Cilia regulate meiotic recombination in zebrafish

Haibo Xie†, Xiaosi Wang†, Minjun Jin, Lanqin Li, Junwen Zhu, Yunsi Kang, Zhe Chen, Yonghua Sun*, Chengtian Zhao*

中国海洋大学；中国科学院水生生物研究所（水生所）淡水生态与生物技术国家重点实验室、种子设计创新研究院、湖北洪山实验室；海洋生物科学与技术国家实验室；中国科学院大学

通讯作者：Chengtian Zhao（赵呈天，chengtian_zhao@ouc.edu.cn）、Yonghua Sun（孙永华，yhsun@ihb.ac.cn）　共同第一作者：Haibo Xie（谢海博）、Xiaosi Wang（王晓思）

期刊论文 · 全文中文翻译　|　Journal of Molecular Cell Biology　·　《分子细胞生物学杂志》 · Oxford University Press 出版（代表中国科学院分子细胞生物学重点实验室） · 2022 年 14 卷 7 期 · 原创研究论文（Article）

期刊与出版信息

一句话速读

减数分裂重组长期被视为核内过程——但细胞质、甚至细胞外的信号能否介入？本文给出了一个此前无人注意到的答案：初级精母细胞在减数分裂前期长出了一根纤毛。作者用免疫荧光与电镜证明它从细线期出现、直线期消失，具有 '9+0' 轴丝结构（不同于精子鞭毛的 '9+2'），由中心粒发出——也就是说，它不是精子鞭毛的前体。为验证其功能，作者建立了一套生殖细胞特异的 CRISPR/Cas9 体系（Tg(kop:cas9-UTRnanos3)），在原始生殖细胞中特异敲除纤毛发生基因 kif3a。结果显示：纤毛缺失的初级精母细胞中，γ-H2A.X 信号在偶线期异常累积（双链断裂修复受阻）、Rad51 招募减少、Mlh1 交叉灶（crossover）数量显著下降、细胞凋亡增加。这是首个证明细胞器层面的"细胞外信号天线"参与减数分裂重组的工作，提示同源染色体配对与交叉形成可能受细胞外信号调控。

编者提示

本文为 2022 年发表的研究论文，原文为标准 Article 体裁（约 12 页），正文含 6 幅主图与 5 幅补充图。本译文为全文完整翻译，含材料与方法、全部图表说明、致谢、作者贡献与参考文献。需特别说明的一处学术背景：作者在讨论中主动指出，就在本文投稿期间，Science 上发表了一篇高度相关的工作——Mytlis et al., 2022, "Control of meiotic chromosomal bouquet and germ cell morphogenesis by the zygotene cilium"（Science 376: eabh3104）。该文同样报告了卵母细胞中的"偶线期纤毛"，但所用突变体均为全局敲除（cep290、cc2d2a、kif7 等与中心体/基体或 Hedgehog 信号相关的基因），因而无法排除其他组织（如颗粒细胞）异常的干扰。本文的核心优势恰恰在于使用了 PGC 特异的条件敲除，把「纤毛缺陷」这一变量严格限定在生殖细胞内。译文在讨论部分完整保留了这一自我定位与对比，不作删改。

摘要

减数分裂对几乎所有有性真核生物的演化与遗传多样性都至关重要。减数分裂重组的机制（例如联会）已被广泛研究。然而，来自细胞质乃至细胞外的信号能否调控减数分裂过程，仍不清楚。纤毛是微管构成的结构，从细胞表面伸出，作为感知胞外信号的信号枢纽发挥作用。本文报告了纤毛在减数分裂重组中一个出乎意料且至关重要的作用。在斑马鱼的配子发生过程中，纤毛特异性存在于初级精母细胞与初级卵母细胞的减数分裂前期。通过建立生殖细胞特异的 CRISPR/Cas9 体系，我们证明：生殖细胞特异耗竭纤毛基因会导致双链断裂修复受损、交叉形成减少以及生殖细胞凋亡增加。本研究揭示了纤毛在减数分裂中一项此前未被发现的角色，并提示胞外信号可能经由这一特定细胞器调控减数分裂重组。

关键词　纤毛；减数分裂；同源重组；kif3a；斑马鱼

一、引言

减数分裂大概是有性繁殖真核生物生活史中最关键的事件。在第一次减数分裂的前期，源自母本与父本的同源染色体配对并联会，从而为通过这一精巧过程在同源染色体之间交换遗传信息创造了条件——这就是同源重组（HR）。减数分裂重组已在从酵母、原虫到哺乳动物的不同模型体系中得到广泛研究（Loidl, 2016; Zelkowski et al., 2019）。在经典的 HR 模型中，DNA 双链断裂（DSB）由减数分裂专一性的拓扑异构酶样蛋白 SPO11 诱导，随后在 DSB 位点周围诱导组蛋白变体 H2A.X 的磷酸化（Keeney et al., 1997; Neale et al., 2005; Borde and de Massy, 2013）。与此同时，DSB 末端被加工，产生的单链突出端被重组酶结合，包括 Dmc1 与 Rad51（Bishop et al., 1992; Shinohara et al., 1992; Bishop, 1994）。断裂的 DNA 末端与这些蛋白形成核蛋白丝，并进一步侵入同源模板进行同源性搜索与 HR（Sun et al., 1991）。Dmc1 介导的同源性搜索还促进联会复合体（SC）的形成——即在配对的同源染色体之间形成的、演化上高度保守的三部蛋白结构。SC 对多个减数分裂过程不可或缺，包括增强同源染色体间重组、确保 obligate crossover 的形成，从而保障染色体忠实分离（Page and Hawley, 2004; Zickler and Kleckner, 2015）。取决于双 Holliday 结的解离方式，DSB 的修复会被导向 Mlh1 依赖的pro-crossover 途径或 non-crossover 途径。交叉重组事件导致等位基因在两条同源染色体之间的相互交换，从而确保子代的遗传多样性（Handel and Schimenti, 2010; Hunter, 2015; Dai et al., 2021）。

减数分裂重组的关键方面之一，是前期过程中染色体的重组组织以确保同源染色体配对。端粒花束（telomere bouquet）的形成是一种演化上保守的机制，用以促进同源配对（Scherthan, 2001; Loidl, 2016; Blokhina et al., 2019）。端粒通过 TRF1 与 TERB1/2–MAJIN 四聚体复合物锚定于核膜（NE）（Shibuya et al., 2014; Shibuya et al., 2015）。在花束形成过程中，端粒通过核骨架与细胞骨架复合体的连接蛋白聚集到核的一侧，该连接蛋白桥接了染色体向核周微管上运动的动力蛋白马达（King et al., 2008; Sato et al., 2009; Burke, 2018）。耐人寻味的是，端粒通常聚集在靠近微管组织中心（MTOC）的核膜处，这提示微管网络可能在促进同源配对中发挥作用（Sawin, 2005; Sato et al., 2009; Elkouby et al., 2016）。尽管 HR 的机制已被广泛研究，但减数分裂重组是否受细胞质或细胞外环境信号调控，仍是一个谜。

纤毛是微管构成的结构，由基体（basal body）成核——基体是一种高度保守的结构，同时充当 MTOC（Song et al., 2016; Zhao et al., 2021）。纤毛从细胞表面伸出，可以作为细胞天线感知胞外信号，并将这些信息传递入细胞（Singla and Reiter, 2006; Ishikawa and Marshall, 2011）。纤毛功能障碍会导致大量破坏性的遗传性疾病，统称纤毛病（ciliopathies）（Hildebrandt et al., 2011; Reiter and Leroux, 2017）。在本研究中，我们显示纤毛存在于斑马鱼的初级精母细胞与初级卵母细胞的减数分裂前期。通过建立生殖细胞特异的条件性敲除策略，我们证明纤毛通过调控 DSB 修复与交叉形成而在减数分裂 HR 中发挥作用。这些结果将有助于我们理解减数分裂重组调控机制的新信息。

二、结果

2.1 纤毛存在于初级精母细胞与初级卵母细胞的减数分裂前期

在考察斑马鱼的精子发生过程时，我们观察到一个特殊结构——它存在于精母细胞中（图 1A）。该纤毛比精子鞭毛短，而精子鞭毛是一种对精子运动至关重要的特殊运动型纤毛（图 1A）。以抗乙酰化微管蛋白（纤毛标志物）与 SYCP3（SC 的侧向元件）抗体进行双重免疫染色显示：这些纤毛结构最初形成于细线期（leptotene），并逐渐延长直至直线期（diplotene）（图 1A）。直线期纤毛约为精子鞭毛长度的一半（图 1A、B）。有趣的是，这些纤毛在终变期（diakinesis）消失，这意味着它们并非精子鞭毛的雏形。进一步以抗 γ-微管蛋白（中心体标志物）抗体进行免疫染色显示，这些微管由中心粒之一成核（图 1C；补充图 S1）。此外，这些纤毛也可被抗谷氨酰化微管蛋白抗体标记（补充图 S2A）。相比之下，精母细胞纤毛中未见微管蛋白糖基化，而精子鞭毛中该信号强烈（补充图 S2B）。此外，超微结构分析显示这些纤毛具有 '9+0' 轴丝构型，与精子鞭毛的 '9+2' 排列形成对比（图 1D–F'）。最后，在初级卵母细胞的细线期与偶线期同样存在纤毛（补充图 S3）。

图 1 ｜ 减数分裂中初级精母细胞的纤毛。（A） 共聚焦图像，显示以抗乙酰化微管蛋白（ace-Tub，绿色）抗体标记的纤毛（白色箭头）与精子鞭毛（粉色箭头）。联会复合体以 SYCP3（红色）标记，细胞核以 DAPI（蓝色）复染。（B） 初级精母细胞各时期与精子中纤毛长度的统计结果。（C） 初级精母细胞上以抗乙酰化微管蛋白（ace-Tub，绿色）与抗 γ-微管蛋白（gamma-Tub，红色）抗体标记的纤毛与基体共聚焦图像。（D–F'）透射电镜显示初级精母细胞纤毛的超微结构（D–E'）与精子鞭毛（F、F'）。横切面显示精母细胞纤毛的 '9+0' 构型（E'）。

2.2 生成生殖细胞特异条件敲除突变体的高效方法

第一次减数分裂前期存在纤毛这一事实，意味着纤毛可能参与 HR 的调控。由于纤毛对早期斑马鱼胚胎发育是必需的（Song et al., 2016），我们需要设计一套策略，专门在精母细胞中去除这些纤毛。为此，我们开发了一套生殖细胞特异的 CRISPR/Cas9 体系：通过建立原始生殖细胞（PGC）特异的 Cas9 转基因品系 Tg(kop:cas9-p2a-egfp-UTRnanos3)（下文简称 Tg(kop:cas9-UTRnanos3)），将 Cas9-2A-EGFP 表达盒置于 PGC 特异的 askopos（kop）启动子与 nanos3 3'-UTR 控制之下（Xiong et al., 2013）。由于 Cas9 蛋白仅在 Tg(kop:cas9-UTRnanos3) 胚胎的 PGC 中表达（图 2A），向胚胎注射单链向导 RNA（sgRNA）即可产生 PGC 特异的基因敲除。母源来源的 RNA 与蛋白在卵子发生过程中合成并积累，在早期胚胎发育中发挥关键作用。这类母源产物的存在，通常能在包括斑马鱼与爪蟾在内的许多生物中部分代偿合子突变基因的缺失。生成母源-合子突变体有助于厘清母源基因在调控早期发育中的作用。由于候选基因已在 Tg(kop:cas9-UTRnanos3) 鱼的 PGC 中被突变，我们推测：即使合子突变是致死的，将注射了 sgRNA 的 F0 雌鱼与雄鱼杂交，也能在 F1 代产生母源-合子突变体（图 2B）。

为检验 PGC 特异表达 Cas9 的效率与外显率，我们首先注射了一条已验证的、靶向 tcf7l1a 的 sgRNA（Zhang et al., 2020）。tcf7l1a 的母源-合子突变体（MZtcf7l1a）——而非母源突变体（M tcf7l1a）或合子突变体（Ztcf7l1a）——表现出无头表型（Kim et al., 2000）。将两尾生殖系突变的雌鱼与雄鱼杂交，导致 超过 50% 的 F1 胚胎出现典型的无头表型（图 2C；补充图 S4A），提示 PGC 表达的 Cas9 具有很高效率。同样的，我们也能生成 MZpou5f3 突变体，表现出严重的发育缺陷（Reim and Brand, 2006; Schulz and Harrison, 2019）（补充图 S4B、C）。这些数据表明 Tg(kop:cas9-UTRnanos3) 品系表达的 Cas9 蛋白效率极高，能够实现生殖细胞特异的基因敲除。值得注意的是，尽管效率很高，配子中突变的外显率并非 100%（图 2C；补充图 S4B），这可能与 sgRNA 的时间性存在有关。

图 2 ｜ 通过生殖细胞特异表达 Cas9 生成 MZkif3a 突变体。（A） 24 hpf 的 Tg(kop:cas9-p2a-egfp-UTRnanos3) 斑马鱼胚胎明场图像，PGC 中可见 EGFP 荧光。上方为构建该转基因的载体示意图。（B） 使用 PGC 特异表达 Cas9 的 Tg(kop:cas9-UTRnanos3) 胚胎生成 MZ 突变体的流程示意图。（C） tcf7l1a sgRNA 注射的 Tg(kop:cas9-UTRnanos3) 鱼的配子突变效率与子代表型。C1 显示野生型样表型，C2 显示完全无眼。每次杂交共基因分型 12 个胚胎以计算突变效率。（D） 生成 kif3a 生殖细胞特异敲除突变体（gcKO kif3a）的策略示意图。（E） 48 hpf 的 Zkif3a 与 MZkif3a 突变体外部表型。放大框示于下方，圆点勾勒出中脑脑室。（F、G） 统计分析显示 MZkif3a 突变体体轴弯曲加重，表现为弯曲角度减小。（H）柱状图显示不同突变体中脑脑室的相对大小。A.U.，任意单位。（I）野生型、Zkif3a 与 MZkif3a 突变体中脊髓与耳囊纤毛的共聚焦图像。纤毛以乙酰化微管蛋白（绿色）标记，基体以 γ-微管蛋白（红色）染色。细胞核以 DAPI 复染。*** P<0.001；**** P<0.0001；ns，无显著性差异；hpf，受精后小时数；wt，野生型。

2.3 MZkif3a 突变体的生成

为进一步提高 PGC 中基因编辑的效率，我们建立了稳定的 Tg(U6:3×sgRNA-kif3a) 转基因品系，其中三条靶向斑马鱼 kif3a 的 sgRNA 各由一个独立的 U6 启动子串联驱动。Kif3a 是驱动纤毛组装的关键正向端马达蛋白（Zhao et al., 2012）。我们进一步将 Tg(kop:cas9-UTRnanos3) 品系与 Tg(U6:3×sgRNA-kif3a) 品系杂交（图 2D），生成 Tg(kop:cas9-UTRnanos3;U6:3×sgRNA-kif3a) 双转基因鱼。通过将双转基因雌鱼与 kif3a 杂合子雄鱼杂交，我们成功生成了母源-合子 kif3a 突变体（MZkif3a）。约 50% 的胚胎（340/707）表现出体轴弯曲缺陷，强烈提示双转基因个体所产卵中几乎均缺乏 Kif3a。与 Zkif3a 突变体相比，MZkif3a 突变体表现出明显的体轴弯曲缺陷，并伴随脑室增大——脑积水的典型特征（图 2E–H；Feng et al., 2017）。进一步的整染结果显示，MZkif3a 突变体中纤毛完全缺失，而 Zkif3a 突变体在早期阶段由于 Kif3a 的母源效应，脊髓与耳囊中仍形成纤毛（图 2I）。

2.4 生殖细胞特异 kif3a 敲除突变体中精子与精母细胞的纤毛发生缺陷

接下来，我们进一步分析了突变雄鱼的表型。尽管双转基因雄鱼能像野生型雄鱼一样正常发育至成体，但由于缺失 Kif3a，其精子无法使野生型卵受精（图 3A–C）。精子能够在睾丸中产生，但其所有鞭毛都显著短于对照同胞的鞭毛（图 3D–F）。这些数据也提示，缺乏 Kif3a 时精子鞭毛仍可部分组装。

由于 Cas9 蛋白在 PGC 中表达，可以认为 kif3a 基因应当在更早的阶段即被破坏。事实上，突变体中纤毛无法形成，抗乙酰化微管蛋白的染色只能在突变精母细胞的中心体处被检出（图 3G）。此外，在睾丸切片上以 SYCP3 染色显示，突变体所有早期阶段的初级精母细胞中纤毛完全缺失（图 3H），这进一步确证了双转基因方案在诱导 kif3a 生殖细胞特异敲除（gcKO kif3a）上接近 100% 的效率（图 2D）。值得注意的是，在那些富含精子的区域仍可见强信号，这与残留的较短精子鞭毛有关（图 3H）。此外，双转基因雌鱼中初级卵母细胞的纤毛同样缺失（补充图 S3）。

图 3 ｜ 生殖细胞特异 kif3a 条件敲除突变体的表型。（A） 野生型与 Tg(kop:cas9-UTRnanos3;U6:3×sgRNA-kif3a) 双转基因雄鱼的外观表型。（B） 野生型雌鱼与对照或双转基因雄鱼杂交产生的胚胎（6 hpf）。（C） 统计分析显示野生型与双转基因雄鱼的受精率百分比。（D） 野生型与 Tg(kop:cas9-UTRnanos;U6:3×sgRNA-kif3a) 双转基因鱼睾丸的组织学分析。箭头指向精母细胞，星号标示精子。（E） 野生型与双转基因鱼精子鞭毛的共聚焦图像，以抗乙酰化微管蛋白抗体（绿色）标记。（F） 统计分析显示野生型与双转基因鱼精子鞭毛的长度。（G） 野生型与双转基因鱼初级精母细胞中纤毛的共聚焦图像。双转基因鱼的精母细胞纤毛（绿色）缺失。精母细胞时期以 SYCP3 染色（红色）区分。（H）野生型与双转基因鱼睾丸中 SYCP3（红色）与乙酰化微管蛋白（绿色）的染色。箭头指示精母细胞纤毛，箭头head指示突变体睾丸中异常精子鞭毛的染色。**** P<0.0001；wt，野生型。

2.5 缺乏纤毛时 DNA 双链断裂的修复受损

在减数分裂重组过程中，DSB 的形成会引发快速的 DNA 损伤应答，导致组蛋白 H2A 异构体在 DSB 位点被磷酸化。通过使用抗 γ-H2A.X 抗体，可以区分细线期与偶线期的精母细胞。γ-H2A.X 的染色从偶线期中段起消失（Xie et al., 2020）。gcKO kif3a 精母细胞与对照同胞在细线期的染色信号相似；然而出乎意料的是，在 gcKO kif3a 突变体中，精母细胞在偶线期整个细胞核内呈现强烈的 γ-H2A.X 染色（图 4A、B）。通过统计 γ-H2A.X 阳性生殖细胞的数量，我们进一步发现，每个精母细胞囊中的精母细胞数量在 gcKO kif3a 与对照鱼之间相当（图 4C），提示精母细胞纤毛的缺失不影响精原细胞的减数分裂。

γ-H2A.X 的强信号提示，缺乏精母细胞纤毛时 DSB 修复可能受到影响。接下来，我们检测了 Rad51 的分布——它是招募至断裂位点参与 DSB 修复的关键重组酶之一（Shinohara et al., 1992）。与对照细胞相比，gcKO kif3a 雄鱼的细线期精母细胞中 Rad51 信号显著减少（图 4D、E）。Rad51 信号在偶线期进一步减弱，而在偶线期后期，突变体与对照同胞之间的 Rad51 染色已无差异（图 4D）。Rad51 是交叉形成所必需的。接下来，我们通过研究精母细胞表面铺片上 Mlh1 灶的数量来评估交叉事件。突变精母细胞中的 Mlh1 灶数量显著减少（图 4F、G）。最后，TUNEL 检测结果显示，突变体睾丸中凋亡的精母细胞数量高于对照同胞（图 4H、I）。综上，这些数据提示精母细胞纤毛的缺失影响了 DSB 修复过程，导致交叉形成减少与细胞凋亡增加。

图 4 ｜ 缺乏精母细胞纤毛时 DNA 双链断裂修复受损。（A） 野生型与 Tg(kop:cas9-UTRnanos3;U6:3×sgRNA-kif3a) 双转基因鱼睾丸中 γ-H2A.X（红色）染色的共聚焦图像。（B） 统计分析显示野生型与双转基因鱼细线期与偶线期精母细胞 γ-H2A.X 染色的相对荧光强度。（C） 统计分析显示野生型与双转基因鱼每个精母细胞囊中精母细胞数量。（D） 野生型与双转基因鱼睾丸中 Rad51 的染色。（E） 细线期与偶线期精母细胞 Rad51 染色相对荧光强度的统计分析。（F） 初级精母细胞中 Mlh1 的染色。（G） 每个精母细胞 Mlh1 灶数量的统计分析。（H、I）野生型与双转基因鱼中经 TUNEL 检测标记的凋亡细胞。* P<0.05；*** P<0.001；**** P<0.0001；ns，无显著性差异；wt，野生型。

2.6 ift88 缺失抑制精母细胞纤毛形成并导致细胞凋亡

为排除 Kif3a 在减数分裂进展中的非纤毛作用，我们进一步生成了 Tg(hsp70l:ift88-egfp) 转基因品系，其中 ift88——另一个纤毛发生必需基因（Tsujikawa and Malicki, 2004）——由热激启动子驱动。通过常规热激，我们成功用该转基因挽救了 ovl(ift88) 突变体（图 5A）。有趣的是，未经热诱导时成年突变体仍可存活一小段时间。通过比较热激与未处理鱼之间的突变体，我们发现非热激对照的睾丸中，精母细胞纤毛大部分丧失（图 5B、C）。此外，由这些非热激成年雌鱼与杂合子雄鱼产生的突变体，表现出比 MZovl 胚胎更严重的体轴弯曲与纤毛发生缺陷（补充图 S5；Huang and Schier, 2009）。与 kif3a 突变体类似，ift88 缺失同样导致精母细胞异常凋亡（图 5D、E），进一步确证了纤毛在减数分裂处理过程中的作用。

图 5 ｜ ift88 缺失导致精母细胞纤母发生缺陷与凋亡。（A） 生成 Tg(hsp70l:ift88-egfp) 转基因以挽救 ovl(ift88) 突变体的策略示意图。（B） 统计分析显示热激与非热激 ift88;Tg(hsp70l:ift88-egfp) 转基因鱼中有纤毛的精母细胞百分比。（C） 不同来源鱼初级精母细胞上以抗乙酰化微管蛋白（绿色）与抗 SYCP3（红色）抗体标记的纤毛与联会复合体的共聚焦图像。（D、E） 经 TUNEL 检测（染色 D）标记的凋亡细胞共聚焦图像及 TUNEL 阳性细胞统计结果（E）。** P<0.01；wt，野生型。

三、讨论

纤毛是从细胞表面伸出的微小细胞器，用于感知胞外信号。运动型纤毛可以驱动液流或推动细胞（如精子），而初级纤毛则在细胞增殖、迁移、分化以及神经轴突导向等诸多方面发挥多样作用（Bisgrove and Yost, 2006; Zhao et al., 2021）。在此，我们报告纤毛可能同样调控减数分裂过程中 DSB 的修复与交叉形成。我们的数据表明，纤毛存在于初级精母细胞与卵母细胞的减数分裂重组过程中（图 6）。通过开发生殖细胞特异的基因敲除方法，我们显示耗竭这些生殖细胞特异的纤毛会导致 DSB 修复受损、交叉形成受损以及细胞凋亡增加（图 6）。纤毛很可能通过招募 Rad51 等重组酶至 DSB 位点来调控 DSB 修复，从而确保交叉形成，而它对减数分裂本身的处理过程并非必需（图 6）。事实上，在缺乏生殖细胞特异纤毛的情况下，成熟卵与精子仍可产生，尽管精子的鞭毛存在缺陷且伴有细胞凋亡。

图 6 ｜ 减数分裂过程中精母细胞纤毛的模型。在减数分裂 I 的前期，从细线期到粗线期，精母细胞中存在纤毛。该纤毛参与调控 HR。在缺乏纤毛的情况下，招募至 DSB 的 Rad51 蛋白减少，损害了 DSB 修复效率，导致 γ-H2A.X 信号累积以及交叉形成水平下降。wt，野生型。

虽然我们尚不清楚这些纤毛调控减数分裂重组的详细机制，但我们的数据传达了一个重要信息：减数分裂重组可以受核外信号调控。纤毛可以作为细胞天线，感知 Hedgehog、Notch/Delta 以及经典与非经典 Wnt 信号等胞外信号（Ishikawa and Marshall, 2011; Anvarian et al., 2019）。因此，精母细胞纤毛可能充当信号枢纽，感知这些胞外信号，以帮助招募 Rad51、Dmc1 等 DSB 修复组分至 DSB 位点，确保 HR 过程的进行。另一方面，这些纤毛由基体成核，而端粒花束的微管正起源于基体。因此，也有可能纤毛为动力蛋白/驱动蛋白马达提供力量，以支持端粒移动与同源染色体配对。

在本论文准备期间，我们注意到近期发表了一篇类似的论文（Mytlis et al., 2022）。该研究报告了卵母细胞中偶线期纤毛的存在，他们认为该结构可能调控染色体配对、生殖细胞形态发生以及卵巢发育与生育力。最为可能的是，这里的偶线期纤毛与本文讨论的精母细胞纤毛是相似的。值得注意的是，他们研究中产生的所有突变体都包含与中心体（基体）（cep290、cc2d2a）或 Hedgehog 信号（kif7）相关基因的突变（Mytlis et al., 2022）。这些基因此前已被证明参与细胞周期的调控，因而也可能影响减数分裂（Tsang et al., 2008; He et al., 2014; Veleri et al., 2014; Prosser et al., 2022）。此外，他们研究中所有突变体均为全局敲除，这可能导致包括颗粒细胞在内的其他细胞出现缺陷，而这些细胞的缺陷也可能促成生殖细胞的形态发生缺陷。相比之下，我们生成了 PGC 特异的条件敲除突变体，排除了其他组织中纤毛缺陷的可能性。我们的数据提示，初级精母细胞纤毛参与调控减数分裂重组，其缺陷可延缓但不能阻断减数分裂过程。事实上，在我们的突变体中成熟卵仍可产生，这与 cep290 或 cc2d2a 突变体中观察到的卵子发生缺陷形成鲜明对比。同样地，在 PGC 中缺失 ift88 的情况下，斑马鱼卵也可正常产生（Huang and Schier, 2009; Borovina and Ciruna, 2013）。

总之，我们在此报告了初级精母细胞与卵母细胞中纤毛的存在，其缺陷可能影响减数分裂中的 HR。仍需进一步的实验来解析这一引人入胜的细胞器背后精确的信号分子。

四、结论

本文首次在斑马鱼中鉴定并刻画了初级精母细胞与初级卵母细胞减数分裂前期特有的纤毛结构，并借助新建的生殖细胞特异 CRISPR/Cas9 体系，证明这些纤毛对减数分裂重组具有实质作用：其缺失导致 Rad51 招募减少、DSB 修复受阻（γ-H2A.X 异常累积）、交叉形成下降（Mlh1 灶减少）与生殖细胞凋亡增加。这一工作把「细胞器—胞外信号—核内染色体重组」这条链条首次在减数分裂中打通，为理解减数分裂重组的核外调控提供了全新框架，也提示纤毛相关疾病（纤毛病）在生殖表型上的潜在机制。

五、材料与方法

5.1 伦理声明

所有斑马鱼研究均依照标准动物指南进行，并经中国海洋大学动物护理委员会与中国科学院水生生物研究所动物护理委员会批准。

5.2 斑马鱼品系

所有斑马鱼品系在 28.5°C、14 小时光照 / 10 小时暗周期下饲养。用于生成 Tg(kop:cas9-p2a-egfp-UTRnanos3) 转基因鱼的质粒，通过在 pTol2(kop:egfp-UTRnanos3) 构建体（Xiong et al., 2013）中以同框序列 cas9-p2A-egfp 替换 egfp 序列而生成，该序列编码斑马鱼密码子优化的 Cas9、p2A 肽与 EGFP。Tg(U6:3×sgRNA-kif3a) 转基因质粒按既往描述以 Golden Gate 克隆方法生成（Yin et al., 2016）。三条靶向 kif3a 的 sgRNA（sgRNA1，GGGAAAACGTTCACTATGGA；sgRNA2，GGCCAAACTCGACATGGAGG；sgRNA3，GAGGAGGTGAGAGATCTGTT）各由一个独立的斑马鱼 U6 启动子驱动。Tg(U6:3×sgRNA-kif3a) 转基因鱼进一步与 Tg(kop:cas9-p2a-egfp-UTRnanos3) 转基因品系杂交以获得双转基因鱼。pTol2-hsp70l:ift88-egfp 质粒通过 Multisite Gateway 克隆构建，并于单细胞期注入同合子 ovl(ift88) 突变体。注入的胚胎每日热激 3 小时直至成体以供后续分析。

5.3 sgRNA 显微注射

在基于显微注射的 PGC 靶向基因敲除实验中，针对 tcf7l1a 与 pou5f3 的 sgRNA 分别为 GGAGGAGGAGGTGATGACCT 与 GGGTGAACTACTACACGCCA，均如既往所述（Zhang et al., 2020）。sgRNA 以每胚胎 80 pg 的剂量注射入 Tg(kop:cas9-p2a-egfp-UTRnanos3) 转基因胚胎的单细胞期。

5.4 染色体铺片与免疫染色

染色体铺片步骤与既往发表的方法相似（Xie et al., 2020）。简述如下：解剖得到的睾丸先在 50 μl 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）中孵育 5 分钟，随后转入 300 μl 低渗液（100 μl 1× PBS 加 200 μl 双蒸水）中，在粘附片上处理 25 分钟。经 4% 多聚甲醛（PFA）固定 5 分钟后，细胞用 PBS 清洗三次，用封闭液（10% 山羊血清、3% 牛血清白蛋白、0.05% Triton X-100）封闭 30 分钟，然后进行常规抗体染色。

5.5 免疫荧光与 TUNEL 检测

斑马鱼睾丸先解剖并在 4°C 下于 4% PFA 中固定过夜。以 PBS 每次清洗 10 分钟、共三次后，睾丸在 4°C 下于 30% 蔗糖中渗透过夜，随后用组织冷冻包埋介质（OCT）包埋。冷冻切片使用 LEICA 冷冻切片机（CM1860）制备。TUNEL 检测使用原位细胞死亡检测试剂盒（Roche），按厂商标准方案进行。图像使用 Leica Sp8 共聚焦显微镜采集。为可视化初级卵母细胞中的纤毛，约 1.5 月龄的斑马鱼雌鱼以冰水安乐处死，解剖卵巢后转入 4% PFA 中过夜（4°C）。以 PBST（1× PBS + 0.1% Tween20）清洗三次后，卵巢进一步以封闭液（0.3% Triton X-100、10% 胎牛血清、1× PBS）在室温封闭 1.5 小时。抗体的染色步骤与睾丸的相似。

免疫荧光实验使用了以下抗体：mouse anti-acetylated tubulin（Sigma, T6793）、rabbit anti-SYCP3（Abcam, ab150292）、rabbit anti-γ-H2A.X（Genetex, GTX127342）、rabbit anti-RAD51（THERMO, PA5-27195）、mouse anti-MLH1（Abcam, ab14206）、mouse anti-gamma tubulin（Sigma, T5326）、rabbit anti-acetylated tubulin（Cell Signaling Technology, 5335S）、mouse anti-glutaminated tubulin（AdipoGen, GT335）、mouse anti-monoglycylated tubulin（Sigma, MABS1353）与 mouse anti-polyglycylated tubulin（Sigma, MABS276）。

5.6 免疫组织化学染色

斑马鱼睾丸解剖后于 4°C 下在 4% PFA 中固定过夜。经 30%、50%、75%、95%、100% 乙醇梯度脱水后，睾丸用 JB4 包埋介质（Polysciences Inc.）包埋。睾丸横切面用 Leica RM2235 切片机收集，并以苏木精和伊红染色。图像使用 Leica DM2500 显微镜拍摄。

5.7 超微结构分析

斑马鱼睾丸解剖后在 2.5% 戊二醛中固定过夜。睾丸用 PBS 每次清洗 10 分钟、共三次，随后在 1% 四氧化锇中再次固定。之后睾丸经清洗、逐步脱水至 100% 丙酮，然后用 Epon812 树脂包埋。超薄切片经醋酸铀与柠檬酸铅染色。切片在透射电子显微镜（JEM-1200EX）上观察，并用 Olympus Soft Imaging Solutions 成像。

5.8 统计分析

所有共聚焦图像均使用 Leica Sp8 共聚焦显微镜采集。为比较对照与突变体之间的荧光信号，每次实验内部的图像均以相同参数采集。使用 ImageJ 软件测量 Rad51 与 γ-H2A.X 染色中每个精母细胞囊的平均荧光强度。此处，精母细胞囊指在 Rad51 与 γ-H2A.X 免疫荧光中呈现相似蛋白定位的一簇初级精母细胞。随后将野生型的平均荧光强度设定为 100%，用 Excel 软件计算 kif3a 突变体的相对荧光强度，图形由 GraphPad Prism 8.0 软件绘制。所有实验至少重复三次。统计分析使用 ImageJ、Microsoft Excel 或 GraphPad Prism 8.0 软件完成。统计显著性采用非配对数据的双尾 Student's t 检验评估。所有数据均以 mean ± SD 表示（图注中另有说明者除外）。P<0.05 被视为具有统计学意义。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。