

Wnt 配体是分泌型信号蛋白，可以自分泌和旁分泌方式发挥作用。尽管 wnt2bb 的表达局限于泄殖腔，但在泄殖腔和泄殖腔周围区域均检测到 β-catenin 核积累、TCF 转基因报告活性和下游靶基因 cyclin D1 的表达。这提示泄殖腔细胞产生 Wnt2bb，以自分泌方式促进自身增殖，并以旁分泌方式刺激邻近泄殖腔周围细胞的增殖。在我们的研究中，旁分泌 Wnt 信号赋予泄殖腔周围细胞增殖优势，进而驱动泄殖腔细胞凋亡，在泄殖腔发育中发挥关键作用。有趣的是，尽管泄殖腔细胞表现出比周围邻居更高的 Wnt 活性，BrdU 掺入实验却显示它们的增殖速率更低。鉴于泄殖腔细胞与泄殖腔周围细胞是不同的细胞群体、可能对 Wnt 信号的反应不同，泄殖腔周围细胞很可能对 Wnt 介导的增殖调控更为敏感。

多个 Wnt 配体已被证明对泄殖腔的形成和形态发生不可或缺：Wnt5a 敲除小鼠胚胎出现直肠尿道瘘和肛门闭锁；斑马鱼 wnt3 敲低导致泄殖腔上皮紊乱和泄殖腔腔隙异常扩张；Wnt 信号抑制因子 Wif1 被报道可通过诱导尿直肠隔顶端内胚层细胞和泄殖腔膜的凋亡促进小鼠泄殖腔分隔。本研究发现 Wnt2bb 通过诱导细胞竞争塑造斑马鱼泄殖腔开口。这些研究都表明，Wnt 信号在泄殖腔发育的多个发育阶段可能具有不同的功能。

研究方法概要

斑马鱼品系：野生型（Tübingen）、wnt2bbs403 突变体、lef1 突变体（CRISPR/Cas9 构建）、Tg(7xTCF:GFP)、Tg(TOPflash:GFP)、Tg(actb1:VC3AI)（caspase-3/7 报告系，Tol2 转座子系统构建）。胚胎于 28.5°C Holtfreter 液中培养。

Morpholino 与显微注射：标准对照 MO 与 wnt2bb MO 注射于 1–2 细胞期胚胎。

WISH/FISH：地高辛与荧光素标记探针按标准流程操作；为清晰显示泄殖腔结构，以 aqp3a 探针 WISH 后 OCT 包埋做冰冻切片。

活体成像：胚胎脱膜、tricaine 麻醉后包埋于 0.8% 低熔点琼脂糖，Hoechst 33342 标记细胞核，Nikon A1R 共聚焦拍摄。

排泄实验：96 hpf 向麻醉胚胎前肠注射 10 kDa 罗丹明葡聚糖，共聚焦观察染料经泄殖腔排出。

免疫荧光与 TUNEL：抗 β-catenin、抗 GFP、抗 Lamin A/C 抗体染色，DAPI 标核；ImageJ 定量核 β-catenin 相对荧光强度；TUNEL 用 TMR red 试剂盒按说明书操作。

药物处理：5 μM BIO、10 μM CCT036477、300 μM Z-VAD-FMK、200 μM Y-27632、10 μM palbociclib 按指定时间处理，等量 DMSO 为对照。

3D 成像与细胞密度：Imaris 软件由共聚焦 z-stack 生成 3D 体积与虚拟细胞点，细胞密度=区域细胞数/区域面积。

LAPS 生物传感器与 FRET 成像：Tol2-LAPS 质粒与转座酶 mRNA 共注射，Zeiss LSM 980 共聚焦 405 nm 激发，FRET 比值=FRET 通道/ECFP 通道荧光强度。

IR-LEGO 镶嵌实验：1345 nm 激光在 36 hpf 对泄殖腔或泄殖腔周围热休克（每区域 1–2 发，光斑直径约 30 μm，每发 45 秒），诱导 ΔN-β-catenin 表达。

统计分析：组间比较用非配对双尾 Student's t 检验，野生型内部（泄殖腔 vs 泄殖腔周围）用配对双尾 t 检验。数据以 mean±s.d. 表示。

注：参考文献与补充材料详见原文。DOI: 10.1242/dev.205141

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。