Mai Nguyen-Chi、Béryl Laplace-Builhé、Jana Travnickova、Patricia Luz-Crawford、Gautier Tejedor、Georges Lutfalla、Karima Kissa、Christian Jorgensen、Farida Djouad

法国蒙彼利埃第一大学 INSERM · CNRS 免疫与感染研究所（IRMB）
DIMNP · 智利洛斯安第斯大学细胞与分子免疫学实验室 · 蒙彼利埃大学骨关节疾病临床单元与生物治疗部

Cell Death and Disease (2017) 8, e2979; doi:10.1038/cddis.2017.374　|　在线发表 2017-08-10
收稿 2017-04-06　修回 2017-06-22　接收 2017-06-23　|　Cell Death and Differentiation Association 官方期刊

一句话读懂

斑马鱼幼鱼的尾鳍切断后会重新长出来，但到底是谁在指挥这场再生？本文给出的答案是：巨噬细胞，而且要分两批、分两个阶段来干活。早期（6–24 小时）涌入的促炎型（M1 样）巨噬细胞释放 TNFα，通过基质细胞上的 TNFR1 打开「增殖闸门」，让芽基（blastema）细胞开始分裂；晚期（24–72 小时）才到的抗炎型（M2 样）巨噬细胞则不管增殖，而是重塑间充质细胞的行为。最漂亮的是「并体（parabiosis）」实验——把两个胚胎缝在一起共用血液循环，证明了 TNFR1 必须在基质细胞自己身上，光靠往伤口里塞巨噬细胞救不回来。

核心要点

①背景悬案：巨噬细胞在再生中的作用早有报道，但斑马鱼幼鱼阶段一直结论矛盾——pu.1 吗啡啉（阻断所有髓系细胞）不影响鳍再生，irf8 吗啡啉（阻断巨噬细胞分化）报道的结果也自相矛盾。根源在于很难在不波及其他细胞的前提下精准、有效地清除巨噬细胞。

②本文策略：用 Tg(mpeg1:mCherry-F/tnfa:eGFP-F) 双转基因品系追踪功能上不同的巨噬细胞亚群，并在再生过程的不同时间点分别做化学清除（脂质体氯膦酸盐）与遗传清除（mpeg1-NTR + 甲硝唑），从而把「阶段依赖性」彻底厘清。

③两个阶段、两种细胞：tnfa⁺（M1 样）巨噬细胞在 6 hpA 即到达并在 6 hpA 达峰（早期清除会阻断其募集）；tnfa⁻（M2 样）巨噬细胞从 6 hpA 持续到 3 dpA，峰值在 24–72 hpA。早期清除影响芽基细胞增殖，晚期清除影响间充质细胞形态（伸长失败）但不影响增殖与死亡。

④TNFα 是关键信号：药理学（己酮可可碱 PTX 抑制 tnfa 转录）与遗传学（tnfr1 吗啡啉 + tnfa 吗啡啉）两条独立路径都证明 TNFα/TNFR1 轴是鳍再生所必需的。tnfr1 吗啡啉胚胎在 6–48 hpA 伤口处巨噬细胞数量减少、24/48 hpA 芽基增殖下降、3 dpA 再生缺陷。

⑤本文最强的一步：并体（parabiosis）实验——把 Tg(mpeg1:mCherry-F) 胚胎与野生型胚胎在原肠胚期融合成共用一个血液循环的联体：野生型供体的巨噬细胞能跨过血流进入敲低伙伴的伤口，但伙伴若自身基质细胞缺 tnfr1，再生依然失败——「循环里的细胞救不了没有受体的场地」。

⑥TNFα 的双重角色：（一）正反馈放大募集——TNF 敲低并不影响巨噬细胞的初始迁移，只是削弱后续累积；（二）直接驱动芽基增殖——经基质细胞的 TNFR1 发挥作用。

⑦一个反直觉的结论：M1 样巨噬细胞并非「有害」——它们通过分泌 TNFα 创造一个「允许再生」的 permissive 环境，为高效再生铺路。这与哺乳动物骨骼肌再生中 M1 状态单核/巨噬细胞分泌 IL-6、TNFα、IL-1β 刺激成肌前体增殖的机制类似。

一、引言：再生研究里最著名的「免疫悖论」

与哺乳动物不同，包括斑马鱼（Danio rerio）在内的低等脊椎动物具有再生丢失或受损组织（如尾鳍）的迷人能力。这一现象称为形态发生型再生（epimorphic regeneration），通过形成一个称为芽基（blastema）的结构来实现——它由大量高增殖率的基质细胞聚集而成，这些细胞增殖并分化，形成丢失结构的精确副本。虽然芽基形成与形态发生型再生的机制已被广泛研究，但仍然知之甚少。伤口的命运取决于分子与细胞过程，而这些过程在各动物物种间具有共同特征：任何损伤之后，免疫细胞立即浸润伤口。尽管白细胞对抵抗微生物入侵不可或缺，但它们被认为在损伤结局（纤维化 vs 再生）中同样发挥关键作用。

近年来，巨噬细胞在形态发生型再生中的作用受到大量关注。巨噬细胞最初因吞噬能力而被描述，在炎症中居核心地位，但也积极参与炎症的消退。巨噬细胞在发育、稳态与组织修复中发挥有益功能，在某些人类疾病中也扮演有害角色。在成年美西螈中，已有研究表明巨噬细胞是四肢再生所必需的：用脂质体包裹的氯膦酸盐在再生过程的不同时间点清除巨噬细胞，揭示出早期巨噬细胞对该过程至关重要。

在斑马鱼幼鱼中，用吗啡啉策略与突变体研究巨噬细胞在尾鳍再生中的作用曾得出有争议的结果：抑制全部髓系细胞发育的 pu.1 吗啡啉（MO）不影响鳍再生；而阻断巨噬细胞谱系分化的干扰素调节因子 8（irf8）MO，则被报道要么延迟再生、要么对鳍再生无影响。在缺乏大部分造血组织与细胞（包括髓系细胞）的斑马鱼 cloche 突变体中，尾鳍再生虽能启动，但观察到凋亡增加与再生细胞增殖缺失，导致再生缺陷。这些差异可能源于难以在不波及其他细胞的前提下特异性、高效地抑制巨噬细胞谱系，这凸显了研究其在幼体再生中作用时需要精确方法的重要性。在成年斑马鱼中，整个再生过程中对巨噬细胞做遗传消融会通过损害芽基细胞增殖而影响尾鳍再生速率，而在组织外生长阶段做消融则只改变组织的图式 patterning。这种阶段依赖性效应强烈提示：存在功能不同的巨噬细胞群体，分别编排肢体/鳍再生的不同阶段。然而，这一点从未被清晰证明。

近期我们已证明斑马鱼中存在不同的巨噬细胞亚型。损伤或 E. coli 感染会诱导巨噬细胞向 M1 样与 M2 样表型极化，表达促炎细胞因子如肿瘤坏死因子 α（tnfa）、白细胞介素-6（il6）与 il1b，以及抗炎细胞因子如转化生长因子 β-1（tgfb1）。这些巨噬细胞亚群与哺乳动物中经典活化的 M1 与交替活化的 M2 巨噬细胞相似。本研究以斑马鱼幼鱼这一易操控体系，完成三项目标：（1）研究功能不同的巨噬细胞亚群在尾鳍切断后被招募至伤口的过程；（2）考察它们在形态发生型再生各阶段中的作用；（3）鉴定出促进「再生许可环境」的巨噬细胞来源分子。

二、结果

1. 再生过程中巨噬细胞的募集与激活：两批细胞，两段时间

我们此前描述过：斑马鱼幼鱼尾鳍切断会触发巨噬细胞的激活与极化，且 tnfa⁺ 巨噬细胞表达 M1 标记 tnfb、il1b、il6，而 tnfa⁻ 巨噬细胞表达 M2 标记 tgfb1、ccr2、cxcr4b。为进一步精确刻画巨噬细胞在尾鳍再生中的行为，我们建立了 3 天龄（dpf）斑马鱼尾鳍切断后巨噬细胞亚群募集的动力学。为特异性追踪各亚群，我们使用了 Tg(mpeg1:mCherry-F/tnfa:eGFP-F) 双转基因幼鱼——其中 tnfa 阳性（M1 巨噬细胞标记）的巨噬细胞同时表达两种异戊二烯化形式的荧光蛋白（GFP-F 与 mCherry-F），并在切断后不同时间点成像。

与既往研究一致，我们观察到巨噬细胞（mpeg1⁺）迅速被招募至伤口，并在整个再生过程（至切断后 3 天，dpA）中持续存在（图 1a–c）。tnfa⁺ 巨噬细胞主要自切断后 6 小时（hpA）开始在伤口聚集，并在 6 hpA 达到峰值（图 1b、c）。相比之下，tnfa⁻ 巨噬细胞自 6 hpA 起存在于受损鳍中直至 3 dpA（图 1c），峰值在 24–72 hpA 之间。这一结果提示，两个不同的巨噬细胞亚群在再生过程中经历相继的动力学：M1 样巨噬细胞在再生早期阶段聚集（称为阶段 1），而 M2 样巨噬细胞在过程后期达峰（阶段 2）（图 1c）。

图 1 | tnfa⁺ 与 tnfa⁻ 巨噬细胞在斑马鱼幼鱼尾鳍再生中被差异性招募。a 3 dpf 幼鱼中截尾方案（红箭头）与计数区域（粉色框）示意。b Tg(mpeg1:mCherry-F/tnfa:eGFP-F) 的尾鳍于 3 dpf 按 a 所示切断，在未损伤（Ctrl）或切断后 6 hpA 用共聚焦显微镜分析 mCherry-F 与 GFP-F 表达。鳍图像为单荧光通道（mCherry-F、GFP-F）的代表性最大强度投影，以及荧光与透射光图像的叠加（Merge）。箭头标示 mCherry-F⁺GFP-F⁺ 细胞，星号标示 GFP-F⁺ 细胞，虚线勾勒鳍的轮廓。比例尺 = 20 μm。c 切断后 3 天内各时间点被招募至伤口区域的 tnfa⁺ 与 tnfa⁻ 巨噬细胞数量。每个时间点所用幼鱼数（N）标于图上方。**P < 0.01、***P < 0.001 表示与 0 hpA 相比。图下方为巨噬细胞亚群募集不同阶段的示意：M1 样巨噬细胞在再生早期阶段（阶段 1）聚集，而 M2 样巨噬细胞在过程后期（阶段 2）达峰。

2. 巨噬细胞在再生中的作用具有阶段依赖性

为确定巨噬细胞在再生两个阶段中的作用，我们依次对巨噬细胞进行清除。首先采用化学方法：脂质体包裹的氯膦酸盐可诱导吞噬性巨噬细胞死亡，我们分别在两个时间点注射（L-氯膦酸盐 1 与 L-氯膦酸盐 2），以优先靶向促炎或抗炎巨噬细胞（图 2a）。与既往研究一致，48 hpf 时静脉注射 L-氯膦酸盐可有效降低注射后 24 小时的巨噬细胞总数，且不影响中性粒细胞数量、也不引起非特异性毒性（补充图 1a–c，数据未显示）。L-氯膦酸盐阻止了切断后巨噬细胞向伤口的募集（4 至 72 hpA）（补充图 1d、e）。在切断前 24 小时注射 L-氯膦酸盐所抑制的 M1 样与 M2 样巨噬细胞募集，损害了鳍的再生性外生长（以初始切断位置到新的鳍远端边缘的距离衡量，图 2b、c，L-氯膦酸盐 1）。

形态发生型再生包含一个芽基细胞增殖的爆发：早在 6 hpA 即在幼鱼残端附近区域出现，随后自 24 hpA 起向更近端区域传播，至 3 dpA 恢复正常水平。因此，我们通过免疫检测磷酸化组蛋白 3（标记增殖细胞，PH3⁺）评估了 L-氯膦酸盐注射幼鱼在整个再生过程中的芽基细胞增殖，发现伤口处细胞增殖低于对照，且在 24 hpA 具有统计学意义（图 2d；补充图 2a）。这与芽基标记基因 junbl 的下调相关（由原位杂交检测，补充图 2b）。这一结果揭示了巨噬细胞在斑马鱼幼鱼鳍再生中的关键作用，很可能是通过促进细胞增殖与芽基形成实现的。

为考察后期（阶段 2）存在于受损鳍中的巨噬细胞的作用，我们在促炎性 tnfa⁺ 巨噬细胞已被募集的时刻——6 hpA——向 Tg(mpeg1:mCherry-F) 幼鱼注射 L-氯膦酸盐（L-氯膦酸盐 2，图 2a）。在 24 与 72 hpA 观察到部分的巨噬细胞募集抑制，并伴随鳍外生长受损与 72 hpA 时再生鳍的形态学缺陷（图 2e、f，L-氯膦酸盐 2，未显示）。与早期清除不同，晚期清除并未改变芽基细胞的增殖（图 2g；补充图 2c）。

其次，为进一步确认巨噬细胞在再生中的阶段依赖性作用，我们采用另一种转基因方法：利用 mpeg1 启动子驱动 E. coli 硝基还原酶（NTR）酶的表达以特异性清除巨噬细胞。用前药甲硝唑（MTZ）在 48 hpf 处理，可有效在 3 dpf 清除巨噬细胞（图 3a；补充图 3a、b）。与 L-氯膦酸盐（L-氯膦酸盐 1）注射类似，48 hpf 的 MTZ 处理（MTZ 1，即切断前 24 小时）阻止了 6 至 72 hpA 的巨噬细胞募集（补充图 3c、d），并改变了 3 dpA 时的鳍再生（图 3b、c）。再生缺陷与伤口处 junbl 表达水平降低、24 与 48 hpA 芽基细胞增殖速率下降相关（补充图 3e、f）。在 6 hpA 施用 MTZ（MTZ 2）以清除晚期募集的巨噬细胞，同样导致鳍再生过程受损（图 3d、e）。然而，晚期巨噬细胞清除既不影响芽基细胞的增殖，也不影响 junbl 表达谱（补充图 3g–h）。

图 2 | 巨噬细胞以阶段依赖的方式参与鳍再生与芽基细胞增殖。a 用 L-氯膦酸盐注射清除巨噬细胞（Mφ）的时间安排。巨噬细胞通过早期 L-氯膦酸盐注射被清除（L-氯膦酸盐 1；伤口处无巨噬细胞），或在后期注射 L-氯膦酸盐被清除（L-氯膦酸盐 2；自 24 hpA 起不再有 M2 样巨噬细胞被募集）。b、e 巨噬细胞清除对尾鳍再生的后果。b 为在再生早期阶段清除所有巨噬细胞，Tg(mpeg1:mCherry-F) 幼鱼在 48 hpf 注射 L-氯膦酸盐（L-clo）或 L-PBS（对照），尾鳍于 72 hpf 切断（L-氯膦酸盐 1）。e 为清除晚期募集的巨噬细胞，Tg(mpeg1:mCherry-F) 幼鱼在 6 hpA 注射 L-氯膦酸盐或 L-PBS（L-氯膦酸盐 2）。鳍图像为 3 dpA 时 mCherry 荧光与透射光采集的代表性叠加。比例尺 = 100 μm。虚线勾勒鳍轮廓，虚线箭头标示初始切断位置。c、f L-氯膦酸盐 1 处理（c）与 L-氯膦酸盐 2 处理（f）后 3 dpA 时再生鳍长度的相应定量（均值 ± S.E.M.，**P < 0.01、***P < 0.001）。d–g L-氯膦酸盐 1（d）与 2（g）处理后 24 hpA 的芽基细胞增殖。分裂细胞用抗磷酸化组蛋白 H3（PH3）抗体检测（Nlarvae = 10–15，cut/uncut 比值的平均值 ± S.E.M.，*P < 0.05）。

图 3 | 不同阶段的遗传性巨噬细胞清除确认了巨噬细胞在鳍再生中的必要性。a 用 Tg(mpeg1:GAL4/UAS:NTR-mCherry) 幼鱼与甲硝唑（MTZ）处理清除巨噬细胞的时间安排。b–e Tg(mpeg1:GAL4/UAS:NTR-mCherry) 幼鱼经 MTZ 处理（NTR⁺ MTZ⁺）以清除巨噬细胞。同一品系的 DMSO 处理（NTR⁺ MTZ⁻）或野生型同窝的 MTZ 处理（NTR⁻ MTZ⁺）作为对照。b 处理自 48 hpf 开始，尾鳍于 3 dpf 切断，以在整个再生过程中清除巨噬细胞（MTZ 1）。d 处理自 6 hpA 开始，以清除晚期巨噬细胞（MTZ 2）。鳍图像为 3 dpA 时 mCherry-F 荧光（红）与透射光采集的代表性叠加。比例尺 = 100 μm。虚线勾勒鳍轮廓，虚线箭头标示初始切断位置。c、e MTZ 1（c）与 MTZ 2（e）处理中 3 dpA 时再生鳍长度的相应定量（均值 ± S.E.M.，来自三次独立实验，***P < 0.001、*P < 0.05）。

为理解晚期巨噬细胞清除幼鱼中鳍再生异常的原因，我们研究了细胞死亡与再生鳍的结构。我们用吖啶橙染色在切断后不同时间点定量早期与晚期巨噬细胞清除幼鱼鳍中的死细胞。L-氯膦酸盐 1 与 2 处理对完整鳍中的细胞死亡均无影响（图 4a、b）。切断后，细胞死亡自 6 hpA 起在伤口处被诱导。尽管 L-氯膦酸盐 1 处理使 48 hpA 的细胞死亡强于对照（图 4a、c），但 L-氯膦酸盐 2 处理的效果与 L-PBS 对照相似（图 4b、d）。

间充质细胞是此阶段鳍褶的主要组分之一，在鳍再生过程中其形态发生显著变化。为分析再生期间间充质细胞的行为，我们在 3 dpf 切断 Tg(rcn3:gal4/UAS:DsRed) 幼鱼的尾鳍，该品系中脊索细胞与鳍的间充质细胞均为荧光。我们观察到与对照相比，L-氯膦酸盐 2 处理幼鱼的间充质细胞伸长部分失败（对照 Nlarvae = 17，L-氯膦酸盐条件 Nlarvae = 5，图 4e）。这一观察提示，晚期 M2 样巨噬细胞的清除通过损害间充质细胞行为而导致再生缺陷，而不改变细胞死亡或增殖速率。总体而言，这些结果凸显了巨噬细胞在鳍再生中的关键作用，并证明存在功能上不同的亚群。此外，我们的数据提示早期募集的巨噬细胞在芽基形成中起关键作用。

图 4 | 清除晚期募集的巨噬细胞通过损害间充质细胞行为而非细胞死亡来影响再生。a、b 代表性图像显示（a）48 hpA 与（b）24 hpA 时完整与切断鳍中的细胞死亡（绿色），用共聚焦显微镜观察。（a）细胞死亡用吖啶橙染色检测，幼鱼在切断前 24 小时经 L-氯膦酸盐处理清除所有巨噬细胞（L-氯膦酸盐 1）或未处理（L-PBS）。（b）细胞死亡用吖啶橙染色检测，幼鱼在 6 hpA 经 L-氯膦酸盐处理清除晚期巨噬细胞（L-氯膦酸盐 2）或未处理（L-PBS）。虚线勾勒鳍轮廓，星号表示色素的自发荧光，箭头标示死细胞。比例尺 = 100 μm。c、d 各条件下的细胞死亡计数（每组 Nlarvae = 7–18，来自两次独立实验，均值 ± S.E.M.，*P < 0.05）。e Tg(rcn3:gal4/UAS:DsRed) 幼鱼于 3 dpf 切断，并在 6 hpA 注射 L-PBS 或 L-氯膦酸盐。鳍图像为 72 hpA 时鳍中间充质细胞 Ds-Red（品红）荧光的代表性共聚焦最大强度投影。箭头标示晚期巨噬细胞清除幼鱼伤口处呈圆形的间充质细胞。比例尺 = 100 μm。

3. TNFα/TNFR1 信号在调控鳍再生中的作用

TNFα 在再生早期阶段由巨噬细胞释放（图 1a–c 及文献 16），我们决定用不同的抑制手段检验 TNF 信号在再生中的参与。首先使用药理学药物己酮可可碱（pentoxifylline，PTX），此前已证明它能在多种体外与体内系统中有效抑制 tnfa 转录。为评估该阻断在斑马鱼幼鱼中的效率，我们对 Tg(mpeg1:mCherry-F/tnfa:eGFP-F) 切断幼鱼施以 PTX 处理。与 DMSO 对照相比，PTX 处理使鳍中 GFP-F⁺ 细胞数量在 6 hpA 减少（图 5a、b），尤其是 GFP-F⁺ 巨噬细胞，并使 24 hpA 时被募集至伤口的巨噬细胞数量减少（补充图 4a、b）。这与 PTX 处理鳍中 tnfa mRNA 表达在 5 hpA 下降相关（图 5c）。我们通过测定 il1b 与 il8 mRNA 稳态水平来监控 PTX 对其他细胞因子���影响：il1b mRNA 量下降，而 il8 未下降（补充图 4c、d）。

这表明 PTX 在斑马鱼中能有效抑制 tnfa 表达，同时也在较小程度上调节 il1b。

尽管 PTX 处理未影响完整鳍的生长（数据未显示），它却损害了 3 dpA 时尾鳍的再生性外生长（图 5d、e）。这与 24 与 48 hpA 芽基细胞增殖速率较对照下降相关（图 5f），但细胞死亡未受损（补充图 4e）。TNFα 的两个受体之一 tnfrsf1a（又称 tnfr1）已被报道在 3 dpf 幼鱼中广泛表达。对 6 hpA 分选细胞做 qRT-PCR 显示，tnfr1 在巨噬细胞（mpeg1⁺ 与 mpeg1⁺tnfa⁺）与非巨噬细胞（阴性）中均有表达，但在 M1 样巨噬细胞（mpeg1⁺tnfa⁺）中表达量更高（图 5g）。

为更具体地检验 TNFα/TNFR1 信号在鳍再生中的作用，我们采用吗啡啉介导的基因敲低。首先，用位于 tnfr1 吗啡啉所靶向剪接位点两侧的引物，我们提供了 3 dpf tnfr1 突变体中 tnfr1 剪接模式部分改变的证据（补充图 5）。其次，为考察 tnfr1 在巨噬细胞募集中的作用，我们向 Tg(mpeg1:mCherry-F) 胚胎注射 tnfr1 MO。虽然未切断的 tnfr1 突变体的整体形态及其巨噬细胞总数均未显著受影响（数据未显示），我们观察到巨噬细胞在 3 hpA 时被募集，但伤口处数量较对照吗啡啉（Ctrl MO）在 6 至 48 hpA 期间减少（图 5h、i）。这提示 TNFR1 对巨噬细胞在伤口处的初始募集并非必需，但可进一步增强巨噬细胞在再生鳍中的累积。在更晚的阶段（3 dpA），tnfr1 突变体相较对照吗啡啉表现出部分鳍再生缺陷（图 5j、k）。与此同时，PH3 免疫检测显示 tnfr1 突变体在 24 与 48 hpA 的芽基细胞增殖显著下降（图 5l）。

类似地，tnfa 突变体在 3 dpA 的鳍再生也受损（补充图 6a、b），提示这些再生缺陷是特异性的，而非吗啡啉相关的普遍伪影或脱靶效应所致。综上，这些结果证明 TNFα/TNFR1 信号通路是芽基细胞增殖与鳍再生所必需的。

图 5 | TNF 信号是斑马鱼尾鳍再生所必需的。a Tg(mpeg1:mCherry-F/tnfa:eGFP-F) 幼鱼被切断并用 DMSO 或己酮可可碱（PTX）处理。代表性鳍图像显示 6 hpA 时的单荧光通道与荧光叠加（Merge）。白色箭头标示伤口。b 各条件下伤口区域 GFP-F⁺ 细胞的数量（Nlarvae = 8–10，均值 ± S.E.M.，两次独立实验，***P < 0.001）。c DMSO 或 PTX 处理幼鱼中 tnfa mRNA 相对于 ef1a 的 qRT-PCR。尾鳍于 3 dpf 切断或不切断，幼鱼随即用 DMSO 或 PTX 处理。RNA 取自尾部（每样本 18 条幼鱼，三次实验的均值 ± S.E.M.，*P < 0.05）。d DMSO 与 PTX 处理后 3 dpA 时鳍的代表性透射光图像。e 各条件下 3 dpA 时再生鳍的长度（均值 ± S.E.M.，三次独立实验，**P < 0.005）。f 各条件下 6、24、48、72 hpA 的芽基细胞增殖。分裂细胞用鳍区域的抗 PH3 抗体检测（Nlarvae = 13–23，cut/uncut 比值均值 ± S.E.M.，两次独立实验，*P < 0.05，**P < 0.005）。g 分选巨噬细胞中 tnfr1 mRNA 的稳态水平。Tg(mpeg1:mCherry-F/tnfa:eGFP-F) 于 3 dpf 切断，6 hpA 用荧光激活流式细胞术收集细胞，用 qRT-PCR 定量下列细胞群中相对于 ef1a 的 tnfr1 mRNA 稳态水平：mpeg1⁻tnfa⁻（阴性）、mpeg1⁺tnfa⁻（mpeg1⁺）与 mpeg1⁺tnfa⁺（四次独立实验的均值 ± S.E.M.，*P < 0.05）。h 24 hpA 时对照吗啡啉（Ctrl MO）或 tnfr1 突变体的 Tg(mpeg1:mCherry-F) 鳍图像，为 mCherry 荧光与透射光的代表性叠加。i Ctrl 与 tnfr1 突变体中伤口区域巨噬细胞（mCherry-F⁺）在各时间点的募集（每组 Nlarvae = 5–18，均值 ± S.E.M.，两次独立实验，*P < 0.05，**P < 0.005，相对 Ctrl MO 条件）。j 3 dpA 时 Ctrl 吗啡啉与 tnfr1 突变体的代表性透射光鳍图像。k 相应的再生鳍长度（均值 ± S.E.M.，三次独立实验，***P < 0.001）。l 各条件下 6、24、48、72 hpA 的芽基细胞增殖，用抗 PH3 抗体检测（Nlarvae = 5–17，cut/uncut 比值 ± S.E.M.，两次独立实验，**P < 0.01）。（a、d、h、j）虚线勾勒鳍轮廓，虚线箭头标示初始切断位置；比例尺 = 100 μm。

4. 由基质细胞表达的 tnfr1 在鳍再生中的作用

随后我们假设：产生 TNFα 的巨噬细胞通过直接激活芽基基质细胞的增殖（由 TNFR1 介导）来促进再生。为验证该假设并准确区分 tnfr1 基因在迁移细胞与基质细胞中的功能，我们进行了并体（parabiosis）实验——以外科方式生成共用同一血液循环的连体斑马鱼胚胎。为检验巨噬细胞能否从并体伙伴之一迁移到另一方，我们把转基因 Tg(mpeg1:mCherry-F) 原肠胚与绿色荧光野生型（WT）原肠胚融合（图 6a–c）。3 dpf 时，融合胚胎表现出躯干与尾部分离（图 6a、d），且 mCherry-F⁺ 细胞已侵入野生型并体体（数据未显示）。野生型并体体通过荧光素辨认，其尾鳍于 3 dpf 切断（图 6b、d）。0 hpA 时伤口处没有 mCherry-F⁺ 巨噬细胞，但 3 hpA 时，来自转基因并体体的 mCherry-F⁺ 巨噬细胞迁移到伤口（图 6e、f）。3 dpA 时尾鳍正确再生，证明了该方法对再生研究的适用性（图 6g）。

为确定鳍再生是否需要芽基基质细胞上的 tnfr1，我们进行了类似的并体实验并结合吗啡啉介导的沉默策略。我们生成了融合的 Tg(mpeg1:mCherry-F) 胚胎与绿色荧光 tnfr1 突变体，并在 3 dpf 切断突变体的尾鳍，以检验突变体中 mCherry-F⁺ tnfr1WT 巨噬细胞的迁移能力。我们观察到，在 Ctrl 与 tnfr1 突变体中，mCherry-F⁺ tnfr1WT 巨噬细胞在 6 hpA 时同样被募集至伤口（图 6h、i）。3 dpA 时，Ctrl 突变体伙伴正确再生，而 tnfr1 突变体伙伴未能正常再生（图 6j）。为将 tnfr1 敲低限制在基质细胞中，我们向 Tg(mpeg1:GAL4/UAS:NTR-mCherry) 胚胎注射 tnfr1 MO，再把这些突变体的原肠胚与野生型原肠胚融合（图 6k）。48 hpf 的 MTZ 处理导致 3 dpf 时大多数 NTR-mCherry⁺ 巨噬细胞死亡。

随后，在切断突变体的尾鳍后，我们观察到伤口处仅有极少的 NTR-mCherry⁺ 巨噬细胞（图 6l）。尽管 NTR-mCherry⁺ 巨噬细胞已被清除，Ctrl 突变体伙伴在 3 dpA 时仍正常再生（图 6m）。这些结果表明，并体通过募集来自野生型并体体的巨噬细胞，恢复了 Tg(mpeg1:GAL4/UAS:NTR-mCherry) Ctrl 突变体的再生潜能；相反，动员 tnfr1 完整的巨噬细胞，无法挽救基质细胞中 tnfr1 被沉默的 tnfr1 突变体的鳍再生潜能（图 6m、n）。这些结果表明，tnfr1 由基质细胞表达，并介导 TNFα 依赖的斑马鱼尾鳍再生。

最后，为确定缺少 tnfa 的巨噬细胞能否刺激再生，我们以 tnfa 突变体作为巨噬细胞供体、以 MTZ 处理的 Tg(mpeg1:GAL4/UAS:NTR-mCherry) 胚胎作为受伤并体体，进行了类似的并体实验（补充图 6c）。6 hpA 时大多数 NTR-mCherry⁺ 巨噬细胞已被 MTZ 处理清除（补充图 6d）；3 dpA 时，接受 tnfa MO 的并体伙伴比对照再生更少（补充图 6c–f），提示缺少 tnfa 的巨噬细胞刺激再生的效率较低。

图 6 | 基质细胞中 tnfr1 敲低损害鳍再生。a–g 尾鳍切断后，并体幼鱼中的巨噬细胞迁移至伤口。（a）并体实验示意。（b）在盾状期生成连体的 Tg(mpeg1:mCherry-F) 与 WT（荧光素-葡聚糖）胚胎。（c）b 中方框区域的高倍放大。（d）3 dpf 时，连体幼鱼躯干头侧融合发育。WT 幼鱼通过卵黄囊中葡聚糖-荧光素的绿色荧光辨认，并被选定进行尾鳍切断（虚线）。（e）WT 幼鱼尾鳍于 3 dpf、0 hpA 切断；鳍中未检测到 mCherry-F⁺ 巨噬细胞。（f）切断后 4 hpA，mCherry-F⁺ 巨噬细胞迁移至伤口；（g）3 dpA 时鳍完全再生（Nlarvae = 6，比例尺 = 100 μm）。h 使用 Tg(mpeg1:mCherry-F) 与 tnfr1（tnfr1 MO）或对照（Ctrl MO）突变体的并体实验示意。突变体的尾鳍于 3 dpf 在虚线箭头所示区域切断。i 6 hpA 时 mCherry 荧光与透射光通道合并的代表性鳍图像，显示 tnfr1WT 巨噬细胞（mCherry-F⁺）被募集至 tnfr1 与 ctrl 突变体被切断的尾鳍中。j 各条件下 3 dpA 时再生鳍长度的相应定量（tnfr1 MO，Nlarvae = 6；Ctrl MO，Nlarvae = 8）。k 使用 WT 与先前注射过 tnfr1 MO 或 Ctrl MO 的 Tg(mpeg1:GAL4/UAS:NTR-mCherry) 的并体实验示意。为在其中一方诱导巨噬细胞清除，并体幼鱼于 48 hpf 施以 MTZ，并对突变体（荧光素）的尾鳍于 3 dpf 切断。l 6 hpA 时 mCherry 荧光与透射光通道合并的代表性鳍图像，显示 NTR-mCherry⁺ 巨噬细胞已被大部分清除。白色箭头标示细胞或细胞碎片中的残留荧光。m 3 dpA 时 tnfr1 与 Ctrl 突变体的代表性透射光鳍图像。n 各条件下再生鳍长度的相应定量（Nlarvae = 4–6，均值 ± S.E.M.，*P < 0.05）。（f、g、i、l、m）虚线勾勒鳍轮廓。（m）虚线箭头标示初始切断位置。比例尺 = 100 μm。

三、讨论

尽管人们为理解形态发生型再生的基础付出了大量努力，巨噬细胞究竟通过何种分子机制传递信号仍鲜有报道。本文展示了一个新角色：在斑马鱼鳍损伤应答的再生过程中，巨噬细胞来源的 TNF 信号编排了这一过程（图 7）。

在本研究中，我们鉴定出 TNFα 是再生早期极化巨噬细胞短暂表达的关键信号之一，调控再生过程。第一，我们证明用 PTX 处理——一种在体外与体内都能有效抑制 TNFα 反应的非选择性磷酸二酯酶抑制剂——会损害再生。尽管 PTX 在斑马鱼中抑制 tnfa mRNA 产生而对其他促炎细胞因子影响不大，但 tnfa 可能并非 PTX 的唯一靶点。第二，用针对受体 tnfr1 与配体 tnfa 的吗啡啉，我们证明 TNFR1/TNFα 轴是正常再生所必需的。

在我们的体系中，TNFα 促进巨噬细胞募集，很可能扮演着放大巨噬细胞向伤口累积的增强环路（图 7）。TNFα 不太可能是触发巨噬细胞募集的第一个信号，因为 TNF 信号敲低既未影响巨噬细胞向受损鳍的初始迁移，也未完全废除其募集。已知有其他趋化分子——包括受损细胞的内容物、完整细胞产生的趋化因子以及一波 H₂O₂——会由伤口释放并触发白细胞募集。这些分子可能作为巨噬细胞募集的初级信号，独立于 tnfa 发挥作用。

TNFα 信号的第二个作用是通过刺激芽基细胞增殖来促进再生。并体实验结合吗啡啉敲低策略强烈提示，TNFα 通过其受体 TNFR1 直接作用于基质细胞（图 7）。事实上，并体能够挽救那些 tnfr1 完全胜任的巨噬细胞清除幼鱼的鳍再生；相反，在 tnfr1 不胜任的鳍中，任何循环细胞（包括巨噬细胞）或可溶性因子都无法恢复再生潜能。此外，我们显示缺少 tnfa 的巨噬细胞在并体中刺激再生的效率较低。尽管 TNFα 的作用可以非常多样，我们的结果与提示其通过促进前体细胞增殖而在视网膜再生中发挥作用的研究一致。

TNF 信号在鳍再生中的必要作用提示，自我限制的急性炎症对于恰当的再生应答是必需的。Petri 及其合作者此前证明，Wnt/β-catenin 信号对成年斑马鱼鳍的芽基形成与再生性外生长至关重要，它调控巨噬细胞募集与细胞因子分泌。Wnt/β-catenin 可能是 TNFα/TNFR1 的上游信号，通过调控巨噬细胞表型的平衡来控制再生进程的推进。

越来越多的证据表明，再生依赖于免疫细胞在伤口部位的及时、受控的介入。尽管巨噬细胞在成年美西螈的肢体再生与成年斑马鱼的尾鳍再生中都是必需的，其在幼体阶段鳍再生中的作用却一直存在争议。本文采用两种独立方法，在幼鱼鳍多阶段再生过程的不同时间点高效且特异地消融了巨噬细胞。化学与遗传清除巨噬细胞的结果一致表明：在早期阶段被募集的巨噬细胞（包括 M1 样与 M2 样）通过刺激芽基细胞增殖而为鳍再生所必需；相反，在再生后期存在、表现为 M2 样表型的巨噬细胞，则可能通过重塑间充质细胞来促进再生。这些结果与在成年斑马鱼和蝾螈中的观察一致，并强调了成年与幼体再生机制之间的相似性。

尽管 M2 极化巨噬细胞被认为更倾向于与组织修复相关，我们的结果却提示 M1 样巨噬细胞通过产生 TNFα 创造了一个许可性环境，为高效再生铺平了道路。M1 样巨噬细胞的积极角色——作为营养因子产生者——让人联想到哺乳动物骨骼肌损伤后再生中的观察：来源于血液、处于 M1 状态的单核/巨噬细胞通过分泌 IL-6、TNFα、IL-1β 等分子刺激成肌前体细胞的增殖。在哺乳动物中，M2 巨噬细胞并非均一群体，往往进一步分为 M2a、M2b 与 M2c 亚类。与哺乳动物类似，斑马鱼幼鱼的 M2 样巨噬细胞可能包含在再生过程中发挥不同功能的亚群。事实上，早期 M2 样与晚期 M2 样巨噬细胞的功能可能并不相同。近期有研究表明，巨噬细胞能衰减伤口上皮中 il1b 的表达，防止再生鳍中过度的细胞死亡。如先前所示，早期 M2 样巨噬细胞表达 tgfb1 等抗炎基因，提示它们负责降低 il1b 介导的炎症。在本研究中，晚期 M2 样巨噬细胞对细胞增殖与细胞死亡无作用，而是在再生后期调控间充质细胞行为。

该功能究竟通过直接接触介导，还是通过表达营养因子实现，仍属未知。

总之，我们提出：形态发生型再生过程依赖尾鳍切断后被激活的 M1 样巨噬细胞所表达的 TNFα 的一段狭窄作用窗口。TNFα 对芽基细胞增殖与命运的关键效应取决于 TNFR1。

图 7 | 巨噬细胞募集与 TNFα 信号在芽基形成启动与尾鳍再生中的模型。3 dpf 斑马鱼幼鱼尾鳍切断后，早期炎症反应表现为 M1 样巨噬细胞自 6 至 24 hpA 在伤口部位聚集，随后 M2 样巨噬细胞逐渐累积。这一受严格调控的 M1/M2 平衡控制着再生过程的不同阶段：表达 tnfa 的 M1 样巨噬细胞激活 TNFα/TNFR1 轴，以增强巨噬细胞向伤口的募集；此外，M1 样巨噬细胞介导的 TNFα 通过受体 TNFR1 控制芽基细胞的增殖。晚期 M2 样巨噬细胞参与鳍的重塑。Mφ，巨噬细胞；MO，吗啡啉反义寡核苷酸；PTX，己酮可可碱；hpA，切断后小时数；dpA，切断后天数。

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