Danhua Zhang、Keith P. Gates、Lindsey Barske、Guangliang Wang、Joseph J. Lancman、Xin-Xin I. Zeng、Megan Groff、Kasper Wang、Michael J. Parsons、J. Gage Crump、P. Duc Si Dong

 Sanford Burnham Prebys 医学发现研究所人类遗传学项目
南加州大学凯克医学院干细胞生物学与再生医学系 · 约翰霍普金斯大学医学院外科学系与 McKusick-Nathans 遗传医学研究所

Nature Communications (2017) 8: 769　|　doi:10.1038/s41467-017-00666-6
收稿 2016-12-19　接收 2017-07-15　|　开放获取（CC BY 4.0）

一句话读懂

Alagille 综合征（ALGS）患者肝脏里导管太少，而 ALGS 由 JAGGED1 突变引起——那 Notch 配体到底管不管肝/胰导管？本文用斑马鱼给出了迄今最干净的答案：把 jag1b 和 jag2b 两个 Notch 配体基因同时敲成纯合子，肝内与胰内导管彻底消失，但肝细胞与腺泡细胞照样正常发育。而嵌合体实验显示：只要附近有野生型内胚层细胞提供 Jagged 配体，缺配体的邻居细胞就能被「救活」并转入导管命运。这直接挑战了「导管细胞是万能祖细胞」这一流行说法，并给 ALGS 提供了一条新的遗传机制解释。

核心要点

①关键工具：两个纯合突变体。jag1bb1105 与 jag2bhu3425 都携带编码区 N 端的无义突变，属完全功能丧失；且不致死，可存活至幼鱼期——这是本文能做「彻底敲除」的关键（此前用吗啡啉只能做到不完全敲低，且有脱靶顾虑）。

②Notch 活性读出：Tp1:GFP 报告器。以 Tp1 启动子驱动 GFP（含 12 个 RBPJk 结合位点）标记经典 Notch 活性细胞。验证显示：在肝与外分泌胰腺中，Notch 活性严格局限于并标记了全部导管细胞（与 Anxa4 共表达；胰腺中与 Nkx6.1 共表达；肝中为 Prox1⁺Hnf4a⁻）。

③单突变 vs 双突变的对照极其漂亮：jag1b−/− 单独突变时 Tp1:GFP 表达与野生型相当；jag2b−/− 单独突变时部分下降（77% 胚胎肝与胰导管部分丧失）；而 jag1b−/−;jag2b−/− 双突变体中，Prox1⁺ 外分泌胰腺完全没有 Tp1:GFP，肝中约 33% 个体也完全缺失、其余仅剩 1–2 个细胞。

④导管谱系完全丧失，但腺泡与肝细胞不受影响。双突变肝中所有 Prox1⁺ 细胞都表达 Hnf4a（即全是肝细胞），Alcama 高表达几乎完全消失；胰腺中 Nkx6.1 与 Pdx1 检测不到，而 ptf1a:GFP 的分布变得连续。且无 Cleaved Caspase3 阳性——说明导管缺失不是因为细胞死亡，而是「根本没被指定出来」。

⑤Notch 的「早晚期双重角色」被厘清。用 γ-分泌酶抑制剂 LY411575 在不同时段处理：早期抑制（30–72 hpf）→ 导管（Knx6.1⁺）消失但无过多内分泌细胞；晚期抑制（69–132 hpf）→ 导管消失且伴随胰腺尾部出现过多 neuroD:GFP⁺ 内分泌细胞。这解释了此前不同 Notch 缺失模型得出相互矛盾结果的原因。

⑥谱系追踪反驳了「导管是祖细胞」的旧说。用 Tp1:CreERT2 + ubb:lox-CFP-STOP-lox-H2b-mCherry 做谱系追踪：标记到的 H2B-mCherry⁺ 细胞中，肝内 79% 是导管细胞、胰腺中 75% 是导管细胞，而肝细胞（Hnf4a⁺）几乎不被标记，腺泡细胞 24 个胚胎中仅 4 个共标记 12 个细胞（对比同批 2578 个胰内导管细胞）。

⑦嵌合体实验定位配体来源。用 sox32 mRNA 诱导供体胚胎的内胚层命运并以罗丹明葡聚糖标记，移植入 jag1b/jag2b 吗啡啉敲低的宿主：Tp1:GFP⁺ 细胞只出现在有野生型供体细胞的区域；且被「救活」的宿主细胞（不表达罗丹明）紧邻供体细胞，其本身是 Nkx6.1⁺（胰）或 Alcama⁺（肝），确实是导管细胞。

⑧最终模型：在无 Notch 信号时，多能前体默认走向肝细胞/腺泡细胞命运；Jagged 配体从内胚层发出信号，把这些前体「改道」进导管谱系；一旦某个细胞开启 Notch 通路，它就只会走向导管，不再回头。这与哺乳动物 ALGS 模型（认为 JAG1 来自非内胚层细胞、缺陷在形态发生而非谱系指定）形成鲜明对比。

一、引言：一个悬了两百年的谱系问题

在哺乳动物与斑马鱼中，肝胰管系统（hepatopancreatic ductal system）是一套连接肝脏肝细胞与胰腺腺泡细胞、并通向肠道的管状上皮网络。肝胰管的畸形与功能障碍可导致多种病理，包括肝内导管稀少（duct paucity）与外分泌胰腺功能不全——这正是 Alagille 综合征（ALGS）患者的表現。ALGS 是一种先天性疾病，估计发病率为每 70,000 例出生中 1 例，表现为新生儿期肝病。它与主要位于 JAG1、较少见于 NOTCH2 的杂合突变相关。要从机制上理解该病的新生儿期导管缺陷，就必须严格研究这些基因在肝胰导管发育中的功能。

以 Sox9 表达定义的导管谱系，曾被提出是参与肝脏与胰腺发育、稳态与再生的多能祖细胞来源。后续关于稳态与再生的研究既有支持也有反驳「导管细胞是多能祖细胞来源」这一说法的结果。一般认为在肝脏与胰腺早期发育中，双能（肝母细胞）或多能细胞产生导管细胞与肝细胞或腺泡细胞。然而，胚胎发育期间已被指定的导管细胞是否也贡献于腺泡与肝细胞谱系，仍未解决。虽然 Sox9 被认为是最早的胆管标记，但用 Sox9 表达做谱系追踪可能并不理想，因为 Sox9 并非在导管谱系中 exclusively 表达。要解决「导管细胞在器官发生中是否是多能祖细胞来源」这一问题，需要使用更确定的导管谱系追踪 CRE 品系，并正面检验肝与胰腺导管细胞的功能必要性。

尽管已有研究涉及胰腺内分泌与腺泡命运的谱系指定特异因子，但在胰腺与肝脏中诱导整个导管谱系所需的基因一直难以确定。大量研究把 Notch 信号与胰内导管（IPD）和肝内导管（IHD）的形态发生与分化联系起来。异位表达 Notch 胞内结构域会抑制肝细胞与胰腺腺泡基因表达、增强导管基因表达，支持 Notch 信号参与导管谱系指定。然而，由于无法在胰腺与肝脏中完全且明确地阻断经典 Notch 通路，人们一直难以解决「该通路是否专门为导管谱系诱导所必需」这一问题——这一问题独立于人们已认识的 Notch 对导管细胞分化、扩增与维持的要求。

鉴于 Notch 配体与受体之间存在功能冗余，广泛阻断经典 Notch 信号的常用策略是操纵通路中更通用的组分。然而，通过调节 Notch 信号组分表达来下调经典 Notch 活性，并未导致导管完全丧失，或得出相互矛盾的结果。例如，Maml1、Rbpj、Mib1 或 Hes1 在小鼠胰腺中的功能丧失均可导致导管谱系标记减少，但对腺泡与内分泌谱系的影响各不相同；Hes1 与 Rbpj 的丧失还导致更广泛的胰腺发育不全。这些差异可能源于 Notch 功能丧失程度的不同，或非 Notch 信号特异效应，因为被操纵的这些组分没有一個是经典 Notch 信号所独有的。此外，敲除 Notch 受体基因也可能并不理想，因为 Notch 受体不依赖配体也被认为参与 β-catenin 信号。

要更直接地评估 Notch 信号在胰腺与肝脏导管指定中的作用，可能需要分析Notch 配体本身的功能。在小鼠门静脉间充质中条件性敲除 Jag1 会导致肝导管管腔形成缺陷，由此形成当前的模型：ALGS 中的胆管稀少通过类似机制产生——非内胚层来源细胞中 JAG1 表达减少导致胆管结构（而非谱系指定）缺陷。Cre/Lox 条件敲除策略效率可能不完整，再叠加 Notch 配体间的功能冗余，使得在小鼠模型中于配体层面完全阻断 Notch 信号在技术上颇具挑战。

支持 Jagged 配体在肝与胰腺发育中具有冗余作用的是，早期斑马鱼研究显示：同时用反义吗啡啉敲低 jag1b 与 jag2b，比单独敲低任一个造成更广泛的胰腺与肝脏导管发育破坏。但这些因子被敲低的胚胎仍能在被称为「杂交肝细胞与腺泡细胞」中表达导管标记 Cytokeratin。早期的导管细胞究竟是未被诱导、出现了但未能正常分化，还是错误分化成了胰腺内分泌细胞，当时并未确定。单独敲低 jag1b 或 jag2b 还可导致内分泌胰腺 α 细胞或 β 细胞数量增加。后期敲低效率下降也是所谓「杂交细胞」的另一种可能解释。考虑到吗啡啉脱靶效应的顾虑，更可靠的功能丧失模型对于严格评估 Jag1b 与 Jag2b 在发育与疾病中的作用至关重要。

为研究 Jag1b 与 Jag2b 功能特异性、一致且完全丧失对肝与胰腺发育的影响，我们分析了斑马鱼 jag1b 与 jag2b 突变体，使用早期与晚期器官细胞谱系标记，以及一个经典 Notch 信号活性的转基因报告器。我们的研究给出证据：Jag1b 与 Jag2b 是斑马鱼发育中肝脏与外分泌胰腺内全部可检测的经典 Notch 信号以及全部导管细胞所必需的主要配体；且导管细胞并非发育中肝细胞或胰腺腺泡谱系的重要祖细胞来源。进一步的阶段特异性功能丧失研究提示：Notch 信号在胰腺发生早期即被需要以建立导管区室（这不同于其后期阻止胰管细胞转向内分泌命运的作用）。我们的嵌合体研究证明，肝与胰腺中内胚层来源细胞所表达的 Jagged 配体能够直接诱导 Notch 信号与导管谱系——这一机制与目前认为哺乳动物及 ALGS 中 Jag1 信号调控导管发育的方式形成鲜明对比。

二、结果

1. 肝脏与外分泌胰腺的 Notch 活性需要 Jagged

在斑马鱼中，发育期间 jag1b 与 jag2b 在肝胰区广泛表达（补充图 1）。为用更一致可靠的功能丧失方法评估这些配体的作用，我们研究了 jag1bb1105 与 jag2bhu3425 突变体。两个突变体都在各自基因 N 端编码区内携带无义突变，因而很可能是完全功能丧失突变。这些突变直到幼鱼期才致死，使得可以在发育中的肝与胰腺中分析 Jagged 功能丧失。

为考察胰腺与肝脏中的经典 Notch 活性，我们用 Tp1:GFP 转基因报告器分析这些突变体。Tp1:GFP 报告器的 GFP 由含 12 个 RBPJk 结合位点的调控元件（来自 Terminal Protein 1 启动子）驱动，已被证明能有效标记具有经典 Notch 信号活性的细胞。借助该品系，我们确认胰内导管与肝内导管（但不是肝胰外导管）具有高水平的经典 Notch 活性——依据是 GFP 与 AnnexinA4（Anxa4，斑马鱼与哺乳动物肝胰导管广泛表达的标记）的共表达。在外分泌胰腺中，所有表达 Tp1:GFP 的细胞同时是 Nkx6.1 阳性（补充图 2a）——该转录因子在小鼠胰腺导管区室中也有表达。在发育中的肝脏中，所有表达 Prox1（肝脏与外分泌胰腺内胚层的宽泛标记）但缺乏肝细胞早期标记 Hnf4a 的细胞都是 Tp1:GFP 阳性（补充图 2b），表明所有内胚层来源细胞要么 Hnf4a 阳性、要么 Tp1:GFP 阳性。

这些发现表明，在肝脏与外分泌胰腺内，基于 Tp1 启动子的 Notch 活性严格局限于并标记了全部导管细胞。肝脏与胰腺内外也可见 Tp1:GFP 阳性但 Prox1 阴性的细胞，提示存在非内胚层来源的 Notch 活性组织；结合内皮报告器 kdrl:mCherry 的 Tp1:GFP 表达分析，证明这些 Notch 活性细胞确实是内皮细胞（补充图 2c、d）。Tp1:GFP 表达在胰腺中一小部分表达 Islet1 的内分泌细胞中也能观察到（补充图 2d）。

jag1bb1105 纯合突变体在受精后 72 小时（hpf）的胚胎（n > 15）中，肝与胰腺的 Tp1:GFP 表达均无明显下降（图 1b）。然而，jag2bhu3425 纯合突变体（n = 26）确实表现出 Tp1:GFP 阳性细胞数量减少：77% 的 jag2bhu3425 纯合子在肝与外分泌胰腺中均有 Tp1:GFP⁺ 细胞的部分丧失（图 1c）。其余胚胎在整个肝与外分泌胰腺中只有 2 个、1 个或 0 个 Tp1:GFP 阳性细胞（未显示），提示 Jag2b 是肝与胰腺发育中大部分 Notch 信号所需的主要配体。可变的外显率可能提示与其他 Notch 配体之间存在功能冗余，正如此前 jag1b 与 jag2b 敲低研究中更严重的导管缺陷所表明的那样；不过那项敲低研究并未评估 Notch 活性。

我们发现双纯合胚胎（jag1b−/−;jag2b−/−）能存活超过 72 hpf，此时胰腺腺泡细胞与肝细胞的分化标记已很明显。双突变体的明场显微镜显示，心脏与前肾水肿是最明显的缺陷，无明显发育延迟（图 1e）。我们发现所有 jag1b−/−;jag2b−/− 胚胎（n = 15，图 1d）在整个 Prox1⁺ 外分泌胰腺中缺乏 Tp1:GFP 表达，而 GFP 仍可在内分泌胰腺以及胰腺相关血管中检测到（图 1a、补充图 3c）。在 Prox1⁺ 肝脏区室中也观察到 Notch 活性丧失，其中约 33% 的 jag1b−/−;jag2b−/− 突变体同样完全缺乏 Tp1:GFP 细胞，其余仅有 1–2 个 Tp1:GFP⁺ 细胞（补充图 4a、b，n = 15）。这些结果表明，Jag1b 与 Jag2b 可以对外分泌胰腺与肝脏中全部可检测的经典 Notch 活性负责。有了经典 Notch 信号完全缺失的双突变体，我们就有了一个更确定的模型来研究配体诱导的经典 Notch 信号在肝与胰腺发育中的特异作用。

图 1 | Jag1b 与 Jag2b 是发育中肝脏与外分泌胰腺全部经典 Notch 信号所必需的。a–d 72 hpf 胚胎前肠内胚层的 3D 重建，背景为经典 Notch 信号转基因报告器 tg(Tp1:GFP)（绿），用肝胰内胚层标记 Prox1 抗体（红）与核标记 DAPI（蓝色）染色。腹面观，前端朝上。jag1b−/− 突变体（b，代表性样本，n > 15）肝与胰腺中的 Tp1:GFP 表达与野生型（a）相当，但在 jag2b−/− 突变体中下降（c，14/18 样本的代表）。jag1b−/−;jag2b−/− 双突变体（d，代表性样本，n = 15）在 Prox1⁺ 细胞中完全缺乏 Tp1:GFP 表达。e 4 dpf 野生型（上）与 jag1b−/−;jag2b−/− 突变体（下）的明场显微镜图像，显示突变体总体发育正常，唯有心脏与前肾水肿。样本来自三个不同的 jag1b−/+;jag2b−/+ 互交窝。比例尺：50 μm（a–d），500 μm（e）。

2. 肝胰内导管谱系指定需要 Jagged

为考察经典 Notch 信号丧失对整个肝胰管系统的影响，我们分析了区分导管与其他胰腺、肝脏细胞类型的早期标记。肝导管谱系最早的鉴别特征之一，是 Prox1 阳性细胞中缺乏肝细胞标记 Hnf4a 的表达。随着肝脏成熟，肝导管细胞维持高水平的 Alcama 表达，而肝细胞则表现出降低或缺失的 Alcama 表达（图 2a、补充图 4c）。整体器官共聚焦显微镜显示，jag1b−/−;jag2b−/− 肝脏中所有 Prox1⁺ 细胞都表达 Hnf4a，提示完全缺乏导管谱系。与此一致，高水平 Alcama 表达几乎完全丧失（图 2b），残留的表达与 Prox1⁺/Hnf4a⁺ 细胞相关（补充图 4d）。在双突变体肝脏（图 2b）与胰腺（未显示）中未观察到 Cleaved Caspase3（凋亡标记），提示导管细胞的缺乏并非源于细胞死亡。这些结果表明 Jag1b 与 Jag2b 对肝内导管谱系指定是必需的。

在小鼠与斑马鱼腹侧胰腺发育早期，ptf1a 最初与 nkx6.1、pdx1 共表达。随着外分泌胰腺的导管与腺泡谱系被指定，ptf1a 表达变得局限于腺泡细胞，而 nkx6.1 与 pdx1 则局限于导管细胞。至 72 hpf，nkx6.1 与 pdx1 仅在 ptf1a 表达极低或不可检测的导管细胞中表达。在 72 hpf 的 jag1b−/−;jag2b−/− 胚胎中，所有双突变体的外分泌胰腺中 Nkx6.1 与 Pdx1 均不可检测，而 ptf1a:GFP 的表达模式在整个外分泌胰腺中显得更为连续（图 2d、f）。然而，双突变体中 Islet1⁺ 内分泌胰腺的 Pdx1 表达并未丧失，表明 Pdx1 的丧失是外分泌胰腺特有的。这些结果表明 Jag1b 与 Jag2b 对胰内导管的谱系指定是必需的。

在 jag1b−/−;jag2b−/− 胚胎中，肝胰外导管（EHPD）中 Anxa4 的表达依然存在（图 2h），而 IHPD 细胞中通常可见的升高表达则丧失。这一发现表明：在 jag1b−/−;jag2b−/− 胚胎中 EHPD 仍可形成，而肝内或胰内的导管细胞则缺失。这种区域化的缺陷与「在 IHPD 中检测到 Notch 活性而在 EHPD 中未检测到」的结果一致。

图 2 | Jag1b 与 Jag2b 是肝胰内导管谱系指定所必需的。a–h 野生型与 jag1b−/−;jag2b−/− 突变体胚胎 72 hpf 前肠内胚层的整体器官免疫荧光表达分析。（a、b 的下方面板移除了 Alcama 通道。）以高 Alcama 水平（a，绿）标记、并以 Prox1（红）而非 Hnf4a（蓝，a）表达标记的肝内导管细胞，见于野生型肝脏（箭头，a）。这些导管细胞在 jag1b−/−;jag2b−/− 突变体肝脏中不存在（b，代表性样本，n = 13），后者完全由同时表达 Prox1 与 Hnf4a 的肝细胞组成。c–f 表达 Nkx6.1（红，c、d）或 Pdx1（红，箭头，e、f）的胰内导管细胞见于野生型，但在 jag1b−/−;jag2b−/− 突变体中不见。Islet1⁺ 细胞（蓝，箭头）与十二指肠（星号）中的 Pdx1 表达与野生型同窝相当，ptf1a:GFP⁺（绿）腺泡细胞 c–f 的表达亦然。g、h Anxa4⁺（红）肝胰外导管可见于连接 ptf1a:GFP⁺（绿）胰腺腺泡细胞与 fabp10a:DsRed⁺ 肝细胞（蓝）的部位。代表性样本来自三个不同的 jag1b−/+;jag2b−/+ 互交窝。比例尺 50 μm。

3. Notch 在导管与内分泌谱系中的早晚期不同作用

不同的 Notch 抑制模型可导致导管细胞丧失，并伴随内分泌细胞分化的过度或减少。在 jag1b−/−;jag2b−/− 突变体中，所有胰腺内分泌细胞（Islet1⁺ 或 neuroD:GFP⁺）都紧邻主胰岛分布（100%，n = 18，图 3a、b），提示缺乏内分泌细胞新生（neogenesis）。与此一致，双突变体中胰腺内分泌细胞总数（87 ± 6 个 Islet⁺ 细胞，n = 8）显著低于 89 hpf 的野生型（113 ± 23 个 Islet⁺ 细胞，n = 10）。我们的分析未显示双突变体中胰腺腺泡大小有一致变化（见图 2c–f 与 3a、b）。

为正式检验不同 Notch 功能丧失模型中相互矛盾的内分泌表型，是否反映了 Notch 信号在胰腺发育过程中时间上不同的功能，我们用 γ-分泌酶抑制剂（GSI）LY411575 在胰腺发育的不同阶段阻断 Notch 信号。虽然 γ-分泌酶的功能涉及多条信号通路，但 γ-分泌酶的化学抑制剂（包括 LY411575）已成为在多个动物模型与器官系统中有效阻断 Notch 通路的公认方法。重要的是，我们发现：与 jag1b−/−;jag2b−/− 胚胎一致，在腹侧胰腺被指定之前开始施用 LY411575，会导致 5 dpf 时 Nkx6.1 阳性胰腺导管细胞完全消失（图 3d）。所有 neuroD:GFP⁺ 胰腺内分泌细胞都紧邻主胰岛分布，并不在胰腺尾部，提示没有过度的内分泌细胞错误分化。虽然较晚施用 LY411575 同样导致表达 Nkx6.1 的导管细胞丧失，但该缺陷伴随胰腺尾部出现过多 neuroD:GFP⁺ 内分泌细胞（图 3f）。

综上，我们的发现支持这样一个模型：Notch 信号功能最初为胰腺导管谱系指定所必需，并间接为新生内分泌谱系所必需；后来则通过抑制内分泌命运而为维持导管谱系所必需。这一模型调和了此前关于 Notch 功能丧失对胰腺内分泌与导管发育影响的数据相互矛盾的结论。然而，无法排除 GSI 处理影响其他遗传通路的可能性。此外，除时间上不同的作用外，空间上以及配体/受体特异的功能也可能对胰腺与肝脏发育有所贡献。

图 3 | Notch 信号在调控导管与内分泌谱系中的早晚期不同作用。a、b 60 hpf 的 jag1b−/−;jag2b−/− 与 wt 同窝胚胎的胰腺。表达 Islet1（红）的新生内分泌细胞通常见于野生型胰腺主胰岛之外、主胰岛基底部（箭头，a）。这些新生内分泌细胞在 60 hpf 的 jag1b−/−;jag2b−/− 突变体胰腺中不存在（b，代表性样本，n = 18，汇集自三个不同的 jag1b−/+;jag2b−/+ 互交窝），其胰腺除主胰岛外完全为 ptf1a:GFP⁺（绿）。c、d 经处理的 5 dpf 胚胎胰腺。用 γ-分泌酶抑制剂 LY575411 早期抑制 Notch 信号（d，n = 9；c，n = 5，样本来自 2 次不同实验）于 30–72 hpf，导致 Nkx6.1⁺ 胰腺导管（红）丧失，且无过多 neuroD:GFP⁺（绿）内分泌细胞。e、f 相比之下，较晚的 LY575411 处理（f，n = 9；对照 e，n = 6，样本汇集自 2 次不同实验）同样导致 nkx6.1⁺ 胰腺导管（红）丧失，但伴随过多 neuroD:GFP⁺（绿）内分泌细胞（箭头，f）。比例尺 50 μm。

4. 腺泡胰腺与肝细胞谱系不需要 IHPD 细胞

jag1b−/−;jag2b−/− 胚胎提供了一个独特机会，可考察在肝与胰腺器官发生期间经典 Notch 信号与导管细胞完全缺失的后果。尽管这些胚胎中相邻心脏与肾脏的水肿对发育中的肝与胰腺造成机械压力，一些双突变体仍具有大小与形状相对正常的肝与胰（图 1–3）。5 dpf 时，与野生型胰腺相似，双突变体的腺泡细胞是极化的（由 ZO-1 的顶端定位与酶原颗粒指示，图 4a、b）。在完全缺乏导管细胞的情况下，双突变体胰腺中腺泡腔的形成仍然明显，甚至可呈囊性——这提供了导管细胞对外分泌胰腺腔形成并非必需的证据。在 jag1b−/−;jag2b−/− 肝脏中，尽管同样缺乏导管细胞，ZO-1 在可见腔隙处的肝细胞顶端仍可检测到（图 4c、d）。5 dpf 时，双突变体肝脏中所有 Prox1 表达细胞都能找到 fabp10a:DsRed 报告器表达，表明存在广泛的肝细胞分化（图 4d）。综上，这些结果提供了功能性证据，提示肝胰内导管对这两个器官的腺泡与肝细胞区室的发育并非必需。

我们发现 Jagged/Notch 信号是 IHPD 谱系指定的诱导事件，这提示追踪 Notch 活性细胞可能是评估导管细胞谱系贡献最可靠的途径。此外，Tp1:GFP 在 Nkx6.1、Pdx1 与 Prox1 表达解析到胰腺导管之前就出现，暗示 Notch 活性是迄今已知最早的导管谱系特异标记。为确定 Notch 活性细胞是否贡献于发育中的腺泡与肝细胞谱系，我们用 Tp1 启动子驱动的他莫昔芬诱导型 Cre（Tp1:CreERT2） 转基因品系，结合 Cre 报告器品系 ubb:lox-CFP-STOP-lox-H2b-mCherry，做经典 Notch 活性细胞的谱系追踪（图 4e）。既往斑马鱼胰腺发育研究发现，在 12 或 56 hpf 加入他莫昔芬时，少量 Tp1:CreERT2⁺ 细胞会贡献于 ptf1a:GFP⁺ 腺泡区室。

为在肝与胰腺发育的最早阶段启动 Tp1⁺ 细胞谱系追踪，我们自 30 hpf 起诱导 Tp1:CreERT2 活性：H2B-mCherry 标记了肝脏中平均 79% 的 Prox1⁺、Hnf4a 阴性导管细胞（图 4g；共 1,416 个细胞，12 个胚胎），以及胰腺中 75% 的 Nkx6.1⁺ 且 ptf1a:GFP 或 Elastase 阴性的导管细胞（图 4f；共 1,586 个细胞，24 个胚胎）。在部分单个样本中，超过 90% 的肝内导管被标记，证明了该谱系追踪方法的有效性。

我们未观察到肝细胞（Hnf4a⁺）被标记，腺泡细胞（ptf1a:GFP⁺ 或 elastase⁺ 且 Nkx6.1 阴性）也只有极少数被标记：24 个胚胎中有 20 个完全没有腺泡细胞被标记，另有 4 个总共只标记了 12 个腺泡细胞，而同批胚胎中被标记的胰内导管细胞多达 2,578 个。总体而言，我们的谱系追踪研究提示，Notch 活性细胞在器官发生期间不贡献于肝细胞谱系，且对腺泡谱系的贡献也极为有限。

图 4 | 肝胰内导管对发育中的腺泡与肝细胞谱系贡献不显著。a–d 5 dpf 野生型（a、c）与 jag1b−/−;jag2b−/− 突变体胚胎（b、d，下方面板移除了 lfabp10:DsRed 通道）中胰腺（a、b）与肝脏（c、d）的免疫荧光分析。尽管 jag1b−/−;jag2b−/− 突变体的 b、d 中缺乏导管细胞，腔形成（箭头）与 ZO-1 顶端定位（b 中为红，d 中为绿）仍与野生型同窝（a、c）相当。正常分化由 ptf1a:GFP⁺ 胰腺腺泡细胞（绿）中的酶原颗粒蓄积与肝细胞中的 lfabp-DsRed 表达（红）指示。e Notch 活性谱系追踪方法示意。f–i 肝脏中被标记的 Notch 活性 H2B-mCherry⁺ 细胞（红）全部为 Prox1⁺（蓝）且 Hnf4a⁻（绿）（n = 12 个胚胎，两次不同实验共计数 1,416 个标记细胞，f；P < 0.0001）。g、h 在胰腺中，几乎所有 H2B-mCherry⁺ 细胞（红）共表达 Nkx6.1（蓝）且为 ptf1a:GFP⁻（绿）（n = 24 个胚胎，三次不同实验共计数 1,586 个标记细胞，P < 0.0001）。g 仅观察到少数缺乏 Nkx6.1 但为 ptf1a:GFP⁺ 的 H2B-mCherry⁺ 细胞（箭头，h；n = 4/24 个胚胎，共 12 个细胞）。i 汇总在肝细胞与肝内导管（IHD）细胞、胰腺腺泡与胰内导管（IPD）细胞中发现的 Notch 活性标记 H2B-mCherry⁺ 细胞数量的图表。代表性样本；a–d，各 n = 4。比例尺 25 μm。

5. 内胚层表达的 Jagged 诱导 Notch 活性与谱系指定

在门静脉间充质中条件性失活 Jag1 会导致肝导管管腔形成缺陷，但并不阻止 Notch 信号标记 Hes1 或早期肝导管标记的表达，提示来自肝脏血管的 Jag1 表达对肝 Notch 信号或导管谱系指定并非必需。一致地，在无法发育血管的斑马鱼 npasl4 突变体中，肝导管指定也未丧失（补充图 6）。目前尚不清楚内胚层来源的 Jagged 配体是否必需直接激活 Notch 信号并诱导 IHPD 指定。已有研究表明 Jag1 在胚胎期小鼠肝与胰腺的内胚层来源细胞中表达，且用 Pdx1-Cre 从胰腺内胚层条件性敲除 Jag1 会导致出生后胰腺导管减少与畸形。这些发现提示，这两个器官中的 Notch 信号可能由相邻内胚层来源细胞的 Jagged 信号直接诱导。

为功能性检验肝与胰腺内胚层来源细胞中正常的 Jag 表达是否足以激活 Notch 并诱导导管谱系，我们用标准移植方法分析了在 jagged 表达上呈嵌合的内胚层胚胎。我们注射 sox32 mRNA 以诱导内胚层命运，并注射罗丹明葡聚糖染料以荧光标记整个供体胚胎。这些被标记的内胚层供体细胞随后被移植到 jag1b 与 jag2b 被吗啡啉敲低的宿主胚胎中（图 5a）。这些移植实验中无法使用突变体，因为双杂合子互交只有 1/16 的后代预期为 jag1b 与 jag2b 双纯合子。为评估经典 Notch 活性，供体与宿主胚胎均使用 Tp1:GFP。在胰腺与肝脏呈嵌合的胚胎中（n = 10），在缺乏罗丹明葡聚糖标记的野生型供体细胞的区域，未发现 Tp1:GFP 表达细胞；而 Tp1:GFP⁺ 细胞只出现在含有罗丹明葡聚糖标记的野生型供体细胞的区域。重要的是，在供体（罗丹明⁺）与吗啡啉宿主细胞（罗丹明⁻）中都能观察到 Tp1:GFP，而这两者直接相邻（图 5b、c）。

这些 Tp1:GFP 细胞在胰腺中为 Nkx6.1⁺，在肝脏中表达高水平的 Alcama，提示它们确实是导管细胞。这些发现表明，肝与胰腺中内胚层来源细胞的 Jagged 配体能够直接诱导 Notch 活性与相邻细胞的 IHPD 谱系指定。

图 5 | 内胚层表达的 Jagged 诱导 Notch 活性与谱系指定。a 生成内胚层嵌合体胚胎的移植方法示意。在 1 细胞期，向野生型 Tp1:GFP 供体胚胎注射罗丹明葡聚糖用于谱系追踪，并注射 sox32 mRNA 以转换为内胚层。在晚囊胚期，供体细胞被移植到注入了针对 Jag1a 与 Jag1b 的反义 MO 以敲低 Jag1b/Jag2b 的 Tp1:GFP 宿主胚胎中。（a，下方面板）内胚层嵌合体胚胎示例，显示罗丹明葡聚糖标记的供体细胞（红）主要定位于 sox17:GFP⁺（绿）宿主肠内胚层区域。b、c 按 a 所述方法生成的嵌合宿主胰腺（b）与肝脏（c）的免疫荧光分析，证明表达野生型 Jag1b/Jag2b 的内胚层细胞挽救了 Jag1b/Jag2b 受损胚胎中的 Notch 信号。Tp1:GFP⁺ 细胞（绿）只出现在含有野生型供体细胞（红）的区域，而不在没有供体细胞的区域（黄色星号）。（d、e）（代表性样本，n = 10 个胚胎，样本汇集自 2 次实验）。无罗丹明葡聚糖的（Tp1:GFP⁺ 宿主细胞；红，白色箭头与箭头）总与罗丹明葡聚糖⁺ 细胞直接相邻。所有被挽救的 Tp1:GFP⁺ 宿主细胞在胰腺中为 Nkx6.1⁺（蓝），在肝脏中为 Alcama⁺（蓝），表明它们属于导管谱系。比例尺：250 μm（a），25 μm（b–e）。

三、讨论

本研究回答了关于肝胰内导管谱系指定、功能与疾病的若干基本悬而未决的问题。能够生成在整个器官发生期存活的 jag1b/jag2b 复合纯合子胚胎这一独特能力，对本研究至关重要。我们的突变体分析证明：仅两个配体 Jag1b 与 Jag2b，就负责了斑马鱼外分泌胰腺与肝脏中全部可检测的经典 Notch 信号与全部导管谱系指定（图 6 总结）。Notch 信号曾因伴随 Rbpjk、Hes1 与 Sox9 丧失所出现的胰腺发育不全而与细胞周期相关联；然而，jag1b−/−;jag2b−/− 胚胎中完全缺乏任何可检测的经典 Notch 信号，而胰腺大小正常，提示这些核因子在胰腺早期生长中的作用并不依赖于配体依赖的经典 Notch 信号。

jag1b−/−;jag2b−/− 胚胎也有助于区分 Notch 信号在导管谱系指定与维持中的角色。这些双突变体中胰腺导管细胞的丧失，并未伴随其他 Notch 功能丧失方式所见过的内分泌过度分化。Notch 信号丧失在阶段与严重程度上的差异，可以解释所发现表型的差别。我们得出结论：在胰腺发育过程中，Notch 信号功能最初为导管谱系指定与新生内分泌谱系所必需，后来则为抑制内分泌命运以维持导管谱系所必需（图 6 总结）。

在双突变体中导管谱系指定完全丧失，而腺泡与肝细胞区室的发育与形态发生并未明显受影响——这一发现尤其出人意料，因为 IHPD 被认为在器官发生中起核心作用，向腺泡与肝细胞区室贡献祖细胞。我们的研究利用 jagged 突变体提供了功能性证据，并用最早的导管特异报告器提供了更确定的谱系追踪数据，揭示肝与胰腺的导管对发育中的肝细胞与腺泡谱系并非必需，也不贡献显著数量的细胞。对肝与胰腺祖细胞生物学的深入理解，将塑造我们对这些器官相关疾病（如癌症、糖尿病与 Alagille 综合征）的再生与疾病的认识。

在双突变体胚胎中 Jagged/Notch 信号完全缺失，我们推测：那些本应贡献于肝胰内导管的细胞被错误指定为采纳腺泡与肝细胞命运。由于表达 Jagged 的细胞功能是诱导 Notch 信号与导管谱系，而这些突变体中没有任何导管特异基因被激活，因此目前无法通过正式的谱系追踪实验来确定「推定导管」的谱系衍生物。然而，已有研究表明通过错误表达 Notch 胞内结构域异位激活 Notch 信号，可以在腺泡细胞与肝细胞中诱导导管谱系标记，提示 Notch 信号能够以牺牲肝细胞与腺泡命运为代价促进导管命运。结合我们的功能丧失研究，我们倾向于这样一个模型：Notch 在胰腺与肝脏早期发育中发挥作用，把腺泡与肝细胞前体改道去采纳导管命运（图 6 总结）。该模型主张：在缺乏 Notch 信号时，腺泡与肝细胞谱系是默认命运。

基于小鼠中 Jag1 功能的研究，当前主流模型认为 ALGS 中的肝内导管稀少是由非内胚层来源细胞提供的 JAG1 信号不足所致的肝导管管腔形成缺陷。然而本文的结果提示：ALGS 中的导管稀少也可能是由于导管谱系指定受损，以及肝与胰腺中内胚层来源细胞提供的 Jagged 信号减少。Jag1 杂合小鼠只有在被大量回交到 C57BL/6J 背景后才表现出肝导管稀少缺陷，提示还有其他基因参与；一致地，Jag1 与 Notch2 双杂合小鼠确实表现出胆管稀少，但该缺陷被归因于导管形态发生失败而非细胞命运指定失败。我们发现的「因两个 Jagged 配体同时丧失而导致导管谱系指定缺陷」与「因 Jag1 丧失而导致导管形态发生缺陷」之间的对比，很可能是 Jagged 功能丧失程度或时序不同所致，但也不能排除物种特异性差异。未来在哺乳动物肝胰祖细胞中同时敲除 Jag1 与 Jag2，可能揭示 Jagged 配体在哺乳动物导管谱系指定中的保守作用。

如果受损的导管谱系指定确实是 ALGS 患者导管稀少的促成因素，我们将需要重新思考该病理的治疗策略，并考虑用再生方法替代该疾病中丢失的导管细胞。

图 6 | 模型图：Jagged1b 与 Jagged2b 在斑马鱼肝脏与胰腺导管谱系指定中的共同作用。

在器官发生期间，多能的肝脏与胰腺前体默认分别产生肝细胞与腺泡细胞。在这两个器官中，Jagged/Notch 信号对于把这些多能前体诱导进入导管谱系都是必需的。一旦某个细胞中被激活 Notch 信号，它就只会贡献于导管谱系。在胰腺中，通过 γ-分泌酶抑制剂（GSI）从已被指定为导管谱系的细胞中去除 Notch 信号，可能导致它们错误分化为内分泌细胞。紫色标示的因子展示胰腺与肝脏之间细胞类型的遗传相似性，绿色与蓝色分别为胰腺与肝脏特异的因子。

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